Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تحليل البلغم الذي يتم التحكم فيه بالجودة حسب قياس التدفق الخلوي

Published: August 9, 2021 doi: 10.3791/62785
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1bioAffinity Technologies, 2Department of Cell Systems & Anatomy, The University of Texas Health Science Center at San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لعدم ربط البلغم بتعليق خلية واحدة والتوصيف اللاحق للمجموعات الفرعية الخلوية على منصات قياس التدفق الخلوي القياسية.

Abstract

يتم تحليل البلغم ، الذي يستخدم على نطاق واسع لدراسة المحتوى الخلوي والميزات الأخرى للبيئة الدقيقة لفهم صحة الرئة ، تقليديا باستخدام منهجيات قائمة على علم الخلايا. فائدته محدودة لأن قراءة الشرائح تستغرق وقتا طويلا وتتطلب موظفين متخصصين للغاية. وعلاوة على ذلك، فإن الحطام الواسع النطاق ووجود عدد كبير جدا من الخلايا الظهارية الحرشفية ، أو خلايا الخد ، غالبا ما يجعل العينة غير كافية للتشخيص. وعلى النقيض من ذلك، يسمح قياس التدفق الخلوي بطباعة الخلايا ذات الإنتاجية العالية مع استبعاد الحطام ومركبات الكربون المستدامة في نفس الوقت.

يصف البروتوكول المعروض هنا طريقة فعالة لتفكيك البلغم إلى تعليق خلية واحدة ، وصمة عار الأجسام المضادة وإصلاح المجموعات الخلوية ، والحصول على عينات على منصة قياس التدفق الخلوي. استراتيجية gating التي تصف استبعاد الحطام والخلايا الميتة (بما في ذلك الشركات الصغيرة والمتوسطة) ومزدوجات الخلية معروضة هنا. علاوة على ذلك ، يشرح هذا العمل أيضا كيفية تحليل خلايا البلغم الواحدة القابلة للتطبيق استنادا إلى مجموعة من التمايز (CD)45 مجموعات سكانية إيجابية وسلبية لتوصيف مجموعات فرعية من النسب الدموي والظهاري. كما يتم توفير مقياس لمراقبة الجودة من خلال تحديد الضامة الخاصة بالرئة كدليل على أن العينة مشتقة من الرئة وليست لعابا. وأخيرا، فقد ثبت أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على منصات مختلفة من خلال توفير ملامح البلغم من نفس المريض تحليلها على ثلاثة مقاييس تدفق الخلايا. نافيوس EX، LSR الثاني، ولريك. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول ليشمل علامات خلوية إضافية ذات أهمية. يتم تقديم طريقة لتحليل عينة البلغم بأكملها على منصة قياس التدفق الخلوي هنا التي تجعل البلغم قابلا لتطوير تشخيص عالي الإنتاجية لمرض الرئة.

Introduction

وقد أتاحت التطورات التقنية في أجهزة وبرامج مقاييس التدفق الخلوي تحديد العديد من مجموعات الخلايا المتميزة في وقت واحد1,2,3,4. على سبيل المثال، أدى استخدام مقياس التدفق الخلوي في أبحاث الخلايا الدموية إلى فهم أفضل بكثير للجهاز المناعي2 والتسلسل الهرمي الخلوي للنظام الدموي(5)، فضلا عن التمييز التشخيصي للعديد من أنواع سرطان الدم المختلفة6,7,8. على الرغم من أن معظم خلايا البلغم هي من أصل دموي9,10,11, لم يتم تطبيق قياس التدفق الخلوي على نطاق واسع لتحليل البلغم لأغراض التشخيص. ومع ذلك، تشير العديد من الدراسات إلى أن تقييم مجموعات الخلايا المناعية في البلغم (أهم مجموعة فرعية من الخلايا) قد يكون عونا كبيرا في تشخيص و/أو مراقبة أمراض مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)12,13,14,15. وعلاوة على ذلك، فإن وجود علامات خاصة بالظهارية التي يمكن استخدامها في قياس التدفق الخلوي يسمح باستجواب المجموعة الفرعية التالية الأكثر أهمية من الخلايا في البلغم، خلايا ظهارية الرئة.

بالإضافة إلى القدرة على تحليل العديد من مجموعات الخلايا المتميزة من أصول أنسجة مختلفة ، يمكن لقياس التدفق أن يقيم أعدادا كبيرة من الخلايا في فترة قصيرة نسبيا. وبالمقارنة، فإن أنواع التحليلات المستندة إلى الشرائح والسيكلوتية كثيرا ما تتطلب موظفين و/أو معدات عالية التخصص. يمكن أن تكون هذه التحليلات كثيفة العمالة ، مما يؤدي إلى تحليل نسبة فقط من عينة البلغم16.

تحد ثلاث قضايا حرجة من الاستخدام الواسع النطاق للسبيتوم في قياس التدفق الخلوي. تتعلق المشكلة الأولى بمجموعة البلغم. يتم جمع البلغم من خلال سعال النفخ الذي يطرد المخاط من الرئتين إلى تجويف الفم ، ويبصق لاحقا في كوب جمع. منذ المخاط يسافر من خلال تجويف الفم، وهناك فرصة كبيرة للتلوث SEC. هذا التلوث يعقد تحليل العينة ، ولكن يتم تصحيح المشكلة بسهولة على منصة قياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح في هذه الدراسة.

ليس كل شخص يمكن أن تنتج البلغم تلقائيا; لذلك ، تم تطوير العديد من الأجهزة للمساعدة في جمع البلغم بطريقة غير الغازية17. البخاخات هو واحد من هذه الأجهزة، وقد ثبت لإنتاج عينات البلغم موثوق بها18,19,20. على الرغم من أن البخاخات هي وسيلة فعالة جدا لجمع البلغم غير الغازية ، إلا أن استخدامه لا يزال يتطلب إعدادا في منشأة طبية مع موظفين متخصصين21. في المقابل، يمكن استخدام الأجهزة المحمولة مثل الناي الرئة22,23,24 و acapella16,25 في المنزل لأنها سهلة الاستخدام للغاية. هذه الأجهزة مساعدة على حد سواء آمنة وفعالة من حيث التكلفة.

بالنسبة لنا، أعطى أكابيلا نتائج أفضل باستمرار من الناي الرئة16، وبالتالي، تم اختيار جهاز أكابيلا لمجموعات البلغم. تم تحديد عينة جمع لمدة 3 أيام لأن الغرض الأساسي لاستخدام البلغم هو تطوير اختبار الكشف عن سرطان الرئة16. وقد تبين أن عينة لمدة 3 أيام يزيد من احتمال الكشف عن سرطان الرئة مقارنة مع عينة 1-أو 2-يوم26,27,28. ومع ذلك، قد تكون أساليب أخرى لجمع البلغم الأفضل لأغراض مختلفة. إذا تم استخدام طريقة مختلفة لجمع البلغم من تلك الموصوفة هنا ، فمن المستحسن أن تثن بعناية كل الأجسام المضادة أو الصبغة المستخدمة لتحليل تدفق القياسات الخلوية ؛ تتوفر بيانات قليلة جدا حول كيفية تأثير طرق جمع البلغم المختلفة على البروتينات المستهدفة لقياس التدفق الخلوي.

القضية الثانية التي تقلل من الحماس لاستخدام البلغم للتشخيص ، تتعلق في المقام الأول بتدفق قياس الخلايا ، هو رقم الخلية. المشكلة هي جمع خلايا كافية قابلة للحياة لتحليل موثوق بها. أظهرت دراستان أن عينات البلغم التي تم جمعها بطرق غير جراحية ، بمساعدة جهاز مساعدة ، تحتوي على ما يكفي من الخلايا القابلة للحياة التي يمكن استخدامها في التشخيص السريري أو الدراسات البحثية16،24. ومع ذلك، لم تتناول أي من هاتين الدراستين مسألة أرقام الخلايا المتعلقة ب قياس التدفق الخلوي.

بالنسبة للدراسات التي تشكل الأساس لهذا البروتوكول، تم جمع عينات البلغم من المشاركين المعرضين لخطر كبير للإصابة بسرطان الرئة باتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية المعتمدة لكل موقع دراسة. تم تعريف المشاركين المعرضين لخطر كبير على أنه بين 55-75 سنة ، بعد أن دخنوا 30 عاما ولم يقلعوا عن التدخين خلال السنوات ال 15 الماضية. وقد تبين للمرضى كيفية استخدام جهاز أكابيلا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة29 وجمع البلغم لمدة ثلاثة أيام متتالية في المنزل. تم الاحتفاظ بالعينة في الثلاجة حتى المجموعة الأخيرة. وفي يوم الجمع الأخير، شحنت العينة إلى المختبر طوال الليل مع حزمة باردة مجمدة. وقد عولجت العينات لتصبح تعليقا لزنزانة واحدة في اليوم الذي وردت فيه. مع هذه الطريقة لجمع البلغم، يتم الحصول على أكثر من ما يكفي من الخلايا القابلة للحياة لتحليل التدفق الخلوي موثوق بها.

