Summary
我々は、第3世代レンチウイルスベクターを用いた エキノコッカス顆粒症 のさまざまな発生段階における迅速な一過性形質導入技術について記載する。
Abstract
嚢胞性エキノコックス症または包虫症は、犬の腸内に生息する小さなサナダムシである エキノコッカス・グラニュローサス によって引き起こされる最も重要な人獣共通感染症の1つである。病因や疾患の制御・予防のメカニズムを理解するための応用遺伝学的研究が急務です。しかし、効果的な遺伝子評価システムの欠如は、 エキノコッカス 種を含むセストード寄生虫の機能遺伝学の直接的な解釈を妨げる。本研究は、 顆粒菌のメタセストードおよびストロビレーテッド形態におけるレンチウイルス遺伝子一過性形質導入の可能性を実証する。プロトスコレース(PSC)を胞状嚢胞から単離し、特定の二相性培養培地に移してストロビレー化ワームに発達させた。ワームを、形質導入プロセス制御としてHEK293T細胞と共に回収した第3世代レンチウイルスでトランスフェクトした。ストロビレーテッドワームにおいて24時間および48時間にわたって顕著な蛍光が検出され、 E. granulosusにおける一過性のレンチウイルス形質導入を示した。この研究は、サナダムシにおけるレンチウイルスベースの一過性形質導入の最初の試みを提示し、扁平虫生物学に関する実験的研究における潜在的な意味合いを持つ有望な結果を示す。
Introduction
嚢胞性エキノコックス症(CE)は、テニイ科1,2科内の小さなサナダムシであるエキノコッカス・グラニュローサスによって引き起こされる最も重要な蠕虫疾患の1つである。顆粒菌の免疫診断およびワクチン開発に関する広範な研究が行われている。しかし、寄生虫生物学の分子基盤に関する不十分な知識は、包虫症の診断、管理、予防に大きな限界をもたらす3,4,5,6。
近年、ゲノムシーケンシングおよびトランスクリプトーム法の開発により、いくつかの研究グループ7、8、9によって扁平虫に関する幅広い分子研究が行われている。しかしながら、寄生虫の世界では、寄生性扁平虫における遺伝子導入技術の進歩は、一部の原生動物に対して開発された再現性の高い一過性形質導入法と比較して依然として限られている10、11、12。
ウイルス送達システムの使用は、過去20年間にわたり、導入遺伝子送達および遺伝子/タンパク質調査のための不可欠なツールとして浮上してきました13。レンチウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染し、したがって、有糸分裂後細胞に感染することを可能にする14、15、16。最近の証拠は、哺乳類細胞にレンチウイルスベースの形質導入システムを使用することで、以前のノックイン/ノックダウン技術の限界のほとんどを克服する可能性を提供することを示しています。GFP発現などの適切な分子マーカーを有する発現レンチウイルスベクターの設計および構築については、以前に16に記載されている。そこで、我々は、顆粒菌のプロトスコレースおよびストロビレーテッドワームにおけるGFPレポーター遺伝子のレンチウイルス一過性形質導入を評価する。
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Protocol
本研究は、国立研究開発法人医薬研究開発機構および研究倫理審査委員会第958680号により承認されました。レンチウイルスはBSL-2生物として分類される。したがって、このプロトコルのすべての実験室培養手順は、滅菌実験室の実践を使用して実施され、NIHガイドラインに従って層流フードの下で実施された。 図1は 、異なる 顆粒菌 ステージに対する研究プロトコールの概略的提示を示す。
1.包虫嚢胞の収集
- 食肉処理場で日常的に屠殺された自然に感染した羊から肝臓の胞子嚢胞を集める。
- プロトスコレーシス(PSC)を吸引する前に、滅菌ガーゼと70%アルコールを使用して嚢胞表面を完全に滅菌する。
- 20〜50mLの包眠液を吸引して、滅菌された50mLの円錐形チューブに入れる。
- 排液後、鋭い刃で嚢胞を拭き取り、胚層を滅菌した50mL円錐形チューブに移し、短時間(〜2分間)振ってPSCの収集を増やす。
- PSCをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3~5倍洗浄します。
- 0.1%エオジン中のPSCを5分間観察し、光学顕微鏡下でPSCの生存率を決定した。培養に少なくとも95%の生存率を有するPSCを使用する。
- PSC沈殿物を2mLのペプシン(2mg/mL、pH2)で15〜20分間処理する。
- 個々のPSCを単離するには、PSC沈殿物をPBSに再懸濁し、2層の滅菌ガーゼを通して新しい滅菌50mL円錐管に通す。
