Summary
Denne protokol beskriver en effektiv metode til at adskille spyt i en enkelt celle suspension og den efterfølgende karakterisering af cellulære delmængder på standard flow cytometriske platforme.
Abstract
Sputum, der i vid udstrækning anvendes til at studere det cellulære indhold og andre mikromiljøfunktioner for at forstå lungens sundhed, analyseres traditionelt ved hjælp af cytologibaserede metoder. Dens nytte er begrænset, fordi læsning af dias er tidskrævende og kræver højt specialiseret personale. Desuden gør omfattende snavs og tilstedeværelsen af for mange pladeformede epitelceller (SECs) eller kindceller ofte en prøve utilstrækkelig til diagnose. I modsætning hertil giver flowcytometri mulighed for fænotyping med høj gennemløb af cellulære populationer, samtidig med at snavs og 2-metri'er udelukkes.
Protokollen præsenteres her beskriver en effektiv metode til at adskille spyt i en enkelt celle suspension, antistof plet og fastsætte cellulære populationer, og erhverve prøver på en flow cytometri platform. En gating strategi, der beskriver udelukkelse af vragrester, døde celler (herunder SECs) og celle doublets præsenteres her. Endvidere forklarer dette arbejde også, hvordan man analyserer levedygtige, enkelte spytceller baseret på en klynge af differentiering (CD)45 positive og negative populationer for at karakterisere hæmatoopoietiske og epitelstrenge subsets. En kvalitetskontrol foranstaltning er også fastsat ved at identificere lunge-specifikke makrofager som bevis for, at en prøve er afledt af lungen og er ikke spyt. Endelig er det blevet påvist, at denne metode kan anvendes på forskellige cytometriske platforme ved at levere spytprofiler fra den samme patient analyseret på tre flowcytometre; Navios EX, LSR II og Lyric. Desuden kan denne protokol ændres til at omfatte yderligere cellulære markører af interesse. En metode til at analysere en hel spytprøve på en flowcytometrisk platform præsenteres her, der gør spyt modtagelig for udvikling af høj-throughput diagnostik af lungesygdom.
Introduction
Tekniske fremskridt inden for hardware og software af flowcytometre har gjort det muligt at identificere mange forskellige cellepopulationer samtidigt1,2,3,4. Udnyttelsen af flowcytometeret i hæmatoopoietisk celleforskning har for eksempel ført til en langt bedre forståelse af immunsystemet2 og det cellulære hierarki i det hæmatoopoietiske system5 samt den diagnostiske sondring af en lang række forskellige blodkræft6,7,8. Selv om de fleste spytceller er af hæmatopoietisk oprindelse9,10,11, flow cytometri har ikke været almindeligt anvendt til spyt analyse til diagnostiske formål. Men, flere undersøgelser tyder på, at evalueringen af immuncellepopulationer i spyt (den mest betydningsfulde delmængde af celler) kan være til stor hjælp i diagnosticering og / eller overvågning af sygdomme som astma og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL)12,13,14,15. Desuden tillader eksistensen af epitelspecifikke markører, der kan bruges i flowcytometri, forhør af følgende mest betydningsfulde delmængde af celler i spyt, lungeepileleceller.
Ud over evnen til at analysere mange forskellige cellepopulationer af forskellig vævsoprindelse kan et flowcytometer evaluere et stort antal celler på relativt kort tid. Til sammenligning kræver diasbaserede, cytologiske typer analyser ofte højt specialiseret personale og/eller udstyr. Disse analyser kan være arbejdskrævende, hvilket fører til, at kun en del af spytprøven analyseres16.
Tre kritiske spørgsmål begrænser den udbredte brug af spyt i flowcytometri. Det første nummer vedrører indsamlingen af spyt. Spyt opsamles gennem en huff hoste, der udviser slim fra lungerne ind i mundhulen, efterfølgende spytte ind i en samling kop. Da slim rejser gennem mundhulen, er der en stor chance for SEC forurening. Denne forurening komplicerer prøveanalysen, men problemet afhjælpes let på en flowcytometrisk platform, som vist i denne undersøgelse.
Ikke alle kan producere spyt spontant; derfor er der udviklet flere enheder til at hjælpe med spytsamlingen på en ikke-invasiv måde17. Forstøveren er en sådan anordning og har vist sig at producere pålidelige spytprøver18,19,20. Selv om forstøveren er en meget effektiv måde at ikke-invasivt indsamling spyt, dens anvendelse stadig kræver en indstilling på en medicinsk facilitet med specialiseret personale21. I modsætning hertil kan håndholdte enheder som lungefløjten22, 23,24 og acapella16,25 bruges hjemme, da de er meget brugervenlige. Disse hjælpeenheder er både sikre og omkostningseffektive.
For os gav acapella konsekvent bedre resultater end lungefløjten16, og derfor er acapella-enheden valgt til spytsamlinger. En 3-dages indsamling prøve blev besluttet, fordi det primære formål med at bruge spyt er at udvikle en lungekræft afsløring test16. Det har vist sig, at en 3-dages prøve øger sandsynligheden for lungekræft afsløring i forhold til en 1- eller 2-dages prøve26,27,28. Andre metoder til sputumindsamling kan dog være at foretrække til forskellige formål. Hvis der anvendes en anden spytsamlingsmetode end den, der er beskrevet her, anbefales det omhyggeligt at titrere hvert antistof eller farvestof, der anvendes til flowcytometrianalyse; meget få data er tilgængelige om, hvordan forskellige spyt indsamling metoder påvirker de målrettede proteiner til flow cytometri.
Det andet spørgsmål, der dæmper begejstringen for at bruge spyt til diagnostik, primært relateret til flowcytometri, er cellenummer. Problemet er indsamlingen af tilstrækkelige levedygtige celler til en pålidelig analyse. To undersøgelser viste, at spytprøver indsamlet ved ikke-invasive metoder, ved hjælp af en hjælpeanordning, indeholder nok levedygtige celler, der kan udnyttes i klinisk diagnose eller forskningsundersøgelser16,24. Ingen af disse undersøgelser omhandlede imidlertid spørgsmålet om celletal vedrørende flowcytometri.
For de undersøgelser, der danner grundlag for denne protokol, sputum prøver blev indsamlet fra deltagere med høj risiko for at udvikle lungekræft efter godkendte institutionelle retningslinjer for hvert studiested. Højrisikodeltagere blev defineret som mellem 55-75 år, efter at have røget 30 pakkeår og ikke har holdt op med at ryge inden for de sidste 15 år. Patienterne blev vist, hvordan man bruger acapella-enheden i henhold til producentens anvisninger29 og indsamlede spyt i tre på hinanden følgende dage derhjemme. Prøven blev opbevaret i køleskabet indtil den sidste samling. På den sidste indsamlingsdag blev prøven sendt til laboratoriet natten over med en frossen kold pakke. Prøverne blev behandlet til en enkelt celle suspension den dag, de blev modtaget. Med denne metode til sputumsamling opnås mere end nok levedygtige celler til en pålidelig flowcytometrisk analyse.