وأخيرا، والمتعلقة المشكلة رقم الخلية السابقة، هو السؤال عن كيفية تحرير خلايا البلغم من بيئتها mucinous. كيف يمكن الحفاظ على الخلايا قابلة للحياة وخلق تعليق خلية واحدة لا تسد مقياس التدفق الخلوي؟ استنادا إلى العمل الأولي من قبل Pizzichini et al.30 و Miller et al.31 ، يصف هذا البروتوكول طريقة سهلة وموثوقة لمعالجة البلغم في تعليق خلية واحدة مناسبة لتحليل التدفق الخلوي. وقد استخدمت هذه الطريقة مبادئ توجيهية راسخة في تدفق الخلايا32,33,34 لوضع استراتيجية فعالة لوضع العلامات على الأجسام المضادة لتحديد الخلايا الدموية والظهارية في البلغم وتوفير إعدادات الأداة، وتدابير مراقبة الجودة، والمبادئ التوجيهية للتحليل توحيد تحليل البلغم على منصة تدفق الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتم تنفيذ جميع خطوات معالجة البلغم في خزانة السلامة البيولوجية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.

1. إعداد الكاشف قبل البدء في تفكك البلغم

  1. إذابة 1٪ بارافورمالديهايد (PFA)، 25 مل لكل عينة على الجليد، والحفاظ على البرد حتى الاستخدام.
    تنبيه: PFA سام عن طريق الاستنشاق والاتصال بالبشرة. إعداد المثبت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتجميد في -20 درجة مئوية في 25 مل aliquots حتى الاستخدام.
  2. تقريب وزن العينة وذوبان ما يكفي من 0.1٪ Dithiothreitol (DTT) للخطوة 2.2 وبذلك إلى 37 درجة مئوية. (يجب تخزين الاقتباسات من DTT عند -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.)
  3. جلب ما يكفي 0.5٪ N-أسيتيل- L-السيستين (NAC) تصل إلى 37 درجة مئوية للخطوة 2.2. (يجب أن يتم إجراء NAC جديدة أسبوعيا وتخزينها في 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.)

2. فصافر البلغم

  1. وزن عينة البلغم لتحديد أحجام الكواشف التفكك.
    ملاحظة: تعتبر العينة صغيرة إذا كان الوزن الأولي ≤3 غرام، ومتوسطة إذا كانت >3 غرام ولكن ≤8 غرام، وكبيرة إذا كانت >8 ولكن ≤16 غرام، وكبيرة جدا إذا كانت العينة تزن >16 غرام. سيتم استخدام المؤشرات الصغيرة والمتوسطة والكبيرة والكبيرة للغاية في جميع أنحاء البروتوكول. تختلف كمية الكواشف المطلوبة للتفكك ووضع العلامات وفقا لحجم عينة البلغم.
  2. نقل عينة صغيرة إلى أنبوب نظيف مخروطي 50 مل، عينة متوسطة إلى زجاجة نظيفة 250 مل البلاستيك المتاح، أو عينة كبيرة وكبيرة جدا إلى زجاجة نظيفة 500 مل البلاستيك المتاح. أضف وزن عينة 1 مل/غرام من 0.5٪ NAC و4 مل/غرام وزن عينة 0.1٪ DTT.
  3. دوامة بأقصى سرعة (لمدة 15 s)، ثم الصخور في درجة حرارة الغرفة (بأقصى سرعة) لمدة 15 دقيقة.
  4. تمييع العينة بأربعة مجلدات من محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS) (استنادا إلى الحجم الإجمالي للعينة + الكواشف) لتحييد NAC و DTT؛ دوامة بسرعة بأقصى سرعة والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في أقصى سرعة.
  5. تصفية تعليق الخلية من خلال 100 ميكرومتر من النايلون شبكة الخلية مصفاة (ق) في واحد أو أكثر من 50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطي (ق) لإنشاء تعليق خلية واحدة.
  6. طرد الخلايا في 800 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. يستنشق supernatant، والجمع بين جميع الكريات في أنبوب واحد مخروطي 15 مل، ومن ثم غسل الكريات مع HBSS باستخدام نفس الشروط.
  7. Resuspend بيليه الخلية في حجم العازلة التي يحددها الوزن الأولي للعينة البلغم.
    ملاحظة: يتم إعادة إنفاق عينة صغيرة في 250 ميكرولتر من HBSS. يتم إعادة إنفاق عينة متوسطة في 760 ميكرولتر من HBSS. يتم إعادة إنفاق عينات كبيرة وكبيرة جدا في 1460 ميكرولتر من HBSS.
  8. اتخاذ aliquot تعليق الخلية لعدد الخلايا الحية / الميتة باستخدام تريبان الأزرق.
    ملاحظة: لعينة صغيرة، استخدم 5 ميكرولتر. لعينة متوسطة أو كبيرة أو كبيرة جدا، استخدم 10 ميكرولتر. تمييع 1:10 مع HBSS.
    1. مزيج 10 ميكرولتر من تخفيف البلغم مع 30 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان الأزرق لتحقيق تخفيف عينة النهائي من 1:40. تحميل في غرف العد من مقياس الدم لعد الخلايا.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري ضبط التخفيف النهائي إذا كانت أرقام الخلايا منخفضة جدا أو عالية جدا لتحقيق عدد دقيق. ينصح بشدة هنا باستشارات Guiot et al.20 للتمييز بشكل صحيح بين خلايا البلغم والحطام. وهذا أمر ضروري لعدد الخلايا دقيقة.
  9. من عينة كبيرة جدا، وإزالة 50 × 106 خلايا من المجموع وإضافة إلى أنبوب جديد مع ما يكفي من HBSS المضافة لخلق حجم إجمالي قدره 1700 ميكرولتر.
    ملاحظة: خذ بعين الاعتبار هذا نموذج كبير لبقية البروتوكول. يمكن التخلص من العينات المتبقية أو استخدامها لأغراض أخرى.

3. الأجسام المضادة وصبغة حيوية تلطيخ

  1. اختيار الأجسام المضادة وصبغ تلطيخ
    ملاحظة: يعرض الجدول 1 الأجسام المضادة وصبغة البقاء المستخدمة في هذا البروتوكول وخلايا الخلايا التي تحددها.
    1. تسمية الأنابيب التي تحتوي على خلايا البلغم (انظر الجدول 2 للتسميات).
    2. استخدام أنابيب قياس الخلايا تدفق 5 مل (متوافقة مع تدفق السيتومتر المستخدمة) للأنبوب عينة مع الخلايا غير الملطخة وأنبوب مع التحكم isotype. استخدام أنابيب مخروطية 15 مل لعينات الدم والأنابيب الظهارية.
      ملاحظة: سيتم نقل هذه العينات لتدفق أنابيب قياس الخلايا بعد تلطيخ الأجسام المضادة والتثبيت.
  2. تسمية أنابيب التعويض (الجدول 3).
    ملاحظة: استخدم أنابيب قياس الخلايا التدفق 5 مل متوافقة مع تدفق الخلايا المستخدمة.
  3. إضافة كمية HBSS والأجسام المضادة و / أو صبغ إلى كل من أنابيب الخلية البلغم وأنابيب التعويض على النحو المبين في الجدول 2 والجدول 3، على التوالي.
    ملاحظة: أضف العازلة (HBBS) والأجسام المضادة، وصبغ لجميع الأنابيب قبل إضافة خلايا أو حبات التعويض لضمان أن جميع أنابيب 'تلطيخ الوقت متسقة.
  4. إضافة كميات حجم الخلية البلغم المسرودة في الجدول 2 إلى أنابيب المقايسة.
  5. إضافة حبات التعويض إلى أنابيب التعويض كما هو مذكور في الجدول 3.
  6. احتضان جميع الأنابيب (أنابيب الفحص والتعويض) على الجليد، محمية من الضوء، لمدة 35 دقيقة. ثم، ملء الأنابيب مع HBSS الباردة الجليد والطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 800 × ز.
  7. لأنابيب التعويض، يستنشق supernatant أقرب إلى الكريات ممكن ونفض الغبار الكريات لتخفيف.
  8. أضف 0.5 مل من HBSS الباردة إلى أنابيب التعويض، وخزنها على الجليد عند 4 درجات مئوية وحمايتها من الضوء حتى الحاجة لتحليل قياس التدفق الخلوي.
  9. يستنشق الناطق الفائق من الأنابيب غير الملطخة ، والدم ، والأنابيب الظهارية بعد الطرد المركزي (الخطوة 3.6 من قسم تلطيخ الأجسام المضادة) وتخفيف الكريات عن طريق النقر على الأنابيب.

4. التثبيت مع 1٪ بارافورمالديهايد (PFA)

  1. إضافة الباردة 1٪ PFA (التي ينبغي إذابة الآن) إلى غير ملطخة، isotype، الدم، والأنابيب الظهارية. 2 مل إلى أنابيب غير ملطخة وisotype، و 10 مل إلى الدم والأنابيب الظهارية.
  2. احتضان الأنابيب على الجليد، محمية من الضوء لمدة ساعة واحدة. دوامة بسرعة بأقصى سرعة بعد 30 دقيقة.
  3. ملء الأنابيب مع HBSS الجليد الباردة. ثم أنابيب الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في 1600 س غ.
  4. يستنشق أكبر قدر ممكن من supernatant دون إزعاج بيليه الخلية ونفض الغبار أنبوب مع الأصابع لتخفيف الخلايا.
  5. إضافة 200 ميكرولتر من HBSS الباردة إلى أنابيب غير ملطخة وisotype.
  6. حساب حجم HBSS لإعادة إنفاق الدم وأنبوب الظهارية وفقا لإجمالي عدد الخلايا.
    ملاحظة: حجم إعادة الإنفاق = 0.15 x [إجمالي عدد الخلايا (الخطوة 8 من فصخ البلغم) / 106]. استخدم 50 × 106 كعدد الخلايا لعينة كبيرة جدا.
  7. تخزين جميع أنابيب العينة والتعويض، محمية من الضوء على الجليد في 4 درجة مئوية حتى يتم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: لم يتم اختبار هذا البروتوكول للتخزين لأكثر من 24 ساعة.

5. الحصول على البيانات على مقياس التدفق الخلوي

  1. تطبيق إجراءات بدء التشغيل المناسبة لقياس التدفق الخلوي المستخدم.
    ملاحظة: يفترض هذا القسم من البروتوكول أن الشخص الذي يشغل مقياس التدفق الخلوي مدرب على استخدام الأداة المتاحة له، ولا سيما فيما يتعلق بالإجراءات اليومية بما في ذلك التحقق من استقرار البصريات وأنظمة السوائل، وتقنيات توحيد تشتت الضوء وكثافة الفلورسينس، فضلا عن حساب وتطبيق مصفوفة التعويض الصحيحة.
  2. استخدام مزيج من المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST) الخرز لضمان أن يتم تعيين مبعثر إلى الأمام والجهدية مبعثر الجانب لوضع الخرز NIST لتمتد قطعة الأرض بأكملها دون وضع الخرز قريبة جدا من المحاور.
    ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لضمان إزالة الحطام الذي تقل كميةه عن 5 ميكرومترات عن طريق تحليل ما بعد الاقتناء. اعتمادا على مقياس التدفق الخلوي المستخدم، يجب أن تضع في اعتبارك أن أصغر الخرز لا يتم استبعادها مع العتبة (عند استخدام LSR II أو Lyric) أو مع التمييز العالي (باستخدام مقياس تدفق Navios EX). لS NAVIOS EX، تم استخدام مكسب من 2 للتشتت إلى الأمام والجانب، والجهد من 236 للتشتت إلى الأمام، و 250 للتشتت الجانب. بالنسبة إلى LSR II ، تم استخدام جهد مبعثر أمامي من 165 وجهد جانبي مبعثر من 190.
  3. تعيين معدل التدفق إلى متوسط (LSR II) أو مرتفع (Navios EX).
    ملاحظة: يمكن استخدام معدل التدفق المتوسط أو المرتفع لمعظم الأدوات للحصول على أنابيب البلغم. من المهم ملاحظة أن استخدام بطيء جدا لمعدل التدفق أو تخفيف العينة قد يؤدي إلى استقرار الخلايا ، مما يؤدي إلى زيادة الدوامة التي ليست مرغوبة. ولذلك، فإن الالتزام بحجم إعادة الإنفاق المحسوب في الخطوة 4.6 يجب أن يؤدي إلى كثافة خلوية يمكن الحصول عليها بسرعة ولكن ليس تسد الجهاز.
  4. ضبط الفولتية لكل معلمة تستخدم لمعلمات مبعثر والفلورسنت لوضع السكان الخلية على مقياس. استخدام الأرقام مع استراتيجية gating وارشادات حول كيفية ضبط الفولتية وفقا لذلك.
    ملاحظة: تأكد من تحديد كافة المعلمات المطلوبة في إطار تحديد المعلمة قبل اكتساب أو أن البيانات لن يتم الحصول عليها.
  5. الحصول على بيانات لعينة البلغم غير الملطخة أولا، تليها عينة isotype الملطخة، ومن ثم أنبوب الدم وأنبوب الظهارية.
    ملاحظة: إذا كان تعليق الخلية مركزا جدا بحيث لا يسمح لقياس التدفق الخلوي بتشغيل العينات دون انسداد، فقد يتم تخفيف العينات بشكل أكبر باستخدام HBSS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تطوير هذا البروتوكول مع وضع مختبر سريري في الاعتبار. وكان التركيز أثناء وضع البروتوكول على البساطة والكفاءة والقابلية للاستنساخ. ووجد أن الخطوة الأكثر استهلاكا للوقت في معالجة البلغم كانت عد الخلايا. لذلك، يتم إعداد البروتوكول بطريقة يمكن بها معالجة البلغم ووضع العلامات على الخلايا بشكل مستقل عن عد الخلايا دون فقدان الوقت. ويمكن بعد ذلك الحصول على عدد دقيق للخلايا، وهو أمر لا يزال ضروريا لتمييع العينة بشكل مناسب لتشغيل دون عائق، خلال فترة حضانة وضع العلامات على الأجسام المضادة.

يستخدم هذا البروتوكول مقياس وزن البلغم بدلا من تعداد الخلايا كمؤشر على مقدار الأجسام المضادة/الصبغة التي يجب استخدامها لوضع العلامات المثالية للخلايا. ومع ذلك ، هناك درجة كبيرة من الاختلاف في وزن عينات البلغم ؛ من العينات 126 التي تم تحليلها، تراوح الوزن من 0.57 غرام إلى 38.30 غرام الشكل 1A يظهر أن العلاقة بين وزن البلغم والخلية العائد ليست قوية. ولذلك، قسمت العينات إلى أربع فئات؛ وكان متوسط وزن العينات 2.1 غرام للعينات الصغيرة، و 5.0 غرام للعينات المتوسطة، و 11.2 غرام للعينات الكبيرة، و 22.0 غرام للعينات الكبيرة جدا (الشكل 1ب). ومع ذلك، لا تزال هناك عينات أسفرت عن خلايا أكثر بكثير مما كان متوقعا على أساس وزنها (الشكل 1C)، فإن غالبية العينات تتجمع بشكل جيد. وبالنسبة للعينات الصغيرة، كان متوسط إنتاج الخلية 8.0 × 106 خلايا، للعينات المتوسطة 13.0 × 106، للعينات الكبيرة 35.4 × 106، والعينات الكبيرة جدا 93.0 × 106.

