Summary
Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het dissociëren van sputum in een enkele celsuspensie en de daaropvolgende karakterisering van cellulaire subsets op standaard flowcytometrische platforms.
Abstract
Sputum, veel gebruikt om de cellulaire inhoud en andere micro-omgevingskenmerken te bestuderen om de gezondheid van de long te begrijpen, wordt traditioneel geanalyseerd met behulp van cytologie-gebaseerde methodologieën. Het nut ervan is beperkt omdat het lezen van de dia's tijdrovend is en zeer gespecialiseerd personeel vereist. Bovendien maakt uitgebreid puin en de aanwezigheid van te veel plaveiselepitheelcellen (SECs), of wangcellen, een monster vaak ongeschikt voor diagnose. Flowcytometrie daarentegen maakt fenotypering met hoge doorvoer van cellulaire populaties mogelijk, terwijl tegelijkertijd puin en SECs worden uitgesloten.
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte methode om sputum te dissociëren in een enkele celsuspensie, antilichaamkleuring en cellulaire populaties te fixeren en monsters te verkrijgen op een flowcytometrisch platform. Een gating-strategie die de uitsluiting van puin, dode cellen (inclusief SECs) en celdubbelts beschrijft, wordt hier gepresenteerd. Verder legt dit werk ook uit hoe levensvatbare, enkele sputumcellen kunnen worden geanalyseerd op basis van een cluster van differentiatie (CD)45 positieve en negatieve populaties om hematopoëtische en epitheliale afstammingssubsets te karakteriseren. Een kwaliteitscontrolemaatregel wordt ook geleverd door longspecifieke macrofagen te identificeren als bewijs dat een monster is afgeleid van de long en geen speeksel is. Ten slotte is aangetoond dat deze methode kan worden toegepast op verschillende cytometrische platforms door sputumprofielen van dezelfde patiënt te verstrekken die op drie flowcytometers zijn geanalyseerd; Navios EX, LSR II en Lyric. Bovendien kan dit protocol worden gewijzigd om extra cellulaire markers van belang op te nemen. Een methode om een volledig sputummonster te analyseren op een flowcytometrisch platform wordt hier gepresenteerd dat sputum geschikt maakt voor het ontwikkelen van high-throughput diagnostiek van longziekte.
Introduction
Technische vooruitgang in de hardware en software van flowcytometers heeft het mogelijk gemaakt om veel verschillende celpopulaties tegelijkertijd te identificeren1,2,3,4. Het gebruik van de flowcytometer in hematopoëtisch celonderzoek heeft bijvoorbeeld geleid tot een veel beter begrip van het immuunsysteem2 en de cellulaire hiërarchie van het hematopoëtische systeem5, evenals het diagnostische onderscheid van een veelheid aan verschillende bloedkankers6,7,8. Hoewel de meeste sputumcellen van hematopoëtische oorsprong zijn9,10,11, is flowcytometrie niet op grote schaal toegepast op sputumanalyse voor diagnostische doeleinden. Verschillende studies suggereren echter dat de evaluatie van immuuncelpopulaties in sputum (de belangrijkste subset van cellen) van grote hulp kan zijn bij het diagnosticeren en / of monitoren van ziekten zoals astma en chronische obstructieve longziekte (COPD)12,13,14,15. Bovendien maakt het bestaan van epitheliale specifieke markers die kunnen worden gebruikt in flowcytometrie de ondervraging van de volgende belangrijkste subset van cellen in sputum, longepitheelcellen mogelijk.
Naast het vermogen om veel verschillende celpopulaties van verschillende weefseloorsprongen te analyseren, kan een flowcytometer grote aantallen cellen in een relatief korte periode evalueren. Ter vergelijking: op dia's gebaseerde, cytologische soorten analyses vereisen vaak zeer gespecialiseerd personeel en / of apparatuur. Deze analyses kunnen arbeidsintensief zijn, wat ertoe leidt dat slechts een deel van het sputummonster wordt geanalyseerd16.
Drie kritieke problemen beperken het wijdverbreide gebruik van sputum in flowcytometrie. Het eerste probleem heeft betrekking op het verzamelen van sputum. Sputum wordt verzameld door middel van een hoest die slijm uit de longen in de mondholte verdrijft en vervolgens in een verzamelbeker spuugt. Omdat het slijm door de mondholte reist, is er een grote kans op SEC-besmetting. Deze verontreiniging bemoeilijkt de monsteranalyse, maar het probleem kan gemakkelijk worden verholpen op een flowcytometrisch platform, zoals blijkt uit deze studie.
Niet iedereen kan spontaan sputum produceren; daarom zijn er verschillende apparaten ontwikkeld om te helpen bij het verzamelen van sputum op een niet-invasieve manier17. De vernevelaar is zo'n apparaat en er is aangetoond dat het betrouwbare sputummonsters produceert18,19,20. Hoewel de vernevelaar een zeer effectieve manier is om sputum niet-invasief te verzamelen, vereist het gebruik ervan nog steeds een instelling in een medische faciliteit met gespecialiseerd personeel21. Handheld-apparaten zoals de longfluit22,23,24 en de acapella16,25 kunnen daarentegen thuis worden gebruikt omdat ze zeer gebruiksvriendelijk zijn. Deze hulpmiddelen zijn zowel veilig als kosteneffectief.
Voor ons gaf de acapella consistent betere resultaten dan de longfluit16, en daarom is het acapella-apparaat gekozen voor sputumcollecties. Er werd besloten tot een 3-daags verzamelmonster omdat het primaire doel voor het gebruik van sputum het ontwikkelen van een longkankerdetectietest16 is. Het is aangetoond dat een 3-daagse steekproef de kans op detectie van longkanker verhoogt in vergelijking met een 1- of 2-daagse steekproef26,27,28. Andere methoden voor het verzamelen van sputum kunnen echter de voorkeur hebben voor verschillende doeleinden. Als een andere sputumverzamelingsmethode wordt gebruikt dan de hier beschreven methode, wordt aanbevolen om elk antilichaam of kleurstof dat wordt gebruikt voor flowcytometrische analyse zorgvuldig te titreren; er zijn zeer weinig gegevens beschikbaar over hoe verschillende sputumverzamelingsmethoden de beoogde eiwitten voor flowcytometrie beïnvloeden.
Het tweede probleem dat het enthousiasme voor het gebruik van sputum voor diagnostiek, voornamelijk gerelateerd aan flowcytometrie, dempt, is het celnummer. Het probleem is het verzamelen van voldoende levensvatbare cellen voor een betrouwbare analyse. Twee studies toonden aan dat sputummonsters verzameld door niet-invasieve methoden, met behulp van een hulpmiddel, voldoende levensvatbare cellen bevatten die kunnen worden gebruikt in klinische diagnose- of onderzoeksstudies16,24. Geen van deze studies ging echter in op de kwestie van celaantallen met betrekking tot flowcytometrie.
Voor de studies die de basis vormen voor dit protocol, werden sputummonsters verzameld van deelnemers met een hoog risico op het ontwikkelen van longkanker volgens goedgekeurde institutionele richtlijnen voor elke onderzoekslocatie. Deelnemers met een hoog risico werden gedefinieerd als tussen 55-75 jaar, 30 pakjaren gerookt en niet gestopt met roken in de afgelopen 15 jaar. Patiënten kregen te zien hoe ze het acapella-apparaat moesten gebruiken volgens de instructies van de fabrikant29 en verzamelden sputum gedurende drie opeenvolgende dagen thuis. Het monster werd tot de laatste verzameling in de koelkast bewaard. Op de laatste ophaaldag werd het monster 's nachts met een bevroren coldpack naar het laboratorium verscheept. De monsters werden verwerkt tot een enkele celsuspensie op de dag dat ze werden ontvangen. Met deze methode van sputumverzameling worden meer dan voldoende levensvatbare cellen verkregen voor een betrouwbare flowcytometrische analyse.