メモ: 光学顕微鏡を使用して、50 μL の PSC 堆積物に対する 3 つのカウントの平均を計算します。その後の試験では、推定値を使用してPSC/μLを決定します。各胞嚢胞分離物は、PCRシーケンシング17 または高分解能融解曲線解析18などの分子的方法によるヌクレオチド多型に基づいて特徴付けられるべきである。
2.成虫を得るためのE.顆粒症のPSCの二相性栽培
注:単離されたPSCは、層流キャビネットクラスIIの下で無菌条件下で培養する必要があります。次のステップ19に進む前に、二相性培養培地の固相および液相を別々に調製する。
- 二相性培養培地を2相からなるように調製する。
- 固相の場合は 、10 mLのウシ血清を25 mLフラスコに加え、76°Cで20〜30分間凝固させます。
- 液相(修飾CMRL)に、熱不活化ウシ胎児血清(FCS)100mL、5%酵母エキス36mL、30%グルコース5.6mL(蒸留水中)、PBS中の5%イヌ胆汁1.4mL、CMRL-1066培地260mLに20mM HEPES緩衝液、および10mM NaHCO3を混合する。最後に、ペニシリン(100IU/mL)およびストレプトマイシン(100mg/mL)を混合物に加える。
- 10 mLの液相培地を各25cm2 培養フラスコに加える。
- 培養フラスコに約5,000個のPSCを加え、フラスコをCO2インキュベーター(37°C、5%CO2)に移します。
- 24〜48時間後、固相(ウシ血清)を含む新しいフラスコにPSCを移し、フラスコあたり同じ新鮮な液相培地を1mL加える。フラスコをCO2インキュベーター(37°C、5%CO2 )に移す。
- 5〜7日ごとに、培地の色の変化および分化したPSCの推定割合に基づいて、培地を新鮮な液相培地と交換する。
注:プロトスコレックは培養後の環境変化に迅速に反応し、そのほとんどは2〜3週間以内に分化します。栄養素の消費とプロトスコレーゼの成長と発達のために、培地のpHは変化し、その色はオレンジと黄色に変わります。
3. E. granulosusのPSCsの単相培養
- 単相培養が形質導入の24〜48時間前に行われることを確認してください。
- RPMIおよび10%ウシ胎児血清(FBS)を含む25cm2 培養フラスコ中で〜5,000個のPSCを培養する。
- フラスコをCO2インキュベーター(37°C、5%CO2)に移して使用するまで。
4. ウイルス産生および調製のための細胞培養
注:ヒト胚性腎臓293T(HEK293T)細胞は、ケルマーン医科学大学病理学幹細胞研究センターからベクター産生のために得られた。
- 5 ×105 個の HEK293T 細胞を、10% FBS、100 U/mL ペニシリン、および 100 μg/mL ストレプトマイシンを含む 5 mL の DMEM を含む25 cm2 フラスコに移します。
- HEK293T細胞を5%CO2中37°Cでインキュベートし、 48時間ごとにそれらを完全な培養培地に通液する。最後に、形質導入20に低継代HEK293T細胞を使用する。
5. 第3世代レンチウイルスベクターによるウイルスの作製と作製
注:レンチウイルスベクターpCDH513b(トランスファーベクター)およびPLPII、PLPI、およびPMD2G(ヘルパーベクター)を使用してGFPレポーター遺伝子を発現させた。 資料の表 および 補足図 S1 を参照してください。
- 1日目:
- 6ウェル培養プレート中のHEK293T細胞21をトリプシン処理した後、10%FBSを含む新鮮な抗生物質フリーDMEMで1ウェルあたり7×104細胞をシードする。
- リン酸カルシウム法による形質導入には、50%~60%のコンフルエント度で細胞を使用します。
- 2日目:
- 実験の2〜3時間前に細胞培養培地を 2%FBSを含む新鮮な抗生物質フリーDMEMと交換する。
- 1.5 mL チューブに、7 μg/μL pCDH513b (トランスファーベクター)、4 μg/μL PLPII、4 μg/μL PLPI、および 2 μg/μL PMD2G (ヘルパーベクター) を含む第 3 世代レンチウイルスプラスミドを混合します。
- HEPES緩衝液(0.28 M NaCl、0.05 M HEPES、および1.5 mMNa2HPO4;最適pH範囲、7.00-7.28)を422 μLの容量で混合物に加える。
- 混合物に16 μLの1%トリス-EDTA(TE)バッファーを加えます。
- チューブに 62 μL の 2.5 mM 塩化カルシウムを加え、よく混ぜます。
- 500 μL の 2x HEPES 緩衝生理食塩水 (HBS) を混合物に加え、パスツールピペットを使用して 1 ~ 2 分以内に滴ずつ滴下します 。半不透明な溶液が得られるまで穏やかに混合し、混合物を室温で20分間インキュベートする。