كل الأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول تم ثديها. وقد اختير تركيز على مرحلة الهضبة (الشكل 2A) الذي له أعلى مؤشر تلطيخ (الشكل 2B) لمنحنى المعايرة كمركز عامل. الاختلافات في أعداد الخلايا لن تغير بشكل كبير من كثافة تلطيخ. هذا المعايرة والفحص المضاد ضروري ويجب إعداده بعناية لكل الأجسام المضادة الجديدة أو الصبغة المستخدمة في هذا البروتوكول34,35. عندما يتم ثدي الجسم المضاد بعناية ، يجب أن يلطخ خلايا أكثر من 10 إلى 50 ضعفا من عدد الخلايا التي تم تثقيت الجسم المضاد عليها34،35. 10- وترد في الجدول 4 مثال على هذا المبدأ. تم ثدي الأجسام المضادة للانسان CD45-PE على 1 × 106 خلايا في حجم إجمالي قدره 400 ميكرولتر. إذا استقراء هذا الجسم المضاد لحجم التلطيخ على البروتوكول (انظر الجدول 2، الذي يظهر كمية CD45-PE وأحجام التلطيخ لكل حجم عينة)، لعينة صغيرة، سيتم تلوين 0.625 × 106 خلايا، وسيتم تلوين 1.25 × 106 خلايا لعينة متوسطة، و 2.5 × 106 خلايا لعينة كبيرة (العمود A في الجدول 4). يتم حساب زيادة 50 ضعفا في عدد الخلايا لكل فئة لتكون 31.25 × 106 و 62.5 × 106 و 125 × 106 خلايا على التوالي (العمود B). وكما هو مبين في العمودين جيم و د، فإن متوسط عدد الخلايا لكل فئة من فئات الحجم وأكبر عينة في كل فئة يقعان ضمن نطاق 50 ضعفا.

على الرغم من الاختلافات الواضحة في الحجم وغلة الخلية بين الأحجام المختلفة لعينات البلغم ، فإن متوسط تلوث SEC في كل فئة متشابه جدا. ويبين الشكل 3 ألف النسبة المئوية لمراكز النامية المستدامة الموجودة في عينات فردية، مصنفة حسب فئات وزنها البلغم. وكان الشاغل الرئيسي مع SECs لأن هذه الخلايا لا تمثل أنسجة الرئة ولكن من تجويف الفم. ومع ذلك، فإن متوسط التلوث SEC هو أقل من 20٪ لجميع الفئات. ويبين الشكل 3 باء النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة الموجودة في هذه العينات. وباستثناء الشركات الصغيرة والمتوسطة الحجم، كان متوسط الجدوى حوالي 72٪ لفئات حجم العينة الصغيرة والمتوسطة والكبيرة. وكان أعلى قليلا (79٪) بالنسبة للفئة خارج كبيرة.

ويبين الشكل 4 استراتيجية نموذجية لفصل خلايا البلغم ذات الأهمية عن الحطام والخلايا الميتة (التي تشمل أيضا مركبات الكربون الهيدروفلورية الملوثة36) وكتل الخلايا. ويبين الشكل 4 ألف استخدام حبات NIST لتعيين بوابات لإزالة الحطام الذي تقل مساحته عن 5 ميكرومتر أو أكبر من 30 ميكرومتر، في حين يطبق الشكل 4B هذه البوابة على خلايا البلغم. يظهر الشكل 4C ملف تعريف البلغم نموذجي عند عرضها كعرض مبعثر جانبي (SSC-W) مقابل عرض مبعثر أمامي (FSC-W)، بوابة العرض. يستخدم هذا الملف الشخصي لإزالة الحطام الصغير الذي يقدم نفسه على طول محاور SSC-W و FSC-W. ويظهر القضاء على الخلايا الميتة في الشكلين 4D والشكل 4E. يتم استخدام عنصر التحكم غير الملون (الشكل 4D) لتحديد قطع الإيجابية FVS510; تعتبر الخلايا التي تلطخ إيجابية لFVS510 فوق عنصر التحكم السلبي ميتة ولن تستخدم في تحليل خلايا البلغم (الشكل 4E). وأخيرا، يتم تطبيق بوابة مفردة لإزالة مزدوجات الخلية من التحليل، والتي تظهر في الشكل 4F. وهكذا، تمثل الخلايا التي تم إجراؤها من خلال بوابات الاختيار الموضحة في الشكل 4B والشكل 4C والشكل 4E والشكل 4F خلايا البلغم المفردة الحية الجاهزة للتحليل اللاحق مع الأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول.

يسمح استخدام الأجسام المضادة للCD45 في بروتوكول وضع العلامات هذا بفصل خلايا البلغم الحية والفردية في مقصورة خلايا الدم (CD45+) ومقصورة الخلية غير الدموية (CD45-). وتشمل الفئة الأخيرة الخلايا الظهارية وغيرها من الخلايا غير الدموية. يظهر الملف الشخصي العلوي في الشكل 5A استخدام عينة البلغم غير الملون لتعيين القطع لإيجابية CD45 ، مما يجعل البوابات لالتقاط خلايا CD45 + وخلايا CD45. يظهر الملف السفلي للشخصية 5A تطبيق هاتين البوابتين على عينة البلغم الملطخة بالأجسام المضادة للCD45. ثم يتم استخدام تلطيخ مع أجسام مضادة إضافية لتحديد مجموعات خلايا الدم الخاصة داخل بوابة CD45 + (الشكل 5B) وغيرها من السكان غير خلايا الدم، بما في ذلك السكان الظهارية في CD45- بوابة (الشكل 5C). في كلا الشكلين، تظهر الملفات الشخصية العليا كيفية استخدام البلغم الملطخ بالنمط المتساوي لتعيين المجموعات السكانية السلبية المزدوجة، في حين تظهر الملفات الشخصية السفلية خلايا البلغم الملطخة بالأجسام المضادة. الشكل 5B (أسفل) يظهر ست مجموعات مختلفة من خلايا CD45 + التي تم إنشاؤها مع مزيج من الأجسام المضادة التي يمكن اكتشافها في قناة 1 مضان (FL) (مكافحة CD66b، CD3، CD19 الأجسام المضادة) ومكافحة CD206 يمكن الكشف عنها في قناة FL3. وقد كشفت تجارب الفرز أن الضامة الرئة محددة يقيمون في البوابات التي تم تحديدها مع M. وبالتالي فإن وجود خلايا في هذه البوابات يشير إلى أن عينة البلغم كانت مشتقة من الرئة ولم تكن لعابا (بيدركا وآخرون، مخطوطة قيد الإعداد). الشكل 5C (أسفل) يظهر رباعيات gating التي تم إنشاؤها باستخدام المضادة لعموم cytokeratin (بانك) يمكن الكشف عنها في قناة FL1 ومكافحة الالتصاق الخلايا الظهارية جزيء (EpCAM) الأجسام المضادة للكشف في قناة FL3 بين خلايا CD45- البلغم.

تم اختبار بروتوكول وضع العلامات هذا على نطاق واسع على Navios EX وLSR II. أجريت بعض التجارب الأولية على ليريك، ولكن من دون التحسين أداة واسعة النطاق التي تم القيام به للآلتين الأخريين. لذلك، يتم توفير إعدادات أداة مفصلة ل NAVIOS EX وLSR II في ورقة المواد، ولكن ليس لليريك. لفهم أوجه التشابه والاختلافات بين هذه المنصات الخلوية التدفق الثلاثة التي يمكن استخدامها لتحليل خلايا البلغم، يمكن مقارنة ملامح التي تم الحصول عليها من مختلف الآلات في الشكل 6 والشكل 7. تمت معالجة عينتين من البلغم الكبيرين وتجميعهما ووضع العلامات عليهما وفصلهما إلى ثلاثة أجزاء متساوية، وتم الحصول عليهما لاحقا على كل مقياس للخلايا المتدفقة المذكور أعلاه. يقارن الشكل 6، الذي يشبه الشكل 4، استراتيجية التخلص من الحطام والخلايا الميتة وكتل الخلايا. يقارن الشكل 7، الذي يتطابق مع الشكل 5، ملامح الدم وغير الدم من البيانات المكتسبة على مقاييس التدفق الخلوي المختلفة.

مقارنة مختلف ملامح التي تم الحصول عليها من ثلاثة مقاييس تدفق مختلفة تبين أن نفس ملامح الأساسية يمكن ملاحظتها مع كل صك. الاختلافات التي يجب الانتباه إليها هي مؤامرات SSC-W/FSC-W (بوابة العرض) (الشكل 6، الصف الثاني) والمقاييس الخطية للمؤامرات المتناثرة (الشكلان 6 و 7). تظهر مؤامرة عرض التشتت التي تم إنشاؤها على Navios EX بوابة تضمين (مربع أحمر) ، مما يعني أن جميع الخلايا المضمنة في البوابة يتم تحليلها بشكل أكبر؛ يتم استبعاد الأحداث على طول المحاور في الزاوية اليسرى السفلية. عرض المؤامرات مبعثر على LSR II، و Lyric لا تظهر إيداع مماثل للأحداث على طول هذه المحاور نفسها. ومن المرجح أن يكون هذا التباين راجعا إلى العتبة الحساسة جدا المستخدمة في نظام Navios EX، مما يؤدي إلى وجود بعض الحطام الصغير في بوابة استبعاد الحجم السابقة (الصف العلوي من الشكل 6). في بعض الأحيان ، وينظر إلى الحطام على طول المحاور في ملف تعريف عرض مبعثر ولدت على LSRII ، لكنه في الزاوية اليمنى السفلى. وفي هذه الحالات، تستخدم بوابة استبعاد (كما هو مبين في المربع الأحمر المتقطع في الملف الوسطي في الصف 2 من الشكل 6) للقضاء على هذه الأحداث من مزيد من التحليل.

