Summary
我们使用第三代慢病毒载体描述了粒状 棘球绦虫 不同发育阶段的快速瞬时转导技术。
Abstract
囊性棘球蚴病或包虫病是由 粒状棘球绦虫 引起的最重要的人畜共患寄生虫病之一，棘球绦虫是一种藏耙在犬科动物肠道中的小绦虫。迫切需要应用遗传学研究来了解发病机制和疾病控制和预防。然而，缺乏有效的基因评估系统阻碍了对囊寄生虫（包括 棘球绦虫 属）的功能遗传学的直接解释。本研究证明了慢病毒基因瞬时转导在 颗粒埃马氏菌的元切除和杂化形式中的潜力。从包虫囊肿中分离出原结肠（PSC）并转移到特定的双相培养基中以发育成蠕动的蠕虫。用收获的第三代慢病毒以及HEK293T细胞转染蠕虫作为转导过程对照。在24 h和48 h的蠕动蠕虫中检测到明显的荧光，表明 颗粒埃布氏菌的瞬时慢病毒转导。这项工作首次尝试了绦虫中基于慢病毒的瞬时转导，并展示了对扁虫生物学实验研究具有潜在意义的有希望的结果。
Introduction
囊性棘球蚴病（CE）是由 粒状棘球绦 虫引起的最重要的蠕虫疾病之一，颗粒棘球绦虫是绦虫科1，2中的一种小型绦虫。已经对 颗粒埃布氏菌 的免疫诊断和疫苗开发进行了广泛的研究。然而，对寄生虫生物学分子基础的了解不足对包虫病的诊断、管理和预防造成了重大限制3，4，5，6。
近年来，由于基因组测序和转录组学方法的发展，几个研究小组7，8，9对扁虫进行了广泛的分子研究。然而，在寄生虫世界中，与为某些原生动物10，11，12开发的高度可重复的瞬时转导方法相比，寄生扁虫的基因转移技术进展仍然有限。
在过去二十年中，病毒递送系统的使用已成为转基因递送和基因/蛋白质研究的重要工具13.慢病毒感染分裂和非分裂细胞，从而有可能感染有丝分裂后细胞14，15，16。最近的证据表明，在哺乳动物细胞中使用基于慢病毒的转导系统有可能克服以前敲入/敲低技术的大部分局限性。具有适当分子标记（例如GFP表达）的表达慢病毒载体的设计和构建在前面已经描述过16。因此，我们评估 了颗粒埃马氏菌原结肠和蠕动蠕虫中GFP报告基因的慢病毒瞬时转导。
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Protocol
本研究由国家医学研究发展研究所和研究伦理审查委员会批准，编号：958680。慢病毒被归类为BSL-2生物;因此，该协议中的所有实验室培养程序均使用无菌实验室实践进行，并根据NIH指南在层流罩下进行。 图1 显示了不同 颗粒芽孢杆菌 阶段的研究方案的示意图。
1. 收集包虫囊肿
- 从屠宰场经常屠宰的自然感染的绵羊中收集肝脏包虫囊肿。
- 在吸出原结肠（PSC）之前，使用无菌纱布和70%酒精完全灭菌囊肿表面。
- 将 20-50 mL 包蒂液吸出到无菌的 50 mL 锥形管中。
- 排出后，用锋利的刀片吸出囊肿，将生发层转移到无菌的50 mL锥形管中，并短时间（约2分钟）摇动以增加PSC的收集。
- 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤PSC 3-5x。
- 在0.1%曙红中观察PSC5分钟，以确定光学显微镜下的PSC活力。使用培养存活率至少为 95% 的 PSC。
- 用2毫升胃蛋白酶（2毫克/毫升，pH 2）处理PSC沉淀15-20分钟。
- 为了分离单个PSC，将PSC沉淀物重悬于PBS中，并将其通过两层无菌纱布进入新的无菌50 mL锥形管中。
注意：使用光学显微镜计算50μL PSC沉积物上三次计数的平均值。对于后续试验，使用估计值确定 PSC/μL。每个包虫囊肿分离物应通过分子方法基于核苷酸多态性进行表征，例如PCR测序17 或高分辨率熔解曲线分析18。
2. 双相培养颗粒蚜虫PSC 以获得成虫
注意：分离的 PSC 应在层流室 II 类的无菌条件下培养。在继续下一步19之前，分别制备双相培养基的固相和液相。
- 准备双相培养基，使其由两个阶段组成。
- 对于固相， 将10mL牛血清加入25mL烧瓶中，并使其在76°C下凝固20-30分钟。
- 对于液相 （修饰的CMRL），将100毫升热灭活胎牛血清（FCS），36毫升5%酵母提取物，5.6毫升30%葡萄糖（蒸馏水），PBS中1.4毫升5%狗胆汁，20毫升HEPES缓冲液和10毫升NaHCO3 混合在260毫升CMRL-1066培养基中。最后，在混合物中加入青霉素（100 IU / mL）和链霉素（100mg / mL）。
- 向每个 25cm 2 培养瓶中加入 10 mL 液相培养基。
- 向培养瓶中加入约5，000个PSC，并将烧瓶转移到CO2 培养箱（37°C，5%CO2）。
- 24-48小时后，将PSC转移到具有固相（牛血清）的新烧瓶中，并在每个烧瓶中加入1mL相同的新鲜液相培养基。将烧瓶转移到CO2 培养箱（37°C，5%CO2）中。
- 每隔5-7天，根据培养基颜色的变化和分化PSC的估计比例，用新鲜的液相培养基替换培养基。
注意：原鳞翅目动物在培养后对环境变化反应迅速，其中大多数在2-3周内分化。由于营养物质的消耗和原冷菜的生长发育，培养基的pH值发生变化，其颜色向橙色和黄色转变。
3. 颗粒苉蜍的单相培养
- 确保在转导前24-48小时进行单相培养。
- 在装有RPMI和10%胎牛血清（FBS）的25 cm2 培养瓶中培养约5，000个PSC。
- 将烧瓶转移到CO2 培养箱（37°C，5%CO2）中直至使用。
4. 用于病毒生产和制备的细胞培养
注意：人类胚胎肾293T（HEK293T）细胞是从克尔曼医学科学大学病理学和干细胞研究中心获得的用于载体生产。
- 将 5 × 10个 5 HEK293T 细胞转移到含有 5 mL DMEM 的25 cm 2 烧瓶中，其中含有 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。
- 将HEK293T细胞在37°C下在5%CO2 中孵育，并每48小时在完整的培养基中传代一次。最后，使用低传代HEK293T细胞进行转导20。
5. 使用第三代慢病毒载体生产和制备病毒
注意：慢病毒载体pCDH513b（转移载体）和PLPII，PLPI和PMD2G（辅助载体）用于表达GFP报告基因。参见 材料表 和 补充图S1。
- 第1天：
- 在6孔培养板中对HEK293T细胞21进行胰蛋白酶消化后，用含有10%FBS的新鲜无抗生素DMEM接种7×每孔104个细胞。
- 使用汇合度为50%-60%的细胞通过磷酸钙方法转导。
- 第2天：
- 在实验前2-3小时用含有2 %FBS的新鲜无抗生素DMEM替换细胞培养基。
- 在 1.5 mL 离心管中，混合第三代慢病毒质粒，包括 7 μg/μL pCDH513b（转移载体）、4 μg/μL PLPII、4 μg/μL PLPI 和 2 μg/μL PMD2G（辅助载体）。
- 将HEPES缓冲液（0.28 M NaCl，0.05 M HEPES和1.5 mM Na2HPO4，最佳pH范围，7.00-7.28）加入混合物中，体积为422μL。
- 向混合物中加入 16 μL 1% 三乳糖乙二胺四乙酸 （TE） 缓冲液。
- 向试管中加入62μL2.5mM氯化钙并充分混合。
- 在1-2分钟内使用巴斯德移液管将500μL 2x HEPES缓冲盐水（HBS）加入混合物 中，逐滴 。轻轻混合，直到获得半不透明的溶液，并在室温下孵育混合物20分钟。
- 将混合物缓慢加入每个板中，并以缓慢的圆周运动分布。
- 将板在37°C下孵育在5%CO2 培养箱中，并在4-6小时后用含有 10%FBS的无抗生素DMEM替换培养基。
- 第3天：
- 使用倒置荧光显微镜确认成功的瞬时转导和细胞活力。
- 第4天：
- 通过收集每个孔的上清液从培养基中收获病毒并将其储存在-70°C直至使用。
注意：可以浓缩和滴定收获的慢病毒，以进行精确的转染22。
- 通过收集每个孔的上清液从培养基中收获病毒并将其储存在-70°C直至使用。
6. 颗粒状芽孢杆菌 不同阶段与病毒的瞬时转导
- 第1天：
- 使用12孔培养板进行基因转移。培养5×10个3-5×10个4 HEK293T细胞一式三份，完整的DMEM培养基作为内部参比。
- 在 RPMI 和 10% FBS 中一式三份培养 150 个新鲜 PSC。
- 在含有10%热灭活FBS的DMEM中一式三份培养30个蚯虫。
注意：所有转导培养基必须 不含抗生素。在此过程中保留三个未处理的HEK293T细胞，PSC和蠕动蠕虫的对照孔。 - 用4μg/mL转染试剂（参见材料表）制备1×106病毒的混合物，以转导HEK293T细胞和蠕虫的不同阶段。
- 将混合物缓慢加入每个板中，并以缓慢的圆周运动分布。将板在CO2 培养箱（37°C，5%CO2）中孵育4-6小时。用相同的完整培养基替换每个样品的培养基，以尽量减少转染试剂的毒性作用。
- 第2天：
- 重复步骤6.1.4-6.1.5以提高HEK293T电池，PSC和蠕动蠕虫的瞬态转导效率。
- 根据细胞培养基的类型，将所有板在具有相同培养条件的CO2 培养箱中孵育24-48小时。
- 第3天：
- 使用荧光显微镜检查转导是否成功。
注意：考虑在基因转移过程中使用进一步的验证性测定，如PCR / qPCR20，23或蛋白质印迹24技术。
- 使用荧光显微镜检查转导是否成功。
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Representative Results