Ten slotte, en gerelateerd aan de vorige kwestie van het celnummer, is de vraag hoe de sputumcellen uit zijn mucineuze omgeving kunnen worden bevrijd. Hoe kunnen de cellen levensvatbaar worden gehouden en een enkele celsuspensie creëren die de flowcytometer niet verstopt? Gebaseerd op het eerste werk van Pizzichini et al.30 en Miller et al.31, beschrijft dit protocol een eenvoudige en betrouwbare methode voor sputumverwerking tot een enkele celsuspensie die geschikt is voor flowcytometrische analyse. Deze methode heeft gevestigde richtlijnen in flowcytometrie32,33,34 gebruikt om een efficiënte antilichaametiketteringsstrategie te ontwikkelen om hematopoëtische en epitheelcellen in sputum te identificeren en instrumentinstellingen, kwaliteitscontrolemaatregelen en analyserichtlijnen te bieden die sputumanalyse standaardiseren op een flowcytometrisch platform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle stappen van de sputumverwerking worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
1. Reagensvoorbereiding voordat met sputumdissociatie wordt begonnen
- Ontdooi 1% paraformaldehyde (PFA), 25 ml per monster op ijs en houd koud tot gebruik.
LET OP: PFA is giftig bij inademing en huidcontact. Bereid het fixeermiddel volgens de instructies van de fabrikant en vries het tot gebruik in bij -20 °C in 25 ml aliquots. - Benader het gewicht van het monster en ontdooi voldoende 0,1% Dithiothreitol (DTT) voor stap 2.2 en breng het op 37 °C. (Aliquots van DTT moeten vóór gebruik bij -20 °C worden bewaard.)
- Breng voldoende 0,5% N-acetyl- L-cysteïne (NAC) tot 37 °C voor stap 2.2. (NAC moet wekelijks vers worden gemaakt en vóór gebruik bij 4 °C worden bewaard.)
2. Sputumdissociatie
- Weeg het sputummonster om de volumes dissociatiereagentia te bepalen.
OPMERKING: Een monster wordt als klein beschouwd als het begingewicht ≤3 g is, gemiddeld als >3 g maar ≤8 g, groot als >8 maar ≤16 g, en extra groot als een monster >16 g weegt. De indicaties small, medium, large en extra-large worden in het hele protocol gebruikt. De hoeveelheid reagentia die nodig is voor dissociatie en etikettering verschilt afhankelijk van de grootte van het sputummonster. - Breng een klein monster over naar een schone conische buis van 50 ml, een medium monster naar een schone plastic wegwerpfles van 250 ml of een groot en extra groot monster naar een schone plastic wegwerpfles van 500 ml. Voeg 1 ml/g monstergewicht van 0,5% NAC en 4 ml/g monstergewicht van 0,1% DTT toe.
- Vortex op maximale snelheid (gedurende 15 s) en vervolgens rocken bij kamertemperatuur (op maximale snelheid) gedurende 15 minuten.
- Verdun het monster met vier volumes Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) (gebaseerd op het totale volume monster + reagentia) om de NAC en DTT te neutraliseren; vortex snel op maximale snelheid en gesteente bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op maximale snelheid.
- Filtreer de celsuspensie door 100 μm nylon mesh celzeef(en) in een of meer conische centrifugebuizen van 50 ml om een eencellige suspensie te creëren.
- Centrifugeer de cellen bij 800 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant op, combineer alle pellets in één conische buis van 15 ml en was de pellets vervolgens met HBSS onder dezelfde omstandigheden.
- Resuspend de celkorrel in een volume buffer dat wordt bepaald door het begingewicht van het sputummonster.
OPMERKING: Een klein monster wordt geresuspendeerd in 250 μL HBSS. Een mediummonster wordt geresuspendeerd in 760 μL HBSS. Grote en extra grote monsters worden geresuspendeerd in 1460 μL HBSS. - Neem een aliquot van de celsuspensie voor een levend/dood celgetal met Trypan Blue.
OPMERKING: Gebruik voor een klein monster 5 μL. Gebruik voor een medium, groot of extra groot monster 10 μL. Verdun 1:10 met HBSS.- Meng 10 μL van de sputumverdunning met 30 μL 0,4% Trypan Blue om een uiteindelijke monsterverdunning van 1:40 te bereiken. Laad in de telkamers van een hemocytometer voor een celtelling.
OPMERKING: Het kan nodig zijn om de uiteindelijke verdunning aan te passen als de celaantallen te laag of te hoog zijn om een nauwkeurige telling te bereiken. Het raadplegen van Guiot et al.20 voor het correct onderscheiden van sputumcellen van SECs en puin wordt hier sterk aanbevolen. Dit is essentieel voor een nauwkeurig celgetal.
- Meng 10 μL van de sputumverdunning met 30 μL 0,4% Trypan Blue om een uiteindelijke monsterverdunning van 1:40 te bereiken. Laad in de telkamers van een hemocytometer voor een celtelling.
- Verwijder uit het extra grote monster 50 x 106 cellen uit het totaal en voeg toe aan een nieuwe buis met voldoende toegevoegde HBSS om een totaal volume van 1700 μL te creëren.
OPMERKING: Beschouw dit als een grote steekproef voor de rest van het protocol. Overgebleven monsters kunnen worden weggegooid of voor andere doeleinden worden gebruikt.
3. Antilichaam en levensvatbaarheid kleurstof kleuring
- Keuze van antilichaam en kleurstof
OPMERKING: Tabel 1 toont de antilichamen en levensvatbaarheidskleurstof die in dit protocol worden gebruikt en de celpopulaties die zij identificeren.- Label de buisjes met de sputumcellen (zie tabel 2 voor etiketten).
- Gebruik 5 ml flowcytometriebuizen (compatibel met de gebruikte flowcytometer) voor de monsterbuis met de niet-gekleurde cellen en de buis met de isotypecontrole. Gebruik 15 ml conische buizen voor de bloed- en epitheliale buismonsters.
OPMERKING: Deze monsters worden overgebracht naar flowcytometriebuizen na antilichaamkleuring en -fixatie.
- Label de compensatiebuizen (tabel 3).
OPMERKING: Gebruik 5 ml flowcytometriebuizen die compatibel zijn met de gebruikte flowcytometer. - Voeg de hoeveelheid HBSS, antilichaam en/of kleurstof toe aan elk van de sputumcelbuizen en compensatiebuizen zoals aangegeven in respectievelijk tabel 2 en tabel 3.
OPMERKING: Voeg buffer (HBBS), antilichamen en kleurstof toe aan alle buizen voordat u cellen of compensatieparels toevoegt om ervoor te zorgen dat de kleuringstijd van alle buizen consistent is. - Voeg de in tabel 2 vermelde hoeveelheden sputumcelvolume toe aan de testbuizen.
- Voeg compensatieparels toe aan de compensatiebuizen zoals vermeld in tabel 3.
- Incubeer alle buizen (assay- en compensatiebuizen) op ijs, beschermd tegen licht, gedurende 35 minuten. Vul vervolgens de buizen met ijskoud HBSS en centrifugeer bij 4 °C gedurende 10 minuten bij 800 x g.
- Zuig voor de compensatiebuizen het supernatant zo dicht mogelijk bij de pellets aan en veeg de pellets los om los te maken.
- Voeg 0,5 ml koude HBSS toe aan de compensatiebuizen, bewaar ze op het ijs bij 4 °C en bescherm ze tegen licht totdat ze nodig zijn voor flowcytometrie-analyse.