في حين أن جداول السجل تبدو مختلفة قليلا على المؤامرات بين NAVIOS EX والمقاييس الخلوية ليريك وLSR الثاني، فإن Navios EX لديها خيار الحصول على البيانات باستخدام عقود أخرى. ويعتمد تنفيذ عقود أخرى على سياق التجربة والحساسية المطلوبة لتصور السكان الذين يهمهم الأمر.

وثمة فرق ملحوظ إضافي بين Navios EX وLSR II وcytometers ليريك هو ظهور الملف الشخصي للبوابة singlet. تم تجهيز مقياس الخلايا Navios EX مع خلية تدفق مستطيلة مع زاوية جمع مختلفة عن LSR II. يحتوي Navios EX على ثلاث زوايا تجميع يتم التحكم فيها بواسطة البرامج لتحسين تشتت ضوء الزاوية الأمامية لتحقيق الحساسية المناسبة لحجم الجسيمات لتحليلها. يجب تعديل بوابة المضلع لمقياس الخلايا Navios EX إلى زاوية أقل قليلا من بوابة المفرد ل LSRII. يمكن تحسين بوابة singlet ل Lyric للحصول على ملف تعريف مشابه لتلك التي شوهدت مع LSR II. باستخدام عينة البلغم، فإن عامل قياس المنطقة تحتاج إلى تحسين لكل ليزر على Lyric لتحقيق بوابة مفردة مماثلة ل LSR II.

تم تحليل جميع الملفات الشخصية المعروضة في الشكل 4 إلى الشكل 7 باستخدام برنامج FlowJo ، الإصدار 10.6. يمكن العثور على ملفات .fcs في FlowRepository (https://flowrepository.org) ، تحت معرفات FR-FCM-Z3LX، FR-FCM-Z3MJ، و FR-FCM-Z3MM ويمكن استخدامها لممارسة تحليل البلغم كما هو موضح في هذه الأرقام.

Figure 1
الشكل 1: أوزان البلغم وعائد الخلية. (أ) المصور هو العلاقة بين وزن البلغم، الذي يتم تحديده قبل المعالجة، وإجمالي إنتاج الخلية، الذي يتم تحديده بعد المعالجة باستخدام مقياس الدم. يمثل كل رمز رصاصة عينة فردية، 126 في المجموع. (ب) تم تقسيم عينات البلغم إلى أربع فئات على أساس وزنها: صغيرة للعينات التي يصل وزنها إلى 3 غرام، ومتوسطة للعينات التي يزيد وزنها عن 3 غرام حتى 8 غرام، وكبيرة للعينات التي يزيد وزنها عن 8 غرامات تصل إلى 16 غرام، وعينات كبيرة جدا لأولئك الذين يزيد وزنهم عن 16 غرام (C) مبين توزيع غلة الخلايا للعينات في كل فئة. تمثل الأشرطة الحمراء في (B) و (C) القيم الوسيطة في كل فئة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: المعايرة المضادة للCD45-PE المضادة للإنسان. (أ) منحنى المعايرة CD45-PE (IgG1) مع متوسط كثافة الفلورسينس (MFI) للسكان الإيجابيين المرسومين مقابل تركيز هضاب الأجسام المضادة CD45-PE عند 1 ميكروغرام/مل. (ب) يظهر منحنى المعايرة الذي يصور مؤشر التلطيخ مقابل تركيز الأجسام المضادة أن أعلى مؤشر تلطيخ هو 1 ميكروغرام/مل. تم حساب مؤشر تلطيخ على النحو: [CD45 MFI السكان إيجابية - CD45 MFI السكان السلبية] / [2 * الانحراف المعياري]. واستنادا إلى الشكل 2 ألف والشكل 2B، اختير تركيز واحد ميكروغرام/مل كمركز أمثل للأجسام المضادة CD45-PE. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نسبة مراكز إعادة الخلايا الجذعية والخلايا الميتة في عينات البلغم متسقة بين فئات الوزن الأربع. (أ) تصنف نسبة الشركات الصغيرة والمتوسطة في عينات البلغم وفقا لفئة وزنها. تم تحديد النسبة المئوية لتلوث لجنة الأوراق المالية والبورصة عن طريق مقياس الدم كجزء من إجمالي عدد الخلايا. (ب) صلاحية الخلية لعينات البلغم باستثناء SECS، التي يحددها مقياس الدم وطريقة استبعاد التريبان الأزرق. تمثل الخطوط الحمراء القيم الوسيطة لكل رسم بياني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: استراتيجية غاتينغ لاستبعاد الحطام والخلايا الميتة والمزدوجات في عينة البلغم. (أ) استخدمت حبات NIST ذات أحجام 5 ميكرومتر و20 ميكرومتر و30 ميكرومتر لتعيين البوابة التي يشير إليها الصندوق الأحمر لاستبعاد الحطام الأصغر من 5 ميكرومتر والحطام الأكبر فوق 30 ميكرومتر وبالقرب من المحور. (ب) تم الحصول على عينة البلغم باستخدام نفس الفولتية للتشتت الأمامي والجانبي مثل حبات NIST. تم تطبيق البوابة التي تم إنشاؤها في (A) لاستبعاد الحطام. (ج) استبعدت حطام صغير قريب من المحور في هذه القطعة عرض مبعثر. (د) استخدمت عينة من البلغم غير الملطخ لتعيين قطع (الخط الأحمر) للسكان السلبية غير الملطخة لصبغة الجدوى. (ه) تم تطبيق القطع الذي تم إنشاؤه في D على عينة البلغم الملون لتشكيل بوابة (الصندوق الأحمر) لتشمل الخلايا الحية القابلة للحياة. (F) تستثني البوابة المفردة التي يشير إليها المضلع الأحمر الخلايا التي لا تقع على القطر، مما يزيل المزدوجات و/أو الكتل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تستخدم استراتيجية غاتينغ لخلايا البلغم في مقصورات الدم والخلايا غير الدموية. (أ) تستخدم خلايا البلغم غير الملطخة المشتقة من بوابة المفرد لتعيين القطع (الخط الأحمر) على السكان السلبيين لCD45 (أعلى). يتم تطبيق قطع من التشكيل الجانبي العلوي على عينة البلغم الملون (أسفل) للتمييز بين CD45 إيجابية (CD45 +) والسكان السلبية (CD45-). (ب) تستخدم خلايا البلغم CD45+ الملطخة بالأجسام المضادة متساوية النوع ل FITC/AF488 لتعيين البوابات على السكان السلبيين (الأعلى). يتم تطبيق نفس البوابات على خلايا البلغم CD45 + ملطخة بعلامات خلايا الدم CD3 و CD19 و CD66b و CD206 (أسفل). (ج) توضع بوابات رباعية على خلايا البلغم CD45- ملطخة بعناصر تحكم متساوية النمط (أعلى) وتطبيقها على الخلايا CD45- من عينة البلغم الملطخة بعلامات الظهارية عموم cytokeratin (بانك) وEpCAM (أسفل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: استراتيجية غاتينغ لاستبعاد الحطام، وكتل، والخلايا الميتة من خلايا البلغم الملون على ثلاث منصات تدفق القياسات الخلوية. تمت معالجة عينتين من البلغم الكبيرين وتجميعهما ووضع العلامات عليهما وتقسيمهما إلى ثلاثة أجزاء متساوية للاستحواذ عليها على Navios EX (A) وLSR II (B) ومقاييس تدفق التدفق Lyric (C). الصف العلوي: تم بوابات عينات البلغم (الصندوق الأحمر) لاستبعاد الحطام الصغير والكبير جدا. الصف الثاني: يمثل المربع الأحمر الكبير في مؤامرة Navios EX بوابة تضمين تتضمن الخلايا ولكنها تستبعد الحطام. ويمثل الصندوق الأحمر الصغير المتقطع الذي شوهد في قطعة الأرض LSR II بوابة استبعاد لإزالة الحطام من مزيد من التحليل. هناك حاجة إلى مزيد من التحسين مع Lyric لتحديد المكان الذي يلزم فيه استبعاد الحطام. لذلك، لا توجد بوابة في تلك المؤامرة. الصف الثالث: بوابات مستطيلة حمراء تشمل الخلايا الحية لمزيد من التحليل. الصف السفلي: بوابة المضلع يحتوي على خلايا مفردة عن طريق استبعاد doublets التي تقع خارج قطري من البوابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: استراتيجية غاتينج للبلغم الملون بالدم وعلامات الظهارية على ثلاث منصات تدفق القياسات الخلوية. 11 - يستمر التحليل المبين في الشكل 6 في الشكل 7؛ تم تقسيم جميع الخلايا القابلة للحياة والفردية (الصف السفلي ، الشكل 6) إلى مجموعات CD45 + و CD45 (الصف الأول ، الشكل 7) ، بحيث يمكن للعلامات الخاصة بخلايا الدم والعلامات الظهارية الخاصة بالخلايا أن تحدد هذه المجموعات السكانية. الصف الثاني: لمحة عن علامات خلايا الدم CD3/CD19/CD66b وCD206 من خلايا CD45+. الصف الثالث: علامات الخلايا الظهارية panCK وEpCAM من CD45-الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الأجسام المضادة / وصمة عار قصد
FVS510 بقعة الجدوى
مكافحة الإنسان CD45 – PE علامة عموم الكريات البيض;  تعويض PE
مكافحة الإنسان CD66b – FITC علامة الحبيبية
مكافحة الإنسان CD3 – Alexa488 علامة الخلية T
مكافحة الإنسان CD19 – Alexa488 علامة الخلية B; تعويض FITC/Alexa488
CD206 المضادة للإنسان – PE-CF594 علامة الضامة الرئة;  PE-CF594 التعويض
المضادة للإنسان EpCAM – PE-CF594 علامة الخلية الظهارية;  PE-CF594 التعويض
المضادة للإنسان عموم السيتوكيراتين (بانك) – Alexa488 علامة الخلية الظهارية
IgG1κ – أليكسا488 CD3/CD19/panCK التحكم متساوية النوع
IgG1κ – فيتك التحكم في نمط ISOTYPE CD66b
IgG1κ – PE-CF594 التحكم في نمط CD206/EpCAM
مضادة للإنسان CD45 – BV510 تعويض FVS510

