Summary
Vi beskriver en snabb transient transduktionsteknik i olika utvecklingsstadier av Echinococcus granulosus med hjälp av tredje generationens lentivirala vektorer.
Abstract
Cystisk echinokocker eller hydatidsjukdom är en av de viktigaste zoonotiska parasitiska sjukdomarna som orsakas av Echinococcus granulosus, en liten bandmask som finns i hundens tarm. Det finns ett akut behov av tillämpad genetisk forskning för att förstå mekanismerna för patogenes och sjukdomskontroll och förebyggande. Avsaknaden av ett effektivt genutvärderingssystem hindrar emellertid en direkt tolkning av cestodparasiternas funktionella genetik, inklusive arten Echinococcus . Den aktuella studien visar potentialen hos lentivirral gentranspervention i metacestoden och strobilerade former av E. granulosus. Protoscoleces (PSC) isolerades från hydatidcystor och överfördes till specifika bifasiska odlingsmedier för att utvecklas till strobilerade maskar. Maskarna transfekterades med skördat tredje generationens lentivirus, tillsammans med HEK293T-celler som en transduktionsprocesskontroll. En uttalad fluorescens detekterades i de strobilerade maskarna över 24 h och 48 h, vilket indikerar övergående lentiviral transduktion i E. granulosus. Detta arbete presenterar det första försöket till lentivirusbaserad övergående transduktion i bandmaskar och visar de lovande resultaten med potentiella konsekvenser i experimentella studier om plattmaskbiologi.
Introduction
Cystisk echinokocker (CE) är en av de viktigaste helminthsjukdomarna som orsakas av Echinococcus granulosus, en liten bandmask inom familjen Taeniidae 1,2. Omfattande studier om immundiagnostisk och vaccinutveckling för E. granulosus har genomförts. Otillräcklig kunskap om den molekylära grunden för parasitbiologi innebär dock stora begränsningar i diagnos, hantering och förebyggande av hydatidsjukdom 3,4,5,6.
Under de senaste åren, på grund av utvecklingen av genomsekvensering och transkriptomiska metoder, har ett brett spektrum av molekylära studier genomförts på plattmaskar av flera forskargrupper 7,8,9. Men i parasiternas värld är framstegen inom genöverföringsteknik hos parasitiska plattmaskar fortfarande begränsade jämfört med de mycket reproducerbara övergående transduktionsmetoderna som utvecklats för vissa protozoer 10,11,12.
Användningen av virala leveranssystem har framstått som ett viktigt verktyg för transgen leverans och gen / protein undersökningar under de senaste två decennierna13. Lentivirus infekterar både delande och icke-delande celler, vilket gör det möjligt att infektera postmitotiska celler 14,15,16. Nya bevis tyder på att användning av ett lentivirusbaserat transduktionssystem i däggdjursceller erbjuder potential att övervinna de flesta begränsningarna i tidigare knock-in / knock-down-tekniker. Design och konstruktion av uttryck lentivirala vektorer med lämpliga molekylära markörer, såsom GFP-uttryck, har beskrivits tidigare16. Därför utvärderar vi lentiviral transient transduktion av en GFP-reportergen i protoskoleces och strobilerade maskar av E. granulosus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av National Institute for Medical Research Development och Research Ethics Review Committee, nr 958680. Lentivirus klassificeras som BSL-2-organismer; Därför utfördes alla laboratorieodlingsprocedurer i detta protokoll med hjälp av sterila laboratoriemetoder och utfördes under en laminär flödeshuv enligt NIH-riktlinjer. Figur 1 visar en schematisk presentation av studieprotokollet för de olika E. granulosus-stadierna .
1. Samla hydatidcyster
- Samla leverhydatidcystor från naturligt infekterade får som rutinmässigt slaktas på ett slakteri.
- Sterilisera cystytan helt med steril gasbindning och 70% alkohol innan protoscoleces (PSC).
- Aspirera 20-50 ml hydatidvätska ut i sterila 50 ml koniska rör.
- Efter tömning, torka ut cysten med ett vasst blad, överför det germinala skiktet till ett sterilt 50 ml koniskt rör och skaka det under en kort period (~ 2 min) för att öka uppsamlingen av PSC. Överför germinalskiktet till ett nytt 1,5 ml rör för molekylär karakterisering.
- Tvätta PSC: erna 3-5x med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Observera PSC i 0,1% eosin i 5 minuter för att bestämma PSC-livskraften under ett ljusmikroskop. Använd psc:er med minst 95 % livskraft för odling.
- Behandla PSC-fällningen med 2 ml pepsin (2 mg/ml, pH 2) i 15-20 minuter.
- För att isolera enskilda PSC: er, återsuspendera PSC-sedimentet i PBS och för det genom två lager sterilt gasbind till ett nytt sterilt 50 ml koniskt rör.
OBS: Beräkna genomsnittet av tre räkningar på 50 μL PSC-sediment med hjälp av ett ljusmikroskop. För efterföljande prövningar, använd det uppskattade värdet för att bestämma PSC/ μL. Varje hydatidcystisolat bör karakteriseras baserat på nukleotidpolymorfismer med molekylära metoder, såsom PCR-sekvensering17 eller högupplöst smältkurvanalys18.
2. Bifasisk odling av PSC av E. granulosus för att erhålla vuxna maskar
OBS: Isolerade PSC bör odlas under sterila förhållanden under ett laminärt flödesskåp klass II. Förbered de fasta och flytande faserna i det bifasiska odlingsmediet separat innan du fortsätter till nästa steg19.
- Förbered det bifasiska odlingsmediet så att det består av två faser.
- För den fasta fasen, tillsätt 10 ml bovint serum till en 25 ml kolv och låt den koagulera vid 76 °C i 20–30 minuter.
- För vätskefasen (modifierad CMRL), blanda 100 ml värmeinaktiverat fosterkalvserum (FCS), 36 ml 5% jästextrakt, 5,6 ml 30% glukos (i destillerat vatten), 1,4 ml 5% hundgalla i PBS, 20 mM HEPES-buffert och 10 mM NaHCO3 i 260 ml CMRL-1066-medium. Slutligen tillsätt penicillin (100 IE/ml) och streptomycin (100 mg/ml) till blandningen.
- Tillsätt 10 ml vätskefasmedium till varje 25 cm2 odlingskolv.
- Tillsätt ~5 000 psc till odlingskolven och överför kolven tillCO2-inkubatorn (37 °C, 5 %CO2).
- Efter 24–48 timmar överför du de gemensamma kontaktpunkterna till en ny kolv med fast fas (bovint serum) och tillsätt 1 ml av samma färska vätskefasmedium per kolv. Överför kolvarna tillCO2-inkubatorn (37 °C, 5 %CO2).
- Var 5-7: e dag, byt ut mediet med färskt vätskefasmedium baserat på förändringar i odlingsmediets färg och den uppskattade andelen differentierade PSC.
OBS: Protoscoleces svarar snabbt på miljöförändringar efter att ha odlats, och de flesta av dem genomgår differentiering inom 2-3 veckor. På grund av konsumtionen av näringsämnen och protoscoleces tillväxt och utveckling förändras kulturmediets pH och dess färg skiftar mot orange och gult.
3. Monofasisk odling av PSC av E. granulosus
- Se till att monofasisk odling görs 24-48 h före transduktion.
- Odla ~ 5 000 PSC i en 25 cm2 odlingskolv med RPMI och 10% fetalt bovint serum (FBS).
- Överför kolvarna tillCO2-inkubatorn (37 °C, 5 %CO2) tills de används.
4. Cellodling för virusproduktion och beredning
OBS: Mänskliga embryonala njure 293T (HEK293T) celler erhölls för vektorproduktion från Pathology and Stem Cell Research Center, Kerman University of Medical Sciences.
- Överför 5 × 105 HEK293T-celler till en 25 cm2-kolv innehållande 5 ml DMEM med 10% FBS, 100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin.
- Inkubera HEK293T-cellerna vid 37 °C i 5 %CO2 och passera dem i hela odlingsmediet var 48:e timme. Slutligen använd HEK293T-celler med låg passage för transduktion20.
5. Produktion och beredning av viruset med tredje generationens lentivirala vektorer
OBS: Lentivirusvektorn pCDH513b (överföringsvektor) och PLPII, PLPI och PMD2G (hjälpvektorer) användes för att uttrycka GFP-reportergenen. Se materialtabellen och kompletterande figur S1.
- Dag 1:
- Efter trypsinisering av HEK293T-cellerna21 i 6-brunns odlingsplattor, frö 7 × 104 celler per brunn med färsk antibiotikafri DMEM innehållande 10% FBS.
- Använd celler vid 50% -60% sammanflöde för transduktion med kalciumfosfatmetoden.
- Dag 2:
- Byt ut cellodlingsmediet 2-3 h före experimentet med färsk antibiotikafri DMEM innehållande 2% FBS.
- Blanda tredje generationens lentivirala plasmider i ett 1,5 ml rör, inklusive 7 μg/μl pCDH513b (överföringsvektor), 4 μg/μl PLPII, 4 μg/μl PLPI och 2 μg/μl PMD2G (hjälpvektorer).
- Tillsätt HEPES-buffert (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES och 1,5 mM Na2HPO4; optimalt pH-intervall, 7,00-7,28) till blandningen till en volym av 422 μL.
- Tillsätt blandningen 16 μl 1 % Tris-EDTA-buffert (TE).
- Tillsätt 62 μL 2,5 mM kalciumklorid i rören och blanda väl.
- Tillsätt 500 μl 2x HEPES-buffrad saltlösning (HBS) till blandningen, droppe för droppe, inom 1-2 min med en Pasteur-pipett. Blanda försiktigt tills en halvgenomskinlig lösning erhålls och inkubera blandningen i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt blandningen långsamt på varje platta och fördela den med långsamma cirkulära rörelser.
- Inkubera plattorna vid 37 °C i en 5% CO2-inkubator och ersätt mediet efter 4-6 timmar med antibiotikafri DMEM innehållande 10% FBS.
- Dag 3:
- Bekräfta framgångsrik övergående transduktion och cellviabilitet med hjälp av ett inverterat fluorescensmikroskop.
- Dag 4:
- Skörda virus från odlingsmediet genom att samla upp varje brunns supernatant och förvara dem vid -70 °C tills de används.
OBS: Skördade lentivirus kan koncentreras och titreras för exakt transfektion22.
- Skörda virus från odlingsmediet genom att samla upp varje brunns supernatant och förvara dem vid -70 °C tills de används.
6. Övergående transduktion av olika stadier av E. granulosus med viruset
- Dag 1:
- Använd en 12-brunns odlingsplatta för genöverföring. Kultur 5 × 103-5 × 104 HEK293T-celler i tre exemplar, med komplett DMEM-medium som intern referens.
- Kultur 150 färska PSC i tre exemplar i RPMI och 10% FBS.
- Kultur 30 strobilerade maskar i tre exemplar i DMEM innehållande 10% värmeinaktiverad FBS.
OBS: Alla transduktionsmedier måste vara antibiotikafria. Förvara tre icke-behandlade kontrollbrunnar för HEK293T-celler, PSC och strobilerade maskar i processen. - Bered en blandning av 1 × 106 virus med 4 μg/ml transfektionsreagens (se materialtabellen) för att transducera HEK293T-cellerna och olika stadier av masken.
- Tillsätt blandningen långsamt på varje platta och fördela den med långsamma cirkulära rörelser. Inkubera plattorna i 4-6 timmar i enCO2-inkubator (37 °C, 5%CO2). Byt ut mediet för varje prov mot samma kompletta odlingsmedium för att minimera de toxiska effekterna av transfektionsreagenset.
- Dag 2:
- Upprepa steg 6.1.4-6.1.5 för att öka effektiviteten för transient transduktion för HEK293T-celler, PSC:er och strobilerade maskar.
- Inkubera alla plattor i 24-48 h i enCO2-inkubator med samma odlingsförhållanden baserat på typen av cellmedia.
- Dag 3:
- Kontrollera om transduktionen lyckas med hjälp av fluorescensmikroskopi.
OBS: Överväg att använda ytterligare bekräftande analyser som PCR / qPCR20,23 eller Western blotting24-tekniker i genöverföringsproceduren.
- Kontrollera om transduktionen lyckas med hjälp av fluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här beskriver vi en snabb och effektiv transient transduktionsteknik i E. granulosus med hjälp av tredje generationens lentivirala vektorer. Vi odlade PSC i ett bifasiskt odlingsmedium för att erhålla strobilerade maskar, som tidigare beskrivits25,26. Protoskoleces utvecklas till strobilerade maskar efter 6 veckor in vitro. Olika stadier av E. granulosus observerades i det bifasiska odlingsmediet, inklusive invaginerade PSC (figur 2A), evagerade PSC (figur 2B) och strobilerade maskar med första och tredje proglottidbildning (figur 2C-E). Protoscoleces och de strobilerade maskarna erhållna från monofasiska respektive bifasiska kulturer transfekterades med GFP-uttryckande lentivirus (Figur 3). För att undvika autofluorescenseffekter jämfördes mikroskopiska observationer med bakgrundsfluorescensen i alla tre grupperna av prover, och alla prover över denna bakgrundsnivå ansågs transfekterade.
Vi justerade fältbelysningen och sänkte slutaren för att förhindra eventuell autofluorescensemission i kontrollproverna för varje behandling. Vi kontrollerade sedan lentivirala vektorbehandlade prover, där grön ljusemission mot ett svart fält ansågs vara effektiv övergående transduktion. HEK293T-celler - den övergående transduktionsprocessens kontroll - tydligt uttryckt GFP (figur 3D). De vuxna maskarna uttryckte GFP tydligast i tegumentskiktet (figur 3F); PSC visade dock en något lägre nivå av GFP-uttryck efter 48 timmar. Vissa cystvätskerester och/eller skräp från avelsmaterial runt psc:erna orsakade viss fluorescens i bakgrunden i de transfekterade proverna. Intensiteten av fluorescens i HEK293T-celler och strobilerade maskar ökade efter 24 timmar och 48 timmar (mindre förändringar observerades i PSC).
Figur 1: En schematisk presentation av studieprotokollet. Förkortning: PSCs = protoscoleces. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: De olika stadierna av Echinococcus granulosus i bifasiskt odlingsmedium. (A) Invaginerade PSC, (B) evagerade PSC, (C, D) maskar i strobilationsprocessen, (E) strobilerade maskar med tredje proglottidbildning, (F) maskar i olika stadier av strobilation i odlingsmediet. Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Övergående transduktionav olika stadier av Echinococcus granulosus och kontrollcellinjen i ljus- och fluorescensmikroskopi. (G, H, I) Blandad ljus- och florescensmikroskopi. Skalstaplar = 50 μm, 100 μm och 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Karta över pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA kloning och uttrycksvektor. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att förstå den molekylära grunden för nematoder och Platyhelminthes biologi är avgörande för att förstå patogeniciteten hos zoonotiska parasiter27. Avsaknaden av ett effektivt genutvärderingssystem är ett stort hinder för den direkta tolkningen av funktionell genetik hos cestodparasiter, inklusive Echinococcus-arter 12,27. Den aktuella studien visar den utmärkta potentialen hos lentivirus vid E. granulosus övergående transduktion.
Lentivirral transduktion kombinerar enkelheten i användningen och hastigheten för övergående transduktion med det starka uttrycket av stabila cellinjer för att leverera transgener till däggdjursceller28. Det huvudsakliga målet med detta arbete var att illustrera processen för lentiviral vektortransduktion, vilket kommer att vara avgörande i framtida Echinococcosis-forskning.
Specifika kritiska punkter måste noteras i detta protokoll. Strikta sterila arbetsflödesförhållanden bör observeras på grund av utelämnandet av antibiotika i odlingsmediet, utan vilket bakteriell och svampförorening kan förväntas efter 24 timmar. Mikrobiell kontaminering minskar parasiternas rörlighet och livskraft, och både transfekterade och kontrollprover kommer att gå förlorade efter 72 timmar.
Att välja lämpliga stadier i Platyhelminthes livscykel och lämpliga odlingsförhållanden är nyckeln till framgångsrik gentransduktion12,27. Vi testade vår lentivirala transduktionsmetod i metacestod- och strobilerade stadier. Resultaten visade att strobilerade maskar var mer mottagliga för övergående transduktion av genen än PSC: erna, vilket kan vara resultatet av den omfattande tegumentala strukturen i de strobilerade formerna. På grund av arten av lentivirral transduktion är emellertid fluorescensintensiteten i de flercelliga PSC: erna och strobilerade maskarna vanligtvis mycket lägre än i monolager HEK293T-celler26.
Potentialen att använda Echinococcus som en ny modell i plattmaskar för att studera biologiska fenomen har länge diskuterats. Därför kan en bättre förståelse av Echinococcus-biologi som modellorganism vara användbar för att utöka stamcellsforskningen och reglera genuttrycket och evolutionsbiologin hos andra platyhelminths 8,29,30,31,32. Det finns ett akut behov av tillämpad genetisk forskning på genomiska och transkriptomiska nivåer för Echinococcus och olika parasitiska och fritt levande plattmaskmodellsystem. Att utveckla en effektiv genöverföringsprocess för bandmaskar banar därför väg för nya tekniker, såsom virusbaserad gen-knock-in eller CRISPR-Cas-medierad genredigering32,33. Detta arbete presenterar lentiviral transduktion i en bandmaskmodell och visar lovande resultat, med potentiella konsekvenser för plattmaskbiologi. Det krävs dock mer djupgående studier för att förbättra metoden och utveckla tillämpligheten av denna teknik för framtida experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes av Elite Researcher Grant Committee under prisnummer 958680 från National Institute for Medical Research Development (NIMAD), Teheran, Iran.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
References
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315 (2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020 (2021).
- Eckert, J., Thompson, R. C. A.
- Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213 (2017).
- Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q.
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315 (2017).
- Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
- Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
- Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
- Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
- Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
- Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P.
- Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
- Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J.
- Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T.
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
- Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
- Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
- Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190 (2020).
- Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755 (2008).
- Wang, X., McManus, M.
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
- Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
- Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991 (2018).
- Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
- Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
- Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).
- Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
- Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496 (2015).