- Zuig het supernatant na centrifugering (stap 3.6 van de antilichaamkleuringssectie) uit de onbevlekte isotype-, bloed- en epitheelbuizen en maak de pellets los door de buizen te vegen.
4. Fixatie met 1% paraformaldehyde (PFA)
- Voeg koude 1% PFA (die inmiddels ontdooid zou moeten zijn) toe aan de onbevlekte, isotype-, bloed- en epitheliale buizen; 2 ml naar de onbevlekte en isotypebuizen en 10 ml naar de bloed- en epitheelbuizen.
- Incubeer de buizen op ijs, beschermd tegen licht gedurende 1 uur. Vortex snel op maximale snelheid na 30 min.
- Vul de tubes met ijskoude HBSS. Centrifugeer vervolgens buizen bij 4 °C gedurende 10 minuten bij 1600 x g.
- Adem zoveel mogelijk bovennatuurlijk mogelijk op zonder de celkorrel te verstoren en veeg met de vingers over de buis om de cellen los te maken.
- Voeg 200 μL koude HBSS toe aan de ongevlekte en isotypebuizen.
- Bereken het volume HBSS voor resuspensie van het bloed en de epitheelbuis volgens het totale celgetal.
OPMERKING: Resuspensievolume = 0,15 x [totaal celgetal (stap 8 van sputumdissociatie) / 106]. Gebruik 50 x 106 als celgetal voor een extra groot monster. - Bewaar alle monsters en compensatiebuizen, beschermd tegen licht op het ijs bij 4 °C totdat de flowcytometrieanalyse is uitgevoerd.
OPMERKING: Dit protocol is niet langer dan 24 uur getest voor opslag.
5. Gegevensverzameling op de flowcytometer
- Pas de juiste opstartprocedures toe voor de gebruikte flowcytometer.
OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol gaat ervan uit dat de persoon die de flowcytometer bedient, is getraind in het gebruik van het instrument dat voor hen beschikbaar is, met name met betrekking tot dagelijkse procedures, waaronder het controleren van de stabiliteit van de optica- en fluidics-systemen, technieken voor het standaardiseren van lichtverstrooiing en fluorescentie-intensiteit, evenals het berekenen en toepassen van de juiste compensatiematrix. - Gebruik het mengsel van NIST-kralen (National Institute of Standards and Technology) om ervoor te zorgen dat voorwaartse verstrooiings- en zijverstrooiingsspanningen zijn ingesteld om de NIST-kralen te plaatsen om het hele perceel te overspannen zonder de kralen te dicht bij de assen te plaatsen.
OPMERKING: Deze stap is cruciaal om ervoor te zorgen dat vuil kleiner dan 5 μm kan worden geëlimineerd door gating post-acquisitie analyse. Afhankelijk van de gebruikte flowcytometer, moet u er rekening mee houden dat de kleinste kralen niet worden uitgesloten met de drempel (bij gebruik van de LSR II of de Lyric) of met de hoge discriminator (met behulp van de Navios EX flowcytometer). Voor de Navios EX werd een versterking van 2 gebruikt voor de voorwaartse en zijverstrooiing, een spanning van 236 voor voorwaartse spreiding en 250 voor zijverstrooiing. Voor de LSR II werd een voorwaartse verstrooiingsspanning van 165 en een zijdelingse verstrooiingsspanning van 190 gebruikt. - Stel het debiet in op gemiddeld (LSR II) of hoog (Navios EX).
OPMERKING: Het gemiddelde of hoge debiet voor de meeste instrumenten kan worden gebruikt om de sputumbuizen te verkrijgen. Het is belangrijk op te merken dat het gebruik van een te lage stroomsnelheid of te verdunning van het monster ertoe kan leiden dat de cellen bezinken, wat resulteert in verhoogde vortexing die niet gewenst is. Daarom moet het vasthouden aan het berekende resuspensievolume in stap 4.6 resulteren in cellulaire dichtheid die snel kan worden verkregen, maar de machine niet verstoppen. - Pas de spanningen aan voor elke parameter die wordt gebruikt voor de scatter- en fluorescentieparameters om de celpopulaties op de schaal te plaatsen. Gebruik de cijfers met de gating-strategie als leidraad voor het aanpassen van de spanningen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle benodigde parameters vóór de acquisitie zijn geselecteerd in het parameterselectievenster, anders worden er geen gegevens verzameld. - Verkrijg eerst gegevens voor het niet-gekleurde sputummonster, gevolgd door het isotype-gekleurde monster en vervolgens de bloedbuis en de epitheelbuis.
OPMERKING: Als de celsuspensie te geconcentreerd is om de flowcytometer in staat te stellen de monsters zonder verstopping uit te voeren, kunnen de monsters verder worden verdund met HBSS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol is ontwikkeld met een klinische laboratoriumomgeving in het achterhoofd. De focus tijdens de ontwikkeling van het protocol lag op eenvoud, efficiëntie en reproduceerbaarheid. Het bleek dat de meest tijdrovende stap in de verwerking van sputum het tellen van de cellen was. Daarom is het protocol zo opgezet dat sputumverwerking en celetikettering onafhankelijk van het tellen van cellen kunnen worden uitgevoerd zonder tijdverlies. Een nauwkeurig celgetal, dat nog steeds nodig is om het monster op de juiste manier te verdunnen voor een onbelemmerde run, kan dan worden verkregen tijdens de incubatieperiode van de antilichaametikettering.
Dit protocol gebruikt een sputumgewichtsmaatstaf in plaats van een celgetal als een indicatie van hoeveel antilichaam / kleurstof moet worden gebruikt voor optimale celetikettering. Er is echter een grote mate van variatie in het gewicht van de sputummonsters; van de 126 geanalyseerde monsters varieerde het gewicht van 0,57 g tot 38,30 g. Figuur 1A laat zien dat de correlatie tussen sputumgewicht en celopbrengst niet sterk is. Daarom werden de steekproeven verdeeld in vier categorieën; de mediane gewichten van de monsters waren 2,1 g voor kleine monsters, 5,0 g voor middelgrote monsters, 11,2 g voor grote monsters en 22,0 g voor extra grote monsters (figuur 1B). Er waren echter nog steeds monsters die veel meer cellen opleverden dan verwacht op basis van hun gewicht (figuur 1C), het merendeel van de monsters clusterde mooi. Voor kleine monsters was de mediane celopbrengst 8,0 x 106 cellen, voor middelgrote monsters 13,0 x 106, voor grote monsters 35,4 x 106 en extra grote monsters 93,0 x 106.
Elk antilichaam dat in dit protocol werd gebruikt, werd getitreerd. Als werkconcentratie werd gekozen voor een concentratie op de plateaufase (figuur 2A) met de hoogste kleuringsindex (figuur 2B) van de titratiecurve. Variaties in celaantallen zullen de kleurintensiteit niet dramatisch veranderen. Deze antilichaamtitratie en -testen zijn essentieel en moeten met zorg worden opgezet voor elk nieuw antilichaam of kleurstof dat in dit protocol wordt gebruikt34,35. Wanneer een antilichaam met zorg wordt getitreerd, moet het 10 tot 50 keer meer cellen kleuren dan het aantal cellen waarop het antilichaam werd getitreerd34,35. Een voorbeeld van dit principe is te vinden in tabel 4. Het anti-humane CD45-PE-antilichaam werd getitreerd op 1 x 106 cellen in een totaal volume van 400 μL. Als dit antilichaam tegen kleuringsvolume wordt geëxtrapoleerd naar het protocol (zie tabel 2, die de CD45-PE-hoeveelheid en kleuringsvolumes voor elke monstergrootte toont), worden voor een klein monster 0,625 x 106 cellen gekleurd, 1,25 x 106 cellen worden gekleurd voor een middelgroot monster en 2,5 x 106 cellen voor een groot monster (kolom A in tabel 4). Een 50-voudige overmaat in celnummer voor elke categorie wordt berekend op respectievelijk 31,25 x 106, 62,5 x 106 en 125 x 106 cellen (kolom B). Zoals weergegeven in de kolommen C en D, liggen het mediane celnummer van elke groottecategorie en de grootste steekproef in elke categorie ruim binnen het 50-voudige bereik.