Endelig, og relateret til den tidligere celle nummer spørgsmål, er spørgsmålet om, hvordan man frigiver spytceller fra sin mucinøse miljø. Hvordan kan cellerne holdes levedygtige og skabe en enkelt celle suspension, der ikke tilstopper strømmen cytometer? Baseret på indledende arbejde af Pizzichini et al.30 og Miller et al.31, beskriver denne protokol en nem og pålidelig metode til spyt behandling i en enkelt celle suspension, der er egnet til flow cytometrisk analyse. Denne metode har anvendt veletablerede retningslinjer i flowcytometri32,33,34 til at udvikle en effektiv antistofmærkningsstrategi til at identificere hæmatopoietiske og epitelceller i spyt og give instrumentindstillinger, kvalitetskontrolforanstaltninger og analyseretningslinjer, der standardiserer spytanalyse på en flowcytometrisk platform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle trin i spytbehandlingen udføres i et biologisk sikkerhedsskab med passende personlige værnemidler.
1. Reagens forberedelse før start sputum dissociation
- Optø 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 mL pr. prøve på is, og hold dig kold, indtil den er i brug.
FORSIGTIG: PFA er giftig ved indånding og hudkontakt. Fiksativt forberedes i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger, og frysning ved -20 °C i 25 mL aliquots indtil brug. - Prøvens vægt tilnærmes og optøs nok 0,1% Dithiothreitol (DTT) i trin 2.2 og bringe den op på 37 °C. (Aliquots af DTT skal opbevares ved -20 °C før brug.)
- Medbring nok 0,5% N-acetyl- L-Cystein (NAC) op til 37 °C for trin 2.2. (NAC skal laves frisk ugentligt og opbevares ved 4 °C før brug).)
2. Sputum dissociation
- Afvej sputumprøven for at bestemme mængden af dissociationsreagenser.
BEMÆRK: En prøve anses for at være lille, hvis startvægten er ≤3 g, medium hvis >3 g, men ≤8 g, stor, hvis >8, men ≤16 g, og ekstra stor, hvis en prøve vejer >16 g. Indikationerne små, mellemstore, store og ekstra store vil blive brugt i hele protokollen. Den mængde reagenser, der kræves til dissociation og mærkning, varierer alt efter sputumprøvens størrelse. - Overfør en lille prøve til et rent 50 mL konisk rør, en mellemprøve til en ren engangsflaske af plast på 250 mL eller en stor og ekstra stor prøve til en ren engangsflaske af plast på 500 mL. Der tilsættes en prøvevægt på 1 mL/g på 0,5 % NAC og en prøvevægt på 0,1 % DTT på 4 mL/g.
- Vortex ved maksimal hastighed (for 15 s), og derefter rock ved stuetemperatur (ved maksimal hastighed) i 15 min.
- Prøven fortyndes med fire bind af Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (baseret på det samlede volumen af prøve + reagenser) for at neutralisere NAC og DTT. hvirvle hurtigt ved maksimal hastighed og sten ved stuetemperatur i 5 min ved maksimal hastighed.
- Celleaffjedringen filtreres gennem 100 μm nylonnetcellesn si(er) i et eller flere 50 mL koniske centrifugerør(er) for at skabe en encellet suspension.
- Centrifugere cellerne ved 800 x g i 10 min ved 4 °C. Aspirere supernatanten, kombinere alle pellets i et 15 mL konisk rør, og vask derefter pellets med HBSS ved hjælp af de samme betingelser.
- Brug cellepillen igen i en buffervolumen bestemt af spytprøvens oprindelige vægt.
BEMÆRK: En lille prøve suspenderes igen i 250 μL HBSS. En mellemprøve suspenderes igen i 760 μL HBSS. Store og ekstra store prøver suspenderes igen i 1460 μL HBSS. - Tag en aliquot af celle suspension for en levende / døde celle tæller ved hjælp af Trypan Blue.
BEMÆRK: For en lille prøve skal du bruge 5 μL. Ved en mellemstor, stor eller ekstra stor prøve anvendes 10 μL. Fortynd 1:10 med HBSS.- Bland 10 μL af spytfortyndingen med 30 μL på 0,4% Trypan Blue for at opnå en endelig prøvefortynding på 1:40. Indlæs i tællekamrene på et hæmocytometer for et celletal.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at justere den endelige fortynding, hvis cellenumrene er for lave eller for høje til at opnå et nøjagtigt antal. Høring Guiot et al.20 for korrekt at skelne spytceller fra SPC'er og snavs anbefales kraftigt her. Dette er afgørende for et nøjagtigt celletal.
- Bland 10 μL af spytfortyndingen med 30 μL på 0,4% Trypan Blue for at opnå en endelig prøvefortynding på 1:40. Indlæs i tællekamrene på et hæmocytometer for et celletal.
- Fra den ekstra store prøve fjernes 50 x 106 celler fra totalen og tilføjes til et nyt rør med nok tilsat HBSS til at skabe et samlet volumen på 1700 μL.
BEMÆRK: Betragt dette som en stor prøve for resten af protokollen. Resterende prøver kan kasseres eller anvendes til andre formål.
3. Antistof og levedygtighed farvestof farvning
- Valg af antistof og farvning farvestof
BEMÆRK: Tabel 1 viser de antistoffer og levedygtighed farvestof, der anvendes i denne protokol, og de cellepopulationer, de identificerer.- Mærk de rør, der indeholder spytcellerne (se tabel 2 for etiketter).
- Brug 5 mL flowcytometrirør (kompatibel med det anvendte flowcytometer) til prøverøret med de ikke-farvede celler og røret med isotypekontrollen. Brug 15 ML koniske rør til blod- og epitelrørsprøverne.
BEMÆRK: Disse prøver overføres til flowcytometrirør efter antistoffarvning og fiksering.
- Mærk kompensationsrørene (tabel 3).
BEMÆRK: Brug 5 mL flowcytometrirør, der er kompatible med det anvendte flowcytometer. - Tilsættes mængden af HBSS, antistof og/eller farvestof til hvert af spytcellerørene og erstatningsrørene som angivet i henholdsvis tabel 2 og tabel 3.
BEMÆRK: Tilføj buffer (HBBS), antistoffer og farvestof til alle rørene, før du tilføjer celler eller kompensationsperler for at sikre, at alle rørs farvningstid er konsistent. - De mængder spytcellevolumen, der er angivet i tabel 2 , til analyserørene.
- Tilsættes kompensationsperler til erstatningsrørene som anført i tabel 3.
- Inkuber alle rør (analyse og kompensation rør) på is, beskyttet mod lys, i 35 min. Fyld derefter rørene med iskold HBSS og centrifuge ved 4 °C i 10 min ved 800 x g.
- For kompensation rør, aspirere supernatant så tæt på pellets som muligt og svirp pellets til at løsne.
- Der tilsættes 0,5 mL kold HBSS til kompensationsrørene, opbevar dem på isen ved 4 °C, og beskyt dem mod lys, indtil det er nødvendigt til flowcytometrianalyse.
