Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

התמרה חולפת של הצורות הסטרוביליות של אכינוקוקוס גרנולוסוס

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/62783
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2, 4, 2
1Student Research Committee, School of Medicine, Kerman University of Medical Sciences, 2Research Center for Hydatid Disease in Iran, Kerman University of Medical Sciences, 3Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Kurdistan University of Medical Sciences, 4State Key Laboratory for Zoonotic Diseases, Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Veterinary Medicine, Jilin University

Summary

אנו מתארים טכניקת התמרה חולפת מהירה בשלבים התפתחותיים שונים של Echinococcus granulosus באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי.

Abstract

אכינוקוקוזיס ציסטי או מחלה הידאטית היא אחת המחלות הטפיליות הזואונוטיות החשובות ביותר הנגרמות על ידי Echinococcus granulosus, תולעת סרט קטנה הניצבת במעי של כלבים. יש צורך דחוף במחקר גנטי יישומי כדי להבין את המנגנונים של פתוגנזה ובקרת מחלות ומניעתן. עם זאת, היעדר מערכת יעילה להערכת גנים מעכב פרשנות ישירה של הגנטיקה התפקודית של טפילי צסטודה, כולל המינים Echinococcus . המחקר הנוכחי מדגים את הפוטנציאל של התמרת גנים לנטי-ויראליים חולפים בצורות המטא-אקסטודות והסטרוביליות של E. granulosus. פרוטוסקולקסים (PSCs) בודדו מציסטות הידאטידיות והועברו למדיה ספציפית של תרביות דו-פאזיות כדי להתפתח לתולעים סטרוביליות. התולעים עברו טרנספקציה עם נגיף לנטי מהדור השלישי שנקטף, יחד עם תאי HEK293T כבקרת תהליך התמרה. פלואורסצנציה בולטת זוהתה בתולעים הסטרובינציות במשך 24 שעות ו-48 שעות, מה שמעיד על התמרת לנטי-וירוס חולפת ב-E. granulosus. עבודה זו מציגה את הניסיון הראשון להתמרה חולפת מבוססת לנטי-וירוס בתולעים מדגימה את התוצאות המבטיחות עם השלכות פוטנציאליות במחקרים ניסיוניים על ביולוגיה של תולעים שטוחות.

Introduction

אכינוקוקוזיס ציסטי (CE) היא אחת ממחלות הלמינת החשובות ביותר הנגרמות על ידי Echinococcus granulosus, תולעת סרט קטנה בתוך המשפחה Taeniidae 1,2. נערכו מחקרים נרחבים על פיתוח אימונו-דיאגנוסטי וחיסונים עבור E. granulosus. עם זאת, ידע לקוי על הבסיס המולקולרי של הביולוגיה של הטפילים מציב מגבלות משמעותיות באבחון, ניהול ומניעה של מחלה היידטית 3,4,5,6.

בשנים האחרונות, בשל פיתוח שיטות ריצוף גנום ותעתיק, נערכו מגוון רחב של מחקרים מולקולריים על תולעים שטוחות על ידי מספר קבוצות מחקר 7,8,9. עם זאת, בעולם הטפילים, ההתקדמות בטכנולוגיית העברת הגנים בתולעים שטוחות טפיליות עדיין מוגבלת בהשוואה לשיטות ההתמרה הארעיות הניתנות לשחזור שפותחו עבור פרוטוזואה מסוימת 10,11,12.

השימוש במערכות לידה ויראליות התגלה ככלי חיוני להעברת טרנסגנים ולחקירות גנים/חלבונים בשני העשורים האחרונים13. נגיף הלנטי מדביק גם תאים מתחלקים וגם תאים שאינם מתחלקים, ובכך מאפשר להדביק תאים פוסט-מיטוטיים 14,15,16. עדויות עדכניות מצביעות על כך ששימוש במערכת התמרה מבוססת לנטי-וירוס בתאי יונקים מציע את הפוטנציאל להתגבר על רוב המגבלות של טכניקות קודמות של דפיקה/הפלה. התכנון והבנייה של וקטורים לנטי-ויראליים של ביטוי עם סמנים מולקולריים מתאימים, כגון ביטוי GFP, תוארו בעבר16. לכן, אנו מעריכים התמרה חולפת לנטי-ויראלית של גן מדווח GFP בפרוטוסקולקסים ובתולעים הסטרובילות של E. granulosus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי המכון הלאומי לפיתוח מחקר רפואי והוועדה לבחינת אתיקה מחקרית, מס '958680. Lentiviruses מסווגים כאורגניזמים BSL-2; לפיכך, כל נהלי תרבית המעבדה בפרוטוקול זה בוצעו באמצעות שיטות מעבדה סטריליות ונערכו תחת מכסה מנוע זרימה למינרי על פי הנחיות NIH. איור 1 מדגים הצגה סכמטית של פרוטוקול המחקר עבור שלבי E. granulosus השונים.