Ondanks de schijnbare verschillen in grootte en celopbrengst tussen de verschillende groottes van de sputummonsters, is het mediane percentage SEC-besmetting in elke categorie zeer vergelijkbaar. Figuur 3A toont het percentage SECs gevonden in individuele monsters, gestratificeerd volgens hun sputumgewichtscategorie. De grootste zorg was met SECs omdat deze cellen niet representatief zijn voor longweefsel maar voor de mondholte. De gemiddelde SEC-besmetting is echter minder dan 20% voor alle categorieën. Figuur 3B toont het percentage levensvatbare cellen dat in deze monsters wordt aangetroffen. Exclusief de SECs bedroeg de gemiddelde levensvatbaarheid ongeveer 72% voor de categorieën kleine, middelgrote en grote steekproefomvang. Het was iets hoger (79%) voor de extra grote categorie.
Figuur 4 toont een typische gating-strategie om de sputumcellen van belang te scheiden van puin, dode cellen (waaronder ook de verontreinigende SECs36) en celklonten. Figuur 4A toont het gebruik van NIST-kralen om poorten in te stellen om vuil kleiner dan 5 μm of groter dan 30 μm te verwijderen, terwijl figuur 4B deze poort toepast op sputumcellen. Figuur 4C toont een typisch sputumprofiel wanneer het wordt gezien als zijspreidingsbreedte (SSC-W) tegen voorwaartse spreidingsbreedte (FSC-W), de breedtepoort. Dit profiel wordt gebruikt om klein vuil te verwijderen dat zich langs de SSC-W- en FSC-W-assen presenteert. De eliminatie van dode cellen is weergegeven in figuur 4D en figuur 4E. De onbevlekte controle (figuur 4D) wordt gebruikt om de cut-off voor FVS510 positiviteit te bepalen; cellen die positief kleuren voor FVS510 boven de negatieve controle worden als dood beschouwd en zullen niet worden gebruikt in de sputumcelanalyse (figuur 4E). Ten slotte wordt een singletpoort toegepast om celdubbelels uit de analyse te verwijderen, die wordt weergegeven in figuur 4F. De cellen die de selectiepoorten in figuur 4B, figuur 4C, figuur 4E en figuur 4F hebben doorstaan, vertegenwoordigen dus levende, enkele sputumcellen die klaar zijn voor latere analyse met de antilichamen die in dit protocol worden gebruikt.
Het gebruik van het anti-CD45-antilichaam in dit etiketteringsprotocol maakt de scheiding van levende, enkele sputumcellen in een bloed (CD45+) celcompartiment en een niet-bloed (CD45-) celcompartiment mogelijk. De laatste categorie omvat epitheelcellen en andere niet-bloedcellen. Het bovenste profiel in figuur 5A toont het gebruik van een onbevlekt sputummonster om de cut-off voor CD45-positiviteit in te stellen, waardoor de poorten cd45+ cellen en CD45-cellen vastleggen. Het onderste profiel van figuur 5A toont beide poorten toegepast op een sputummonster gekleurd met het anti-CD45-antilichaam. Kleuring met extra antilichamen wordt vervolgens gebruikt om bloedcelspecifieke populaties binnen de CD45+ poort (figuur 5B) en andere niet-bloedcelpopulaties te identificeren, inclusief epitheliale populaties in de CD45-gate (figuur 5C). In beide figuren laten de bovenste profielen zien hoe isotype-gekleurd sputum wordt gebruikt om de dubbele negatieve populaties in te stellen, terwijl de onderste profielen de met antilichamen bevlekte sputumcellen tonen. Figuur 5B (onder) toont zes verschillende CD45+ celpopulaties gemaakt met de cocktail van antilichamen detecteerbaar in het fluorescentie (FL) 1 kanaal (anti-CD66b, CD3, CD19 antilichamen) en de anti-CD206 detecteerbaar in het FL3 kanaal. Sorteerexperimenten hebben aangetoond dat longspecifieke macrofagen zich bevinden in de poorten die met M zijn geïdentificeerd. De aanwezigheid van cellen in deze poorten wijst er dus op dat het sputummonster was afgeleid van de long en geen speeksel was (Bederka et al., manuscript in voorbereiding). Figuur 5C (onder) toont de gating kwadranten gemaakt met het anti-pan-cytokeratine (panCK) detecteerbaar in het FL1 kanaal en anti-epitheelcel adhesie molecuul (EpCAM) antilichamen detecteerbaar in het FL3 kanaal onder de CD45- sputum cellen.
Dit etiketteringsprotocol is uitgebreid getest op de Navios EX en de LSR II. Enkele voorbereidende experimenten werden uitgevoerd op de Lyric, maar zonder de uitgebreide instrumentoptimalisatie die voor de andere twee machines werd gedaan. Daarom worden gedetailleerde instrumentinstellingen verstrekt voor de Navios EX en de LSR II in het materialenblad, maar niet voor de Lyric. Om de overeenkomsten en variaties tussen deze drie flowcytometrische platforms te begrijpen die kunnen worden gebruikt om sputumcellen te analyseren, kunnen profielen verkregen uit de verschillende machines worden vergeleken in figuur 6 en figuur 7. Twee grote sputummonsters werden verwerkt, samengevoegd, gelabeld, gescheiden in drie gelijke porties en vervolgens verkregen op elke hierboven genoemde flowcytometer. Figuur 6, die vergelijkbaar is met figuur 4, vergelijkt de gating-strategie voor het elimineren van puin, dode cellen en celklonten. Figuur 7, die identiek is aan figuur 5, vergelijkt de bloed- en niet-bloedprofielen van de gegevens die zijn verkregen op de verschillende flowcytometers.
Uit een vergelijking van de verschillende profielen verkregen uit de drie verschillende flowcytometers blijkt dat bij elk instrument dezelfde basisprofielen kunnen worden waargenomen. De verschillen waar je op moet letten zijn de SSC-W/FSC-W (width gate) percelen (figuur 6, tweede rij) en de lineaire schalen van de strooipercelen (figuren 6 en 7). De spreidingsbreedteplot gegenereerd op de Navios EX toont een inclusiepoort (rode doos), wat betekent dat alle cellen in de poort verder worden geanalyseerd; de gebeurtenissen langs de assen in de linkerbenedenhoek zijn uitgesloten. De spreidingsbreedteplots op de LSR II en Lyric tonen geen vergelijkbare afzetting van gebeurtenissen langs dezelfde assen. Deze discrepantie is waarschijnlijk te wijten aan de zeer gevoelige drempel die op de Navios EX wordt gebruikt, wat leidt tot wat klein puin in de vorige poort voor het uitsluiten van grootte (bovenste rij van figuur 6). Af en toe wordt puin gezien langs de assen in het strooibreedteprofiel dat op de LSRII wordt gegenereerd, maar het bevindt zich in de rechterbenedenhoek. In die gevallen wordt een uitsluitingspoort (zoals aangegeven door het rode vak in het middelste profiel in rij 2 van figuur 6) gebruikt om deze gebeurtenissen uit verdere analyse te verwijderen.