الجدول 1: الأجسام المضادة وبقع البقاء المستخدمة. قائمة الأجسام المضادة وصبغة البقاء المستخدمة في هذا البروتوكول. يشار إلى المجموعات الفرعية الخلوية التي يحددها كل منها.

أنبوب (تسمية) حجم العينة* HBSS (ميكرولتر) FVS510 (ميكرولتر) CD45 (ميكرولتر) أجسام مضادة أخرى (ميكرولتر) الخلايا § (ميكرولتر)
غير ملطخة صغير 80 20
متوسط 50 50
كبير 50 50
IgG1κ - أليكسا488 IgG1κ- فيتك IgG1κ - PE-CF594
عنصر تحكم Isotype صغير 60.65 0.6 10 2 6 0.75 20
متوسط 30.65 0.6 10 2 6 0.75 50
كبير 30.25 1 10 2 6 0.75 50
CD206 CD3 CD19 CD66b
دم صغير 92.875 1.5 25 1.875 5 1.25 7.5 115
متوسط 65.75 3 50 3.75 10 2.5 15 350
كبير 102.5 10 100 7.5 20 5 30 725
إبكام بانك
الظهاريه صغير 96.5 1.5 25 10 2 115
متوسط 73 3 50 20 4 350
كبير 117 10 100 40 8 725
* تعتبر عينات صغيرة أو متوسطة أو كبيرة على أساس الوزن المحدد في الخطوة 1 من قسم فص البلغم من البروتوكول.
§ وينبغي إضافة الخلايا بعد توزيع جميع الكواشف، بما في ذلك الكواشف الموجودة في أنابيب التعويض (الجدول 3).

الجدول 2: محتوى الأنابيب ذات خلايا البلغم. استخدم هذا الجدول كما هو مذكور في البروتوكول لإضافة وحدات التخزين المحددة من الأجسام المضادة ووصمة البقاء لحجم العينة المناسب.

أنبوب (تسمية) الكواشف المضافة (μL) الكواشف المضافة (إسقاط)
HBSS CD45-PE CD206-PE-CF594 EpCAM-PE-CF594 CD19-اليكسا488 CD45-BV510 كومب ميد (+) كومباك ميد * (-)
شركات PE. 76 4 x x x x 1 1
PE-CF594 شركات. 72 x 4 4 x x 1 1
اليكسا488 / شركة فيتك. 60 x x x 20 x 1 1
BV510 شركات. 60 x x x x 20 1 1
* ينبغي إضافة الخرز الإيجابي (+) والسلبي (-) بعد توزيع جميع الكواشف وإعداد الأنابيب في الجدول 2.
شركات = التعويض

الجدول 3: محتوى أنابيب التعويض. استخدم هذا الجدول كما هو مذكور في البروتوكول لإضافة وحدات التخزين المحددة من الأجسام المضادة إلى حبات التعويض.

رقم الخلية (x 106)
A B C D
حجم العينة في حجم تلطيخ * وصول 50 أضعاف عينة وسيطة (وصول طية) # أكبر عينة (وصول أضعاف) #
صغير 0.625 31.25 8.0 (12.8) 24.77 (39.6)
متوسط 1.25 62.5 13.0 (10.4) 48.87 (39.1)
كبير 2.5 125 35.4 (14.2) 113.5 (45.4)
* تلطيخ الأحجام المستخدمة في البروتوكول (الجدول 2).  يتم استقراء رقم الخلية من كيفية تنفيذ منحنى المعايرة؛ 1 ميكروغرام/مل من CD45-PE و1 × 106 خلايا لكل 200 ميكرولتر.
* وصول 50 ضعفا من أرقام الخلايا في العمود ألف.
# أضعاف الوصول في الأعمدة C و D تحسب بقسمة عدد المقدمة في خلايا الأعمدة C أو D على الرقم في الخلية المقابلة في العمود A.

الجدول 4: تركيز CD45-PE المضاد للإنسان لجميع العينات في كل فئة من فئات حجم العينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتضمن المحتوى الخلوي للسبيتوم مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا واسعة النطاق ، غالبا ما يرافقها الكثير من الحطام37. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تحليل البلغم مراقبة الجودة التي تؤكد أن العينة يتم جمعها من الرئة بدلا من تجويف الفم38. لذلك ، فإنه ليس من السهل تحليل البلغم عن طريق قياس التدفق الخلوي كما هو الحال بالنسبة للدم ، على سبيل المثال ، والذي يطلق تعليق خلايا أنظف ومتجانسة. وقد عالج هذا البروتوكول جميع هذه القضايا: توفير إعدادات الأجهزة باستخدام حبات حجم محددة لضمان إمكانية اكتشاف أصغر وأكبر مجموعات الخلايا، واستراتيجية للقضاء على الحطام، وكتل الخلايا، وتلويث الشركات الصغيرة والمتوسطة وغيرها من الخلايا الميتة، وأخيرا، إجراء لمراقبة الجودة لضمان أن تكون عينة البلغم من الرئة بدلا من أن تكون في الغالب لعابا.