1. איסוף ציסטות הידאטיות

  1. אספו ציסטות כבדות מכבשים נגועות באופן טבעי שנשחטו באופן שגרתי באבטואר.
  2. לעקר לחלוטין את משטח הציסטה באמצעות גזה סטרילית ו-70% אלכוהול לפני שאיפת הפרוטוסקולקים (PSCs).
  3. לשאוף 20-50 מ"ל של נוזל hydatid החוצה לתוך צינורות חרוטיים סטריליים 50 מ"ל.
  4. לאחר הניקוז, מכתימים את הציסטה עם להב חד, מעבירים את שכבת הנביט לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל, ומנערים אותה לתקופה קצרה (כ-2 דקות) כדי להגדיל את אוסף ה-PSCs. מעבירים את שכבת הנביט לצינור חדש של 1.5 מ"ל לאפיון מולקולרי.
  5. שטפו את ה-PSCs פי 3-5 עם מי מלח עם מאגר פוספט (PBS).
  6. שימו לב ל-PSC ב-0.1% eosin במשך 5 דקות כדי לקבוע את כדאיות ה-PSC תחת מיקרוסקופ אור. השתמש בתשדירי שירות עם לפחות 95% כדאיות לתרבות.
  7. טפלו בזרז PSC עם 2 מ"ל של פפסין (2 מ"ג/מ"ל, pH 2) למשך 15-20 דקות.
  8. כדי לבודד PSCs בודדים, החיזרו את משקעי ה-PSC ב-PBS והעבירו אותו דרך שתי שכבות של גזה סטרילית לתוך צינור חרוטי סטרילי חדש של 50 מ"ל.
    הערה: חשב את הממוצע של שלוש ספירות על 50 μL של משקעי PSC באמצעות מיקרוסקופ אור. עבור ניסויים מאוחרים יותר, השתמש בערך המשוער כדי לקבוע PSCs/μL. יש לאפיין כל ציסטה מבודדת הידאטיד על סמך פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בשיטות מולקולריות, כגון ריצוף PCR17 או ניתוח עקומת התכה ברזולוציה גבוהה18.

2. טיפוח דו-פאזי של PSCs של E. granulosus כדי להשיג תולעים בוגרות

הערה: PSCs מבודדים צריכים להיות מתורבתים בתנאים סטריליים תחת ארון זרימה למינרי מחלקה II. הכן את השלבים המוצקים והנוזליים של מדיום התרבית הדו-פאזית בנפרד לפני שתמשיך לשלבים הבאים19.

  1. הכינו את מדיום התרבות הדו-פאזית כך שיכלול שני שלבים.
    1. עבור השלב המוצק, להוסיף 10 מ"ל של סרום בקר לבקבוקון 25 מ"ל ולהשאיר אותו coagulate ב 76 °C (76 °C ) למשך 20-30 דקות.
    2. עבור השלב הנוזלי (CMRL שעבר שינוי), יש לערבב 100 מ"ל של סרום עגל עוברי מומת בחום (FCS), 36 מ"ל של 5% תמצית שמרים, 5.6 מ"ל של 30% גלוקוז (במים מזוקקים), 1.4 מ"ל של 5% מרה לכלבים ב-PBS, 20 mM HEPES buffer ו-10 mM NaHCO3 ב-260 מ"ל של CMRL-1066 בינוני. לבסוף, יש להוסיף לתערובת פניצילין (100 יחב"ל/מ"ל) וסטרפטומיצין (100 מ"ג/מ"ל).
  2. הוסיפו 10 מ"ל של מדיום הפאזה הנוזלית לכל בקבוקון תרביתבגודל 25 ס"מ 25 ס"מ.
  3. הוסיפו כ-5,000 PSCs לבקבוקון התרבית והעבירו את הבקבוקון לחממת CO2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  4. לאחר 24-48 שעות, מעבירים את ה-PSCs לבקבוקון חדש עם הפאזה המוצקה (סרום בקר) ומוסיפים 1 מ"ל של אותו מדיום פאזה נוזלית טרייה לכל בקבוקון. העבר את הצלוחיות לחממת CO2 (37 °C , 5% CO2).
  5. כל 5-7 ימים, החליפו את המדיום במדיום פאזה נוזלית טרייה בהתבסס על שינויים בצבע מדיום התרבית והשיעור המשוער של PSCs מובחנים.
    הערה: פרוטוסקולקים מגיבים במהירות לשינויים סביבתיים לאחר שעברו תרבית, ורובם עוברים התמיינות תוך 2-3 שבועות. בשל צריכת החומרים המזינים והצמיחה וההתפתחות של פרוטוסקולקים, ה- pH של מדיום התרבית משתנה, וצבעו משתנה לכיוון כתום וצהוב.

3. טיפוח מונופאזי של PSCs של E. granulosus

  1. ודא כי טיפוח מונופאזי נעשה 24-48 שעות לפני ההעתקה.
    1. תרבית כ-5,000 PSCs בבקבוקון תרבית בגודל25 ס"מ עם RPMI ו-10% סרום בקר עוברי (FBS).
    2. מעבירים את הצלוחיות לחממת CO2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) עד לשימוש.

4. תרבית תאים לייצור והכנה של וירוסים

הערה: תאי כליה עובריים אנושיים 293T (HEK293T) התקבלו לייצור וקטורים מהמרכז לחקר פתולוגיה ותאי גזע, אוניברסיטת קרמן למדעי הרפואה.

  1. העבר 5 × 105 תאי HEK293Tלבקבוק בגודל 25 ס"מ המכיל 5 מ"ל של DMEM עם 10% FBS, פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין.
  2. דגירה של תאי HEK293T בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 והעברו אותם במדיום התרבית השלם כל 48 שעות. לבסוף, השתמש בתאי HEK293T בעלי מעבר נמוך עבור התמרה20.

5. ייצור והכנה של הנגיף עם וקטורים לנטיוויראליים מהדור השלישי

הערה: וקטור lentivirus pCDH513b (וקטור העברה) ו- PLPII, PLPI ו- PMD2G (וקטורים עוזרים) שימשו לביטוי הגן של כתב GFP. ראה טבלת החומרים ואיור משלים S1.

  1. יום 1:
    1. לאחר התנסות בתאי HEK293T21 בצלחות תרבית של 6 בארות, זרע 7 × 104 תאים לכל באר עם DMEM טרי ללא אנטיביוטיקה המכיל 10% FBS.
    2. השתמש בתאים ב-50%-60% מפגש להתמרה בשיטת סידן פוספט.
  2. יום 2:
    1. החליפו את מדיום תרביות התאים 2-3 שעות לפני הניסוי ב-DMEM טרי ללא אנטיביוטיקה המכיל 2% FBS.
    2. בצינור של 1.5 מ"ל, ערבבו את הדור השלישי של הפלסמידים הלנטי-ויראליים, כולל 7 מיקרוגרם/μL pCDH513b (וקטור העברה), 4 מיקרוגרם/μL PLPII, 4 מיקרוגרם/μL PLPI ו-2 מיקרוגרם/μL PMD2G (וקטורים עוזרים).
    3. הוסף מאגר HEPES (0.28 M NaCl, 0.05 M HEPES ו- 1.5 mM Na2HPO4; טווח pH אופטימלי, 7.00-7.28) לתערובת לנפח של 422 μL.
    4. הוסיפו לתערובת 16 μL של מאגר Tris-EDTA (TE) של 1%.
    5. מוסיפים 62 μL של 2.5 mM סידן כלורי לצינורות ומערבבים היטב.
    6. הוסיפו לתערובת 500 μL של 2x מי מלח עם חציצה של HEPES (HBS), טיפה אחר טיפה, תוך 1-2 דקות באמצעות פיפטת פסטר. מערבבים בעדינות עד לקבלת תמיסה אטומה למחצה, ודוגרים את התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. מוסיפים את התערובת לכל צלחת באיטיות ומפיצים אותה בתנועות מעגליות איטיות.
    8. דגירו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 של 5% והחליפו את המדיום לאחר 4-6 שעות ב-DMEM ללא אנטיביוטיקה המכיל 10% FBS.
  3. יום 3:
    1. אשרו התמרה חולפת מוצלחת ואת יכולת הכדאיות של התא באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
  4. יום 4:
    1. קוצרים וירוסים ממדיום התרבית על ידי איסוף הסופרנאטנט של כל באר ומאחסנים אותם בטמפרטורה של -70 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: ניתן היה לרכז את נגיפי הלנטי-וירוסים שנקטפו ולצמצם אותם לצורך טרנספקציה מדויקת22.