Hoewel de logschalen enigszins verschillen op de plots tussen de Navios EX en de Lyric en LSR II cytometers, heeft de Navios EX wel de mogelijkheid om gegevens te verzamelen met behulp van meer decennia. Het implementeren van meer decennia hangt af van de context van het experiment en de gewenste gevoeligheid om de populaties van belang te visualiseren.
Een bijkomend opmerkelijk verschil tussen de Navios EX en LSR II en Lyric cytometers is het uiterlijk van het profiel van de singlet gate. De Navios EX cytometer is uitgerust met een rechthoekige flowcel met een andere opvanghoek dan de LSR II. De Navios EX bevat drie softwaregestuurde opvanghoeken om de voorwaartse lichtverstrooiing te optimaliseren om de gevoeligheid te bereiken die geschikt is voor het analyseren van de deeltjesgrootte. De polygoonpoort voor de Navios EX-cytometer moet worden aangepast aan een iets lagere hoek dan de singletpoort voor de LSRII. De singletpoort voor de Lyric kan worden geoptimaliseerd om een profiel te krijgen dat vergelijkbaar is met dat van de LSR II. Met behulp van het sputummonster zou de gebiedsschaalfactor voor elke laser op de Lyric moeten worden geoptimaliseerd om een singletpoort te bereiken die vergelijkbaar is met de LSR II.
Alle profielen in figuur 4 tot en met figuur 7 werden geanalyseerd met FlowJo-software, versie 10.6. De .fcs-bestanden zijn te vinden in de FlowRepository (https://flowrepository.org), onder ID's FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ en FR-FCM-Z3MM en kunnen worden gebruikt om de sputumanalyse te oefenen zoals geïllustreerd in deze cijfers.
Figuur 1: Sputumgewichten en celopbrengst. (A) Afgebeeld is de relatie tussen sputumgewicht, bepaald vóór verwerking, en totale celopbrengst, bepaald na verwerking met behulp van een hemocytometer. Elke opsommingsteken vertegenwoordigt een individueel monster, 126 in totaal. B) Sputummonsters werden op basis van hun gewicht in vier categorieën ingedeeld: klein voor monsters met een gewicht tot 3 g, medium voor monsters met een gewicht van meer dan 3 g tot 8 g, groot voor monsters met een gewicht van meer dan 8 g tot 16 g en extra grote monsters voor monsters met een gewicht van meer dan 16 g. (C) De verdeling van de celopbrengst voor de monsters in elke categorie is weergegeven. De rode balken in (B) en (C) vertegenwoordigen de mediane waarden in elke categorie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Antilichaamtitratie voor anti-humaan CD45-PE. (A) De CD45-PE (IgG1) titratiecurve met de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van de positieve populatie uitgezet versus de concentratie van de CD45-PE antilichaamplateaus bij 1 μg/ml. (B) De titratiecurve die de kleuringsindex versus de antilichaamconcentratie weergeeft, laat zien dat de hoogste kleuringsindex 1 μg/ml is. Kleuringsindex werd berekend als: [CD45 MFI-positieve populatie - CD45 MFI-negatieve populatie] / [2 * Standaarddeviatie]. Op basis van figuur 2A en figuur 2B werd 1 μg/ml gekozen als optimale concentratie voor het CD45-PE-antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Aandeel VAN SECs en dode cellen in sputummonsters is consistent in de vier gewichtscategorieën. (A) Het aandeel SECs in sputummonsters wordt ingedeeld naar gewichtscategorie. Het percentage SEC-besmetting werd bepaald door de hemocytometer als onderdeel van het totale celgetal. (B) Cel levensvatbaarheid van sputummonsters met uitzondering van SECS, bepaald door hemocytometer en de trypan blue exclusion methode. Voor elke grafiek vertegenwoordigen de rode lijnen de mediaanwaarden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gating-strategie voor het uitsluiten van puin, dode cellen en doubletten in een sputummonster. (A) NIST-kralen van de afmetingen 5 μm, 20 μm en 30 μm werden gebruikt om de door de rode doos aangegeven poort in te stellen om puin kleiner dan 5 μm en groter puin boven 30 μm en dicht bij de as uit te sluiten. (B) Er werd een sputummonster verkregen met dezelfde spanningen voor de voorwaartse en zijverstrooiing als die van de NIST-kralen. De poort gemaakt in (A) werd toegepast om puin uit te sluiten. (C) Klein puin dicht bij de as was uitgesloten in deze strooibreedte plot. (D) Een onbevlekt sputummonster werd gebruikt om de afsnijding (rode lijn) voor de negatieve, niet-gekleurde populatie voor de levensvatbaarheidskleurstof in te stellen. (E) De in D gecreëerde afsnijding werd toegepast op het gekleurde sputummonster om een poort (rode doos) te vormen die levende, levensvatbare cellen omvat. (F) De singletpoort die door de rode veelhoek wordt aangegeven, sluit cellen uit die niet op de diagonaal vallen, waardoor doubletten en/of klonten worden geëlimineerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Gating-strategie van sputumcellen in bloed- en niet-bloedcelcompartimenten. (A) Niet-gekleurde sputumcellen afgeleid van de singletpoort worden gebruikt om de cut-off (rode lijn) op de negatieve populatie voor CD45 (boven) in te stellen. De afsnijding van het bovenste profiel wordt toegepast op het gekleurde sputummonster (onder) om CD45-positieve (CD45+) en negatieve populaties (CD45-) te onderscheiden. (B) CD45+ sputumcellen gekleurd met isotype antilichamen voor FITC/AF488 worden gebruikt om de poorten op de negatieve populatie te zetten (boven). Dezelfde poorten worden toegepast op de CD45+ sputumcellen gekleurd met bloedcelmarkers CD3, CD19, CD66b en CD206 (onder). (C) Kwadrantpoorten worden geplaatst op de CD45-sputumcellen gekleurd met isotypecontroles (boven) en toegepast op de CD45-cellen uit het sputummonster gekleurd met de epitheliale markers pan-cytokeratine (panCK) en EpCAM (onder). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Gating-strategie om puin, klonten en dode cellen van gekleurde sputumcellen op drie flowcytometrische platforms uit te sluiten. Twee grote sputummonsters werden verwerkt, samengevoegd, gelabeld en verdeeld in drie gelijke porties voor acquisitie op de Navios EX (A), LSR II (B) en de Lyric (C) flowcytometers. Bovenste rij: Sputummonsters werden omheind (rode doos) om zeer klein en groot puin uit te sluiten. Tweede rij: Het grote rode vak in het Navios EX-plot vertegenwoordigt een inclusiepoort die de cellen bevat, maar puin uitsluit. Het kleine rode vak in het LSR II-plot vertegenwoordigt een uitsluitingspoort om puin uit verdere analyse te verwijderen. Verdere optimalisatie met de Lyric is nodig om te bepalen waar puinuitsluiting nodig is. Daarom is er geen poort aanwezig in dat perceel. Derde rij: rode rechthoekige poorten bevatten levende cellen voor verdere analyse. Onderste rij: polygoonpoort heeft enkele cellen door doubletten uit te sluiten die buiten de diagonaal van de poort vallen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Gating-strategie voor sputum gekleurd voor bloed en epitheliale markers op drie flowcytometrische platforms. De analyse in figuur 6 wordt voortgezet in figuur 7; alle levensvatbare, enkele cellen (onderste rij, figuur 6) werden verdeeld in CD45+ en CD45-populaties (eerste rij, figuur 7), zodat bloedcelspecifieke markers en epitheelcelspecifieke markers deze populaties verder konden afbakenen. Tweede rij: profiel van bloedcelmarkers CD3/CD19/CD66b en CD206 van CD45+ cellen. Derde rij: epitheelcelmarkers panCK en EpCAM uit CD45-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Antilichaam/kleuring | Doel |
| FVS510 | Levensvatbaarheidsvlek |
| Anti-menselijke CD45 – PE | Pan-leukocytenmarker; PE-compensatie |
| Anti-menselijke CD66b – FITC | Granulocytenmarker |
| Anti-menselijke CD3 - Alexa488 | T-cel marker |
| Anti-menselijke CD19 - Alexa488 | B-cel marker; FITC /Alexa488 compensatie |
| Anti-menselijke CD206 – PE-CF594 | Long macrofaag marker; PE-CF594 compensatie |
| Anti-menselijke EpCAM – PE-CF594 | Epitheelcelmarker; PE-CF594 compensatie |
| Anti-humaan pan-cytokeratine (panCK) - Alexa488 | Epitheelcelmarker |
| IgG1κ - Alexa488 | CD3/CD19/panCK isotype controle |
| IgG1κ – FITC | CD66b isotype controle |
| IgG1κ – PE-CF594 | CD206/EpCAM isotype controle |
| Anti-menselijke CD45 – BV510 | FVS510 compensatie |
Tabel 1: Gebruikte antilichamen en levensvatbaarheidsvlekken. Lijst van antilichamen en levensvatbaarheidskleurstof die in dit protocol worden gebruikt. Aangegeven zijn de cellulaire subsets die ze elk identificeren.