- Aspirere supernatant fra unstained isotype, blod, og epitel rør efter centrifugering (trin 3.6 fra antistof farvning sektion) og løsne pellets ved at svirpe rørene.
4. Fiksering med 1% Paraformaldehyd (PFA)
- Tilsæt kulde 1% PFA (som bør optøs nu) til de unstained, isotype, blod og epitelrør; 2 mL til de ufarvede og isotyperør og 10 mL til blod- og epitelrørene.
- Inkuber rørene på is, beskyttet mod lys i 1 time. Vortex hurtigt ved maksimal hastighed efter 30 min.
- Fyld rørene med iskold HBSS. Derefter centrifugerør ved 4 °C i 10 min ved 1600 x g.
- Aspirere så meget supernatant som muligt uden at forstyrre cellepillen og svirp røret med fingrene for at løsne cellerne.
- Der tilsættes 200 μL kolde HBSS til de ikke-farvede og isotyperør.
- Beregn mængden af HBSS til resuspension af blodet og epitelrøret i henhold til det samlede celletal.
BEMÆRK: Resuspension volumen = 0,15 x [samlet celleantal (trin 8 i spyt dissociation) / 106]. Brug 50 x 106 som celletal for en ekstra stor prøve. - Alle prøve- og erstatningsrør, der er beskyttet mod lys på isen, ved 4 °C, indtil der foretages en analyse af flowcytometrien.
BEMÆRK: Denne protokol er ikke blevet testet til opbevaring i mere end 24 timer.
5. Dataindsamling på flowcytometeret
- Anvend passende startprocedurer for det flowcytometer, der bruges.
BEMÆRK: I dette afsnit af protokollen antages det, at den person, der driver flowcytometeret, er uddannet i brugen af det instrument, de har til rådighed, især vedrørende daglige procedurer, herunder kontrol af optik- og fluidicsystemernes stabilitet, teknikker til standardisering af lyssprednings- og fluorescensintensitet samt beregning og anvendelse af den korrekte kompensationsmatrix. - Brug blandingen af National Institute of Standards and Technology (NIST) perler for at sikre, at fremad scatter og side scatter spændinger er indstillet til at placere NIST perler til at spænde over hele plottet uden at placere perlerne for tæt på akserne.
BEMÆRK: Dette trin er afgørende for at sikre, at snavs mindre end 5 μm kan elimineres ved gating post-erhvervelse analyse. Afhængigt af det anvendte flowcytometer skal du være opmærksom på, at de mindste perler ikke udelukkes med tærsklen (ved brug af LSR II eller Lyric) eller med den høje diskriminator (ved hjælp af Navios EX flowcytometeret). For Navios EX, en gevinst på 2 blev brugt til frem og side scatter, en spænding på 236 for fremad scatter, og 250 for side scatter. For LSR II blev der anvendt en fremadrettet scatter spænding på 165 og en side scatter spænding på 190. - Indstil strømningshastighed til medium (LSR II) eller høj (Navios EX).
BEMÆRK: Den mellemstore eller høje strømningshastighed for de fleste instrumenter kan bruges til at erhverve spytrørene. Det er vigtigt at bemærke, at brug af for langsom strømningshastighed eller for fortyndet af prøven kan resultere i cellerne afregning, hvilket resulterer i øget hvirvlen, som ikke ønskes. Derfor bør overholdelse af den beregnede resuspension volumen i trin 4.6 resultere i cellulær tæthed, der kan erhverves hurtigt, men ikke tilstoppe maskinen. - Juster spændingerne for hver parameter, der bruges til scatter- og fluorescerende parametre for at placere cellepopulationerne på skalaen. Brug tallene med gating-strategien som vejledning i, hvordan du justerer spændingerne i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: Sørg for, at alle de nødvendige parametre er valgt i parametervalgvinduet før anskaffelsen, eller at dataene ikke hentes. - Erhverve data for den ubesmittede spytprøve først, efterfulgt af isotype-farvede prøve, og derefter blodrøret og epitelrøret.
BEMÆRK: Hvis celleaffjedringen er for koncentreret til, at flowcytometeret kan køre prøverne uden tilstopning, kan prøverne fortyndes yderligere med HBSS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol blev udviklet med et klinisk laboratorium indstilling i tankerne. Fokus under udviklingen af protokollen var på enkelhed, effektivitet og reproducerbarhed. Det blev konstateret, at det mest tidskrævende trin i behandlingen af spyt var at tælle cellerne. Derfor er protokollen konfigureret på en sådan måde, at spytbehandling og cellemærkning kan udføres uafhængigt af celletælling uden tidstab. Et nøjagtigt celletal, som stadig er nødvendigt for at fortynde prøven korrekt til en uhindret kørsel, kan derefter opnås i antistofmærkningsperioden.
Denne protokol bruger en spytvægt mål i stedet for en celle tæller som en indikation af, hvor meget antistof / farvestof til at bruge til optimal celle mærkning. Der er dog en stor grad af variation i vægten af spytprøverne; af de 126 prøver, der blev analyseret, varierede vægten fra 0,57 g til 38,30 g. Figur 1A viser, at sammenhængen mellem spytvægt og celleudbytte ikke er stærk. Prøverne blev derfor opdelt i fire kategorier; Medianvægtene af prøverne var 2,1 g for små prøver, 5,0 g for mellemstore prøver, 11,2 g for store prøver og 22,0 g for ekstra store prøver (figur 1B). Der var dog stadig prøver, der gav langt flere celler end forventet baseret på deres vægt (Figur 1C), de fleste af prøverne grupperet pænt. For små prøver var mediancelleudbyttet 8,0 x 106 celler, til mellemstore prøver 13,0 x 106, til store prøver 35,4 x 106 og ekstra store prøver 93,0 x 106.
Hvert antistof, der anvendes i denne protokol, blev titreret. En koncentration på plateaufasen (figur 2A) med det højeste farvningsindeks (figur 2B) i titreringskurven blev valgt som arbejdskoncentration. Variationer i celletal vil ikke dramatisk ændre farvning intensitet. Denne antistoftitering og -testning er afgørende og bør oprettes med omhu for hvert nyt antistof eller farvestof, der anvendes i denne protokol34,35. Når et antistof titreres med omhu, skal det plette 10 til 50 gange flere celler end antallet af celler, hvor antistoffet blev titreret34,35. Et eksempel på dette princip findes i tabel 4. Anti-humant CD45-PE-antistof blev titreret på 1 x 106 celler i et samlet volumen på 400 μL. Hvis dette antistof til farvningsvolumen ekstrapoleres til protokollen (se tabel 2, som viser CD45-PE-mængde- og farvningsmængderne for hver stikprøvestørrelse), vil 0,625 x 106 celler for en lille prøve blive farvet, 1,25 x 106 celler farves til en mellemprøve og 2,5 x 106 celler til en stor prøve (kolonne A i tabel 4). Et 50 gange stort celletal for hver kategori beregnes til at være henholdsvis 31,25 x 106, 62,5 x 106 og 125 x 106 celler (kolonne B). Som vist i kolonne C og D ligger mediancellenummeret for hver størrelseskategori og den største stikprøve i hver kategori godt inden for det 50-foldne interval.
På trods af de tilsyneladende forskelle i størrelse og celle udbytte mellem de forskellige størrelser af spyt prøver, median procent SEC forurening i hver kategori er meget ens. Figur 3A viser den procentdel af 2000, der findes i individuelle prøver, stratificeret i henhold til deres spytvægtkategori. Den største bekymring var med 2-1-pc'er, da disse celler ikke er repræsentative for lungevæv, men for mundhulen. Den gennemsnitlige SEC-forurening er dog mindre end 20% for alle kategorier. Figur 3B viser procentdelen af levedygtige celler, der findes i disse prøver. Bortset fra 2019 var den gennemsnitlige levedygtighed ca. 72 % for de små, mellemstore og store stikprøvestørrelseskategorier. Det var lidt højere (79%) for den ekstra store kategori.
Figur 4 viser en typisk gating strategi for at adskille spyt celler af interesse fra vragrester, døde celler (som også omfatter forurenende SCS36), og celle klumper. Figur 4A viser brugen af NIST-perler til at indstille porte til at fjerne snavs, der er mindre end 5 μm eller større end 30 μm, mens figur 4B anvender denne port på spytceller. Figur 4C viser en typisk spytprofil, når den ses som side scatter bredde (SSC-W) mod fremad scatter bredde (FSC-W), bredden gate. Denne profil bruges til at fjerne små snavs, der præsenterer sig langs SSC-W og FSC-W akser. Elimineringen af døde celler er vist i figur 4D og figur 4E. Den ikke-farvede kontrol (Figur 4D) bruges til at bestemme cut-off for FVS510 positivitet; celler, der pletter positivt for FVS510 over den negative kontrol, betragtes som døde og vil ikke blive brugt i spytcelleanalysen (Figur 4E). Endelig anvendes en enkeltport til at fjerne celledubler fra analysen, som er vist i figur 4F. Således repræsenterer de celler, der har gjort det gennem udvælgelsesportene vist i figur 4B, figur 4C, figur 4E og figur 4F , levende, enkelte spytceller, der er klar til efterfølgende analyse med de antistoffer, der anvendes i denne protokol.
Brugen af anti-CD45 antistof i denne mærkning protokol tillader adskillelse af levende, enkelt spyt celler i et blod (CD45 +) cellerum og en ikke-blod (CD45-) celle rum. Sidstnævnte kategori omfatter epitelceller og andre ikke-blodceller. Topprofilen i figur 5A viser brugen af en ikke-farvet spytprøve til at indstille cut-off til CD45-positivitet, hvilket gør portene til at fange CD45+ celler og CD45-celler. Den nederste profil af figur 5A viser begge disse porte anvendes på en spyt prøve farves med anti-CD45 antistof. Farvning med yderligere antistoffer anvendes derefter til at identificere blodcellespecifikke populationer i CD45+-porten (figur 5B) og andre ikke-blodcellepopulationer, herunder epitelpopulationer i CD45-gaten (figur 5C). I begge tal viser topprofilerne, hvordan isotype-farvet spyt bruges til at indstille de dobbelte negative populationer, mens de nederste profiler viser de antistofplettede spytceller. Figur 5B (nederst) viser seks forskellige CD45+ cellepopulationer, der er skabt med cocktailen af antistoffer, der kan påvises i fluorescens (FL) 1-kanalen (anti-CD66b, CD3, CD19-antistoffer) og anti-CD206,som kan påvises i FL3-kanalen. Sorteringsforsøg har vist, at lungespecifikke makrofager ligger i portene identificeret med M. Tilstedeværelsen af celler i disse porte indikerer således, at spytprøven var afledt af lungen og ikke var spyt (Bederka et al., manuskript under forberedelse). Figur 5C (nederst) viser de gating kvadranter skabt med anti-pan-cytokeratin (panCK), der kan påvises i FL1-kanalen og anti-epitelcelle vedhæsion molekyle (EpCAM) antistoffer påvises i FL3 kanal blandt CD45- spyt celler.
Denne mærkningsprotokol er blevet grundigt testet på Navios EX og LSR II. Nogle indledende eksperimenter blev udført på Lyric, men uden den omfattende instrument optimering, der blev gjort for de to andre maskiner. Derfor er detaljerede instrumentindstillinger fastsat for Navios EX og LSR II i materialer ark, men ikke for Lyric. For at forstå ligheder og variationer mellem disse tre flow cytometriske platforme, der kan bruges til at analysere spytceller, profiler opnået fra de forskellige maskiner kan sammenlignes i figur 6 og figur 7. To store spytprøver blev behandlet, samlet, mærket, opdelt i tre lige store portioner og efterfølgende erhvervet på hvert flowcytometer, der er nævnt ovenfor. Figur 6, der ligner figur 4, sammenligner gatingstrategien for eliminering af snavs, døde celler og celleklumper. Figur 7, som er identisk med figur 5, sammenligner blod- og ikke-blodprofilerne fra de data, der er indsamlet på de forskellige flowcytometre.
Sammenligning af de forskellige profiler, der er opnået fra de tre forskellige flowcytometre, viser, at de samme basisprofiler kan observeres med hvert instrument. Forskellene at være opmærksom på er SSC-W/FSC-W (bredde gate) parceller (Figur 6, anden række) og de lineære skalaer af scatter plots (Figur 6 og 7). Punktbreddeplottet, der genereres på Navios EX, viser en inkluderingsport (rød boks), hvilket betyder, at alle celler, der er inkluderet i porten, analyseres yderligere; hændelserne langs akserne i venstre nederste hjørne er udelukket. Punktbredden plots på LSR II, og Lyric viser ikke en lignende indbetaling af begivenheder langs de samme akser. Denne uoverensstemmelse skyldes sandsynligvis den meget følsomme tærskel, der anvendes på Navios EX, hvilket fører til nogle små snavs i den tidligere størrelsesudelukkelsesport (øverste række i figur 6). Til tider ses snavs langs akserne i scatter bredde profil genereret på LSRII, men det er i højre nederste hjørne. I disse tilfælde anvendes en udelukkelsesport (som angivet i den stiplede røde boks i den midterste profil i række 2 i figur 6) til at fjerne disse hændelser fra yderligere analyse.
Mens log skalaer synes lidt anderledes på parcellerne mellem Navios EX og Lyric og LSR II cytometre, Navios EX har mulighed for at erhverve data ved hjælp af flere årtier. Gennemførelse af flere årtier afhænger af eksperimentets kontekst og den ønskede følsomhed for at visualisere de befolkningsgrupper af interesse.
En yderligere bemærkelsesværdig forskel mellem Navios EX og LSR II og Lyric cytometre er udseendet af profilen af singlet gate. Navios EX cytometeret er udstyret med en rektangulær flowcelle med en anden samlingsvinkel end LSR II. Navios EX indeholder tre softwarestyrede samlingsvinkler for at optimere den fremadrettede vinkellysspredning for at opnå den følsomhed, der passer til partikelstørrelse at analysere. Polygonporten til Navios EX-cytometeret skal justeres til en lidt lavere vinkel end singletporten til LSRII. Singlet gate til Lyric kan optimeres for at få en profil svarende til den, der ses med LSR II. Ved hjælp af spytprøven skal områdets skaleringsfaktor optimeres for hver laser på Lyric for at opnå en singletport svarende til LSR II.
Alle de profiler, der vises i figur 4 til figur 7 , blev analyseret med FlowJo-software, version 10.6. .fcs-filerne findes i FlowRepository (https://flowrepository.org), under ID FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ og FR-FCM-Z3MM og kan bruges til at praktisere sputumanalysen som illustreret i disse tal.
Figur 1: Spytvægte og celleudbytte. (A) Afbildet er forholdet mellem spytvægt, bestemt før forarbejdning, og det samlede celleudbytte, bestemt efter behandling ved hjælp af et hæmocytometer. Hvert punkttegn repræsenterer en individuel prøve, 126 i alt. B) Spytprøverne blev stratificeret i fire kategorier baseret på deres vægt: små til prøver, der vejer op til 3 g, medium for prøver, der vejer mere end 3 g op til 8 g, store til prøver, der vejer mere end 8 g op til 16 g, og ekstra store prøver for prøver, der vejer mere end 16 g. (C) Vist er fordelingen af celleudbyttet for prøverne i hver kategori. De røde søjler i (B) og (C) repræsenterer medianværdierne i hver kategori. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Antistoftritering for anti-human CD45-PE. A) CD45-PE-titreringskurven med den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) for den positive population, der er afbildet, i forhold til koncentrationen af CD45-PE-antistofplateauerne ved 1 μg/mL. B) Titreringskurven, der viser farvningsindekset i forhold til antistofkoncentrationen, viser, at det højeste farvningsindeks er på 1 μg/mL. Farvningsindeks blev beregnet som: [CD45 MFI positiv population - CD45 MFI negativ population] / [2 * Standardafvigelse]. Baseret på figur 2A og figur 2B blev 1 μg/mL valgt som den optimale koncentration for CD45-PE antistoffet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Andelen af 100-tal og døde celler i spytprøver er konsistent blandt de fire vægtkategorier. Den procent SEC forurening blev bestemt af hæmocytometer som en del af det samlede celletal. (B) Celle levedygtigheden af spytprøver undtagen SECS, bestemt ved hæmocytometer og trypan blå udelukkelse metode. For hver graf repræsenterer de røde linjer medianværdierne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Gating strategi for udelukkelse af snavs, døde celler, og doublets i en spyt prøve. A) NIST-perler i størrelserne 5 μm, 20 μm og 30 μm blev anvendt til at indstille porten angivet af den røde boks for at udelukke snavs, der var mindre end 5 μm og større snavs over 30 μm og tæt på aksen. (B) Der blev udtaget en spytprøve ved hjælp af de samme spændinger for den forreste og side scatter som NIST perler. Porten, der blev oprettet i (A), blev anvendt til at udelukke snavs. (C) Små snavs tæt på aksen blev udelukket i dette punktbreddeplot. (D) Der blev anvendt en ikke-farvet spytprøve til at indstille afskæringen (rød linje) for den negative, ikke-farvede population for levedygtighedsfarven. (E) Cut-off oprettet i D blev anvendt på den farvede spyt prøve til at danne en port (rød boks) til at omfatte levende, levedygtige celler. (F) Den enkeltport, der er angivet med den røde polygon, omfatter ikke celler, der ikke falder på diagonalen, hvilket eliminerer dobbeltter og/eller klumper. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Gating strategi af spytceller i blod og ikke-blod celle rum. (A) Ubesmittede spytceller afledt af singlet gate bruges til at indstille cut-off (rød linje) på den negative befolkning for CD45 (top). Cut-off fra topprofilen påføres den farvede spytprøve (nederst) for at skelne CD45-positive (CD45+) og negative populationer (CD45-). (B) CD45+ spytceller, der er farvet med isotypeantistoffer til FITC/AF488, bruges til at indstille portene til den negative population (øverst). De samme porte anvendes på CD45+ spytcellerne, der er farvet med blodcellemarkørerne CD3, CD19, CD66b og CD206 (nederst). (C) Kvadrantporte placeres på CD45-spytcellerne, der er farvet med isotypekontroller (øverst) og påføres CD45-cellerne fra spytprøven, der er farvet med epitelmarkørerne pancytokeratin (panCK) og EpCAM (nederst). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Gating strategi for at udelukke snavs, klumper, og døde celler af farvede spyt celler på tre flow cytometri platforme. To store spytprøver blev behandlet, samlet, mærket og opdelt i tre lige store portioner til erhvervelse på Navios EX (A), LSR II (B) og Lyric (C) flowcytometre. Øverste række: Spytprøver blev gated (rød boks) for at udelukke meget små og store snavs. Anden række: Den store røde boks i Navios EX-plottet repræsenterer en inklusionsport, der indeholder cellerne, men udelukker snavs. Den stiplede lille røde boks set i LSR II plot repræsenterer en udelukkelse gate for at fjerne vragrester fra yderligere analyse. Yderligere optimering med Lyric er nødvendig for at afgøre, hvor vragrester udelukkelse gating er nødvendig. Derfor er der ingen port til stede i dette plot. Tredje række: røde rektangulære porte omfatter levende celler til yderligere analyse. Nederste række: polygonporten har enkelte celler ved at udelukke doubler, der falder uden for portens diagonal. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Gating strategi for spyt farves til blod og epitel markører på tre flow cytometri platforme. Analysen i figur 6 videreføres i figur 7; alle levedygtige, enkeltceller (nederste række, figur 6) blev opdelt i CD45+ og CD45-populationer (første række, figur 7), således at blodcellespecifikke markører og epitelcellespecifikke markører yderligere kunne afgrænse disse populationer. Anden række: profil af blodlegemer CD3/CD19/CD66b og CD206 fra CD45+ celler. Tredje række: epitelcellemarkører panCK og EpCAM fra CD45-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Antistof/plet | Formål |
| FVS510 | Levedygtighedsplet |
| Anti-human CD45 – PE | Pan-leukocyte markør; PE kompensation |
| Anti-human CD66b – FITC | Granulocyte markør |
| Anti-menneskelige CD3 - Alexa488 | T-cellemærke |
| Anti-menneskelige CD19 - Alexa488 | B-cellemærke; FITC/Alexa488 kompensation |
| Anti-human CD206 – PE-CF594 | Markør for makrofag i lungerne; PE-CF594 kompensation |
| Anti-human EpCAM – PE-CF594 | Epitelcellemarkør; PE-CF594 kompensation |
| Anti-human pan-cytokeratin (panCK) – Alexa488 | Epitelcellemarkør |
| IgG1κ – Alexa488 | CD3/CD19/panCK isotype kontrol |
| IgG1κ – FITC | CD66b isotype kontrol |
| IgG1κ – PE-CF594 | Cd206/EpCAM isotype kontrol |
| Anti-human CD45 – BV510 | FVS510 kompensation |
Tabel 1: Der anvendes antistoffer og levedygtighedspletter. Liste over antistoffer og levedygtighed farvestof, der anvendes i denne protokol. Angivet er de cellulære delmængder, de hver især identificerer.
| Rør (etiket) | Stikprøvestørrelse* | HBSS (μL) | FVS510 (μL) | CD45 (μL) | Andre antistoffer (μL) | Celler § (μL) | |||
| Farves ikke | lille | 80 | 20 | ||||||
| Medium | 50 | 50 | |||||||
| stor | 50 | 50 | |||||||
| IgG1κ - Alexa488 | IgG1κ- FITC | IgG1κ - PE-CF594 | |||||||
| Isotype-kontrolelement | lille | 60.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 20 | |
| Medium | 30.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| stor | 30.25 | 1 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| CD206 | CD3 | CD19 | CD66b | ||||||
| Blod | lille | 92.875 | 1.5 | 25 | 1.875 | 5 | 1.25 | 7.5 | 115 |
| Medium | 65.75 | 3 | 50 | 3.75 | 10 | 2.5 | 15 | 350 | |
| stor | 102.5 | 10 | 100 | 7.5 | 20 | 5 | 30 | 725 | |
| EpCAM | PanCK | ||||||||
| Epitel | lille | 96.5 | 1.5 | 25 | 10 | 2 | 115 | ||
| Medium | 73 | 3 | 50 | 20 | 4 | 350 | |||
| stor | 117 | 10 | 100 | 40 | 8 | 725 | |||
| * Prøver betragtes som små, mellemstore eller store baseret på vægt bestemt i trin 1 i sputum dissociation del af protokollen. | |||||||||
| § Celler skal tilsættes , når alle reagenser er blevet fordelt, herunder dem i erstatningsrørene (tabel 3). | |||||||||
Tabel 2: Indhold af rør med spytceller. Brug denne tabel som nævnt i protokollen til at tilføje de angivne mængder antistoffer og levedygtighedsplet for den relevante stikprøvestørrelse.
| Rør (etiket) | Reagenser tilføjet (μL) | Reagenser tilføjet (drop) | ||||||
| HBSS | CD45-PE | CD206-PE-CF594 | EpCAM-PE-CF594 | CD19-Alexa488 | CD45-BV510 | CompBead (+) | CompBead * (-) | |
| PE comp. | 76 | 4 | x | x | x | x | 1 | 1 |
| PE-CF594 comp. | 72 | x | 4 | 4 | x | x | 1 | 1 |
| Alexa488/FITC comp. | 60 | x | x | x | 20 | x | 1 | 1 |
| BV510 comp. | 60 | x | x | x | x | 20 | 1 | 1 |
| * De positive (+) og negative (-) perler skal tilsættes , når alle reagenser er blevet fordelt, og rørene i tabel 2 er blevet forberedt. | ||||||||
| comp. = kompensation | ||||||||
Tabel 3: Indholdet af erstatningsrør. Brug denne tabel som nævnt i protokollen til at føje de angivne mængder antistoffer til kompensationsperlerne.
| Celletal (x 106) | ||||
| En | B | C | D | |
| Eksempelstørrelse | I farvning volumen * | 50 gange adgang ¶ | Median prøve (fold adgang) # | Største prøve (fold adgang) # |
| Lille | 0.625 | 31.25 | 8.0 (12.8) | 24.77 (39.6) |
| Medium | 1.25 | 62.5 | 13.0 (10.4) | 48.87 (39.1) |
| Stor | 2.5 | 125 | 35.4 (14.2) | 113.5 (45.4) |
| * Farvning af diskenheder, der bruges i protokollen (tabel 2). Cellenummer ekstrapoleres fra, hvordan titreringskurven blev udført; 1 μg/mL AF CD45-PE og 1 x 106 celler pr. 200 μL. | ||||
| ¶ 50 gange adgang til cellenumre i kolonne A. | ||||
| # foldadgang i kolonne C og D beregnes ved at dividere det tal, der præsenteres i cellerne i kolonne C eller D, med tallet i den tilsvarende celle i kolonne A. | ||||
Tabel 4: Anti-human CD45-PE-koncentration for alle prøver i hver stikprøvestørrelseskategori.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det cellulære indhold af spyt omfatter et stort udvalg af vidtrækkende celler, ofte ledsaget af en masse snavs37. Derudover kræver spytanalyse en kvalitetskontrol, der bekræfter, at prøven indsamles fra lungen i stedet for mundhulen38. Derfor er det ikke så simpelt at analysere spyt ved flowcytometri som det er for blod, for eksempel, hvilket frigiver en meget renere og homogen celleaffjedring. Denne protokol har behandlet alle disse spørgsmål: at give instrumentindstillinger ved hjælp af specifikke størrelse perler for at sikre, at både de mindste og største cellepopulationer kan påvises, en gating strategi for at fjerne snavs, celle klumper, forurenende TAC'er og andre døde celler, og endelig en kvalitetskontrol foranstaltning for at sikre en spyt prøve er fra lungerne i stedet for at være for det meste spyt.
Der er kritiske trin i protokollen i arbejdet med spyt, der er værd at påpege. For det første kan celleudbyttet blive drastisk påvirket af antallet af nyloncellesnien, der anvendes i trin 2.5 i spytafledningsdelen af protokollen. Flere sien kan være nødvendige for at undgå at miste for mange celler på grund af tilstopning af si. Når strømmen gennem sistammerne er bremset mærkbart, skal der anvendes en ny si. For det andet kan cellepillen af spytprøver være meget løs, især hvis der er høj forurening af 2-2-2-2000. Derfor er det vigtigt ikke at aspirere for tæt på pellet, når supernatanten fjernes efter centrifugering af prøverne. Aspirating for tæt på pellet kan resultere i celletab, hvis ikke tab af hele pellet. For det tredje kræver denne protokol et fikseringstrin. Dette bevarer cellerne og deres farvningsprofil og tjener som en sikkerhedsforanstaltning for at beskytte flowcytometeroperatøren. Kørende prøver på visse flowcytometre kan udgøre en øget biologisk fare på grund af risikoen for aerosolproduktion39. PFA-fikseringen hjælper med at beskytte operatøren mod potentielle patogener i spytprøven. For det fjerde, og måske det mest udfordrende aspekt af udarbejdelsen spyt prøver til flow cytometri analyse, er celletælling. Celletælling er kompliceret på grund af det store udvalg af celletyper, der findes i spyt. Tællemaskiner er ofte begrænset af cellestørrelsesområdet, de kan fange, og er derfor mindre pålidelige end et hæmocytometer. Men celletælling af spytprøver ved hæmocytometer, som er fremragende beskrevet af Guiot et al.20, er kedelig og kræver praksis for at blive dygtig. Et nøjagtigt celletal er afgørende for at bestemme prøvens endelige resuspensionsvolumen for at give mulighed for en rimelig strømningshastighed og forhindre træsko i flowcytometeret. Tilstedeværelsen af de meget store 2-pc'er i spyt og de mange mindre celleklumper, der ikke brydes op af dissociationsbufferen eller fanget af filtrene, øger sandsynligheden for at tilstoppe flowcytometeret. Derfor anbefales det at bruge lidt tid på at bestemme den bedste cellekoncentration / flowhastighed til dataindsamling ved hjælp af det tilgængelige flowcytometer. Derudover skal du sikre dig, at flowcytometeret har den passende flowcelle- og dysestørrelse (eller sonde), der er i stand til at måle de større cellepopulationer, der er til stede i spyt.
Selv når færdigheder i celletælling er opnået, er det stadig en tidskrævende proces. Reagensernes bestemmelse for cellemærkning i denne protokol er derfor baseret på stikprøvestørrelsen (som bedømt efter vægt) i stedet for cellenummer. Dette giver mulighed for en mere effektiv brug af tid, da det manuelle celletal kan afsluttes i den tid, der er nødvendig for antistof- og levedygtighedsfarvefarvningen. Der er dog tre bemærkelsesværdige undtagelser fra dette. Hvis en prøve >16 g (de såkaldte ekstra store prøver), skal det manuelle celletal forekomme før farvning, så dyre reagenser kan bevares ved kun at farvning 25 x 106 celler hver for blod og epitelrør. Dette cellenummer giver meget pålidelige profiler i de indstillinger, der er beskrevet i denne protokol. En anden potentiel undtagelse er tilfældet med en meget lille prøve. Skønnet er, at der er behov for mindst 1-2 x 106 celler til flowcytometrianalysen som vist i denne protokol for at generere pålidelige profiler (data, der ikke vises). Hvis en prøve indeholder færre end 1-2 x 106 celler, er det derfor muligvis ikke værd at fortsætte proceduren, da det endelige resultat sandsynligvis vil være uacceptabelt.
Specifikke mærkning reagenser, der fungerer godt på perifere blodlegemer eller cellelinjer kan arbejde meget forskelligt på blodlegemer indeholdt i spyt (ikke-offentliggjorte observationer). Derfor anbefales det at titrere hvert antistof eller andre mærkning reagenser i henhold til veletablerede protokoller34,35 før de anvendes i flow cytometri eksperimenter. De fleste antistoftritering bør give sammenlignelige resultater ved farvning op til 10 til 50 gange; Det anbefales dog at gøre yderligere titreringer med celletal højere end dette interval34. Når en reagenskoncentration er fastlagt, er det vigtigt at holde inkubationstiden for dette reagens det samme som i det faktiske forsøg. Af denne grund understreger protokollen at tilføje alle buffer og reagenser til rørene, før cellerne eller kompensationsperlerne tilsættes. Denne rækkefølge af tilsætning af reagenser og celler / perler sammen giver mulighed for højere konsistens i mærkning gange. Hvis den eksperimentelle inkubationstid af en eller anden grund ikke kan holdes svarende til den, der anvendes til antistof/farvestoftitering, skal sidstnævnte gentages med en inkubationstid, der er mulig under forsøg.
Spytprøver er blevet meget anvendt som en diagnostisk prøve til at studere patofysiologi af forskellige sygdomme, der påvirker lungen. Tuberkulose40,41, KOL13,42, astma43, cystisk fibrose44,45, lungekræft46,47,48, og leddegigt49 er blandt de mange sygdomme, hvor spyt er blevet undersøgt på grund af fordelen ved det er en ikke-invasivt opnået prøve. Senest er spyt under coronapandemien blevet brugt til at opspore langvarig virusudgydelse hos patienter indlagt med coronavirus i 2019 (covid-19)50.
Forskellige teknologier, herunder omvendt transskription-polymerase kædereaktion (RT-PCR), proteinanalyse, mikroskopi, og flow cytometri, er blevet brugt til at identificere sygdomsspecifikke markører i spyt. Brug af en flow cytometrisk platform til at analysere spytprøver er ikke meget udbredt, men dens anvendelse stiger. Med de seneste fremskridt inden for teknologi flow cytometre3,51,52, samt fremskridt i kemikere af fluorophores, generation af nye antistof kloner, og udvikling af forskellige farvestoffer til at identificere døde cellepopulationer51,53,54, muligheden for at designe antistofpaneler med henblik på at diagnosticere menneskelige sygdomme er steget dramatisk. Desuden vil det nylige skub til automatisering af analysen af flowcytometriske data55,56 eliminere den potentielle bias ved manuelt at læse og fortolke flowdata. Disse nye udviklinger inden for flowcytometri vil i væsentlig grad lette udforskningen af spyt som en klinisk diagnostisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne er tidligere eller nuværende medarbejdere i bioAffinity Technologies.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke David Rodriguez for hans hjælp med figurforberedelsen. Sputum prøver blev kørt på BD LSR II på UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, støttet af UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC på UT Health) og UL1 TR001120 (CTSA tilskud).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Paraformaldehyde Flow-Fix | Polysciences | 25037 | |
| 100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
| 50 mL conical falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Alexa488 anti-human CD19 | BioLegend | 302219 | |
| Alexa488 anti-human CD3 | BioLegend | 300415 | |
| Alexa488 anti-human cytokeratin | BioLegend | 628608 | |
| Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype | BioLegend | 400129 | |
| BV510 anti-human CD45 | BioLegend | 304036 | |
| CD66b FITC isotype | BD Biosciences | 555748 | |
| CompBead Plus Compensation Beads | BD Biosciences | 560497 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
| CS&T beads | BD Biosciences | 655051 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| FITC anti-human CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 564406 | |
| FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
| FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| NAC | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NIST Beads, 05 μM | Polysciences | 64080 | |
| NIST Beads, 20 μM | Polysciences | 64160 | |
| NIST Beads, 30 μM | Polysciences | 64170 | |
| PE anti-human CD45 | BioLegend | 304039 | |
| PE-CF594 anti-human EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
| PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype | BD Biosciences | 562292 | |
| PE-CR594 anti-human CD206 | BD Biosciences | 564063 | |
| Sodium citrate dihydrate | EMD | SX0445-1 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 |
References
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews. Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), San Diego, Calif. 251-258 (2012).
- Robinson, J. P., Roederer, M. History of science. Flow cytometry strikes gold. Science. 350 (6262), New York, N.Y. 739-740 (2015).
- Orfao, A., et al. Immunophenotypic dissection of normal hematopoiesis. Journal of Immunological Methods. 475, 112684 (2019).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Bento, L. C., et al. The use of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: A review. Frontiers in Oncology. 7, 270 (2017).
- Della Porta, M. G., Picone, C. Diagnostic utility of flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases. 9 (1), 2017017 (2017).
- Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2), Pt 1 475-478 (2000).
- Spanevello, A., et al. Induced sputum cellularity. Reference values and distribution in normal volunteers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 162 (3), Pt 1 1172-1174 (2000).
- Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
- Hastie, A. T., et al. Mixed sputum granulocyte longitudinal impact on lung function in the severe asthma research program. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (7), 882-892 (2021).
- Hastie, A. T., et al. Association of sputum and blood eosinophil concentrations with clinical measures of COPD severity: an analysis of the SPIROMICS cohort. The Lancet. Respiratory Medicine. 5 (12), 956-967 (2017).
- Kim, J., et al. Innate immune crosstalk in asthmatic airways: Innate lymphoid cells coordinate polarization of lung macrophages. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (5), 1769-1782 (2019).
- Bai, Y., Zhou, Q., Fang, Q., Song, L., Chen, K. Inflammatory cytokines and T-Lymphocyte subsets in serum and sputum in patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 25, 2206-2210 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-Carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Hristara-Papadopoulou, A., Tsanakas, J., Diomou, G., Papadopoulou, O. Current devices of respiratory physiotherapy. Hippokratia. 12 (4), 211-220 (2008).
- Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and biochemical analysis of induced sputum from asthmatic and from healthy subjects. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
- Alexis, N., Soukup, J., Ghio, A., Becker, S. Sputum phagocytes from healthy individuals are functional and activated: a flow cytometric comparison with cells in bronchoalveolar lavage and peripheral blood. Clinical Immunology. 97 (1), 21-32 (2000).
- Guiot, J., et al. Methodology for sputum induction and laboratory processing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56612 (2017).
- Paggiaro, P. L., et al. Sputum induction. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 3-8 (2002).
- Anjuman, N., Li, N., Guarnera, M., Stass, S. A., Jiang, F. Evaluation of lung flute in sputum samples for molecular analysis of lung cancer. Clinical and Translational Medicine. 2, 15 (2013).
- Sethi, S., Yin, J., Anderson, P. K. Lung flute improves symptoms and health status in COPD with chronic bronchitis: A 26 week randomized controlled trial. Clinical and Translational Medicine. 3, 29 (2014).
- Su, J., et al. Analysis of lung flute-collected sputum for lung cancer diagnosis. Biomarker Insights. 10, 55-61 (2015).
- Naraparaju, S., Vaishali, K., Venkatesan, P., Acharya, V. A comparison of the Acapella and a threshold inspiratory muscle trainer for sputum clearance in bronchiectasis-A pilot study. Physiotherapy Theory and Practice. 26 (6), 353-357 (2010).
- Hinson, K. F., Kuper, S. W. The diagnosis of lung cancer by examination of sputum. Thorax. 18, 350-353 (1963).
- Johnston, W. W., Bossen, E. H. Ten years of respiratory cytopathology at Duke University Medical Center. I. The cytopathologic diagnosis of lung cancer during the years 1970 to 1974, noting the significance of specimen number and type. Acta Cytologica. 25 (2), 103-107 (1981).
- Ng, A. B., Horak, G. C. Factors significant in the diagnostic accuracy of lung cytology in bronchial washing and sputum samples. II. Sputum samples. Acta Cytologica. 27 (4), 397-402 (1983).
- Smiths Medical Videos. , Available from: https://videos.smiths-medical.com/search?q=acapella&page=1 (2021).
- Pizzichini, E., et al. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154 (2), 308-317 (1996).
- Miller, H. R., Phipps, P. H., Rossier, E. Reduction of nonspecific fluorescence in respiratory specimens by pretreatment with N-acetylcysteine. Journal of Clinical Microbiology. 24 (3), 470-471 (1986).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 4, Unit 4.1 (2001).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Kini, S. R. Color Atlas of Pulmonary Cytopathology. , Springer-Verlag New York, Inc. (2002).
- Papanicolaou Society of Cytopathology Task Force on Standards of Practice. Guidelines of the Papanicolaou Society of Cytopathology for the examination of cytologic specimens obtained from the respiratory tract. Diagnostic Cytopathology. 21 (1), 61-69 (1999).
- Holmes, K. L., et al. International Society for the Advancement of Cytometry cell sorter biosafety standards. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 85 (5), 434-453 (2014).
- Datta, S., Shah, L., Gilman, R. H., Evans, C. A. Comparison of sputum collection methods for tuberculosis diagnosis: a systematic review and pairwise and network meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (8), 760-771 (2017).
- Armstrong-Hough, M., et al. "Something so hard": a mixed-methods study of home sputum collection for tuberculosis contact investigation in Uganda. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease: The Official Journal of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. 22 (10), 1152-1159 (2018).
- Freeman, C. M., et al. Design of a multi-center immunophenotyping analysis of peripheral blood, sputum and bronchoalveolar lavage fluid in the Subpopulations and Intermediate Outcome Measures in COPD Study (SPIROMICS). Journal of Translational Medicine. 13, 19 (2015).
- Petsky, H. L., Li, A., Chang, A. B. Tailored interventions based on sputum eosinophils versus clinical symptoms for asthma in children and adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 8, 005603 (2017).
- Hisert, K. B., Liles, W. C., Manicone, A. M. A flow cytometric method for isolating cystic fibrosis airway macrophages from expectorated sputum. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (1), 42-50 (2019).
- Duncan, G. A., et al. Microstructural alterations of sputum in cystic fibrosis lung disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (18), 88198 (2016).
- Kemp, R. A., Reinders, D. M., Turic, B. Detection of lung cancer by automated sputum cytometry. Journal of Thoracic Oncology: Official Publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2 (11), 993-1000 (2007).
- Blandin Knight, S., et al. Progress and prospects of early detection in lung cancer. Open Biology. 7 (9), (2017).
- Gomperts, B. N., Spira, A., Elashoff, D. E., Dubinett, S. M. Lung cancer biomarkers: FISHing in the sputum for risk assessment and early detection. Cancer Prevention Research. 3 (4), Philadelphia, Pa. 420-423 (2010).
- Demoruelle, M. K., et al. Antibody responses to citrullinated and noncitrullinated antigens in the sputum of subjects with rheumatoid arthritis and subjects at risk for development of rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (4), Hoboken, N.J. 516-527 (2018).
- Wang, K., et al. Differences of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 shedding duration in sputum and nasopharyngeal swab specimens among adult inpatients with coronavirus disease 2019. Chest. 158 (5), 1876-1884 (2020).
- Chattopadhyay, P. K., Hogerkorp, C. -M., Roederer, M. A chromatic explosion: the development and future of multiparameter flow cytometry. Immunology. 125 (4), 441-449 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nature Immunology. 15 (2), 128-135 (2014).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit 9.34 (2010).
- Chattopadhyay, P. K., et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine. 12 (8), 972-977 (2006).
- Duetz, C., Bachas, C., Westers, T. M., Avan de Loosdrecht, A. A. Computational analysis of flow cytometry data in hematological malignancies: future clinical practice. Current Opinion in Oncology. 32 (2), 162-169 (2020).
- Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews. Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).