6. התמרה חולפת של שלבים שונים של E. granulosus עם הנגיף

  1. יום 1:
    1. השתמשו בצלחת תרבית של 12 בארות להעברת גנים. תרבית 5 × 103-5 × 104 תאי HEK293T במשולש, עם מדיום DMEM שלם כהתייחסות הפנימית.
    2. תרבות 150 PSCs טריים במשולש ב- RPMI ו- 10% FBS.
    3. תרבית 30 תולעים טרובילציה במשולש ב-DMEM המכילה 10% FBS מומת חום.
      הערה: כל אמצעי ההעתקה חייב להיות ללא אנטיביוטיקה. שמור שלוש בארות בקרה שאינן מטופלות עבור תאי HEK293T, PSCs ותולעים סטרוביליות בתהליך.
    4. הכינו תערובת של 1 ×-106 וירוסים עם ריאגנט טרנספקציה של 4 מיקרוגרם/מ"ל (ראו טבלת החומרים) כדי להתמר את תאי HEK293T ואת השלבים השונים של התולעת.
    5. מוסיפים את התערובת לכל צלחת באיטיות ומפיצים אותה בתנועות מעגליות איטיות. דגירה של הצלחות במשך 4-6 שעות בחממת CO2 (37 °C (37 °C (37 °C), 5% CO2). החלף את המדיום עבור כל דגימה באותו מדיום תרבית שלם כדי למזער את ההשפעות הרעילות של מגיב הטרנספקציה.
  2. יום 2:
    1. חזור על שלבים 6.1.4-6.1.5 כדי להגביר את היעילות של התמרה חולפת עבור תאי HEK293T, PSCs ותולעים סטרוביטיביות.
    2. דגירה של כל הלוחות למשך 24-48 שעות בחממת CO2 עם אותם תנאי תרבית המבוססים על סוג המדיה התאית.
  3. יום 3:
    1. בדוק אם ההעתקה מצליחה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
      הערה: שקול להשתמש במבחנים מאשרים נוספים כמו PCR/qPCR20,23 או טכניקות כתםמערביות 24 בהליך העברת הגנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, אנו מתארים טכניקת התמרה ארעית מהירה ויעילה ב- E. granulosus על ידי שימוש בווקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי. תרבנו PSCs במדיום תרבית דו-פאזית כדי להשיג תולעים סטרוביליות, כפי שתואר קודם לכן25,26. פרוטוסקולקים מתפתחים לתולעים סטרוביליות לאחר 6 שבועות במבחנה. שלבים שונים של E. granulosus נצפו במדיום התרבית הדו-פאזית, כולל PSCs מבודדים (איור 2A), PSCs שהתאדו (איור 2B) ותולעים סטרוביליות עם היווצרות פרוגלוטיד ראשונה ושלישית (איור 2C-E). פרוטוסקולקסים ותולעים סטרוביליות שהתקבלו מתרבויות מונופאזיות וביפאזיות, בהתאמה, הועתקו עם נגיפי לנטי-וירוסים המבטאים GFP (איור 3). כדי להימנע מהשפעות אוטופלואורסצנטיות, הושוו תצפיות מיקרוסקופיות עם הפלואורסצנציה ברקע בכל שלוש קבוצות הדגימות, וכל הדגימות מעל רמת רקע זו נחשבו לתצפית טרנספקטית.

התאמנו את תאורת השדה והורדנו את התריס כדי למנוע כל פליטה אפשרית של פלואורסצנציה אוטומטית בדגימות הבקרה עבור כל טיפול. לאחר מכן בדקנו דגימות שטופלו בווקטורים לנטי-ויראליים, שבהן פליטת אור ירוק כנגד שדה שחור נחשבה להתמרה חולפת יעילה. תאי HEK293T - בקרת תהליך התמרה חולף - GFP המבוטא בבירור (איור 3D). התולעים הבוגרות ביטאו את ה-GFP בצורה המובהקת ביותר בשכבה הטגומנטלית (איור 3F); עם זאת, PSCs הדגימו רמה מעט נמוכה יותר של ביטוי GFP לאחר 48 שעות. חלק משאריות נוזל הציסטה ו/או פסולת שכבת הנביטה סביב PSCs גרמו לפלואורסצנציה מסוימת ברקע בדגימות המועברות. עוצמת הפלואורסצנציה בתאי HEK293T ובתולעים סטרוביליות עלתה לאחר 24 שעות ו-48 שעות (נצפו שינויים קלים ב-PSCs).

Figure 1
איור 1: הצגה סכמטית של פרוטוקול המחקר. קיצור: PSCs = protoscoleces. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: השלבים השונים של Echinococcus granulosus במדיום התרבות הדו-פאזית. (A) PSCs מאונים, (B) PSCs שהתאדו, (C, D) תולעים בתהליך של סטרוביציה, (E) תולעים סטרוביליות עם היווצרות פרוגלוטיד שלישית, (F) תולעים בשלבים שונים של סטרוביציה במדיום התרבית. סרגלי קנה מידה = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: התמרה חולפת של שלבים שונים של Echinocococcus granulosus וקו תאי הבקרה במיקרוסקופיה של אור ופלואורסצנציה. (ז, ח, א) מיקרוסקופיה מעורבת של אור ופלורסנט. סרגלי קנה מידה = 50 μm, 100 μm ו- 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים S1: מפה של pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA שיבוט וקטור ביטוי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הבנת הבסיס המולקולרי של נמטודות וביולוגיה של פלטיהלמינתס חיונית להבנת הפתוגניות של טפילים זואונוטיים27. היעדר מערכת יעילה להערכת גנים מהווה מכשול מרכזי לפרשנות ישירה של גנטיקה פונקציונלית של טפילי צסטודה, כולל מיני אכינוקוק 12,27. המחקר הנוכחי מדגים את הפוטנציאל המצוין של נגיף לנטי בהתמרה ארעית E. granulosus.

התמרה לנטי-ויראלית משלבת את פשטות השימוש והמהירות של התמרה חולפת עם ביטוי חזק של קווי תאים יציבים כדי להעביר טרנסגנים לתאי יונקים28. המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה להמחיש את התהליך של התמרה וקטורית לנטי-ויראלית, שתהיה קריטית במחקר עתידי של אכינוקוקוזיס.
יש לציין נקודות קריטיות ספציפיות בפרוטוקול זה. יש להקפיד על תנאי זרימת עבודה סטריליים מחמירים עקב השמטת אנטיביוטיקה במדיום התרבית, שבלעדיה ניתן לצפות לזיהום חיידקי ופטרייתי לאחר 24 שעות. זיהום מיקרוביאלי מפחית את תנועתיותם וכדאיותם של הטפילים, וגם דגימות שעברו ניתוח והן דגימות בקרה יאבדו לאחר 72 שעות.

בחירת השלבים המתאימים במחזור החיים של Platyhelminthes ותנאי תרבית מתאימים הם המפתח להתמרת גנים מוצלחת12,27. בדקנו את שיטת ההתמרה ה-lentiviral שלנו בשלבים המטא-אקסטודיים והסטרוביטיביים. התוצאות הראו כי התולעים הטרובילטיות היו מגיבות יותר להתמרה חולפת של הגן מאשר ה-PSCs, מה שעשוי להיות תוצאה של המבנה הטגומנטלי הנרחב בצורות הסטרובילציה. עם זאת, בשל האופי של התמרה לנטי-ויראלית, עוצמת הפלואורסצנציה ב-PSCs הרב-תאיים ובתולעים הסטרובילות היא בדרך כלל נמוכה בהרבה מאשר בתאי HEK293Tחד-שכבתיים 26.