| Buis (Label) | Steekproefgrootte* | HBSS (μL) | FVS510 (μL) | CD45 (μL) | Andere antilichamen (μL) | Cellen § (μL) | |||
| Onbevlekt | klein | 80 | 20 | ||||||
| Gemiddeld | 50 | 50 | |||||||
| groot | 50 | 50 | |||||||
| IgG1κ - Alexa488 | IgG1κ- FITC | IgG1κ - PE-CF594 | |||||||
| Isotype controle | klein | 60.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 20 | |
| Gemiddeld | 30.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| groot | 30.25 | 1 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| cd206 | cd3 | cd19 | cd66b | ||||||
| Bloed | klein | 92.875 | 1.5 | 25 | 1.875 | 5 | 1.25 | 7.5 | 115 |
| Gemiddeld | 65.75 | 3 | 50 | 3.75 | 10 | 2.5 | 15 | 350 | |
| groot | 102.5 | 10 | 100 | 7.5 | 20 | 5 | 30 | 725 | |
| Epcam | Panck | ||||||||
| Epithelial | klein | 96.5 | 1.5 | 25 | 10 | 2 | 115 | ||
| Gemiddeld | 73 | 3 | 50 | 20 | 4 | 350 | |||
| groot | 117 | 10 | 100 | 40 | 8 | 725 | |||
| * Monsters worden beschouwd als klein, middelgroot of groot op basis van het gewicht bepaald in stap 1 van de sputumdissociatiesectie van het protocol. | |||||||||
| § Cellen moeten worden toegevoegd nadat alle reagentia zijn gedistribueerd, inclusief die in de compensatiebuizen (tabel 3). | |||||||||
Tabel 2: Inhoud van buizen met sputumcellen. Gebruik deze tabel zoals vermeld in het protocol om de opgegeven volumes antilichamen en levensvatbaarheidskleuring toe te voegen voor de juiste steekproefgrootte.
| Buis (Label) | Toegevoegde reagentia (μL) | Reagentia toegevoegd (druppel) | ||||||
| HBSS | cd45-pe | CD206-PE-CF594 | Epcam-PE-CF594 | cd19-alexa488 | Cd45-BV510 | CompBead (+) | CompBead * (-) | |
| PE comp. | 76 | 4 | x | x | x | x | 1 | 1 |
| PE-CF594 comp. | 72 | x | 4 | 4 | x | x | 1 | 1 |
| Alexa488 / FITC comp. | 60 | x | x | x | 20 | x | 1 | 1 |
| BV510 comp. | 60 | x | x | x | x | 20 | 1 | 1 |
| * De positieve (+) en negatieve (-) kralen moeten worden toegevoegd nadat alle reagentia zijn verdeeld en de buizen in tabel 2 zijn voorbereid. | ||||||||
| comp. = compensatie | ||||||||
Tabel 3: Inhoud van compensatiebuizen. Gebruik deze tabel zoals vermeld in het protocol om de opgegeven hoeveelheden antilichamen aan de compensatiekralen toe te voegen.
| Celnummer (x 106) | ||||
| Een | B | C | D | |
| Steekproefgrootte | In kleuringsvolume * | 50-voudige toegang ¶ | Mediaanmonster (toegang tot vouwen) # | Grootste steekproef (vouwtoegang) # |
| Klein | 0.625 | 31.25 | 8.0 (12.8) | 24.77 (39.6) |
| Gemiddeld | 1.25 | 62.5 | 13.0 (10.4) | 48.87 (39.1) |
| Groot | 2.5 | 125 | 35.4 (14.2) | 113.5 (45.4) |
| * Kleuringsvolumes die in het protocol worden gebruikt (tabel 2). Het celgetal wordt geëxtrapoleerd uit de manier waarop de titratiecurve werd uitgevoerd; 1 μg/ml CD45-PE en 1 x 106 cellen per 200 μL. | ||||
| ¶ 50-voudige toegang tot celnummers in kolom A. | ||||
| # vouwtoegang in kolommen C en D worden berekend door het aantal in de cellen van kolom C of D gepresenteerd te delen door het nummer in de overeenkomstige cel in kolom A. | ||||
Tabel 4: Anti-humane CD45-PE-concentratie voor alle monsters in elke steekproefgroottecategorie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De cellulaire inhoud van sputum omvat een grote verscheidenheid aan brede cellen, vaak vergezeld van veel puin37. Bovendien vereist sputumanalyse een kwaliteitscontrole die bevestigt dat het monster wordt verzameld uit de long in plaats van de mondholte38. Daarom is het niet zo eenvoudig om sputum te analyseren door flowcytometrie als voor bijvoorbeeld bloed, dat een veel schonere en homogene celsuspensie vrijgeeft. Dit protocol heeft al deze problemen aangepakt: het bieden van instrumentinstellingen met behulp van kralen van specifieke grootte om ervoor te zorgen dat zowel de kleinste als de grootste celpopulaties kunnen worden gedetecteerd, een gating-strategie om puin, celklonten, contaminerende SECs en andere dode cellen te elimineren, en ten slotte een kwaliteitscontrolemaatregel om ervoor te zorgen dat een sputummonster uit de long komt in plaats van voornamelijk speeksel.