在这里，我们通过使用第三代慢病毒载体描述了颗粒桔梗的快速有效的瞬时转导技术。我们在双相培养基中培养PSCs以获得蠕动的蠕虫，如前所述25，26。原结肠在体外6周后发育成蠕动的蠕虫。在双相培养基中观察到颗粒杆菌的不同阶段，包括内陷的PSCs（图2A），蒸发的PSCs（图2B）和具有第一和第三个孕节形成的蠕动蠕虫（图2C-E）。分别从单相和双相培养物中获得的原结肠和曲柄蠕虫用表达GFP的慢病毒转染（图3）。为避免自发荧光效应，将显微镜观察结果与所有三组样品的背景荧光进行比较，并将所有高于该背景水平的样品视为转染。
我们调整了场照度并降低了快门，以防止每次处理的对照样品中出现任何可能的自发荧光发射。然后，我们检查了慢病毒载体处理的样品，其中绿光对黑场的发射被认为是有效的瞬态转导。HEK293T细胞 - 瞬态转导过程控制 - 清晰表达GFP（图3D）。成虫在外膜层表达GFP最明显（图3F）;然而，PSC在48 h后表现出略低的GFP表达水平。PSC周围的一些囊肿液残留物和/或生发层碎片在转染样品的背景中引起一些荧光。HEK293T细胞和絮状蠕虫的荧光强度在24 h和48 h后增加（在PSC中观察到微小的变化）。
图1：研究方案的示意图。缩写：PSC = 原结肠。请点击此处查看此图的大图。
图2：粒 状棘球绦 虫在双相培养基中的不同阶段。 （A）侵入的PSC，（B）蒸发的PSCs，（C，D）蠕动过程中的蠕虫，（E）具有第三个前体形成的蠕动蠕虫，（F）培养基中不同蠕动阶段的蠕虫。比例尺 = 200 μm .请点击此处查看此图的大图。
图3：在光学和荧光显微镜下瞬时转导 颗粒棘球绦球菌 和对照细胞系的不同阶段 （A，D）HEK293T细胞作为转导过程对照，（B，E）原脊骨和（C，F）蠕动蠕虫。（G、H、I）混合光和荧光显微镜。比例尺 = 50 μm、100 μm 和 500 μm .请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：pCDH-巨细胞病毒-MCS-EF1-绿核cDNA克隆和表达载体的图谱。请按此下载此档案。
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Discussion
了解线虫和梧桐生物学的分子基础对于理解人畜共患寄生虫的致病性至关重要27.缺乏有效的基因评估系统是直接解释茴香寄生虫（包括 棘球绦虫 属12，27）功能性遗传学的主要障碍。本研究证明了慢病毒在 细粒埃布氏菌 瞬时转导中的优异潜力。
慢病毒转导将瞬时转导的简单使用和速度与稳定细胞系的强表达相结合，将转基因递送到哺乳动物细胞28。这项工作的主要目标是说明慢病毒载体转导的过程，这在未来的棘球蚴病研究中至关重要。
该协议中必须注意特定的关键点。由于培养基中遗漏了抗生素，应遵守严格的无菌工作流程条件，如果没有抗生素，24小时后可以预期细菌和真菌污染。微生物污染降低了寄生虫的运动性和活力，转染和对照样品将在72小时后丢失。
选择梧桐生命周期中的适当阶段和合适的培养条件是基因转导成功的关键12，27.我们在间歇期和曲化阶段测试了我们的慢病毒转导方法。结果表明，与SPC相比，蚯化蠕虫对基因瞬时转导的反应更灵敏，这可能是串化形式中广泛结膜结构的结果。然而，由于慢病毒转导的性质，多细胞PSC和絮状蠕虫中的荧光强度通常远低于单层HEK293T细胞26。
使用棘球绦虫作为扁虫研究生物现象的新模型的潜力早已被讨论。因此，更好地了解棘球绦虫生物学作为模式生物可用于扩大干细胞研究并调节其他鸭嘴蠕虫8，29，30，31，32的基因表达和进化生物学。迫切需要在棘球绦虫的基因组和转录组水平以及各种寄生和自由生活的扁虫模型系统上进行应用遗传研究。因此，为绦虫开发有效的基因转移过程为新技术铺平了道路，例如基于病毒的基因敲入或CRISPR-Cas介导的基因编辑32，33。这项工作在绦虫模型中提出了慢病毒转导，并展示了有希望的结果，对扁虫生物学具有潜在影响。然而，需要更深入的研究来改进该方法并开发该技术在未来实验中的适用性。
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Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
本出版物中报道的研究得到了精英研究人员资助委员会的支持，奖励编号为958680，来自伊朗德黑兰国家医学研究发展研究所（NIMAD）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
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