- 混合物を各プレートにゆっくりと加え、ゆっくりと円を描くように分配する。
- プレートを5%CO2 インキュベーター内で37°Cでインキュベートし、4〜6時間後に培地を 10%FBSを含む抗生物質フリーDMEMと交換する。
- 3日目:
- 一過性形質導入の成功と細胞生存率を倒立蛍光顕微鏡を用いて確認します。
- 4日目:
- 各ウェルの上清を採取して培養液からウイルスを採取し、使用時まで-70°Cで保存する。
注:回収されたレンチウイルスは、正確なトランスフェクションのために濃縮および滴定することができた22。
- 各ウェルの上清を採取して培養液からウイルスを採取し、使用時まで-70°Cで保存する。
6. ウイルスによる 顆粒菌 の異なる段階の一過性形質導入
- 1日目:
- 遺伝子導入には12ウェル培養プレートを使用してください。培養5×103~5×104HEK293T細胞を3連で、完全DMEM培地を内部基準とした。
- 150個の新鮮なPSCをRPMIおよび10%FBSで3連で培養する。
- 30個のストロビレートワームを3連で培養し、10%熱不活化FBSを含むDMEM中で培養する。
注:すべての形質導入培地は 抗生物質フリーでなければなりません。その過程で、HEK293T細胞、PSC、およびストロビレートワーム用の3つの無処理コントロールウェルを保管してください。 - 1 ×106 個のウイルスを 4 μg/mL トランスフェクション試薬 ( 材料表を参照) と混合して、HEK293T 細胞およびワームのさまざまな段階を形質導入します。
- 混合物を各プレートにゆっくりと加え、ゆっくりと円を描くように分配する。プレートをCO2 インキュベーター(37°C、5%CO2)中で4〜6時間インキュベートする。各サンプルの培地を同じ完全な培養培地と交換して、トランスフェクション試薬の毒性の影響を最小限に抑えます。
- 2日目:
- ステップ6.1.4~6.1.5を繰り返して、HEK293T細胞、PSC、ストロビレーテッドワームの一過性形質導入の効率を高めます。
- 細胞培地の種類に基づいて同じ培養条件でCO2インキュベーター内ですべてのプレートを24 〜48時間インキュベートします。
- 3日目:
- 蛍光顕微鏡を使用して、形質導入が成功したかどうかを確認します。
注:遺伝子導入手順では、PCR/qPCR20、23、 またはウェスタンブロッティング24 技術などのさらなる確認アッセイを使用することを検討してください。
- 蛍光顕微鏡を使用して、形質導入が成功したかどうかを確認します。
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Representative Results
ここでは、第3世代レンチウイルスベクターを用いた顆粒菌における迅速かつ効率的な一過性形質導入技術について説明する。我々は、以前に25、26に記載されるように、ストロビレーションされたワームを得るために、二相性培養培地中でPSCsを培養した。プロトスコレックは、インビトロで6週間後にストロビレーテッドワームに発達する。二相性培養培地では、浸潤性PSC(図2A)、浮浪性PSC(図2B)、および第1および第3のプログロチッド形成を伴うストロビレートワーム(図2C-E)を含む、異なる段階のE. granulosusが観察された。プロトスコレックおよび単相性および二相性培養物から得られたストロビレートワームを、それぞれ、GFP発現レンチウイルスでトランスフェクトした(図3)。自家蛍光の影響を回避するために、顕微鏡観察を3つのサンプル群すべてにおけるバックグラウンド蛍光と比較し、このバックグラウンドレベルを超えるすべてのサンプルをトランスフェクトしたとみなした。
各処理について、視野照明を調整し、シャッターを下げて、対照サンプル中の自家蛍光発光の可能性を防止しました。次に、レンチウイルスベクター処理サンプルを調べたところ、黒視野に対する緑色発光が有効な一過性形質導入と考えられていました。HEK293T細胞(一過性形質導入プロセス制御)はGFPを明瞭に発現した(図3D)。成虫のワームは、外皮層で最も明確にGFPを発現した(図3F)。しかしながら、PSCは48時間後にGFP発現のレベルがやや低いことを示した。PSCの周囲のいくつかの嚢胞液残基および/または胚層破片は、トランスフェクトされたサンプルのバックグラウンドでいくつかの蛍光を引き起こした。HEK293T細胞およびストロビレーテッドワームにおける蛍光の強度は、24時間および48時間後に増加した(PSCにおいて軽微な変化が観察された)。
図1:研究プロトコールの概略プレゼンテーション。略語: PSC = プロトスコレース。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:二相性培養培地中の エキノコッカス・グラニュローサス の異なる段階。 (A)移入されたPSC、(B)エベジネーションされたPSC、(C、D)ストロビレーションの過程にあるワーム、(E)第3のプログロッティッド形成を伴うストロビレーションされたワーム、(F)培養培地中のストロビレーションの異なる段階にあるワーム。スケール バー = 200 μm 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:光および蛍光顕微鏡におけるエキノコッカス顆粒症および対照細胞株の異なる段階の一過性形質導入(A、D)形質導入プロセス制御としてのHEK293T細胞、(B、E)プロトスコレース、および(C、F)ストロビレートワーム。(G, H, I)混合光と花の顕微鏡検査。スケール バー = 50 μm、100 μm、および 500 μm です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:pCDH−CMV−MCS−EF1−グリーンプロcDNAクローニングおよび発現ベクターのマップ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
線虫とプラチヘルミンテス生物学の分子基盤を理解することは、人獣共通感染症の寄生虫の病原性を理解するために不可欠です27。効果的な遺伝子評価システムの欠如は、エキノコッカス種12,27を含むセストード寄生虫の機能遺伝学の直接的な解釈に対する大きな障害である。本研究は、E. Granulousの一過性形質導入におけるレンチウイルスの優れた可能性を実証する。
レンチウイルス形質導入は、一過性形質導入の使用の単純さと速度を安定な細胞株の強い発現と組み合わせ、哺乳動物細胞に導入遺伝子を送達する28。この研究の主な目的は、将来のエキノコックス症研究において重要となるレンチウイルスベクター形質導入のプロセスを説明することでした。
このプロトコルでは、特定の重要な点に注意する必要があります。培養培地中の抗生物質の欠落のために厳格な滅菌ワークフロー条件が観察されるべきであり、それなしでは細菌および真菌の汚染が24時間後に期待され得る。微生物汚染は寄生虫の運動性と生存率を低下させ、トランスフェクトされたサンプルと対照サンプルの両方が72時間後に失われます。
Platyhelminthesの生活環における適切な段階および適切な培養条件を選択することは、遺伝子導入を成功させるための鍵である12,27。我々は、メタセストードおよびストロビレート段階でレンチウイルス形質導入法を試験した。結果は、ストロビレーションされたワームがPSCよりも遺伝子の一過性形質導入に対してより応答性が高いことを示し、これはストロビレートされた形態の広範な外皮構造の結果である可能性がある。しかしながら、レンチウイルス形質導入の性質に起因して、多細胞PSCおよびストロビレートワームにおける蛍光強度は、典型的には、単層HEK293T細胞26よりもはるかに低い。
エキノコッカスを扁平虫の新しいモデルとして使用して生命現象を研究する可能性は長い間議論されてきました。したがって、モデル生物としてのエキノコッカス生物学のより良い理解は、幹細胞研究を拡大し、他のカモノハシの遺伝子発現および進化生物学を調節するのに有用であり得る8,29,30,31,32。エキノコッカスおよび様々な寄生および自由生活扁平虫モデルシステムのためのゲノムおよびトランスクリプトームレベルでの応用遺伝学的研究が緊急に必要とされている。したがって、サナダムシの効果的な遺伝子導入プロセスの開発は、ウイルスベースの遺伝子ノックインやCRISPR-Cas媒介遺伝子編集などの新しい技術への道を開く32,33。この研究は、サナダムシモデルにおけるレンチウイルスの形質導入を提示し、扁平虫生物学に潜在的な意味を持つ有望な結果を示している。しかし、この方法を改善し、将来の実験へのこの技術の適用可能性を開発するには、より詳細な研究が必要です。
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Disclosures
著者らは、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この出版物で報告された研究は、イランのテヘランにある国立医療研究開発研究所(NIMAD)の賞番号958680の下でエリート研究者助成金委員会によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
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