Er zijn kritieke stappen in het protocol in het werken met sputum die het vermelden waard zijn. Ten eerste kan de celopbrengst drastisch worden beïnvloed door het aantal nyloncelzeefjes dat wordt gebruikt in stap 2.5 van het sputumdissociatiegedeelte van het protocol. Meerdere zeven kunnen nodig zijn om te voorkomen dat te veel cellen verloren gaan als gevolg van verstopping van de zeef. Wanneer de stroom door de zeven merkbaar is vertraagd, moet een nieuwe zeef worden gebruikt. Ten tweede kan de celkorrel van sputummonsters erg los zitten, vooral als er een hoge verontreiniging van SECs is. Daarom is het essentieel om niet te dicht bij de pellet te aspirateren bij het verwijderen van het supernatant na het centrifugeren van de monsters. Te dicht bij de pellet aanzuigen kan leiden tot celverlies, zo niet verlies van de gehele pellet. Ten derde vereist dit protocol een fixatiestap. Dit behoudt de cellen en hun kleurprofiel en dient als een veiligheidsmaatregel om de operator van de flowcytometer te beschermen. Het uitvoeren van monsters op bepaalde flowcytometers kan verhoogde biologische gevaren opleveren als gevolg van het potentieel voor aerosolproductie39. De PFA-fixatie helpt de operator te beschermen tegen potentiële pathogenen in het sputummonster. Ten vierde, en misschien wel het meest uitdagende aspect van het voorbereiden van sputummonsters voor flowcytometrische analyse, is het tellen van cellen. Het tellen van cellen is gecompliceerd vanwege de grote verscheidenheid aan celtypen die in het sputum aanwezig zijn. Telmachines worden vaak beperkt door het celgroottebereik dat ze kunnen vastleggen en zijn daarom minder betrouwbaar dan een hemocytometer. Het tellen van cellen van sputummonsters door hemocytometer, die uitstekend wordt beschreven door Guiot et al.20, is echter vervelend en vereist oefening om bekwaam te worden. Een nauwkeurig celgetal is van vitaal belang bij het bepalen van het uiteindelijke resuspensievolume van het monster om een redelijke stroomsnelheid mogelijk te maken en verstoppingen in de flowcytometer te voorkomen. De aanwezigheid van de zeer grote SECs in het sputum en de vele kleinere celklonten die niet worden afgebroken door de dissociatiebuffer, noch worden opgevangen door de filters, verhogen de kans op verstopping van de flowcytometer. Daarom wordt aanbevolen om enige tijd te besteden aan het bepalen van de beste celconcentratie / stroomsnelheid voor gegevensverzameling met behulp van de beschikbare flowcytometer. Zorg er bovendien voor dat de flowcytometer de juiste stroomcel- en nozzlegrootte (of sonde) heeft die in staat is om de grotere celpopulaties in het sputum te meten.
Zelfs wanneer vaardigheid in het tellen van cellen is bereikt, is het nog steeds een tijdrovend proces. Daarom is de bepaling van de reagentia voor celetikettering in dit protocol gebaseerd op de steekproefgrootte (zoals beoordeeld op gewicht) in plaats van het celnummer. Dit zorgt voor een efficiënter gebruik van de tijd, omdat het handmatige celgetal kan worden voltooid gedurende de tijd die nodig is voor de kleuring van het antilichaam en de levensvatbaarheid. Er zijn echter drie opmerkelijke uitzonderingen hierop. Als een monster >16 g is (de zogenaamde extra grote monsters), moet het handmatige celgetal vóór het kleuren plaatsvinden, zodat dure reagentia kunnen worden bewaard door slechts 25 x 106 cellen elk voor het bloed en de epitheelbuizen te kleuren. Dit celnummer geeft zeer betrouwbare profielen in de instellingen die in dit protocol worden beschreven. Een andere mogelijke uitzondering is het geval van een zeer kleine steekproef. De schatting is dat er minimaal 1-2 x 106 cellen nodig zijn voor de flowcytometrie-analyse zoals gepresenteerd in dit protocol om betrouwbare profielen te genereren (gegevens niet weergegeven). Daarom, als een monster minder dan 1-2 x 106 cellen bevat, is het misschien niet de moeite waard om door te gaan met de procedure, omdat het eindresultaat waarschijnlijk onaanvaardbaar zal zijn.
Specifieke etiketteringsreagentia die goed werken op perifere bloedcellen of cellijnen kunnen heel anders werken op bloedcellen in sputum (ongepubliceerde waarnemingen). Daarom wordt aanbevolen om elk antilichaam of andere etiketteringsreagentia te titreren volgens gevestigde protocollen34,35 voordat ze worden gebruikt in flowcytometrie-experimenten. De meeste antilichaamtitraties zouden vergelijkbare resultaten moeten geven bij kleuring tot 10 tot 50-voudig; het wordt echter geadviseerd om extra titraties uit te voeren met celnummers hoger dan dat bereik34. Wanneer een reagensconcentratie is bepaald, is het essentieel om de incubatietijd van dat reagens gelijk te houden aan die in het eigenlijke experiment. Om die reden benadrukt het protocol het toevoegen van alle buffer en reagentia aan de buizen voordat de cellen of compensatieparels worden toegevoegd. Deze volgorde van het toevoegen van reagentia en cellen / kralen samen zorgt voor een hogere consistentie in etiketteringstijden. Als om de een of andere reden de experimentele incubatietijd niet vergelijkbaar kan worden gehouden met die voor antilichaam/kleurstoftitratie, moet deze laatste worden herhaald met een incubatietijd die haalbaar is tijdens experimenten.
Sputummonsters zijn op grote schaal gebruikt als een diagnostisch monster om de pathofysiologie van verschillende ziekten die de longen aantasten te bestuderen. Tuberculose40,41, COPD13,42, astma43, cystische fibrose44,45, longkanker46,47,48 en reumatoïde artritis49 behoren tot de vele ziekten waarbij sputum is bestudeerd vanwege het voordeel dat het een niet-invasief verkregen specimen is. Meer recent, tijdens de coronaviruspandemie, is sputum gebruikt om langdurige virale uitscheiding te detecteren bij patiënten die in het ziekenhuis zijn opgenomen met coronavirusziekte 2019 (COVID-19)50.
Verschillende technologieën, waaronder reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), eiwitanalyse, microscopie en flowcytometrie, zijn gebruikt om ziektespecifieke markers in sputum te identificeren. Het gebruik van een flowcytometrisch platform om sputummonsters te analyseren wordt niet veel gebruikt, maar het gebruik ervan neemt toe. Met recente ontwikkelingen in de technologie van flowcytometers3,51,52, evenals vooruitgang in de chemie van fluoroforen, het genereren van nieuwe antilichaamklonen en de ontwikkeling van verschillende kleurstoffen om dode celpopulaties te identificeren51,53,54, is de mogelijkheid om antilichaampanelen te ontwerpen gericht op het diagnosticeren van menselijke ziekten dramatisch toegenomen. Bovendien zal de recente push voor het automatiseren van de analyse van flowcytometrische gegevens55,56 de potentiële vertekening bij het handmatig lezen en interpreteren van stroomgegevens elimineren. Deze nieuwe ontwikkelingen in flowcytometrie zullen de exploratie van sputum als klinische diagnose aanzienlijk vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs zijn voormalige of huidige medewerkers van bioAffinity Technologies.
Acknowledgments
We willen David Rodriguez bedanken voor zijn hulp bij de figuurvoorbereiding. Sputummonsters werden uitgevoerd op de BD LSR II in de UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, ondersteund door UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC bij UT Health) en UL1 TR001120 (CTSA-subsidie).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Paraformaldehyde Flow-Fix | Polysciences | 25037 | |
| 100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
| 50 mL conical falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Alexa488 anti-human CD19 | BioLegend | 302219 | |
| Alexa488 anti-human CD3 | BioLegend | 300415 | |
| Alexa488 anti-human cytokeratin | BioLegend | 628608 | |
| Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype | BioLegend | 400129 | |
| BV510 anti-human CD45 | BioLegend | 304036 | |
| CD66b FITC isotype | BD Biosciences | 555748 | |
| CompBead Plus Compensation Beads | BD Biosciences | 560497 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
| CS&T beads | BD Biosciences | 655051 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| FITC anti-human CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 564406 | |
| FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
| FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| NAC | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NIST Beads, 05 μM | Polysciences | 64080 | |
| NIST Beads, 20 μM | Polysciences | 64160 | |
| NIST Beads, 30 μM | Polysciences | 64170 | |
| PE anti-human CD45 | BioLegend | 304039 | |
| PE-CF594 anti-human EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
| PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype | BD Biosciences | 562292 | |
| PE-CR594 anti-human CD206 | BD Biosciences | 564063 | |
| Sodium citrate dihydrate | EMD | SX0445-1 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 |
References
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews. Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), San Diego, Calif. 251-258 (2012).
- Robinson, J. P., Roederer, M. History of science. Flow cytometry strikes gold. Science. 350 (6262), New York, N.Y. 739-740 (2015).
- Orfao, A., et al. Immunophenotypic dissection of normal hematopoiesis. Journal of Immunological Methods. 475, 112684 (2019).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Bento, L. C., et al. The use of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: A review. Frontiers in Oncology. 7, 270 (2017).
- Della Porta, M. G., Picone, C. Diagnostic utility of flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases. 9 (1), 2017017 (2017).
- Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2), Pt 1 475-478 (2000).
- Spanevello, A., et al. Induced sputum cellularity. Reference values and distribution in normal volunteers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 162 (3), Pt 1 1172-1174 (2000).
- Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
- Hastie, A. T., et al. Mixed sputum granulocyte longitudinal impact on lung function in the severe asthma research program. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (7), 882-892 (2021).
- Hastie, A. T., et al. Association of sputum and blood eosinophil concentrations with clinical measures of COPD severity: an analysis of the SPIROMICS cohort. The Lancet. Respiratory Medicine. 5 (12), 956-967 (2017).
- Kim, J., et al. Innate immune crosstalk in asthmatic airways: Innate lymphoid cells coordinate polarization of lung macrophages. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (5), 1769-1782 (2019).
- Bai, Y., Zhou, Q., Fang, Q., Song, L., Chen, K. Inflammatory cytokines and T-Lymphocyte subsets in serum and sputum in patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 25, 2206-2210 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-Carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Hristara-Papadopoulou, A., Tsanakas, J., Diomou, G., Papadopoulou, O. Current devices of respiratory physiotherapy. Hippokratia. 12 (4), 211-220 (2008).
- Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and biochemical analysis of induced sputum from asthmatic and from healthy subjects. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
- Alexis, N., Soukup, J., Ghio, A., Becker, S. Sputum phagocytes from healthy individuals are functional and activated: a flow cytometric comparison with cells in bronchoalveolar lavage and peripheral blood. Clinical Immunology. 97 (1), 21-32 (2000).
- Guiot, J., et al. Methodology for sputum induction and laboratory processing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56612 (2017).
- Paggiaro, P. L., et al. Sputum induction. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 3-8 (2002).
- Anjuman, N., Li, N., Guarnera, M., Stass, S. A., Jiang, F. Evaluation of lung flute in sputum samples for molecular analysis of lung cancer. Clinical and Translational Medicine. 2, 15 (2013).
- Sethi, S., Yin, J., Anderson, P. K. Lung flute improves symptoms and health status in COPD with chronic bronchitis: A 26 week randomized controlled trial. Clinical and Translational Medicine. 3, 29 (2014).
- Su, J., et al. Analysis of lung flute-collected sputum for lung cancer diagnosis. Biomarker Insights. 10, 55-61 (2015).
- Naraparaju, S., Vaishali, K., Venkatesan, P., Acharya, V. A comparison of the Acapella and a threshold inspiratory muscle trainer for sputum clearance in bronchiectasis-A pilot study. Physiotherapy Theory and Practice. 26 (6), 353-357 (2010).
- Hinson, K. F., Kuper, S. W. The diagnosis of lung cancer by examination of sputum. Thorax. 18, 350-353 (1963).
- Johnston, W. W., Bossen, E. H. Ten years of respiratory cytopathology at Duke University Medical Center. I. The cytopathologic diagnosis of lung cancer during the years 1970 to 1974, noting the significance of specimen number and type. Acta Cytologica. 25 (2), 103-107 (1981).
- Ng, A. B., Horak, G. C. Factors significant in the diagnostic accuracy of lung cytology in bronchial washing and sputum samples. II. Sputum samples. Acta Cytologica. 27 (4), 397-402 (1983).
- Smiths Medical Videos. , Available from: https://videos.smiths-medical.com/search?q=acapella&page=1 (2021).
- Pizzichini, E., et al. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154 (2), 308-317 (1996).
- Miller, H. R., Phipps, P. H., Rossier, E. Reduction of nonspecific fluorescence in respiratory specimens by pretreatment with N-acetylcysteine. Journal of Clinical Microbiology. 24 (3), 470-471 (1986).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 4, Unit 4.1 (2001).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Kini, S. R. Color Atlas of Pulmonary Cytopathology. , Springer-Verlag New York, Inc. (2002).
- Papanicolaou Society of Cytopathology Task Force on Standards of Practice. Guidelines of the Papanicolaou Society of Cytopathology for the examination of cytologic specimens obtained from the respiratory tract. Diagnostic Cytopathology. 21 (1), 61-69 (1999).
- Holmes, K. L., et al. International Society for the Advancement of Cytometry cell sorter biosafety standards. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 85 (5), 434-453 (2014).
- Datta, S., Shah, L., Gilman, R. H., Evans, C. A. Comparison of sputum collection methods for tuberculosis diagnosis: a systematic review and pairwise and network meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (8), 760-771 (2017).
- Armstrong-Hough, M., et al. "Something so hard": a mixed-methods study of home sputum collection for tuberculosis contact investigation in Uganda. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease: The Official Journal of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. 22 (10), 1152-1159 (2018).
- Freeman, C. M., et al. Design of a multi-center immunophenotyping analysis of peripheral blood, sputum and bronchoalveolar lavage fluid in the Subpopulations and Intermediate Outcome Measures in COPD Study (SPIROMICS). Journal of Translational Medicine. 13, 19 (2015).
- Petsky, H. L., Li, A., Chang, A. B. Tailored interventions based on sputum eosinophils versus clinical symptoms for asthma in children and adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 8, 005603 (2017).
- Hisert, K. B., Liles, W. C., Manicone, A. M. A flow cytometric method for isolating cystic fibrosis airway macrophages from expectorated sputum. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (1), 42-50 (2019).
- Duncan, G. A., et al. Microstructural alterations of sputum in cystic fibrosis lung disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (18), 88198 (2016).
- Kemp, R. A., Reinders, D. M., Turic, B. Detection of lung cancer by automated sputum cytometry. Journal of Thoracic Oncology: Official Publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2 (11), 993-1000 (2007).
- Blandin Knight, S., et al. Progress and prospects of early detection in lung cancer. Open Biology. 7 (9), (2017).
- Gomperts, B. N., Spira, A., Elashoff, D. E., Dubinett, S. M. Lung cancer biomarkers: FISHing in the sputum for risk assessment and early detection. Cancer Prevention Research. 3 (4), Philadelphia, Pa. 420-423 (2010).
- Demoruelle, M. K., et al. Antibody responses to citrullinated and noncitrullinated antigens in the sputum of subjects with rheumatoid arthritis and subjects at risk for development of rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (4), Hoboken, N.J. 516-527 (2018).
- Wang, K., et al. Differences of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 shedding duration in sputum and nasopharyngeal swab specimens among adult inpatients with coronavirus disease 2019. Chest. 158 (5), 1876-1884 (2020).
- Chattopadhyay, P. K., Hogerkorp, C. -M., Roederer, M. A chromatic explosion: the development and future of multiparameter flow cytometry. Immunology. 125 (4), 441-449 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nature Immunology. 15 (2), 128-135 (2014).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit 9.34 (2010).
- Chattopadhyay, P. K., et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine. 12 (8), 972-977 (2006).
- Duetz, C., Bachas, C., Westers, T. M., Avan de Loosdrecht, A. A. Computational analysis of flow cytometry data in hematological malignancies: future clinical practice. Current Opinion in Oncology. 32 (2), 162-169 (2020).
- Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews. Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).