هناك خطوات حاسمة في البروتوكول في العمل مع البلغم الذي يستحق الإشارة. أولا، يمكن أن تتأثر نسبة إنتاج الخلية بشكل كبير بعدد مصافي خلايا النايلون المستخدمة في الخطوة 2.5 من جزء تفكك البلغم من البروتوكول. قد تكون هناك حاجة إلى مصافي متعددة لتجنب فقدان الكثير من الخلايا بسبب انسداد مصفاة. عندما يتباطأ التدفق من خلال مصفاات بشكل ملحوظ، وينبغي استخدام مصفاة جديدة. ثانيا، يمكن أن تكون بيليه الخلية من عينات البلغم فضفاضة جدا، خاصة إذا كان هناك تلوث عالية من الشركات الخاصة. لذلك ، من الضروري عدم تذييب قريب جدا من بيليه عند إزالة supernatant بعد الطرد المركزي العينات. قد يؤدي القرصنة قريبة جدا من بيليه في فقدان الخلية، إن لم يكن فقدان بيليه كامل. ثالثا، يتطلب هذا البروتوكول خطوة تثبيت. وهذا يحافظ على الخلايا وملفها الشخصي تلطيخ وبمثابة تدبير سلامة لحماية مشغل تدفق الخلايا. قد يؤدي تشغيل العينات على بعض مقاييس التدفق الخلوي إلى زيادة المخاطر البيولوجية بسبب إمكانية إنتاج الهباء الجوي39. يساعد تثبيت PFA على حماية المشغل من مسببات الأمراض المحتملة في عينة البلغم. رابعا، وربما الجانب الأكثر تحديا لإعداد عينات البلغم لتحليل التدفق الخلوي، هو عد الخلايا. عد الخلايا معقد بسبب مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا الموجودة في البلغم. غالبا ما تكون آلات العد محدودة بنطاق حجم الخلية الذي يمكنها التقاطه وبالتالي فهي أقل موثوقية من مقياس الدم. ومع ذلك ، فإن عد الخلايا لعينات البلغم عن طريق مقياس الدم ، والذي وصفه Guiot et al.20 بشكل ممتاز ، ممل ويتطلب الممارسة لتصبح بارعة. يعد رقم الخلية الدقيق أمرا حيويا في تحديد حجم إعادة الإنفاق النهائي للعينة للسماح بمعدل تدفق معقول ومنع القباقيب في مقياس التدفق الخلوي. وجود SECs كبيرة جدا في البلغم والعديد من كتل الخلايا الصغيرة التي لم يتم تقسيمها من قبل العازلة الانفصال، ولا اشتعلت من قبل المرشحات، وزيادة احتمال انسداد مقياس التدفق الخلوي. لذلك، فمن المستحسن أن تنفق بعض الوقت في تحديد أفضل معدل تركيز الخلية / تدفق للحصول على البيانات باستخدام مقياس التدفق الخلوي المتاحة. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن مقياس التدفق الخلوي يحتوي على خلية التدفق المناسبة وحجم الفوهة (أو المسبار) القادر على قياس مجموعات الخلايا الأكبر الموجودة في البلغم.

وحتى عندما تحقق الكفاءة في عد الخلايا، فإنها لا تزال عملية تستغرق وقتا طويلا. لذلك، يستند تحديد الكواشف لعلامات الخلية في هذا البروتوكول على حجم العينة (كما تم الحكم عليه حسب الوزن) بدلا من رقم الخلية. وهذا يسمح للاستخدام أكثر كفاءة من الوقت منذ يمكن الانتهاء من عدد الخلايا اليدوية خلال الوقت اللازم للأجسام المضادة وصبغة تلطيخ البقاء. ومع ذلك، هناك ثلاثة استثناءات ملحوظة لهذا. إذا كانت العينة >16 غرام (ما يسمى عينات كبيرة جدا)، يجب أن يحدث عدد الخلايا اليدوي قبل تلطيخ بحيث يمكن الحفاظ على الكواشف باهظة الثمن عن طريق تلطيخ فقط 25 × 106 خلايا لكل من الدم والأنابيب الظهارية. يعطي رقم الخلية هذا ملفات تعريف موثوقة جدا في الإعدادات الموضحة في هذا البروتوكول. وثمة استثناء محتمل آخر هو حالة عينة صغيرة جدا. التقدير هو أن هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 1-2 × 106 خلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي كما هو معروض في هذا البروتوكول لتوليد ملامح موثوقة (البيانات غير مبينة). لذلك، إذا كانت عينة تحتوي على أقل من 1-2 × 106 خلايا، قد لا يكون من المفيد الاستمرار في الإجراء لأن النتيجة النهائية من المرجح أن تكون غير مقبولة.

قد تعمل الكواشف المحددة التي تعمل بشكل جيد على خلايا الدم الطرفية أو خطوط الخلايا بشكل مختلف جدا على خلايا الدم الموجودة في البلغم (ملاحظات غير منشورة). لذلك ، يوصى بتكميل كل الأجسام المضادة أو غيرها من الكواشف التي تحمل علامات وفقا للبروتوكولات الراسخة34،35 قبل استخدامها في تجارب قياس التدفق الخلوي. معظم المعايرة الأجسام المضادة ينبغي أن تعطي نتائج مماثلة عند تلطيخ ما يصل إلى 10 إلى 50 أضعاف. ومع ذلك، ينصح بالقيام ب المعايرة إضافية مع أرقام الخلايا أعلى من range34. عندما يتم تحديد تركيز الكاشف ، من الضروري الحفاظ على وقت حضانة هذا الكاشف كما هو الحال في التجربة الفعلية. لهذا السبب، يؤكد البروتوكول إضافة كافة المخزن المؤقت والكواشف إلى الأنابيب قبل إضافة الخلايا أو حبات التعويض. يسمح هذا الترتيب لإضافة الكواشف والخلايا/الخرز معا بتناسق أعلى في أوقات وضع العلامات. إذا كان، لسبب ما، لا يمكن الاحتفاظ بوقت الحضانة التجريبية مماثلة لتلك المستخدمة لأجسام مضادة / صبغ المعايرة، وهذا الأخير ينبغي أن تتكرر مع وقت الحضانة التي هي ممكنة أثناء التجارب.

وقد استخدمت عينات البلغم على نطاق واسع كعينة تشخيصية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لمختلف الأمراض التي تؤثر على الرئة. السل40,41, COPD13,42, asthma43, التليف الكيسي44,45, سرطان الرئة46,47,48, والتهاب المفاصل الروماتويدي49 هي من بين العديد من الأمراض التي تمت دراسة البلغم بسبب ميزة كونها عينة غير الغازية التي تم الحصول عليها. في الآونة الأخيرة ، خلال وباء الفيروس التاجي ، تم استخدام البلغم للكشف عن سفك الفيروس لفترات طويلة في المرضى الذين أدخلوا المستشفى مع مرض الفيروس التاجي 2019 (COVID-19)50.

وقد استخدمت تكنولوجيات مختلفة، بما في ذلك النسخ العكسي - البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (RT-PCR)، وتحليل البروتين، والمجهر، وقياس التدفق الخلوي، لتحديد علامات خاصة بالأمراض في البلغم. لا يستخدم استخدام منصة قياس التدفق الخلوي لتحليل عينات البلغم على نطاق واسع ، ولكن استخدامه يزيد. مع التطورات الأخيرة في تكنولوجيا تدفق cytometers3،51،52 ، فضلا عن التقدم في كيمياء الفلوروفوريس ، وتوليد استنساخ الأجسام المضادة الجديدة ، وتطوير الأصباغ المختلفة لتحديد مجموعات الخلايا الميتة51،53،54 ، زادت إمكانية تصميم لوحات الأجسام المضادة التي تهدف إلى تشخيص الأمراض البشرية بشكل كبير. وعلاوة على ذلك، فإن الدفعة الأخيرة لأتمتة تحليل البيانات الخلوية التدفقية55,56 ستقضي على التحيز المحتمل في قراءة وتفسير بيانات التدفق يدويا. هذه التطورات الجديدة في قياس التدفق الخلوي سوف تسهل بشكل كبير استكشاف البلغم كتشخيص سريري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جميع المؤلفين هم من الموظفين السابقين أو الحاليين من تقنيات bioAffinity.

Acknowledgments

ونود أن نشكر ديفيد رودريغيز على مساعدته في إعداد الرقم. تم تشغيل عينات البلغم على BD LSR II في مرفق الموارد المشتركة لقياس الخلايا في UT Health San Antonio Flow ، بدعم من UT Health و NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) وUL1 TR001120 (منحة CTSA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix Polysciences 25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 Fisher Scientific 08-771-19
3 M NaOH EMD SX0593-1
50 mL conical falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
Alexa488 anti-human CD19 BioLegend 302219
Alexa488 anti-human CD3 BioLegend 300415
Alexa488 anti-human cytokeratin BioLegend 628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype BioLegend 400129
BV510 anti-human CD45 BioLegend 304036
CD66b FITC isotype BD Biosciences 555748
CompBead Plus Compensation Beads BD Biosciences 560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL Fisher Scientific 09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL Fisher Scientific 09-761-10
CS&T beads BD Biosciences 655051
DTT Fisher Scientific BP172-5
FITC anti-human CD66b GeneTex GTX75907
Fixable Viability Stain BD Biosciences 564406
FlowCheck Beckman Coulter A69183
FlowSet Beckman Coulter A69184
HBSS Fisher Scientific 14-175-095
NAC Sigma-Aldrich A9165
NIST Beads, 05 μM Polysciences 64080
NIST Beads, 20 μM Polysciences 64160
NIST Beads, 30 μM Polysciences 64170
PE anti-human CD45 BioLegend 304039
PE-CF594 anti-human EpCAM BD Biosciences 565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype BD Biosciences 562292
PE-CR594 anti-human CD206 BD Biosciences 564063
Sodium citrate dihydrate EMD SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
  2. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews. Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
  3. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), San Diego, Calif. 251-258 (2012).
  4. Robinson, J. P., Roederer, M. History of science. Flow cytometry strikes gold. Science. 350 (6262), New York, N.Y. 739-740 (2015).
  5. Orfao, A., et al. Immunophenotypic dissection of normal hematopoiesis. Journal of Immunological Methods. 475, 112684 (2019).
  6. Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
  7. Bento, L. C., et al. The use of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: A review. Frontiers in Oncology. 7, 270 (2017).
  8. Della Porta, M. G., Picone, C. Diagnostic utility of flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases. 9 (1), 2017017 (2017).
  9. Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2), Pt 1 475-478 (2000).
  10. Spanevello, A., et al. Induced sputum cellularity. Reference values and distribution in normal volunteers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 162 (3), Pt 1 1172-1174 (2000).
  11. Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
  12. Hastie, A. T., et al. Mixed sputum granulocyte longitudinal impact on lung function in the severe asthma research program. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (7), 882-892 (2021).
  13. Hastie, A. T., et al. Association of sputum and blood eosinophil concentrations with clinical measures of COPD severity: an analysis of the SPIROMICS cohort. The Lancet. Respiratory Medicine. 5 (12), 956-967 (2017).
  14. Kim, J., et al. Innate immune crosstalk in asthmatic airways: Innate lymphoid cells coordinate polarization of lung macrophages. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (5), 1769-1782 (2019).
  15. Bai, Y., Zhou, Q., Fang, Q., Song, L., Chen, K. Inflammatory cytokines and T-Lymphocyte subsets in serum and sputum in patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 25, 2206-2210 (2019).
  16. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-Carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  17. Hristara-Papadopoulou, A., Tsanakas, J., Diomou, G., Papadopoulou, O. Current devices of respiratory physiotherapy. Hippokratia. 12 (4), 211-220 (2008).
  18. Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and biochemical analysis of induced sputum from asthmatic and from healthy subjects. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
  19. Alexis, N., Soukup, J., Ghio, A., Becker, S. Sputum phagocytes from healthy individuals are functional and activated: a flow cytometric comparison with cells in bronchoalveolar lavage and peripheral blood. Clinical Immunology. 97 (1), 21-32 (2000).
  20. Guiot, J., et al. Methodology for sputum induction and laboratory processing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56612 (2017).
  21. Paggiaro, P. L., et al. Sputum induction. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 3-8 (2002).
  22. Anjuman, N., Li, N., Guarnera, M., Stass, S. A., Jiang, F. Evaluation of lung flute in sputum samples for molecular analysis of lung cancer. Clinical and Translational Medicine. 2, 15 (2013).
  23. Sethi, S., Yin, J., Anderson, P. K. Lung flute improves symptoms and health status in COPD with chronic bronchitis: A 26 week randomized controlled trial. Clinical and Translational Medicine. 3, 29 (2014).
  24. Su, J., et al. Analysis of lung flute-collected sputum for lung cancer diagnosis. Biomarker Insights. 10, 55-61 (2015).
  25. Naraparaju, S., Vaishali, K., Venkatesan, P., Acharya, V. A comparison of the Acapella and a threshold inspiratory muscle trainer for sputum clearance in bronchiectasis-A pilot study. Physiotherapy Theory and Practice. 26 (6), 353-357 (2010).
  26. Hinson, K. F., Kuper, S. W. The diagnosis of lung cancer by examination of sputum. Thorax. 18, 350-353 (1963).
  27. Johnston, W. W., Bossen, E. H. Ten years of respiratory cytopathology at Duke University Medical Center. I. The cytopathologic diagnosis of lung cancer during the years 1970 to 1974, noting the significance of specimen number and type. Acta Cytologica. 25 (2), 103-107 (1981).
  28. Ng, A. B., Horak, G. C. Factors significant in the diagnostic accuracy of lung cytology in bronchial washing and sputum samples. II. Sputum samples. Acta Cytologica. 27 (4), 397-402 (1983).
  29. Smiths Medical Videos. , Available from: https://videos.smiths-medical.com/search?q=acapella&page=1 (2021).
  30. Pizzichini, E., et al. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154 (2), 308-317 (1996).
  31. Miller, H. R., Phipps, P. H., Rossier, E. Reduction of nonspecific fluorescence in respiratory specimens by pretreatment with N-acetylcysteine. Journal of Clinical Microbiology. 24 (3), 470-471 (1986).
  32. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  33. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  34. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
  35. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 4, Unit 4.1 (2001).
  36. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  37. Kini, S. R. Color Atlas of Pulmonary Cytopathology. , Springer-Verlag New York, Inc. (2002).
  38. Papanicolaou Society of Cytopathology Task Force on Standards of Practice. Guidelines of the Papanicolaou Society of Cytopathology for the examination of cytologic specimens obtained from the respiratory tract. Diagnostic Cytopathology. 21 (1), 61-69 (1999).
  39. Holmes, K. L., et al. International Society for the Advancement of Cytometry cell sorter biosafety standards. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 85 (5), 434-453 (2014).
  40. Datta, S., Shah, L., Gilman, R. H., Evans, C. A. Comparison of sputum collection methods for tuberculosis diagnosis: a systematic review and pairwise and network meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (8), 760-771 (2017).
  41. Armstrong-Hough, M., et al. "Something so hard": a mixed-methods study of home sputum collection for tuberculosis contact investigation in Uganda. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease: The Official Journal of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. 22 (10), 1152-1159 (2018).
  42. Freeman, C. M., et al. Design of a multi-center immunophenotyping analysis of peripheral blood, sputum and bronchoalveolar lavage fluid in the Subpopulations and Intermediate Outcome Measures in COPD Study (SPIROMICS). Journal of Translational Medicine. 13, 19 (2015).
  43. Petsky, H. L., Li, A., Chang, A. B. Tailored interventions based on sputum eosinophils versus clinical symptoms for asthma in children and adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 8, 005603 (2017).
  44. Hisert, K. B., Liles, W. C., Manicone, A. M. A flow cytometric method for isolating cystic fibrosis airway macrophages from expectorated sputum. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (1), 42-50 (2019).
  45. Duncan, G. A., et al. Microstructural alterations of sputum in cystic fibrosis lung disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (18), 88198 (2016).
  46. Kemp, R. A., Reinders, D. M., Turic, B. Detection of lung cancer by automated sputum cytometry. Journal of Thoracic Oncology: Official Publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2 (11), 993-1000 (2007).
  47. Blandin Knight, S., et al. Progress and prospects of early detection in lung cancer. Open Biology. 7 (9), (2017).
  48. Gomperts, B. N., Spira, A., Elashoff, D. E., Dubinett, S. M. Lung cancer biomarkers: FISHing in the sputum for risk assessment and early detection. Cancer Prevention Research. 3 (4), Philadelphia, Pa. 420-423 (2010).
  49. Demoruelle, M. K., et al. Antibody responses to citrullinated and noncitrullinated antigens in the sputum of subjects with rheumatoid arthritis and subjects at risk for development of rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (4), Hoboken, N.J. 516-527 (2018).
  50. Wang, K., et al. Differences of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 shedding duration in sputum and nasopharyngeal swab specimens among adult inpatients with coronavirus disease 2019. Chest. 158 (5), 1876-1884 (2020).
  51. Chattopadhyay, P. K., Hogerkorp, C. -M., Roederer, M. A chromatic explosion: the development and future of multiparameter flow cytometry. Immunology. 125 (4), 441-449 (2008).
  52. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nature Immunology. 15 (2), 128-135 (2014).
  53. Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit 9.34 (2010).
  54. Chattopadhyay, P. K., et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine. 12 (8), 972-977 (2006).
  55. Duetz, C., Bachas, C., Westers, T. M., Avan de Loosdrecht, A. A. Computational analysis of flow cytometry data in hematological malignancies: future clinical practice. Current Opinion in Oncology. 32 (2), 162-169 (2020).
  56. Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews. Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).

Tags

الطب، العدد 174،
تحليل البلغم الذي يتم التحكم فيه بالجودة حسب قياس التدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grayson, M., Lai, S. C., Bederka, L. … More

Grayson, M., Lai, S. C., Bederka, L. H., Araujo, P., Sanchez, J., Reveles, X. T., Rebel, V. I., Rebeles, J. Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (174), e62785, doi:10.3791/62785 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter