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Medicine

Analyse des expectorations de qualité contrôlée par cytométrie en flux

Published: August 9, 2021 doi: 10.3791/62785
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1bioAffinity Technologies, 2Department of Cell Systems & Anatomy, The University of Texas Health Science Center at San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit une méthode efficace pour dissocier les expectorations en une seule suspension cellulaire et la caractérisation ultérieure de sous-ensembles cellulaires sur des plateformes cytométriques en flux standard.

Abstract

Les expectorations, largement utilisées pour étudier le contenu cellulaire et d’autres caractéristiques microenvironnementales afin de comprendre la santé du poumon, sont traditionnellement analysées à l’aide de méthodologies cytologiques. Son utilité est limitée car la lecture des diapositives prend beaucoup de temps et nécessite un personnel hautement spécialisé. De plus, des débris étendus et la présence d’un trop grand nombre de cellules épithéliales squameuses (ETC), ou cellules des joues, rendent souvent un échantillon inadéquat pour le diagnostic. En revanche, la cytométrie en flux permet un phénotypage à haut débit des populations cellulaires tout en excluant simultanément les débris et les SEC.

Le protocole présenté ici décrit une méthode efficace pour dissocier les expectorations en une seule suspension cellulaire, tacher les anticorps et fixer les populations cellulaires, et acquérir des échantillons sur une plate-forme cytométrique en flux. Une stratégie de contrôle qui décrit l’exclusion des débris, des cellules mortes (y compris les SEC) et des doublets cellulaires est présentée ici. En outre, ce travail explique également comment analyser des cellules d’expectorations uniques viables basées sur un groupe de populations positives et négatives de différenciation (CD)45 pour caractériser des sous-ensembles de lignées hématopoïétiques et épithéliales. Une mesure de contrôle de la qualité est également fournie en identifiant les macrophages spécifiques aux poumons comme preuve qu’un échantillon est dérivé du poumon et n’est pas de la salive. Enfin, il a été démontré que cette méthode peut être appliquée à différentes plateformes cytométriques en fournissant des profils d’expectorations du même patient analysés sur trois cytomètres de flux; Navios EX, LSR II et Lyric. De plus, ce protocole peut être modifié pour inclure des marqueurs cellulaires supplémentaires d’intérêt. Une méthode d’analyse d’un échantillon d’expectorations entier sur une plate-forme cytométrique en flux est présentée ici qui rend les expectorations utilisables pour le développement de diagnostics à haut débit des maladies pulmonaires.

Introduction

Les progrès techniques dans le matériel et les logiciels des cytomètres de flux ont permis d’identifier simultanément de nombreuses populations cellulaires distinctes1,2,3,4. L’utilisation du cytomètre en flux dans la recherche sur les cellules hématopoïétiques, par exemple, a permis de mieux comprendre le système immunitaire2 et la hiérarchie cellulaire du système hématopoïétique5, ainsi que la distinction diagnostique d’une multitude de cancers du sang différents6,7,8. Bien que la plupart des cellules des expectorations soient d’origine hématopoïétique9,10,11, la cytométrie en flux n’a pas été largement appliquée à l’analyse des expectorations à des fins diagnostiques. Cependant, plusieurs études suggèrent que l’évaluation des populations de cellules immunitaires dans les expectorations (le sous-ensemble de cellules le plus important) peut être d’une grande aide dans le diagnostic et / ou la surveillance de maladies telles que l’asthme et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)12,13,14,15. De plus, l’existence de marqueurs épithéliaux spécifiques qui peuvent être utilisés en cytométrie en flux permet l’interrogation du sous-ensemble de cellules le plus important suivant dans les expectorations, les cellules épithéliales pulmonaires.

En plus de la capacité d’analyser de nombreuses populations cellulaires distinctes d’origines tissulaires différentes, un cytomètre en flux peut évaluer un grand nombre de cellules dans une période relativement courte. En comparaison, les types d’analyses cytologiques à base de lames nécessitent souvent du personnel et/ou de l’équipement hautement spécialisés. Ces analyses peuvent nécessiter beaucoup de main-d’œuvre, ce qui conduit à l’analyse d’une partie seulement de l’échantillon d’expectorations16.

Trois problèmes critiques limitent l’utilisation généralisée des expectorations en cytométrie en flux. La première question concerne la collecte des expectorations. Les expectorations sont recueillies par une toux qui expulse le mucus des poumons dans la cavité buccale, puis crache dans une tasse de collecte. Étant donné que le mucus se déplace à travers la cavité buccale, il y a un risque élevé de contamination par la SEC. Cette contamination complique l’analyse de l’échantillon, mais le problème est facilement rectifié sur une plate-forme cytométrique en flux, comme le montre cette étude.

Tout le monde ne peut pas produire des expectorations spontanément; par conséquent, plusieurs dispositifs ont été mis au point pour faciliter la collecte des expectorations de manière non invasive17. Le nébuliseur est l’un de ces dispositifs et il a été démontré qu’il produisait des échantillons d’expectorations fiables18,19,20. Bien que le nébuliseur soit un moyen très efficace de collecter les expectorations de manière non invasive, son utilisation nécessite toujours un réglage dans un établissement médical avec du personnel spécialisé21. En revanche, les appareils portatifs tels que la flûte pulmonaire22,23,24 et l’acapella16,25 peuvent être utilisés à la maison car ils sont très conviviaux. Ces dispositifs d’assistance sont à la fois sûrs et rentables.

Pour nous, l’acapella a toujours donné de meilleurs résultats que la flûte pulmonaire16, et par conséquent, le dispositif acapella a été choisi pour les collections d’expectorations. Un échantillon de prélèvement de 3 jours a été décidé parce que le but principal de l’utilisation des expectorations est de développer un test de détection du cancer du poumon16. Il a été démontré qu’un échantillon de 3 jours augmente la probabilité de détection du cancer du poumon par rapport à un échantillon de 1 ou 2 jours26,27,28. Cependant, d’autres méthodes de collecte des expectorations peuvent être préférables à des fins différentes. Si une méthode de collecte des expectorations différente de celle décrite ici est utilisée, il est recommandé de titrer soigneusement chaque anticorps ou colorant utilisé pour l’analyse cytométrique en flux; très peu de données sont disponibles sur la façon dont les différentes méthodes de collecte des expectorations affectent les protéines ciblées pour la cytométrie en flux.

Le deuxième problème qui atténue l’enthousiasme pour l’utilisation des expectorations pour le diagnostic, principalement lié à la cytométrie en flux, est le nombre de cellules. Le problème est la collecte de suffisamment de cellules viables pour une analyse fiable. Deux études ont démontré que les échantillons d’expectorations prélevés par des méthodes non invasives, à l’aide d’un dispositif d’assistance, contiennent suffisamment de cellules viables pouvant être utilisées dans le diagnostic clinique ou les études de recherche16,24. Cependant, aucune de ces études n’a abordé la question du nombre de cellules concernant la cytométrie en flux.

Pour les études qui constituent la base de ce protocole, des échantillons d’expectorations ont été prélevés sur des participants à risque élevé de développer un cancer du poumon conformément aux directives institutionnelles approuvées pour chaque site d’étude. Les participants à risque élevé ont été définis comme étant âgés de 55 à 75 ans, ayant fumé 30 paquets-années et n’ayant pas cessé de fumer au cours des 15 dernières années. On a montré aux patients comment utiliser le dispositif acapella conformément aux instructions du fabricant29 et ont recueilli des expectorations pendant trois jours consécutifs à la maison. L’échantillon a été conservé au réfrigérateur jusqu’à la dernière collecte. Le dernier jour du prélèvement, l’échantillon a été expédié au laboratoire pendant la nuit avec un compresse froid congelé. Les échantillons ont été transformés en une suspension à cellule unique le jour de leur réception. Avec cette méthode de collecte des expectorations, on obtient plus qu’assez de cellules viables pour une analyse cytométrique en flux fiable.

Enfin, et en relation avec le problème précédent du nombre de cellules, il y a la question de savoir comment libérer les cellules des expectorations de leur environnement mucineux. Comment les cellules peuvent-elles rester viables et créer une suspension cellulaire unique qui n’obstrue pas le cytomètre en flux? Basé sur les travaux initiaux de Pizzichini et al.30 et Miller et al.31, ce protocole décrit une méthode facile et fiable pour le traitement des expectorations en une suspension à cellule unique qui convient à l’analyse cytométrique en flux. Cette méthode a utilisé des lignes directrices bien établies en cytométrie en flux32,33,34 pour développer une stratégie efficace de marquage des anticorps afin d’identifier les cellules hématopoïétiques et épithéliales dans les expectorations et de fournir des paramètres d’instrument, des mesures de contrôle de la qualité et des lignes directrices d’analyse normalisant l’analyse des expectorations sur une plate-forme cytométrique en flux.

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Protocol

Toutes les étapes du traitement des expectorations sont effectuées dans une armoire de sécurité biologique avec l’équipement de protection individuelle approprié.

1. Préparation du réactif avant le début de la dissociation des expectorations

  1. Décongeler 1 % de paraformaldéhyde (PFA), 25 mL par échantillon sur de la glace et garder au froid jusqu’à utilisation.
    ATTENTION : Le PFA est toxique par inhalation et par contact cutané. Préparer le fixateur conformément aux instructions du fabricant et congeler à -20 °C dans des aliquotes de 25 mL jusqu’à utilisation.
  2. Approximer le poids de l’échantillon et décongeler suffisamment 0,1 % de dithiothréitol (TNT) pour l’étape 2.2 et l’amener à 37 °C. (Les aliquotes de TNT doivent être conservées à -20 °C avant utilisation.)
  3. Apportez suffisamment de 0,5 % de N-acétyl-L-cystéine (NAC) jusqu’à 37 °C pour l’étape 2.2. (Le NAC doit être préparé frais chaque semaine et conservé à 4 °C avant utilisation.)

2. Dissociation des expectorations

  1. Peser l’échantillon d’expectorations pour déterminer les volumes de réactifs de dissociation.
    REMARQUE: Un échantillon est considéré comme petit si le poids initial est de ≤3 g, moyen s’il est >3 g mais ≤8 g, grand s’il >8 mais ≤16 g et extra-grand si un échantillon pèse >16 g. Les indications petite, moyenne, grande et extra-large seront utilisées tout au long du protocole. La quantité de réactifs nécessaires à la dissociation et au marquage diffère selon la taille de l’échantillon d’expectorations.
  2. Transférer un petit échantillon dans un tube conique propre de 50 mL, un échantillon moyen dans une bouteille jetable en plastique propre de 250 mL ou un échantillon grand et extra-large dans une bouteille jetable en plastique propre de 500 mL. Ajouter 1 mL/g de poids d’échantillon de 0,5 % de NAC et 4 mL/g de poids d’échantillon de 0,1 % de TNT.
  3. Vortex à vitesse maximale (pendant 15 s), puis roche à température ambiante (à vitesse maximale) pendant 15 min.
  4. Diluer l’échantillon avec quatre volumes de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) (en fonction du volume total de l’échantillon + réactifs) pour neutraliser le NAC et la TNT; vortex rapidement à vitesse maximale et roche à température ambiante pendant 5 min à vitesse maximale.
  5. Filtrer la suspension cellulaire à travers une ou plusieurs crépines de cellules en maille de nylon de 100 μm dans un ou plusieurs tubes de centrifugeuse coniques de 50 mL pour créer une suspension à cellule unique.
  6. Centrifuger les cellules à 800 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le surnageant, combiner toutes les pastilles dans un tube conique de 15 mL, puis laver les pastilles avec HBSS dans les mêmes conditions.
  7. Remettre en suspension la pastille de cellule dans un volume de tampon déterminé par le poids initial de l’échantillon d’expectorations.
    REMARQUE : Un petit échantillon est remis en suspension dans 250 μL de HBSS. Un échantillon moyen est remis en suspension dans 760 μL de HBSS. Les échantillons de grande taille et de très grande taille sont remis en suspension dans 1460 μL de HBSS.
  8. Prenez une aliquote de la suspension cellulaire pour un comptage de cellules vivantes / mortes en utilisant Trypan Blue.
    REMARQUE: Pour un petit échantillon, utilisez 5 μL. Pour un échantillon moyen, grand ou extra-large, utilisez 10 μL. Diluer 1:10 avec HBSS.
    1. Mélanger 10 μL de dilution des expectorations avec 30 μL de 0,4 % de bleu de trypan pour obtenir une dilution finale de l’échantillon de 1:40. Chargez dans les chambres de comptage d’un hémocytomètre pour un comptage cellulaire.
      REMARQUE: Il peut être nécessaire d’ajuster la dilution finale si le nombre de cellules est trop faible ou trop élevé pour obtenir un nombre précis. Il est fortement recommandé de consulter Guiot et al.20 pour distinguer correctement les cellules d’expectorations des SEC et des débris. Ceci est essentiel pour un comptage précis des cellules.
  9. De l’échantillon extra-large, retirez 50 x 106 cellules du total et ajoutez-les à un nouveau tube avec suffisamment de HBSS ajouté pour créer un volume total de 1700 μL.
    REMARQUE : Considérez qu’il s’agit d’un échantillon volumineux pour le reste du protocole. Les échantillons restants peuvent être jetés ou utilisés à d’autres fins.

3. Coloration des anticorps et des colorants de viabilité

  1. Choix de l’anticorps et du colorant
    NOTE : Le tableau 1 montre les anticorps et le colorant de viabilité utilisés dans ce protocole et les populations cellulaires qu’ils identifient.
    1. Étiqueter les tubes contenant les cellules d’expectorations (voir le tableau 2 pour les étiquettes).
    2. Utilisez des tubes de cytométrie en flux de 5 mL (compatibles avec le cytomètre en flux utilisé) pour le tube d’échantillon avec les cellules non colorées et le tube avec le contrôle d’isotype. Utilisez des tubes coniques de 15 mL pour les échantillons de sang et de tubes épithéliaux.
      REMARQUE: Ces échantillons seront transférés dans des tubes de cytométrie en flux après la coloration et la fixation des anticorps.
  2. Étiquetez les tubes de compensation (tableau 3).
    REMARQUE: Utilisez des tubes de cytométrie en flux de 5 mL compatibles avec le cytomètre en flux utilisé.
  3. Ajouter la quantité d’HBSS, d’anticorps et/ou de colorant à chacun des tubes cellulaires d’expectorations et des tubes de compensation comme indiqué dans les tableaux 2 et 3, respectivement.
    REMARQUE: Ajoutez un tampon (HBBS), des anticorps et un colorant à tous les tubes avant d’ajouter des cellules ou des perles de compensation pour vous assurer que le temps de coloration de tous les tubes est cohérent.
  4. Ajouter les quantités de volume de cellules d’expectorations indiquées dans le tableau 2 aux tubes d’essai.
  5. Ajoutez des perles de compensation aux tubes de compensation comme indiqué dans le tableau 3.
  6. Incuber tous les tubes (tubes d’essai et de compensation) sur de la glace, à l’abri de la lumière, pendant 35 min. Ensuite, remplissez les tubes avec du HBSS glacé et centrifugez à 4 °C pendant 10 min à 800 x g.
  7. Pour les tubes de compensation, aspirez le surnageant aussi près que possible des pastilles et faites glisser les pastilles pour les desserrer.
  8. Ajouter 0,5 mL de HBSS froid aux tubes de compensation, les stocker sur la glace à 4 °C et les protéger de la lumière jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires à l’analyse par cytométrie en flux.
  9. Aspirer le surnageant de l’isotype, du sang et des tubes épithéliaux non colorés après la centrifugation (étape 3.6 de la section de coloration des anticorps) et desserrer les pastilles en agitant les tubes.

4. Fixation avec 1% de paraformaldéhyde (PFA)

  1. Ajouter du PFA froid de 1 % (qui devrait être décongelé maintenant) aux tubes non colorés, isotypes, sanguins et épithéliaux; 2 mL aux tubes non colorés et isotypes, et 10 mL aux tubes sanguins et épithéliaux.
  2. Incuber les tubes sur de la glace, à l’abri de la lumière pendant 1 h. Vortex rapidement à vitesse maximale après 30 min.
  3. Remplissez les tubes avec du HBSS glacé. Ensuite, centrifugez les tubes à 4 °C pendant 10 min à 1600 x g.
  4. Aspirer autant de surnageant que possible sans perturber la pastille cellulaire et faire glisser le tube avec les doigts pour desserrer les cellules.
  5. Ajouter 200 μL de HBSS froid aux tubes non colorés et isotypes.
  6. Calculer le volume d’HBSS pour la remise en suspension du sang et du tube épithélial en fonction du nombre total de cellules.
    REMARQUE: Volume de remise en suspension = 0,15 x [nombre total de cellules (étape 8 de la dissociation des expectorations) / 106]. Utilisez 50 x 106 comme nombre de cellules pour un échantillon extra-large.
  7. Conservez tous les tubes d’échantillonnage et de compensation, à l’abri de la lumière sur la glace à 4 °C jusqu’à ce que l’analyse par cytométrie en flux soit effectuée.
    REMARQUE: Ce protocole n’a pas été testé pour le stockage depuis plus de 24 heures.

5. Acquisition de données sur le cytomètre en flux

  1. Appliquer les procédures de démarrage appropriées pour le cytomètre en flux utilisé.
    REMARQUE: Cette section du protocole suppose que la personne qui utilise le cytomètre en flux est formée à l’utilisation de l’instrument à sa disposition, en particulier en ce qui concerne les procédures quotidiennes, y compris la vérification de la stabilité des systèmes optiques et fluidiques, les techniques de normalisation de la diffusion de la lumière et de l’intensité de fluorescence, ainsi que le calcul et l’application de la matrice de compensation correcte.
  2. Utilisez le mélange de billes du National Institute of Standards and Technology (NIST) pour vous assurer que les tensions de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale sont réglées pour placer les billes NIST afin de couvrir toute la parcelle sans placer les perles trop près des axes.
    REMARQUE: Cette étape est cruciale pour s’assurer que les débris de moins de 5 μm peuvent être éliminés par une analyse post-acquisition de contrôle. Selon le cytomètre de flux utilisé, gardez à l’esprit que les plus petites billes ne sont pas exclues avec le seuil (lors de l’utilisation du LSR II ou du Lyric) ou avec le discriminateur élevé (en utilisant le cytomètre de flux Navios EX). Pour le Navios EX, un gain de 2 a été utilisé pour la diffusion avant et latérale, une tension de 236 pour la diffusion avant et de 250 pour la diffusion latérale. Pour le LSR II, une tension de diffusion directe de 165 et une tension de diffusion latérale de 190 ont été utilisées.
  3. Réglez le débit sur moyen (LSR II) ou élevé (Navios EX).
    REMARQUE: Le débit moyen ou élevé de la plupart des instruments peut être utilisé pour acquérir les tubes d’expectorations. Il est important de noter que l’utilisation d’un débit trop lent ou trop dilué de l’échantillon peut entraîner la sédimentation des cellules, entraînant une augmentation du vortex qui n’est pas souhaitée. Par conséquent, le respect du volume de remise en suspension calculé à l’étape 4.6 devrait entraîner une densité cellulaire qui peut être acquise rapidement mais ne pas obstruer la machine.
  4. Ajustez les tensions pour chaque paramètre utilisé pour les paramètres de diffusion et de fluorescence afin de placer les populations cellulaires sur l’échelle. Utilisez les chiffres avec la stratégie de contrôle comme guide sur la façon d’ajuster les tensions en conséquence.
    Remarque : Assurez-vous que tous les paramètres nécessaires sont sélectionnés dans la fenêtre de sélection des paramètres avant l’acquisition ou que les données ne seront pas acquises.
  5. Obtenez d’abord des données pour l’échantillon d’expectorations non coloré, suivi de l’échantillon coloré par isotype, puis du tube sanguin et du tube épithélial.
    REMARQUE: Si la suspension cellulaire est trop concentrée pour permettre au cytomètre en flux de faire fonctionner les échantillons sans obstruer, les échantillons peuvent être dilués avec HBSS.

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Representative Results

Ce protocole a été élaboré en tenant compte d’un laboratoire clinique. Lors de l’élaboration du protocole, l’accent a été mis sur la simplicité, l’efficacité et la reproductibilité. Il a été constaté que l’étape la plus longue dans le traitement des expectorations était de compter les cellules. Par conséquent, le protocole est configuré de manière à ce que le traitement des expectorations et l’étiquetage des cellules puissent être effectués indépendamment du comptage des cellules sans perte de temps. Un comptage cellulaire précis, qui est encore nécessaire pour diluer l’échantillon de manière appropriée pour une course non obstruée, peut ensuite être obtenu pendant la période d’incubation du marquage des anticorps.

Ce protocole utilise une mesure du poids des expectorations au lieu d’un nombre de cellules comme indication de la quantité d’anticorps / colorant à utiliser pour un marquage cellulaire optimal. Cependant, il existe un grand degré de variation dans le poids des échantillons d’expectorations; sur les 126 échantillons analysés, le poids variait de 0,57 g à 38,30 g. La figure 1A montre que la corrélation entre le poids des expectorations et le rendement cellulaire n’est pas forte. Par conséquent, les échantillons ont été divisés en quatre catégories; le poids médian des échantillons était de 2,1 g pour les petits échantillons, de 5,0 g pour les échantillons moyens, de 11,2 g pour les grands échantillons et de 22,0 g pour les échantillons extra-larges (figure 1B). Cependant, il y avait encore des échantillons qui donnaient beaucoup plus de cellules que prévu en fonction de leur poids (Figure 1C), la majorité des échantillons se regroupaient bien. Pour les petits échantillons, le rendement cellulaire médian était de 8,0 x 106 cellules, pour les échantillons moyens de 13,0 x 106, pour les grands échantillons de 35,4 x 106 et pour les échantillons extra-larges de 93,0 x 106.

Chaque anticorps utilisé dans ce protocole a été titré. Une concentration sur la phase de plateau (figure 2A) avec l’indice de coloration le plus élevé (figure 2B) de la courbe de titrage a été choisie comme concentration de travail. Les variations du nombre de cellules ne modifieront pas considérablement l’intensité de la coloration. Ce titrage et ce test d’anticorps sont essentiels et doivent être mis en place avec soin pour chaque nouvel anticorps ou colorant utilisé dans ce protocole34,35. Lorsqu’un anticorps est titré avec soin, il devrait tacher 10 à 50 fois plus de cellules que le nombre de cellules sur lesquelles l’anticorps a été titré34,35. Un exemple de ce principe est fourni dans le tableau 4. L’anticorps anti-humain CD45-PE a été titré sur 1 x 106 cellules dans un volume total de 400 μL. Si cet anticorps contre le volume de coloration est extrapolé au protocole (voir le tableau 2, qui montre la quantité de CD45-PE et les volumes de coloration pour chaque taille d’échantillon), pour un petit échantillon, 0,625 x 106 cellules seront colorées, 1,25 x 106 cellules seront colorées pour un échantillon moyen et 2,5 x 106 cellules pour un grand échantillon (colonne A du tableau 4). Un excès de 50 fois dans le nombre de cellules pour chaque catégorie est calculé à 31,25 x 106, 62,5 x 106 et 125 x 106 cellules, respectivement (colonne B). Comme le montrent les colonnes C et D, le nombre médian de cellules de chaque catégorie de taille et le plus grand échantillon de chaque catégorie se situent bien dans la fourchette de 50 fois.

Malgré les différences apparentes de taille et de rendement cellulaire entre les différentes tailles des échantillons d’expectorations, le pourcentage médian de contamination par la SEC dans chaque catégorie est très similaire. La figure 3A montre le pourcentage de CEE trouvés dans des échantillons individuels, stratifiés en fonction de leur catégorie de poids d’expectorations. La principale préoccupation concernait les SECs, car ces cellules ne sont pas représentatives du tissu pulmonaire mais de la cavité buccale. Cependant, la contamination moyenne par la SEC est inférieure à 20% pour toutes les catégories. La figure 3B montre le pourcentage de cellules viables trouvées dans ces échantillons. En excluant les CEE, la viabilité moyenne était d’environ 72 % pour les catégories de petite, moyenne et grande taille d’échantillon. Il était légèrement plus élevé (79 %) pour la catégorie extra-large.

La figure 4 montre une stratégie typique de contrôle pour séparer les cellules d’intérêt des expectorations des débris, des cellules mortes (qui comprennent également les SECs36 contaminants) et des amas de cellules. La figure 4A montre l’utilisation de billes du NIST pour fixer des barrières afin d’éliminer les débris de moins de 5 μm ou de plus de 30 μm, tandis que la figure 4B applique cette porte sur les cellules d’expectorations. La figure 4C montre un profil d’expectoration typique lorsqu’il est vu comme largeur de dispersion latérale (SSC-W) par rapport à la largeur de dispersion avant (FSC-W), la porte de largeur. Ce profil est utilisé pour éliminer les petits débris qui se présentent le long des axes SSC-W et FSC-W. L’élimination des cellules mortes est illustrée aux figures 4D et 4E. Le témoin non coloré (figure 4D) est utilisé pour déterminer le seuil de positivité FVS510; les cellules qui colorent positivement pour FVS510 au-dessus du témoin négatif sont considérées comme mortes et ne seront pas utilisées dans l’analyse des cellules des expectorations (Figure 4E). Enfin, une porte singlet est appliquée pour retirer les doublets de cellules de l’analyse, ce qui est illustré à la figure 4F. Ainsi, les cellules qui ont franchi les portes de sélection illustrées aux figures 4B, 4C, 4E et 4F représentent des cellules d’expectorations uniques vivantes prêtes pour une analyse ultérieure avec les anticorps utilisés dans ce protocole.

L’utilisation de l’anticorps anti-CD45 dans ce protocole de marquage permet la séparation de cellules d’expectorations uniques vivantes en un compartiment cellulaire sanguin (CD45+) et un compartiment cellulaire non sanguin (CD45-). Cette dernière catégorie comprend les cellules épithéliales et d’autres cellules non sanguines. Le profil supérieur de la figure 5A montre l’utilisation d’un échantillon d’expectorations non coloré pour définir le seuil de positivité CD45, rendant les portes pour capturer les cellules CD45+ et les cellules CD45- . Le profil inférieur de la figure 5A montre ces deux portes appliquées à un échantillon d’expectorations coloré avec l’anticorps anti-CD45. La coloration avec des anticorps supplémentaires est ensuite utilisée pour identifier les populations spécifiques des cellules sanguines à l’intérieur de la porte CD45+ (figure 5B) et d’autres populations non sanguines, y compris les populations épithéliales dans la porte CD45( figure 5C). Dans les deux figures, les profils du haut montrent comment les expectorations colorées par isotype sont utilisées pour définir les populations doubles négatives, tandis que les profils du bas montrent les cellules d’expectorations colorées par anticorps. La figure 5B (en bas) montre six populations différentes de cellules CD45+ créées avec le cocktail d’anticorps détectables dans le canal de fluorescence (FL) 1 (anticorps anti-CD66b, CD3, CD19) et l’anti-CD206 détectable dans le canal FL3. Des expériences de tri ont révélé que des macrophages spécifiques aux poumons résident dans les portes identifiées à M. La présence de cellules dans ces portes indique donc que l’échantillon d’expectorations provenait du poumon et n’était pas de la salive (Bederka et al., manuscrit en préparation). La figure 5C (en bas) montre les quadrants de contrôle créés avec l’anti-pan-cytokératine (panCK) détectable dans le canal FL1 et les anticorps de la molécule d’adhésion cellulaire anti-épithéliale (EpCAM) détectables dans le canal FL3 parmi les cellules d’expectoration CD45.

Ce protocole d’étiquetage a été largement testé sur le Navios EX et le LSR II. Quelques expériences préliminaires ont été réalisées sur le Lyric, mais sans l’optimisation approfondie de l’instrument qui a été faite pour les deux autres machines. Par conséquent, des réglages détaillés de l’instrument sont fournis pour le Navios EX et le LSR II dans la feuille Matériaux, mais pas pour le Lyric. Pour comprendre les similitudes et les variations entre ces trois plates-formes cytométriques en flux qui peuvent être utilisées pour analyser les cellules d’expectorations, les profils obtenus à partir des différentes machines peuvent être comparés dans les figures 6 et 7. Deux grands échantillons d’expectorations ont été traités, regroupés, étiquetés, séparés en trois portions égales, puis acquis sur chaque cytomètre de flux mentionné ci-dessus. La figure 6, qui est similaire à la figure 4, compare la stratégie de contrôle pour éliminer les débris, les cellules mortes et les amas de cellules. La figure 7, identique à la figure 5, compare les profils sanguins et non sanguins à partir des données acquises sur les différents cytomètres de flux.

La comparaison des différents profils obtenus à partir des trois cytomètres de flux différents montre que les mêmes profils de base peuvent être observés avec chaque instrument. Les différences auxquelles il faut prêter attention sont les diagrammes SSC-W/FSC-W (largeur de la porte) (figure 6, deuxième rangée) et les échelles linéaires des nuages de points (figures 6 et 7). Le diagramme de largeur de dispersion généré sur le Navios EX montre une porte d’inclusion (boîte rouge), ce qui signifie que toutes les cellules incluses dans la porte sont analysées plus en détail; les événements le long des axes dans le coin inférieur gauche sont exclus. Les diagrammes de largeur de dispersion sur le LSR II et Lyric ne montrent pas un dépôt similaire d’événements le long de ces mêmes axes. Cet écart est probablement dû au seuil très sensible utilisé sur le Navios EX, ce qui a entraîné de petits débris dans la porte d’exclusion de taille précédente (rangée supérieure de la figure 6). À l’occasion, des débris sont vus le long des axes dans le profil de largeur de dispersion généré sur le LSRII, mais ils se trouvent dans le coin inférieur droit. Dans ces cas, une barrière d’exclusion (comme l’indique la case rouge pointillée dans le profil central de la ligne 2 de la figure 6) est utilisée pour éliminer ces événements d’une analyse plus approfondie.

Alors que les échelles logarithmiques semblent légèrement différentes sur les graphiques entre le Navios EX et les cytomètres Lyric et LSR II, le Navios EX a la possibilité d’acquérir des données en utilisant plus de décennies. La mise en œuvre de plus de décennies dépend du contexte de l’expérience et de la sensibilité souhaitée pour visualiser les populations d’intérêt.

Une différence notable supplémentaire entre les cytomètres Navios EX et LSR II et Lyric est l’apparence du profil de la porte singulet. Le cytomètre Navios EX est équipé d’une cellule d’écoulement rectangulaire avec un angle de collecte différent de celui du LSR II. Le Navios EX contient trois angles de collecte contrôlés par logiciel pour optimiser la diffusion de la lumière de l’angle avant afin d’obtenir la sensibilité appropriée à la taille des particules à analyser. La grille polygonale du cytomètre Navios EX devra être ajustée à un angle légèrement inférieur à celui de la porte singulet du LSRII. La porte singlet pour le Lyric peut être optimisée pour obtenir un profil similaire à celui vu avec le LSR II. En utilisant l’échantillon d’expectorations, le facteur d’échelle de la zone devrait être optimisé pour chaque laser sur le Lyric afin d’obtenir une porte singlet similaire au LSR II.

Tous les profils présentés dans les figures 4 à 7 ont été analysés avec le logiciel FlowJo, version 10.6. Les fichiers .fcs se trouvent dans le FlowRepository (https://flowrepository.org), sous les ID FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ et FR-FCM-Z3MM et peuvent être utilisés pour pratiquer l’analyse des expectorations comme illustré dans ces figures.

Figure 1
Figure 1 : Poids des expectorations et rendement cellulaire. (A) La relation représentée est la relation entre le poids des expectorations, déterminé avant le traitement, et le rendement cellulaire total, déterminé après le traitement à l’aide d’un hémocytomètre. Chaque puce représente un échantillon individuel, 126 au total. (B) Les échantillons d’expectorations ont été stratifiés en quatre catégories en fonction de leur poids: petits pour les échantillons pesant jusqu’à 3 g, moyens pour les échantillons pesant plus de 3 g jusqu’à 8 g, grands pour les échantillons pesant plus de 8 g jusqu’à 16 g et extra-larges pour ceux pesant plus de 16 g. (C) La distribution du rendement cellulaire pour les échantillons de chaque catégorie est indiquée. Les barres rouges en (B) et (C) représentent les valeurs médianes de chaque catégorie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Titrage des anticorps pour le CD45-PE anti-humain. (A) La courbe de titrage cd45-PE (IgG1) avec l’intensité moyenne de fluorescence (IFM) de la population positive tracée par rapport à la concentration de l’anticorps CD45-PE plafonne à 1 μg/mL. (B) La courbe de titrage représentant l’indice de coloration par rapport à la concentration d’anticorps montre que l’indice de coloration le plus élevé est de 1 μg/mL. L’indice de coloration a été calculé comme suit : [population positive de l’IFM CD45 - population négative de l’IFM CD45] / [2 * Écart type]. Sur la base des figures 2A et 2B, 1 μg/mL a été choisi comme concentration optimale pour l’anticorps CD45-PE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: La proportion de SEC et de cellules mortes dans les échantillons d’expectorations est cohérente entre les quatre catégories de poids. (A) La proportion de SEC dans les échantillons d’expectorations est classée en fonction de leur catégorie de poids. Le pourcentage de contamination par la SEC a été déterminé par hémocytomètre dans le cadre du nombre total de cellules. (B) Viabilité cellulaire des échantillons d’expectorations à l’exclusion du SECS, déterminée par hémocytomètre et la méthode d’exclusion du bleu de trypan. Pour chaque graphique, les lignes rouges représentent les valeurs médianes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Stratégie de contrôle pour exclure les débris, les cellules mortes et les doublets dans un échantillon d’expectorations. (A) Des billes du NIST de tailles 5 μm, 20 μm et 30 μm ont été utilisées pour fixer la porte indiquée par la boîte rouge afin d’exclure les débris de moins de 5 μm et les débris plus gros au-dessus de 30 μm et proches de l’axe. (B) Un échantillon d’expectorations a été acquis en utilisant les mêmes tensions pour la dispersion vers l’avant et latérale que celles des billes du NIST. La barrière créée en (A) a été appliquée pour exclure les débris. (C) Les petits débris proches de l’axe ont été exclus de ce nuage de points. (D) Un échantillon d’expectorations non coloré a été utilisé pour fixer le seuil (ligne rouge) de la population négative et non colorée pour le colorant de viabilité. (E) La coupure créée en D a été appliquée à l’échantillon d’expectorations colorées pour former une porte (boîte rouge) afin d’inclure des cellules vivantes et viables. (F) La porte singulet indiquée par le polygone rouge exclut les cellules qui ne tombent pas sur la diagonale, éliminant ainsi les doublets et/ou les amas. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Stratégie de contrôle des cellules d’expectorations dans les compartiments sanguins et non sanguins. (A) Des cellules d’expectorations non colorées dérivées de la porte singulet sont utilisées pour définir le seuil (ligne rouge) de la population négative pour CD45 (en haut). La coupure du profil supérieur est appliquée à l’échantillon d’expectorations coloré (en bas) pour différencier les populations CD45 positives (CD45+) et négatives (CD45-). (B) Les cellules d’expectorations CD45+ colorées avec des anticorps isotypes pour FITC/AF488 sont utilisées pour fixer les portes sur la population négative (en haut). Les mêmes portes sont appliquées aux cellules des expectorations CD45+ colorées avec des marqueurs de cellules sanguines CD3, CD19, CD66b et CD206 (en bas). (C) Des portes quadrantaires sont placées sur les cellules d’expectorations CD45 colorées avec des contrôles d’isotype (en haut) et appliquées aux cellules CD45 à partir de l’échantillon d’expectorations coloré avec les marqueurs épithéliaux pan-cytokératine (panCK) et EpCAM (en bas). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Stratégie de contrôle pour exclure les débris, les amas et les cellules mortes des cellules d’expectorations colorées sur trois plateformes cytométriques en flux. Deux grands échantillons d’expectorations ont été traités, regroupés, étiquetés et divisés en trois portions égales pour acquisition sur les cytomètres de flux Navios EX (A), LSR II (B) et Lyric (C). Rangée du haut : Les échantillons d’expectorations ont été fermés (boîte rouge) pour exclure les très petits et gros débris. Deuxième rangée : La grande boîte rouge du tracé Navios EX représente une porte d’inclusion qui inclut les cellules mais exclut les débris. La petite boîte rouge en pointillés vue dans le graphique LSR II représente une porte d’exclusion pour éliminer les débris d’une analyse plus approfondie. Une optimisation supplémentaire avec le Lyric est nécessaire pour déterminer où l’exclusion des débris est nécessaire. Par conséquent, aucune porte n’est présente dans cette parcelle. Troisième rangée: les portes rectangulaires rouges comprennent des cellules vivantes pour une analyse plus approfondie. Rangée du bas: la porte polygonale a des cellules simples en excluant les doublets qui tombent en dehors de la diagonale de la porte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Stratégie de contrôle des expectorations colorées pour le sang et les marqueurs épithéliaux sur trois plateformes cytométriques en flux. L’analyse illustrée à la figure 6 se poursuit à la figure 7; toutes les cellules uniques viables (rangée du bas, figure 6) ont été divisées en populations CD45+ et CD45( première rangée, figure 7), de sorte que les marqueurs spécifiques des cellules sanguines et les marqueurs spécifiques des cellules épithéliales puissent délimiter davantage ces populations. Deuxième rangée : profil des marqueurs de cellules sanguines CD3/CD19/CD66b et CD206 à partir de cellules CD45+. Troisième rangée : marqueurs de cellules épithéliales panCK et EpCAM à partir de cellules CD45. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Anticorps/coloration But
FVS510 Tache de viabilité
CD45 anti-humain – PE Marqueur pan-leucocytaire;  Rémunération PE
CD66b anti-humain – FITC Marqueur granulocytaire
CD3 anti-humain – Alexa488 Marqueur de lymphocytes T
CD19 anti-humain – Alexa488 Marqueur de cellules B; Rémunération FITC/Alexa488
CD206 anti-humain – PE-CF594 Marqueur de macrophage pulmonaire;  Compensation PE-CF594
EpCAM anti-humain – PE-CF594 Marqueur de cellules épithéliales;  Compensation PE-CF594
Pan-cytokératine anti-humaine (panCK) – Alexa488 Marqueur de cellules épithéliales
IgG1κ – Alexa488 Contrôle de l’isotype CD3/CD19/panCK
IgG1κ – FITC Contrôle de l’isotype CD66b
IgG1κ – PE-CF594 Contrôle de l’isotype CD206/EpCAM
CD45 anti-humain – BV510 Indemnisation FVS510

Tableau 1 : Anticorps et taches de viabilité utilisés. Liste des anticorps et du colorant de viabilité utilisés dans ce protocole. Les sous-ensembles cellulaires qu’ils identifient chacun sont indiqués.

Tube (étiquette) Taille de l’échantillon* HBSS (μL) FVS510 (μL) CD45 (μL) Autres anticorps (μL) Cellules § (μL)
Non taché petit 80 20
Douleur moyenne 50 50
grand 50 50
IgG1κ - Alexa488 IgG1κ- FITC IgG1κ - PE-CF594
Contrôle de l’isotype petit 60.65 0.6 10 2 6 0.75 20
Douleur moyenne 30.65 0.6 10 2 6 0.75 50
grand 30.25 1 10 2 6 0.75 50
CD206 CD3 CD19 CD66b
Sang petit 92.875 1.5 25 1.875 5 1.25 7.5 115
Douleur moyenne 65.75 3 50 3.75 10 2.5 15 350
grand 102.5 10 100 7.5 20 5 30 725
EpCAM PanCK
Épithélial petit 96.5 1.5 25 10 2 115
Douleur moyenne 73 3 50 20 4 350
grand 117 10 100 40 8 725
* Les échantillons sont considérés comme petits, moyens ou grands en fonction du poids déterminé à l’étape 1 de la section de dissociation des expectorations du protocole.
§ Les cellules doivent être ajoutées après la distribution de tous les réactifs, y compris ceux des tubes de compensation (tableau 3).

Tableau 2 : Contenu des tubes contenant des cellules d’expectorations. Utilisez ce tableau tel que référencé dans le protocole pour ajouter les volumes spécifiés d’anticorps et la coloration de viabilité pour la taille d’échantillon appropriée.

Tube (étiquette) Réactifs ajoutés (μL) Réactifs ajoutés (drop)
LE CD45-PE CD206-PE-CF594 EpCAM-PE-CF594 CD19-Alexa488 CD45-BV510 CompBead (+) CompBead * (-)
PE comp. 76 4 x x x x 1 1
PE-CF594 comp. 72 x 4 4 x x 1 1
Alexa488/FITC comp. 60 x x x 20 x 1 1
BV510 comp. 60 x x x x 20 1 1
* Les billes positives (+) et négatives (-) doivent être ajoutées après la distribution de tous les réactifs et la préparation des tubes du tableau 2.
comp. = rémunération

Tableau 3: Contenu des tubes de compensation. Utilisez ce tableau tel que référencé dans le protocole pour ajouter les volumes spécifiés d’anticorps aux billes de compensation.

Numéro de cellule (x 106)
Un B C D
Taille de l’échantillon En volume de coloration * Accès 50 fois Échantillon médian (accès au pli) # Plus grand échantillon (accès au pli) #
Petit 0.625 31.25 8.0 (12.8) 24.77 (39.6)
Douleur moyenne 1.25 62.5 13.0 (10.4) 48.87 (39.1)
Grand 2.5 125 35.4 (14.2) 113.5 (45.4)
* Volumes de coloration utilisés dans le protocole (tableau 2).  Le nombre de cellules est extrapolé à partir de la façon dont la courbe de titrage a été effectuée; 1 μg/mL de CD45-PE et 1 x 106 cellules pour 200 μL.
Accès 50 fois supérieur aux numéros de cellule dans la colonne A.
# L’accès au pli dans les colonnes C et D est calculé en divisant le nombre présenté dans les cellules des colonnes C ou D par le nombre dans la cellule correspondante de la colonne A.

Tableau 4 : Concentration anti-humaine de CD45-PE pour tous les échantillons de chaque catégorie de taille d’échantillon.

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Discussion

Le contenu cellulaire des expectorations comprend une grande variété de cellules très variées, souvent accompagnées de beaucoup de débris37. De plus, l’analyse des expectorations nécessite un contrôle de la qualité qui confirme que l’échantillon est prélevé dans les poumons au lieu de la cavité buccale38. Par conséquent, il n’est pas aussi simple d’analyser les expectorations par cytométrie en flux que pour le sang, par exemple, qui libère une suspension cellulaire beaucoup plus propre et homogène. Ce protocole a abordé toutes ces questions : fournir des réglages d’instruments à l’aide de perles de taille spécifique pour s’assurer que les populations cellulaires les plus petites et les plus grandes peuvent être détectées, une stratégie de contrôle pour éliminer les débris, les amas cellulaires, la contamination des SEC et d’autres cellules mortes, et enfin, une mesure de contrôle de la qualité pour s’assurer qu’un échantillon d’expectorations provient du poumon au lieu d’être principalement de la salive.

Il y a des étapes critiques dans le protocole pour travailler avec les expectorations qui méritent d’être soulignées. Tout d’abord, le rendement cellulaire peut être considérablement affecté par le nombre de crépines de cellules en nylon utilisées à l’étape 2.5 de la partie dissociation des expectorations du protocole. Plusieurs crépines peuvent être nécessaires pour éviter de perdre trop de cellules en raison du colmatage de la passoire. Lorsque le débit à travers les crépines a sensiblement ralenti, une nouvelle crépine doit être utilisée. Deuxièmement, la pastille cellulaire des échantillons d’expectorations peut être très lâche, surtout s’il y a une forte contamination des SEC. Par conséquent, il est essentiel de ne pas aspirer trop près de la pastille lors du retrait du surnageant après avoir centrifugé les échantillons. Aspirer trop près de la pastille peut entraîner la perte de cellules, voire la perte de la pastille entière. Troisièmement, ce protocole nécessite une étape de fixation. Cela préserve les cellules et leur profil de coloration et sert de mesure de sécurité pour protéger l’opérateur du cytomètre en flux. Les échantillons en cours d’exécution sur certains cytomètres en flux peuvent présenter des risques biologiques accrus en raison du potentiel de production d’aérosols39. La fixation du PFA aide à protéger l’opérateur contre les agents pathogènes potentiels dans l’échantillon d’expectorations. Quatrièmement, et peut-être l’aspect le plus difficile de la préparation d’échantillons d’expectorations pour l’analyse cytométrique en flux, est le comptage cellulaire. Le comptage cellulaire est compliqué en raison de la grande variété de types de cellules présentes dans les expectorations. Les machines de comptage sont souvent limitées par la gamme de taille des cellules qu’elles peuvent capturer et sont donc moins fiables qu’un hémocytomètre. Cependant, le comptage cellulaire des échantillons d’expectorations par hémocytomètre, qui est excellemment décrit par Guiot et al.20, est fastidieux et nécessite de la pratique pour devenir compétent. Un nombre précis de cellules est essentiel pour déterminer le volume final de remise en suspension de l’échantillon afin de permettre un débit raisonnable et d’éviter les bouchons dans le cytomètre en flux. La présence des très gros SEC dans les expectorations et les nombreux amas cellulaires plus petits qui ne sont pas brisés par le tampon de dissociation, ni capturés par les filtres, augmentent la probabilité d’obstruer le cytomètre en flux. Par conséquent, il est recommandé de passer un certain temps à déterminer la meilleure concentration cellulaire / débit pour l’acquisition de données à l’aide du cytomètre en flux disponible. De plus, assurez-vous que le cytomètre en flux a la taille appropriée de la cellule d’écoulement et de la buse (ou de la sonde) capable de mesurer les plus grandes populations de cellules présentes dans les expectorations.

Même lorsque la maîtrise du comptage cellulaire a été atteinte, il s’agit toujours d’un processus qui prend beaucoup de temps. Par conséquent, la détermination des réactifs pour le marquage des cellules dans ce protocole est basée sur la taille de l’échantillon (jugée par le poids) plutôt que sur le nombre de cellules. Cela permet une utilisation plus efficace du temps puisque le comptage manuel des cellules peut être effectué pendant le temps nécessaire à la coloration des anticorps et du colorant de viabilité. Cependant, il y a trois exceptions notables à cela. Si un échantillon est >16 g (les échantillons dits extra-larges), le comptage manuel des cellules doit avoir lieu avant la coloration afin que les réactifs coûteux puissent être conservés en ne colorant que 25 x 106 cellules chacune pour le sang et les tubes épithéliaux. Ce numéro de cellule donne des profils très fiables dans les paramètres décrits dans ce protocole. Une autre exception potentielle est le cas d’un très petit échantillon. L’estimation est qu’un minimum de 1-2 x 106 cellules est nécessaire pour l’analyse de cytométrie en flux telle que présentée dans ce protocole afin de générer des profils fiables (données non montrées). Par conséquent, si un échantillon contient moins de 1-2 x 106 cellules, il peut ne pas être utile de poursuivre la procédure car le résultat final sera probablement inacceptable.

Les réactifs de marquage spécifiques qui fonctionnent bien sur les cellules sanguines périphériques ou les lignées cellulaires peuvent fonctionner très différemment sur les cellules sanguines contenues dans les expectorations (observations non publiées). Par conséquent, il est recommandé de titrer chaque anticorps ou autre réactif de marquage selon des protocoles bien établis34,35 avant qu’ils ne soient utilisés dans des expériences de cytométrie en flux. La plupart des titrations d’anticorps devraient donner des résultats comparables lors de la coloration jusqu’à 10 à 50 fois; cependant, il est conseillé de faire des titrages supplémentaires avec un nombre de cellules supérieur à cette plage34. Lorsqu’une concentration de réactif a été déterminée, il est essentiel de maintenir le temps d’incubation de ce réactif le même que dans l’expérience réelle. Pour cette raison, le protocole stresse l’ajout de tout le tampon et des réactifs aux tubes avant l’ajout des cellules ou des billes de compensation. Cet ordre d’ajout de réactifs et de cellules/billes permet une plus grande cohérence dans les temps d’étiquetage. Si, pour une raison quelconque, le temps d’incubation expérimental ne peut pas être maintenu similaire à celui utilisé pour le titrage des anticorps / colorants, ce dernier doit être répété avec un temps d’incubation réalisable pendant les expériences.

Les échantillons d’expectorations ont été largement utilisés comme échantillon diagnostique pour étudier la physiopathologie de diverses maladies affectant le poumon. La tuberculose40,41, la BPCO13,42, l’asthme43, la fibrose kystique44,45, le cancer du poumon46,47,48 et la polyarthrite rhumatoïde49 font partie des nombreuses maladies où les expectorations ont été étudiées en raison de l’avantage d’être un échantillon obtenu de manière non invasive. Plus récemment, pendant la pandémie de coronavirus, les expectorations ont été utilisées pour détecter l’excrétion virale prolongée chez les patients hospitalisés pour la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19)50.

Diverses technologies, y compris la réaction en chaîne par transcription inverse-polymérase (RT-PCR), l’analyse des protéines, la microscopie et la cytométrie en flux, ont été utilisées pour identifier les marqueurs spécifiques à la maladie dans les expectorations. L’utilisation d’une plate-forme cytométrique en flux pour analyser des échantillons d’expectorations n’est pas largement utilisée, mais son utilisation augmente. Avec les progrès récents dans la technologie des cytomètres en flux3,51,52, ainsi que les progrès dans les chimies des fluorophores, la génération de nouveaux clones d’anticorps et le développement de divers colorants pour identifier les populations de cellules mortes51,53,54, la possibilité de concevoir des panels d’anticorps visant à diagnostiquer les maladies humaines a considérablement augmenté. De plus, la récente poussée en faveur de l’automatisation de l’analyse des données cytométriques en flux55,56 éliminera le biais potentiel dans la lecture et l’interprétation manuelles des données de flux. Ces nouveaux développements en cytométrie en flux faciliteront considérablement l’exploration des expectorations en tant que diagnostic clinique.

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Disclosures

Tous les auteurs sont des employés passés ou actuels de bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier David Rodriguez pour son aide dans la préparation de la figure. Des échantillons d’expectorations ont été exécutés sur le BD LSR II à l’UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, soutenu par UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC à UT Health) et UL1 TR001120 (subvention CTSA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix Polysciences 25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 Fisher Scientific 08-771-19
3 M NaOH EMD SX0593-1
50 mL conical falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
Alexa488 anti-human CD19 BioLegend 302219
Alexa488 anti-human CD3 BioLegend 300415
Alexa488 anti-human cytokeratin BioLegend 628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype BioLegend 400129
BV510 anti-human CD45 BioLegend 304036
CD66b FITC isotype BD Biosciences 555748
CompBead Plus Compensation Beads BD Biosciences 560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL Fisher Scientific 09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL Fisher Scientific 09-761-10
CS&T beads BD Biosciences 655051
DTT Fisher Scientific BP172-5
FITC anti-human CD66b GeneTex GTX75907
Fixable Viability Stain BD Biosciences 564406
FlowCheck Beckman Coulter A69183
FlowSet Beckman Coulter A69184
HBSS Fisher Scientific 14-175-095
NAC Sigma-Aldrich A9165
NIST Beads, 05 μM Polysciences 64080
NIST Beads, 20 μM Polysciences 64160
NIST Beads, 30 μM Polysciences 64170
PE anti-human CD45 BioLegend 304039
PE-CF594 anti-human EpCAM BD Biosciences 565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype BD Biosciences 562292
PE-CR594 anti-human CD206 BD Biosciences 564063
Sodium citrate dihydrate EMD SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061

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References

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Médecine numéro 174
Analyse des expectorations de qualité contrôlée par cytométrie en flux
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Grayson, M., Lai, S. C., Bederka, L. … More

Grayson, M., Lai, S. C., Bederka, L. H., Araujo, P., Sanchez, J., Reveles, X. T., Rebel, V. I., Rebeles, J. Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (174), e62785, doi:10.3791/62785 (2021).

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