Summary
在这里，我们提出了一种分离来自血小板裂解物（PL）的细胞外囊泡（EV）的方法及其用于包衣钛（Ti）植入物表面的方法。我们描述了滴铸涂层方法，电动汽车从表面的释放曲线，以及电动汽车涂层Ti表面的 体外 生物相容性。
Abstract
细胞外囊泡（EV）是生物纳米囊泡，在细胞通讯中起关键作用。其含量包括蛋白质和核酸等活性生物分子，在再生医学中具有巨大的潜力。最近，来自血小板裂解物（PL）的EV显示出与PL相当的成骨能力。此外，生物材料经常用于骨科或牙齿修复。在这里，我们提供了一种用PL衍生的EV功能化Ti表面的方法，以改善其成骨性能。
通过尺寸排阻色谱法从PL中分离出EV，然后通过滴铸将Ti表面与PL-EV功能化。功能化通过EV释放和乳酸盐脱氢酶（LDH）释放测定的生物相容性得到证明。
Introduction
EV是由任何细胞分泌的膜囊泡（30-200nm），通过传递其货物在细胞间通信中起着关键作用。它们含有多种活性生物分子，其中可能包括核酸、生长因子或生物活性脂质1。由于这些原因，电动汽车已被评估其在治疗中的潜在用途。在骨科和骨再生方面，来自不同来源的EV已经过测试。其中，血小板衍生的EV已被证明可以诱导干细胞的分化作用，同时保持低细胞毒性2，3。因此，需要进一步的研究来探索将EV与生物材料相结合的可能性，以便在日常临床实践中使用它们。
钛基生物材料由于其机械性能、高生物相容性和长期耐用性，被广泛用作骨愈合临床干预的支架4。然而，Ti植入物是一种生物惰性材料，因此与周围骨组织的结合能力较差5。因此，正在研究钛改性，以便通过在其表面实现功能更强大的微环境来提高其性能4，6，7。从这个意义上说，电动汽车可以通过化学8 或物理相互作用与钛锚定9，10。来自干细胞或巨噬细胞的固定化EV通过促进细胞粘附和增殖来增强Ti的生物活性，从而诱导成骨作用8，9，10。
本文将重点介绍使用PL衍生的EV涂覆Ti表面的液滴铸造策略。此外，我们将评估EV在一段时间内从包被表面的释放曲线，并在 体外确认其细胞生物相容性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
血小板裂解物（PL）按照先前所述使用IdISBa生物库提供的新鲜白蛋白涂层作为起始材料获得，符合机构指南3 。它们在当前项目中的使用得到了其道德委员会的批准（IB 1995/12 BIO）。
1. 电动汽车与PL隔离
- 较大的身体移除
- 在室温下解冻PL。
- 在4°C下以1，500× g 离心PL15分钟。 丢弃含有细胞碎片的沉淀。
- 收集上清液并在4°C下以10，000× g 连续离心30分钟。
注意：沉淀对应于较大的EV，例如微泡，在这种情况下，它被丢弃。 - 过滤上清液首先通过0.8μm多孔膜，然后通过0.2μm多孔膜。
注意：这些步骤将删除所有不需要的电动汽车。 - 将过滤后的PL池化并储存在-20°C直至使用。
- 尺寸排阻色谱
- 用过滤的PBS以所需的流速平衡耦合到色谱设备的色谱柱。
注：使用的流速取决于色谱柱特性;在这种情况下，它被设置为0.5毫升/分钟。 - 用注射器将处理后的PL（5 mL）装载到设备上。
- 将PL注入色谱柱中，并开始在15 mL管中收集5 mL级分。
- 收集EV富集馏分并将其储存在-80°C直至使用。
注意：首次进行实验时，通过蛋白质定量和免疫检测表征所有组分，以确定富含EVs的组分3，11。在这个实验中，收集了第 9个分数。 - 用30mL的0.2%NaOH溶液洗涤色谱柱，一旦达到平衡，将其储存在20%乙醇溶液中。
- 用过滤的PBS以所需的流速平衡耦合到色谱设备的色谱柱。
图1：血小板裂解物（PL）细胞外囊泡（EV）分离的示意图。 PL首先以1，500 x g 离心，然后以10，000 x g 离心以除去较大的主体。上清液通过0.8和0.2μm过滤器过滤。将处理后的PL加载到色谱柱上，并通过尺寸排阻色谱分离EV。 请点击此处查看此图的放大版本。
2. 电动汽车特性描述
注：EV表征是进行功能研究所必需的12。电子显微镜或蛋白质印迹表征以前已有报道13。本报告将重点介绍Ti表面功能化的基本表征技术。
- 纳米颗粒跟踪分析
- 将EV（1：1000）稀释在0.2μm过滤的PBS中。
注意：过于浓缩的样品或太稀释的样品将超出NTA测定的范围，并且需要进行调整。 - 用注射器将1 mL稀释的EV加载到NTA设备中，并将其注入NTA设备。
- 遵循制造商的颗粒浓度和尺寸分布测定协议。
- 将EV（1：1000）稀释在0.2μm过滤的PBS中。
- 蛋白质浓度
- 使用1μLEV溶液测定浓度。使用分光光度计测量波长为280nm的吸光度。
注意：与颗粒数量相比，电动汽车的蛋白质水平应该较低。 - 按照制造商的说明使用分光光度计获取吸光度读数。
- 使用1μLEV溶液测定浓度。使用分光光度计测量波长为280nm的吸光度。
3. 钛表面功能化
注：在这种方法中，使用机加工的钛圆盘，c.p.等级IV，直径6.2毫米，高度2毫米。这些光盘可以用Ti镊子操纵，但重要的是不要划伤表面。此外，在整个过程中，机加工侧必须朝上。
- 钛盘清洗
注：用于Ti洗涤的溶液体积应足以覆盖Ti盘。将Ti圆盘放入玻璃烧杯中，并将溶液倒入其中。然后，通过倾析取溶液。- 用去离子（DI）水清洗Ti植入物，然后丢弃水。
- 用乙醇洗涤Ti植入物70%，然后倾析以除去溶液。
- 将植入物置于DI水中，并在50°C下超声处理5分钟。丢弃水。
- 将Ti植入物在40%NaOH溶液中孵育50°C并搅拌10分钟。丢弃解决方案。
注意：NaOH溶液在制备过程中会变暖。该溶液具有腐蚀性，应在通风橱内使用。 - 将植入物在50°C的DI水中超声处理5分钟，然后取出水。
- 用去离子水（至少5次）进行几次洗涤，直到达到中性pH值。使用pH指示剂检查pH值。
- 在50°C的DI水中超声处理植入物5分钟，然后取出水。
- 将Ti植入物在50°C的50%HNO3 溶液中孵育10分钟，搅拌。删除解决方案。
注意：HNO3 是一种腐蚀性和氧化性物质，应在通风橱内使用。 - 将植入物在50°C的DI水中超声处理5分钟。取出水。
- 用去离子水（至少5次）进行几次洗涤，直到获得中性pH值。使用pH指示剂检查pH值。
- 将植入物在50°C的DI水中超声处理5分钟。取出水。
注意：此时，可以通过将Ti植入物储存在70%乙醇溶液中来停止实验。
- 钛钝化
注：Ti钝化步骤是通过按下面列出的顺序用不同的溶液完全覆盖Ti光盘来执行的。将Ti圆盘放入玻璃烧杯中，并将溶液轻轻倒在上面。所有洗涤步骤中使用的体积必须完全覆盖植入物，并通过倾析去除。- 将Ti植入物在30%HNO3 溶液中孵育30分钟，在室温下温和搅拌。删除解决方案。
- 用去离子水（至少5次）进行几次洗涤，直到达到中性pH值。使用pH指示剂检查pH值。
- 将Ti植入物在室温下在DI水中孵育过夜。
- 在40°C的真空条件下干燥植入物10分钟。
- 电动汽车下降铸件
注意：对于细胞功能研究，在细胞培养柜中工作很重要。- 将Ti植入物置于96孔板中，加工面朝上。
注意：如果植入物倒置，可以使用针头将其放回去。 - 解冻电动汽车溶液，并将其与搅拌混合。使用涡旋脉冲3秒。
- 将EV沉积在Ti表面上。在这项研究中，将滴剂40μL的EV溶液滴到Ti上，根据NTA确定的浓度，每个植入物最多固定4 x 1011 个EV。
- 将含有Ti的板置于37°C的真空条件下，直到滴完全干燥（〜2小时）。
注意：根据植入物的数量和真空室中存在的水来调整时间。
- 将Ti植入物置于96孔板中，加工面朝上。
图2：Ti钝化和EV通过液滴铸造功能化的原理图。 Ti植入物首先在室温下在30%HNO3 溶液中孵育30分钟，钝化。用去离子水洗涤几次后，pH值达到中性。然后，将Ti植入物在室温下在DI水中孵育过夜。之后，植入物在40°C的真空条件下干燥。 对于EV固定化，将40μLEV溶液沉积到Ti植入物上。接下来，植入物在真空下孵育2小时，直到EV物理结合到表面。 请点击此处查看此图的放大版本。
4. Ti 表面表征
- 发布研究
- 在37°C下用200μL过滤的PBS孵育Ti表面。
注：PBS经过滤波，以避免干扰NTA测量。 - 在不同的时间点更换PBS并储存在-80°C。
注意：在这项研究中，分析了2天，6天，10天和14天的时间点。 - 根据制造商的说明，NTA分析存储的PBS以进行颗粒研究。
注：PBS中不同时间的颗粒浓度是电动汽车随时间变化的释放曲线的表示。
- 在37°C下用200μL过滤的PBS孵育Ti表面。
- 生物相容性研究
注意：人脐带来源间充质干细胞（hUC-MSC）是根据机构指南从IdISBa生物库获得的。- 在补充 20% FBS 的 DMEM 低血糖中维持 hUC-MSC，直至使用。每周更换两次培养基。
- 对于细胞接种，用5 mL PBS在烧瓶中洗涤细胞两次。
- 通过加入 1 mL 胰蛋白酶溶液对 hUC-MSC 进行胰蛋白酶消化。确保它完全覆盖细胞的单层。除去胰蛋白酶溶液并将细胞培养瓶置于37°C约2分钟。在显微镜下观察细胞脱离。分离的细胞将呈现圆形，并将处于悬浮状态。
- 将细胞重悬于 DMEM 低葡萄糖中，1% 的 EV 耗尽 FBS。
注意：准备补充有1%FBS的培养基，然后以120，000× g 超速离心18小时以除去FBS-EV。重要的是要去除EV以避免与血小板EV的干扰。 - 通过用Neubauer室计数细胞数量来确定细胞浓度14。
- 使hUC-MSC达到50，000个细胞/ mL的浓度。
- 将200μL细胞溶液接种到Ti植入物上。
- 48小时后，根据制造商的协议，收集50μL培养基并使用乳酸脱氢酶（LDH）活性试剂盒进行细胞毒性测定。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
本文中介绍的方法允许获得EV功能化的钛盘。电动汽车与表面物理粘合，这允许随着时间的推移持续释放。NTA可以在第2天，第6天，第10天和第14天测量释放的EV数量。第2天的第一次测量显示，大约有109 辆电动汽车被释放，然后在第6天持续释放（约108 辆电动汽车）;第10天（约107 辆电动汽车）和第14天（约107 辆电动汽车）。这证实了持续释放，尽管随着时间的推移，电动汽车的释放量有所下降。
图3：Ti功能化表面的累积EV释放。 颗粒在37°C下于第2天，第6天，第10天和第14天在PBS中释放。 数据表示 n = 3 时 SEM ±平均值。 请点击此处查看此图的放大版本。
此外，对MSC进行的生物相容性研究表明，在Ti和Ti-EV上细胞生长48小时后，与Ti对照组相比，Ti-EV组的生物相容性有所改善，Ti-EV组的LDH活性水平低于Ti组。在植入物上细胞生长48小时后收集培养基。直接在组织培养塑料上生长的细胞用作具有0%LDH活性的阴性对照，而用1%Triton X-100处理的细胞用作具有100%细胞毒性的阳性对照。
图4：Ti-EV 的体外 细胞生物相容性。 在细胞接种到植入物上48小时后，在培养基中测量LDH活性。接种在组织培养塑料上的细胞被设定为0%的毒性，而接种在组织培养塑料上并用triton X-100处理的细胞被设定为100%的毒性。虚线显示为30%，这是根据ISO-10993：5接受的医疗器械细胞毒性的最大值。数据表示SEM±平均值，n = 15（进行了三次独立实验）。 请点击此处查看此图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议旨在为电动汽车在Ti表面上的功能化提供明确的说明。所提出的方法基于液滴铸造策略，这是一种物理吸附类型的功能化。关于Ti表面上的EV功能化，书目很差，尽管很少有研究表明在Ti10上固定EV具有不同的优势。无论如何，探索的一些策略包括生化结合8，聚合物截留9 或滴铸10。虽然通过共价键使用化学涂层可能会实现更均匀的涂层，并具有更高级别的功能化，但化学反应可能会损害EV的结构和功能15。与聚合物截留或生化结合相比，滴铸是一种简单且低成本的方法。
该协议中可以解决的一个重要点是EV源。在本研究中，EV是从PL获得的。然而，液滴铸造方法适用于任何类型的电动汽车，因为它基于物理相互作用。先前使用其他方法的研究在评估细胞培养的EV（如干细胞8，10 或machropages）的使用后呈现出积极的结果9。关于电动汽车的使用，对它们进行完整的表征非常重要。国际细胞外囊泡学会旨在确定大多数主要的EV参数，以确保在现场的可重复性12。其他研究已经描述了电动汽车表征的方法，因此在该协议中，我们没有详细说明所执行的电子显微镜和蛋白质印迹技术方案13。
通过滴铸实现Ti功能化的关键步骤是电动汽车物理吸附所允许的时间和条件。在我们提出的方案中，在真空条件下进行孵育，直到滴液完全干旱。通常需要2小时才能确保水在37°C和真空条件下蒸发。然而，正在功能化的植入物的数量可能会增加确保电动汽车在Ti上正确粘附所需的时间。在进行表征或功能研究之前，确保没有水留下是很重要的。然而，在文献中可以找到EV对Ti的功能化协议的变化。例如，已经探索了在4°C无真空条件下孵育过夜10。但是，在我们手中，与我们描述的完全干燥相比，使用这种方法导致的结果较差。
虽然在本方案中没有执行，但可以通过不同的方法来评估EV的功能化，除其他外，表面润湿性的变化可以通过测量表面上的水接触角来表征;以及通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱与光学显微镜耦合的涂层化学性质的变化。此外，电动汽车可以用特定的染料（如PKH26染料）染色，功能化的表面可以通过荧光显微镜成像。
总体而言，可以进行进一步的功能测试，以探索EV沉积在Ti上的成骨功能。一方面，通过共聚焦显微镜或酶活性进行的细胞粘附或生长测定可能是测试功能的第一种方法10。在本文中，我们将细胞毒性测定描述为植入物对细胞影响的首批方法之一。另一方面，PCR测定可用于确定在Ti盘上进行的细胞培养物中成骨标记物的基因表达8，9，10。此外，通过蛋白质印迹检测蛋白质也可以表明成骨特征，尽管这是一种半定量技术。其他蛋白质检测技术，如检测阵列或酶试剂盒，也可能是功能实验性能的良好方法9。另一种功能测定是通过钙黄绿素蓝染色测定钙沉积16。一旦体 外 功能得到证实，可以使用动物模具进行进一步的实验8。
总之，表面功能化允许改进生物材料的治疗设计。电动汽车与植入式生物材料的结合可以允许与改善生物材料的生物相容性和成骨特性相关的持续释放。重要的是要探索EV绑定的不同方法;因此，滴铸是未来研究的一个有趣的起点，旨在生产临床上可用的矫形器械。本文中提出的方案旨在为未来实验的性能提供简单且可重复的指导。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究由卡洛斯三世社会研究所资助，由欧洲社会基金和ERDF欧洲区域发展基金共同资助（MS16/00124;CP16/00124;PI17/01605）、Direcció General d'Investigació、Conselleria d'Investigació、Govern Balear （FPI/2046/2017）和PROJECTA JUNIOR DEL PROJECTE TALENT PLUS， construyendo SALUD， generando VALOR （JUNIOR01/18），由巴利阿里群岛的可持续旅游税资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
References
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), Basel, Switzerland. 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