הפוטנציאל של שימוש באכינוקוק כמודל חדש בתולעים שטוחות לחקר תופעות ביולוגיות נדון זה מכבר. לכן, הבנה טובה יותר של הביולוגיה של אכינוקוק כאורגניזם מודל יכולה להיות שימושית להרחבת המחקר בתאי גזע ולוויסות ביטוי הגנים והביולוגיה האבולוציונית של פלטילמינתים אחרים 8,29,30,31,32. יש צורך דחוף במחקר גנטי יישומי ברמות הגנומיות והתעתיקיות עבור אכינוקוק ומערכות שונות של מודלים של תולעים שטוחות טפיליות וחופשיות. לכן, פיתוח תהליך יעיל להעברת גנים עבור תולעי סרט סולל את הדרך לטכניקות חדשות, כגון גנים מבוססי וירוסים או עריכת גנים בתיווך CRISPR-Cas32,33. עבודה זו מציגה התמרה לנטי-ויראלית במודל של תולעי סרט ומדגימה תוצאות מבטיחות, עם השלכות פוטנציאליות על הביולוגיה של תולעים שטוחות. עם זאת, נדרשים מחקרים מעמיקים יותר כדי לשפר את השיטה ולפתח את הישימות של טכניקה זו לניסויים עתידיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי ועדת מענקי חוקרי העילית תחת פרס מספר 958680 מטעם המכון הלאומי לפיתוח מחקר רפואי (NIMAD), טהראן, איראן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well culture plates SPL Life Sciences 30012
25 cm2 culture flask SPL Life Sciences 70325
6-well culture plates SPL Life Sciences 30006
Calcium chloride Sigma-Aldrich C4901-500G Working concentration: 2.5 mM
CMRL 1066 medium Thermo Fisher Scientific 11530037
CO2 incubator memmert ICO150
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
DMEM Life Technology 12100046
Dog bile Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter
Eosin Y Sigma-Aldrich E4009-5G prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test
Fetal Bovine Serum (FBS) DNAbiotech DB9723-100ml Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C)
Fetal Calf Serum (FCS) DNAbiotech DB9724-100ml Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C)
HEK293T cells BONbiotech BN_0012.1.14 Human embryonic kidney 293T
HEPES buffered saline (HBS) Sigma-Aldrich 51558-50ML 2x concentrate
Inverted fluorescence microscope OLYMPUS IX51
Penicillin Sigma-Aldrich P3032-10MU Working concentration: 100 IU/mL
Pepsin Roche 10108057001 Working concentration: 2 mg/mL, pH 2
Phosphate-buffered saline (PBS) DNAbiotech DB0011 This reagent solve in less than 1 min in D.W
Polybrene (Transfection reagent) Sigma-Aldrich TR-1003-G
RPMI medium BioIdea BI-1006-05
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761-1KG
Streptomycin Sigma-Aldrich S9137-25G Working concentration: 100 μg/mL
Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) SBI System Biosciences (BioCat GmbH) CD513B-1-SBI Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) Invitrogen (Life Technologies) K4975-00 Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) Addgene Plasmid 12259 Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Tris/EDTA Buffer (TE) DNAbiotech DB9713-100ml
Trypsin Sigma-Aldrich T9935-50MG 1x working solutions (pH 7.4–7.6)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315 (2017).
  2. Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020 (2021).
  3. Eckert, J., Thompson, R. C. A. Historical aspects of echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 1-64 (2017).
  4. Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213 (2017).
  5. Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q. Echinococcosis: control and prevention. Advances in Parasitology. 95, 55 (2016).
  6. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315 (2017).
  7. Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
  8. Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
  9. Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
  10. Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
  11. Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
  12. Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P. Transfection of Platyhelminthes. BioMed Research International. 2015, 206161 (2015).
  13. Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
  14. Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. Establishing transgenic schistosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230 (2011).
  15. Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T. Lentiviral transduction of microglial cells. Glia. 50 (1), 48-55 (2005).
  16. Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
  17. Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
  18. Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
  19. Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190 (2020).
  20. Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
  21. Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755 (2008).
  22. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1499 (2009).
  23. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031 (2012).
  24. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
  25. Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
  26. Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  27. Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
  28. Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991 (2018).
  29. Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
  30. Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
  31. Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).
  32. Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
  33. Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496 (2015).

Tags

גנטיקה גיליון 187 Lentivirus התמרה חולפת Echinococcus granulosus GFP metacestode protoscoleces
התמרה חולפת של הצורות הסטרוביליות של <em>אכינוקוקוס גרנולוסוס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohammadi, M. A., Afgar, A., Faridi, … More

Mohammadi, M. A., Afgar, A., Faridi, A., Mousavi, S. M., Derakhshani, A., Borhani, M., Fasihi Harandi, M. Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus. J. Vis. Exp. (187), e62783, doi:10.3791/62783 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter