Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Dissoziation von Sputum in eine einzelne Zellsuspension und die anschließende Charakterisierung zellulärer Untergruppen auf Standard-Durchflusszytometrieplattformen.
Abstract
Sputum, weit verbreitet, um den zellulären Inhalt und andere mikroumweltliche Merkmale zu untersuchen, um die Gesundheit der Lunge zu verstehen, wird traditionell mit zytologischen Methoden analysiert. Sein Nutzen ist begrenzt, da das Lesen der Folien zeitaufwendig ist und hochspezialisiertes Personal erfordert. Darüber hinaus machen ausgedehnte Trümmer und das Vorhandensein von zu vielen Plattenepithelzellen (SECs) oder Wangenzellen eine Probe oft für die Diagnose ungeeignet. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Durchflusszytometrie eine Hochdurchsatz-Phänotypisierung zellulärer Populationen bei gleichzeitigem Ausschluss von Trümmern und SECs.
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine effiziente Methode, um Sputum in eine einzelne Zellsuspension zu dissoziieren, Antikörper zu färben und zelluläre Populationen zu fixieren und Proben auf einer durchflusszytometrischen Plattform zu entnehmen. Eine Gating-Strategie, die den Ausschluss von Trümmern, toten Zellen (einschließlich SECs) und Zelldouletten beschreibt, wird hier vorgestellt. Darüber hinaus erklärt diese Arbeit auch, wie lebensfähige, einzelne Sputumzellen basierend auf einem Cluster von Differenzierungspopulationen (CD) 45 positiven und negativen Populationen analysiert werden können, um hämatopoetische und epitheliale Abstammungsuntergruppen zu charakterisieren. Eine Qualitätskontrollmaßnahme wird auch durch die Identifizierung lungenspezifischer Makrophagen als Beweis dafür bereitgestellt, dass eine Probe aus der Lunge stammt und kein Speichel ist. Schließlich wurde gezeigt, dass diese Methode auf verschiedene zytometrische Plattformen angewendet werden kann, indem Sputumprofile desselben Patienten bereitgestellt werden, die auf drei Durchflusszytometern analysiert wurden. Navios EX, LSR II und Lyric. Darüber hinaus kann dieses Protokoll modifiziert werden, um zusätzliche zelluläre Marker von Interesse aufzunehmen. Hier wird eine Methode zur Analyse einer gesamten Sputumprobe auf einer durchflusszytometrischen Plattform vorgestellt, die Sputum für die Entwicklung einer Hochdurchsatzdiagnostik von Lungenerkrankungen geeignet macht.
Introduction
Technische Fortschritte in der Hard- und Software von Durchflusszytometern haben es ermöglicht, viele verschiedene Zellpopulationen gleichzeitig zu identifizieren1,2,3,4. Der Einsatz des Durchflusszytometers in der hämatopoetischen Zellforschung hat beispielsweise zu einem viel besseren Verständnis des Immunsystems2 und der zellulären Hierarchie des hämatopoetischen Systems5 sowie zur diagnostischen Unterscheidung einer Vielzahl verschiedener Blutkrebsarten geführt6,7,8. Obwohl die meisten Sputumzellen hämatopoetischen Ursprungs sind9,10,11, wurde die Durchflusszytometrie nicht weit verbreitet für die Sputumanalyse zu diagnostischen Zwecken eingesetzt. Mehrere Studien deuten jedoch darauf hin, dass die Bewertung von Immunzellpopulationen im Sputum (der bedeutendsten Untergruppe von Zellen) eine große Hilfe bei der Diagnose und / oder Überwachung von Krankheiten wie Asthma und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) sein kann 12,13,14,15. Darüber hinaus ermöglicht die Existenz von epithelspezifischen Markern, die in der Durchflusszytometrie verwendet werden können, die Abfrage der folgenden signifikantesten Untergruppe von Zellen im Sputum, Lungenepithelzellen.
Neben der Fähigkeit, viele verschiedene Zellpopulationen unterschiedlicher Gewebeherkunft zu analysieren, kann ein Durchflusszytometer eine große Anzahl von Zellen in relativ kurzer Zeit auswerten. Im Vergleich dazu erfordern folienbasierte, zytologische Analysen oft hochspezialisiertes Personal und/oder Equipment. Diese Analysen können arbeitsintensiv sein, was dazu führt, dass nur ein Teil der Sputumprobe analysiert wird16.
Drei kritische Punkte begrenzen die weit verbreitete Verwendung von Sputum in der Durchflusszytometrie. Die erste Frage bezieht sich auf die Sammlung von Sputum. Sputum wird durch einen Huff-Husten gesammelt, der Schleim aus der Lunge in die Mundhöhle ausstößt und anschließend in einen Sammelbecher spuckt. Da der Schleim durch die Mundhöhle wandert, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit einer SEC-Kontamination. Diese Kontamination erschwert die Probenanalyse, aber das Problem kann leicht auf einer durchflusszytometrischen Plattform behoben werden, wie in dieser Studie gezeigt.
Nicht jeder kann spontan Sputum produzieren; Daher wurden mehrere Geräte entwickelt, um die Sputumsammlung auf nicht-invasive Weise zu unterstützen17. Der Vernebler ist ein solches Gerät und produziert nachweislich zuverlässige Auswurfproben18,19,20. Obwohl der Vernebler eine sehr effektive Möglichkeit ist, Sputum nicht-invasiv zu sammeln, erfordert seine Verwendung immer noch eine Einstellung in einer medizinischen Einrichtung mit spezialisiertem Personal21. Im Gegensatz dazu können Handheld-Geräte wie die Lungenflöte22,23,24 und die acapella16,25 zu Hause verwendet werden, da sie sehr benutzerfreundlich sind. Diese Assistenzgeräte sind sowohl sicher als auch kostengünstig.
Für uns lieferte die Acapella durchweg bessere Ergebnisse als die Lungenflöte16, und daher wurde das Acapella-Gerät für Sputumsammlungen ausgewählt. Eine 3-tägige Entnahmeprobe wurde beschlossen, da der Hauptzweck für die Verwendung von Sputum darin besteht, einen Lungenkrebserkennungstest zu entwickeln16. Es hat sich gezeigt, dass eine 3-Tage-Probe die Wahrscheinlichkeit der Lungenkrebserkennung im Vergleich zu einer 1- oder 2-Tage-Probe erhöht26,27,28. Andere Methoden der Sputumsammlung können jedoch für verschiedene Zwecke vorzuziehen sein. Wenn eine andere Sputumsammelmethode als die hier beschriebene verwendet wird, wird empfohlen, jeden Antikörper oder Farbstoff, der für die durchflusszytometrische Analyse verwendet wird, sorgfältig zu titrieren. Es liegen nur sehr wenige Daten darüber vor, wie sich verschiedene Sputumsammelmethoden auf die Zielproteine für die Durchflusszytometrie auswirken.
Das zweite Thema, das die Begeisterung für die Verwendung von Sputum für die Diagnostik dämpft, vor allem im Zusammenhang mit der Durchflusszytometrie, ist die Zellzahl. Das Problem ist die Sammlung von ausreichend lebensfähigen Zellen für eine zuverlässige Analyse. Zwei Studien zeigten, dass Sputumproben, die mit hilfe eines Hilfsgeräts mit nicht-invasiven Methoden entnommen wurden, genügend lebensfähige Zellen enthalten, die in klinischen Diagnose- oder Forschungsstudien verwendet werden können16,24. Keine dieser Studien befasste sich jedoch mit der Frage der Zellzahlen in Bezug auf die Durchflusszytometrie.
Für die Studien, die die Grundlage für dieses Protokoll bilden, wurden Sputumproben von Teilnehmern mit hohem Risiko für die Entwicklung von Lungenkrebs nach genehmigten institutionellen Richtlinien für jeden Studienstandort gesammelt. Hochrisikoteilnehmer wurden als zwischen 55 und 75 Jahren definiert, nachdem sie 30 Packungsjahre geraucht und in den letzten 15 Jahren nicht mit dem Rauchen aufgehört hatten. Den Patienten wurde gezeigt, wie sie das Acapella-Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers29 verwenden und Sputum an drei aufeinanderfolgenden Tagen zu Hause sammelten. Die Probe wurde bis zur letzten Entnahme im Kühlschrank aufbewahrt. Am letzten Abholtag wurde die Probe über Nacht mit einer gefrorenen Kühlpackung ins Labor geschickt. Die Proben wurden am Tag ihres Eingangs zu einer einzelnen Zellsuspension verarbeitet. Mit dieser Methode der Sputumgewinnung werden mehr als genug lebensfähige Zellen für eine zuverlässige durchflusszytometrische Analyse gewonnen.
Schließlich, und im Zusammenhang mit dem vorherigen Problem der Zellzahl, stellt sich die Frage, wie die Sputumzellen aus ihrer muzinösen Umgebung freigesetzt werden können. Wie können die Zellen lebensfähig gehalten werden und eine einzelne Zellsuspension erzeugen, die das Durchflusszytometer nicht verstopft? Basierend auf ersten Arbeiten von Pizzichini et al.30 und Miller et al.31 beschreibt dieses Protokoll eine einfache und zuverlässige Methode zur Sputumverarbeitung zu einer Einzelzellsuspension, die für die durchflusszytometrische Analyse geeignet ist. Diese Methode hat etablierte Richtlinien in der Durchflusszytometrie32,33,34 verwendet, um eine effiziente Antikörpermarkierungsstrategie zu entwickeln, um hämatopoetische und epitheliale Zellen im Sputum zu identifizieren und Instrumenteneinstellungen, Qualitätskontrollmaßnahmen und Analyserichtlinien bereitzustellen, die die Sputumanalyse auf einer durchflusszytometrischen Plattform standardisieren.
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Protocol
Alle Schritte der Sputumaufbereitung werden in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt.
1. Reagenzienvorbereitung vor Beginn der Sputumdissoziation
- 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml pro Probe auf Eis auftauen und bis zum Gebrauch kalt aufbewahren.
VORSICHT: PFA ist giftig durch Einatmen und Hautkontakt. Bereiten Sie das Fixiermittel gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und frieren Sie es bei -20 °C in 25 ml Aliquots bis zum Gebrauch ein. - Ungefähr das Gewicht der Probe und 0,1% Dithiothreitol (DTT) für Schritt 2.2 auftauen und auf 37 °C bringen. (Aliquots von DVB-T sollten vor Gebrauch bei -20 °C gelagert werden.)
- Bringen Sie genügend 0,5% N-Acetyl-L-Cystein (NAC) bis zu 37 °C für Schritt 2.2 mit. (NAC sollte wöchentlich frisch zubereitet und vor Gebrauch bei 4 °C gelagert werden.)
2. Dissoziation des Sputums
- Wiegen Sie die Sputumprobe, um das Volumen der Dissoziationsreagenzien zu bestimmen.
ANMERKUNG: Eine Probe gilt als klein, wenn das Anfangsgewicht ≤3 g beträgt, als mittel, wenn >3 g, aber ≤8 g, groß, wenn >8, aber ≤16 g, und als besonders groß, wenn eine Probe >16 g wiegt. Die Indikationen small, medium, large und extra large werden während des gesamten Protokolls verwendet. Die Menge der für die Dissoziation und Markierung erforderlichen Reagenzien unterscheidet sich je nach Größe der Sputumprobe. - Übertragen Sie eine kleine Probe in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen, eine mittlere Probe in eine saubere 250-ml-Einwegflasche aus Kunststoff oder eine große und extra große Probe in eine saubere 500-ml-Einwegflasche aus Kunststoff. Fügen Sie 1 ml/g Probengewicht von 0,5 % NAC und 4 ml/g Probengewicht von 0,1 % DTT hinzu.
- Wirbel bei maximaler Geschwindigkeit (für 15 s) und dann Gestein bei Raumtemperatur (bei maximaler Geschwindigkeit) für 15 min.
- Verdünnen Sie die Probe mit vier Volumina von Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (basierend auf dem Gesamtvolumen der Probe + Reagenzien), um NAC und DTT zu neutralisieren; Wirbel schnell bei maximaler Geschwindigkeit und Gestein bei Raumtemperatur für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit.
- Filtrieren Sie die Zellsuspension durch 100 μm Nylongewebe-Zellsieb in ein oder mehrere konische Zentrifugenröhrchen mit einer Länge von 50 ml, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, kombinieren Sie alle Pellets in einem konischen 15-ml-Rohr und waschen Sie die Pellets dann mit HBSS unter den gleichen Bedingungen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Puffervolumen, das durch das Anfangsgewicht der Sputumprobe bestimmt wird.
ANMERKUNG: Eine kleine Probe wird in 250 μL HBSS resuspendiert. Eine mittlere Probe wird in 760 μL HBSS resuspendiert. Große und extragroße Proben werden in 1460 μL HBSS resuspendiert. - Nehmen Sie ein Aliquot der Zellsuspension für eine lebende/ tote Zellzahl mit Trypan Blue.
HINWEIS: Verwenden Sie für eine kleine Probe 5 μL. Für eine mittlere, große oder extragroße Probe verwenden Sie 10 μL. Verdünnen Sie 1:10 mit HBSS.- Mischen Sie 10 μL der Sputumverdünnung mit 30 μL 0,4% Trypan Blue, um eine endgültige Probenverdünnung von 1:40 zu erhalten. Laden Sie in die Zählkammern eines Hämozytometers für eine Zellzahl.
HINWEIS: Es kann notwendig sein, die endgültige Verdünnung anzupassen, wenn die Zellzahlen zu niedrig oder zu hoch sind, um eine genaue Zählung zu erreichen. Die Konsultation von Guiot et al.20 zur korrekten Unterscheidung von Sputumzellen von SECs und Ablagerungen wird hier dringend empfohlen. Dies ist für eine genaue Zellzahl unerlässlich.
- Mischen Sie 10 μL der Sputumverdünnung mit 30 μL 0,4% Trypan Blue, um eine endgültige Probenverdünnung von 1:40 zu erhalten. Laden Sie in die Zählkammern eines Hämozytometers für eine Zellzahl.
- Entfernen Sie aus der extra großen Probe 50 x 106 Zellen aus der Gesamtmenge und fügen Sie sie zu einem neuen Röhrchen mit genügend zugesetztem HBSS hinzu, um ein Gesamtvolumen von 1700 μL zu erzeugen.
HINWEIS: Betrachten Sie dies als eine große Stichprobe für den Rest des Protokolls. Übrig gebliebene Proben können verworfen oder für andere Zwecke verwendet werden.
3. Färbung von Antikörpern und Lebensfähigkeitsfarbstoffen
- Auswahl an Antikörpern und Färbefarbstoffen
HINWEIS: Tabelle 1 zeigt die Antikörper und Lebensfähigkeitsfarbstoffe, die in diesem Protokoll verwendet werden, und die Zellpopulationen, die sie identifizieren.- Beschriften Sie die Röhrchen, die die Sputumzellen enthalten (siehe Tabelle 2 für Etiketten).
- Verwenden Sie 5 ml Durchflusszytometrieröhrchen (kompatibel mit dem verwendeten Durchflusszytometer) für das Probenröhrchen mit den nicht gefärbten Zellen und das Röhrchen mit der Isotypkontrolle. Verwenden Sie 15 ml konische Röhrchen für die Blut- und Epithelröhrchenproben.
HINWEIS: Diese Proben werden nach der Färbung und Fixierung des Antikörpers in Durchflusszytometrieröhrchen übertragen.
- Beschriften Sie die Kompensationsröhrchen (Tabelle 3).
HINWEIS: Verwenden Sie 5 ml Durchflusszytometrieröhrchen, die mit dem verwendeten Durchflusszytometer kompatibel sind. - Fügen Sie die Menge an HBSS, Antikörper und/oder Farbstoff zu jedem der Sputumzellröhrchen und Kompensationsröhrchen hinzu, wie in Tabelle 2 bzw. Tabelle 3 angegeben.
HINWEIS: Fügen Sie Puffer (HBBS), Antikörper und Farbstoff zu allen Röhrchen hinzu, bevor Sie Zellen oder Kompensationsperlen hinzufügen, um sicherzustellen, dass die Färbezeit aller Röhrchen konsistent ist. - Fügen Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Mengen an Sputumzellvolumen zu den Assay-Röhrchen hinzu.
- Fügen Sie den in Tabelle 3 aufgeführten Kompensationsröhrchen Kompensationsperlen hinzu.
- Inkubieren Sie alle Röhrchen (Assay- und Kompensationsröhrchen) 35 min lang auf Eis, geschützt vor Licht. Anschließend die Röhrchen mit eiskaltem HBSS füllen und bei 4 °C für 10 min bei 800 x g zentrifugieren.
- Für die Kompensationsrohre den Überstand so nah wie möglich an den Pellets absaugen und die Pellets zur Lockerung streichen.
- Geben Sie 0,5 ml kaltes HBSS in die Kompensationsröhrchen, lagern Sie sie bei 4 °C auf dem Eis und schützen Sie sie vor Licht, bis sie für die Durchflusszytometrie-Analyse benötigt werden.
- Den Überstand nach der Zentrifugation (Schritt 3.6 aus dem Antikörper-Färbeabschnitt) aus dem ungefärbten Isotyp, dem Blut und den Epithelröhren absaugen und die Pellets durch Flicken der Röhrchen lösen.
4. Fixierung mit 1% Paraformaldehyd (PFA)
- Fügen Sie kalte 1% PFA (die inzwischen aufgetaut sein sollte) zu den ungefärbten, Isotyp-, Blut- und Epithelröhren hinzu; 2 ml zu den ungefärbten und Isotypröhren und 10 ml zu den Blut- und Epithelröhren.
- Inkubieren Sie die Röhren auf Eis, geschützt vor Licht für 1 h. Wirbeln Sie schnell bei maximaler Geschwindigkeit nach 30 min.
- Füllen Sie die Röhrchen mit eiskaltem HBSS. Dann Zentrifugenröhrchen bei 4 °C für 10 min bei 1600 x g.
- Aspirieren Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Zellpellet zu stören, und streichen Sie mit den Fingern über die Röhre, um die Zellen zu lockern.
- Fügen Sie 200 μL kaltes HBSS zu den ungefärbten und isotypischen Röhrchen hinzu.
- Berechnen Sie das Volumen von HBSS für die Resuspension des Blutes und des Epithelschlauchs entsprechend der Gesamtzellzahl.
ANMERKUNG: Resuspensionsvolumen = 0,15 x [Gesamtzellzahl (Schritt 8 der Sputumdissoziation) / 106]. Verwenden Sie 50 x 106 als Zellzahl für eine extra große Stichprobe. - Lagern Sie alle Proben- und Kompensationsröhrchen, geschützt vor Licht auf dem Eis bei 4 °C, bis eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt wird.
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde nicht länger als 24 h für die Lagerung getestet.
5. Datenerfassung am Durchflusszytometer
- Wenden Sie geeignete Startverfahren für das verwendete Durchflusszytometer an.
HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls geht davon aus, dass die Person, die das Durchflusszytometer bedient, in der Verwendung des ihr zur Verfügung stehenden Instruments geschult ist, insbesondere in Bezug auf tägliche Verfahren, einschließlich der Überprüfung der Stabilität der optischen und fluidischen Systeme, Techniken zur Standardisierung der Lichtstreuung und Fluoreszenzintensität sowie der Berechnung und Anwendung der korrekten Kompensationsmatrix. - Verwenden Sie die Mischung aus NIST-Perlen (National Institute of Standards and Technology), um sicherzustellen, dass Vorwärtsstreu- und Seitenstreuspannungen so eingestellt sind, dass die NIST-Perlen so platziert sind, dass sie das gesamte Diagramm umfassen, ohne die Perlen zu nahe an den Achsen zu platzieren.
HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass Ablagerungen, die kleiner als 5 μm sind, durch eine Gating-Analyse nach der Erfassung eliminiert werden können. Beachten Sie je nach verwendetem Durchflusszytometer, dass die kleinsten Kügelchen nicht mit der Schwelle (bei Verwendung des LSR II oder des Lyric) oder mit dem hohen Diskriminator (mit dem Navios EX Durchflusszytometer) ausgeschlossen werden. Für den Navios EX wurde eine Verstärkung von 2 für die Vorwärts- und Seitenstreuung, eine Spannung von 236 für die Vorwärtsstreuung und 250 für die Seitenstreuung verwendet. Für den LSR II wurde eine Durchlassstreuspannung von 165 und eine Seitenstreuspannung von 190 verwendet. - Stellen Sie die Durchflussrate auf mittel (LSR II) oder hoch (Navios EX) ein.
HINWEIS: Die mittlere oder hohe Durchflussrate für die meisten Instrumente kann verwendet werden, um die Sputumrohre zu erfassen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Verwendung einer zu langsamen Durchflussrate oder einer zu verdünnten Probe dazu führen kann, dass sich die Zellen absetzen, was zu einer erhöhten Wirbelung führt, die nicht erwünscht ist. Daher sollte die Einhaltung des berechneten Resuspensionsvolumens in Schritt 4.6 zu einer Zelldichte führen, die schnell erworben werden kann, aber die Maschine nicht verstopft. - Passen Sie die Spannungen für jeden Parameter an, der für die Streu- und Fluoreszenzparameter verwendet wird, um die Zellpopulationen auf der Skala zu platzieren. Verwenden Sie die Zahlen mit der Gating-Strategie als Anleitung, wie Sie die Spannungen entsprechend anpassen können.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle benötigten Parameter vor der Erfassung im Parameterauswahlfenster ausgewählt sind oder dass keine Daten erfasst werden. - Erfassen Sie zuerst Daten für die nicht gefärbte Sputumprobe, gefolgt von der isotypgefärbten Probe und dann für das Blutröhrchen und das Epithelrohr.
HINWEIS: Wenn die Zellsuspension zu konzentriert ist, damit das Durchflusszytometer die Proben ohne Verstopfung betreiben kann, können die Proben weiter mit HBSS verdünnt werden.
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Representative Results
Dieses Protokoll wurde mit Blick auf ein klinisches Labor entwickelt. Der Fokus bei der Entwicklung des Protokolls lag auf Einfachheit, Effizienz und Reproduzierbarkeit. Es wurde festgestellt, dass der zeitaufwendigste Schritt bei der Verarbeitung von Sputum das Zählen der Zellen war. Daher ist das Protokoll so aufgebaut, dass die Sputumverarbeitung und Zellmarkierung unabhängig von der Zellzählung ohne Zeitverlust durchgeführt werden kann. Eine genaue Zellzahl, die immer noch notwendig ist, um die Probe für einen ungehinderten Lauf angemessen zu verdünnen, kann dann während der Inkubationszeit der Antikörpermarkierung erhalten werden.
Dieses Protokoll verwendet ein Sputumgewichtsmaß anstelle einer Zellzahl als Hinweis darauf, wie viel Antikörper / Farbstoff für eine optimale Zellmarkierung verwendet werden soll. Es gibt jedoch eine große Variation im Gewicht der Sputumproben; Von den 126 analysierten Proben lag das Gewicht zwischen 0,57 g und 38,30 g. Abbildung 1A zeigt, dass die Korrelation zwischen Sputumgewicht und Zellausbeute nicht stark ist. Daher wurden die Stichproben in vier Kategorien eingeteilt; Die Mediangewichte der Proben betrugen 2,1 g für kleine Proben, 5,0 g für mittlere Proben, 11,2 g für große Proben und 22,0 g für extra große Proben (Abbildung 1B). Es gab jedoch immer noch Proben, die aufgrund ihres Gewichts weit mehr Zellen ergaben als erwartet (Abbildung 1C), die Mehrheit der Proben gruppierte sich gut. Für kleine Proben betrug die mittlere Zellausbeute 8,0 x 106 Zellen, für mittlere Proben 13,0 x 106, für große Proben 35,4 x 106 und extra große Proben 93,0 x 106.
Jeder in diesem Protokoll verwendete Antikörper wurde titriert. Als Arbeitskonzentration wurde eine Konzentration auf der Plateauphase (Abbildung 2A) mit dem höchsten Färbeindex (Abbildung 2B) der Titrationskurve gewählt. Variationen in der Zellzahl verändern die Färbeintensität nicht dramatisch. Diese Antikörpertitration und -prüfung ist unerlässlich und sollte mit Vorsicht für jeden neuen Antikörper oder Farbstoff, der in diesem Protokoll verwendet wird, eingerichtet werden34,35. Wenn ein Antikörper vorsichtig titriert wird, sollte er 10- bis 50-fach mehr Zellen färben als die Anzahl der Zellen, auf denen der Antikörper titriert wurde34,35. Ein Beispiel für dieses Prinzip ist in Tabelle 4 dargestellt. Der antimenschliche CD45-PE-Antikörper wurde auf 1 x 106 Zellen in einem Gesamtvolumen von 400 μL titriert. Wenn dieser Antikörper auf das Färbevolumen auf das Protokoll extrapoliert wird (siehe Tabelle 2, die die CD45-PE-Menge und das Färbevolumen für jede Probengröße zeigt), werden für eine kleine Probe 0,625 x 106 Zellen, 1,25 x 106 Zellen für eine mittlere Probe und 2,5 x 106 Zellen für eine große Probe gefärbt (Spalte A in Tabelle 4). Ein 50-facher Überschuss an Zellzahl für jede Kategorie wird mit 31,25 x 106, 62,5 x 106 bzw. 125 x 106 Zellen berechnet (Spalte B). Wie in den Spalten C und D gezeigt, liegen die mittlere Zellzahl jeder Größenkategorie und die größte Stichprobe in jeder Kategorie deutlich im 50-fachen Bereich.
Trotz der offensichtlichen Unterschiede in Größe und Zellausbeute zwischen den verschiedenen Größen der Sputumproben ist die mittlere prozentuale SEC-Kontamination in jeder Kategorie sehr ähnlich. Abbildung 3A zeigt den Prozentsatz der in einzelnen Stichproben gefundenen SECs, geschichtet nach ihrer Sputumgewichtsklasse. Die Hauptsorge galt den SECs, da diese Zellen nicht repräsentativ für das Lungengewebe, sondern für die Mundhöhle sind. Die durchschnittliche SEC-Kontamination beträgt jedoch weniger als 20% für alle Kategorien. Abbildung 3B zeigt den Prozentsatz der lebensfähigen Zellen, die in diesen Proben gefunden wurden. Ohne die SWU betrug die durchschnittliche Rentabilität für die Kategorien des kleinen, mittleren und großen Stichprobenumfangs etwa 72 %. Für die extragroße Kategorie war sie etwas höher (79%).
Abbildung 4 zeigt eine typische Angussstrategie, um die interessierenden Sputumzellen von Trümmern, toten Zellen (zu denen auch die kontaminierenden SECs36 gehören) und Zellklumpen zu trennen. Abbildung 4A zeigt die Verwendung von NIST-Perlen zum Setzen von Toren, um Ablagerungen kleiner als 5 μm oder größer als 30 μm zu entfernen, während Abbildung 4B dieses Tor auf Sputumzellen anwendet. Abbildung 4C zeigt ein typisches Sputumprofil, wenn es als Seitenstreubreite (SSC-W) im Vergleich zur Vorwärtsstreubreite (FSC-W), dem Breitengate, betrachtet wird. Dieses Profil wird verwendet, um kleine Trümmer zu beseitigen, die sich entlang der SSC-W- und FSC-W-Achsen präsentieren. Die Eliminierung abgestorbener Zellen ist in den Abbildungen 4D und Abbildung 4E dargestellt. Die ungefärbte Kontrolle (Abbildung 4D) wird verwendet, um den Cut-off für die FVS510-Positivität zu bestimmen; Zellen, die oberhalb der Negativkontrolle positiv auf FVS510 färben, gelten als tot und werden nicht in der Sputumzellanalyse verwendet (Abbildung 4E). Schließlich wird ein Singulett-Gatter angewendet, um Zellduletten aus der Analyse zu entfernen, was in Abbildung 4F dargestellt ist. Somit stellen die Zellen, die es durch die in den Abbildungen 4B, Abbildung 4C, Abbildung 4E und Abbildung 4F gezeigten Selektionstore geschafft haben, lebende Einzelneputumzellen dar, die für eine anschließende Analyse mit den in diesem Protokoll verwendeten Antikörpern bereit sind.
Die Verwendung des Anti-CD45-Antikörpers in diesem Markierungsprotokoll ermöglicht die Trennung von lebenden, einzelnen Sputumzellen in ein Blutzellkompartiment (CD45+) und ein Nicht-Blut-Zellkompartiment (CD45-). Die letztere Kategorie umfasst Epithelzellen und andere Nicht-Blutzellen. Das obere Profil in Abbildung 5A zeigt die Verwendung einer ungefärbten Sputumprobe, um den Cut-off für die CD45-Positivität festzulegen und die Gatter zu rendern, um CD45+-Zellen und CD45-Zellen zu erfassen. Das untere Profil von Abbildung 5A zeigt diese beiden Gatter, die auf eine mit dem Anti-CD45-Antikörper gefärbte Sputumprobe aufgebracht wurden. Die Färbung mit zusätzlichen Antikörpern wird dann verwendet, um blutzellspezifische Populationen innerhalb des CD45+-Gatters (Abbildung 5B) und anderer Nicht-Blutzellpopulationen, einschließlich Epithelpopulationen im CD45-Gatter, zu identifizieren (Abbildung 5C). In beiden Abbildungen zeigen die oberen Profile, wie isotypgefärbtes Sputum verwendet wird, um die doppelt negativen Populationen einzustellen, während die unteren Profile die Antikörper-gefärbten Sputumzellen zeigen. Abbildung 5B (unten) zeigt sechs verschiedene CD45+-Zellpopulationen, die mit dem Cocktail von Antikörpern gebildet wurden, die im Fluoreszenzkanal (FL) 1 (Anti-CD66b-, CD3-, CD19-Antikörper) und im FL3-Kanal nachweisbar gegen CD206 nachweisbar sind. Sortierexperimente haben gezeigt, dass sich lungenspezifische Makrophagen in den mit M identifizierten Toren befinden. Das Vorhandensein von Zellen in diesen Toren deutet somit darauf hin, dass die Sputumprobe aus der Lunge stammte und kein Speichel war (Bederka et al., Manuskript in Vorbereitung). Abbildung 5C (unten) zeigt die Gating-Quadranten, die mit dem im FL1-Kanal nachweisbaren Anti-Pan-Cytokeratin (panCK) und den im FL3-Kanal nachweisbaren Anti-Pan-Cytokeratin -Antikörpern (EpCAM) unter den CD45-Sputum-Zellen nachgewiesen wurden.
Dieses Kennzeichnungsprotokoll wurde ausgiebig auf dem Navios EX und dem LSR II getestet. Einige Vorbereitende Experimente wurden auf dem Lyric durchgeführt, jedoch ohne die umfangreiche Instrumentenoptimierung, die für die beiden anderen Maschinen durchgeführt wurde. Daher sind detaillierte Instrumenteneinstellungen für den Navios EX und den LSR II im Materialblatt angegeben, nicht jedoch für den Lyric. Um die Ähnlichkeiten und Variationen zwischen diesen drei durchflusszytometrischen Plattformen zu verstehen, die zur Analyse von Sputumzellen verwendet werden können, können die von den verschiedenen Maschinen erhaltenen Profile in Abbildung 6 und Abbildung 7 verglichen werden. Zwei große Sputumproben wurden verarbeitet, gepoolt, markiert, in drei gleiche Portionen getrennt und anschließend auf jedem oben genannten Durchflusszytometer erfasst. Abbildung 6, die Abbildung 4 ähnelt, vergleicht die Gating-Strategie zur Beseitigung von Ablagerungen, abgestorbenen Zellen und Zellklumpen. Abbildung 7, die mit Abbildung 5 identisch ist, vergleicht die Blut- und Nichtblutprofile aus den Daten, die auf den verschiedenen Durchflusszytometern erfasst wurden.
Der Vergleich der verschiedenen Profile, die von den drei verschiedenen Durchflusszytometern erhalten wurden, zeigt, dass bei jedem Gerät die gleichen Grundprofile beobachtet werden können. Die zu beachtenden Unterschiede sind die SSC-W/FSC-W-Diagramme (Width Gate) (Abbildung 6, zweite Reihe) und die linearen Skalen der Streudiagramme (Abbildungen 6 und 7). Das auf dem Navios EX erzeugte Streubreitendiagramm zeigt ein Einschlusstor (rote Box), was bedeutet, dass alle im Tor enthaltenen Zellen weiter analysiert werden. Die Ereignisse entlang der Achsen in der linken unteren Ecke werden ausgeschlossen. Die Streubreitendiagramme auf dem LSR II und Lyric zeigen keine ähnliche Ablagerung von Ereignissen entlang derselben Achsen. Diese Diskrepanz ist wahrscheinlich auf die sehr empfindliche Schwelle zurückzuführen, die auf dem Navios EX verwendet wurde und zu einigen kleinen Trümmern im vorherigen Größenausschlusstor führte (obere Reihe von Abbildung 6). Gelegentlich sind Trümmer entlang der Achsen im Streubreitenprofil zu sehen, das auf dem LSRII erzeugt wird, aber es befindet sich in der rechten unteren Ecke. In diesen Fällen wird ein Ausschlussgate (wie durch das gestrichelte rote Kästchen im mittleren Profil in Zeile 2 von Abbildung 6 angezeigt) verwendet, um diese Ereignisse aus der weiteren Analyse auszuschließen.
Während die Log-Skalen auf den Plots zwischen dem Navios EX und den Zytometern Lyric und LSR II etwas unterschiedlich erscheinen, hat der Navios EX die Möglichkeit, Daten mit mehr Jahrzehnten zu erfassen. Die Implementierung weiterer Jahrzehnte hängt vom Kontext des Experiments und der gewünschten Sensibilität ab, um die interessierenden Populationen zu visualisieren.
Ein weiterer bemerkenswerter Unterschied zwischen den Zytometern Navios EX und LSR II und Lyric ist das Aussehen des Profils des Singulett-Gatters. Das Navios EX Zytometer ist mit einer rechteckigen Durchflusszelle mit einem anderen Auffangwinkel als das LSR II ausgestattet. Der Navios EX enthält drei softwaregesteuerte Erfassungswinkel, um die Vorwärtswinkel-Lichtstreuung zu optimieren und die für die zu analysierende Partikelgröße geeignete Empfindlichkeit zu erreichen. Das Polygon-Gate für das Navios EX-Zytometer muss auf einen etwas niedrigeren Winkel eingestellt werden als das Singulett-Gate für das LSRII. Das Singlet-Gate für den Lyric kann optimiert werden, um ein ähnliches Profil wie beim LSR II zu erhalten. Unter Verwendung der Sputumprobe müsste der Flächenskalierungsfaktor für jeden Laser auf dem Lyric optimiert werden, um ein Singulett-Gate ähnlich dem LSR II zu erhalten.
Alle in Den Abbildungen 4 bis 7 dargestellten Profile wurden mit der FlowJo-Software, Version 10.6, analysiert. Die .fcs Dateien befinden sich im FlowRepository (https://flowrepository.org), unter den IDs FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ und FR-FCM-Z3MM und können verwendet werden, um die Sputumanalyse wie in diesen Abbildungen dargestellt zu üben.
Abbildung 1: Sputumgewichte und Zellausbeute. (A) Dargestellt ist die Beziehung zwischen dem Sputumgewicht, das vor der Verarbeitung bestimmt wurde, und der Gesamtzellausbeute, die nach der Verarbeitung mit einem Hämozytometer bestimmt wurde. Jedes Aufzählungszeichen stellt eine einzelne Stichprobe dar, insgesamt 126. (B) Sputumproben wurden je nach Gewicht in vier Kategorien geschichtet: klein für Proben mit einem Gewicht von bis zu 3 g, mittel für Proben mit einem Gewicht von mehr als 3 g bis 8 g, groß für Proben mit einem Gewicht von mehr als 8 g bis 16 g und extragroße Proben für Proben mit einem Gewicht von mehr als 16 g. (C) Dargestellt ist die Verteilung der Zellausbeute für die Proben in jeder Kategorie. Die roten Balken in (B) und (C) stellen die Medianwerte in jeder Kategorie dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Antikörpertitration für Anti-Human-CD45-PE. (A) Die CD45-PE (IgG1)-Titrationskurve mit der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) der positiven Population im Vergleich zur Konzentration der CD45-PE-Antikörperplateaus bei 1 μg/ml. (B) Die Titrationskurve, die den Färbeindex im Vergleich zur Antikörperkonzentration darstellt, zeigt, dass der höchste Färbeindex bei 1 μg/ml liegt. Der Färbeindex wurde wie folgt berechnet: [CD45 MFI positive Population - CD45 MFI negative Population] / [2 * Standardabweichung]. Basierend auf Abbildung 2A und Abbildung 2B wurde 1 μg/ml als optimale Konzentration für den CD45-PE-Antikörper ausgewählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Der Anteil der SDC und abgestorbenen Zellen in Sputumproben ist in den vier Gewichtsklassen konsistent. (A) Der Anteil der SECs in Sputumproben wird nach ihrer Gewichtsklasse klassifiziert. Die prozentuale SEC-Kontamination wurde per Hämozytometer als Teil der Gesamtzellzahl bestimmt. (B) Zelllebensfähigkeit von Sputumproben ohne SECS, bestimmt durch Hämozytometer und trypanblaue Ausschlussmethode. Für jedes Diagramm stellen die roten Linien die Medianwerte dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Gating-Strategie zum Ausschließen von Ablagerungen, toten Zellen und Dubletten in einer Sputumprobe. (A) NIST-Perlen der Größen 5 μm, 20 μm und 30 μm wurden verwendet, um das durch den roten Kasten angezeigte Tor so einzustellen, dass Trümmer kleiner als 5 μm und größere Ablagerungen über 30 μm und nahe an der Achse ausgeschlossen wurden. (B) Eine Sputumprobe wurde mit den gleichen Spannungen für die Vorwärts- und Seitenstreuung wie die der NIST-Kügelchen aufgenommen. Das in (A) erstellte Tor wurde angewendet, um Trümmer auszuschließen. (C) Kleine Trümmer in der Nähe der Achse wurden in diesem Streubreitendiagramm ausgeschlossen. (D) Eine nicht gebeizte Sputumprobe wurde verwendet, um den Cut-off (rote Linie) für die negative, nicht gefärbte Population für den Lebensfähigkeitsfarbstoff festzulegen. (E) Der in D erzeugte Cut-off wurde auf die gefärbte Sputumprobe aufgebracht, um ein Tor (rote Box) zu bilden, um lebende, lebensfähige Zellen einzuschließen. (F) Das durch das rote Polygon angezeigte Singulett-Tor schließt Zellen aus, die nicht auf die Diagonale fallen, wodurch Dubletten und/oder Klumpen eliminiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Gating-Strategie von Sputumzellen in Blut- und Nicht-Blutzellkompartimente. (A) Nicht gefärbte Sputumzellen, die vom Singulett-Gate abgeleitet sind, werden verwendet, um den Cut-off (rote Linie) auf die negative Population für CD45 festzulegen (oben). Der Cut-off vom oberen Profil wird auf die gefärbte Sputumprobe (unten) aufgetragen, um CD45 positive (CD45+) und negative Populationen (CD45-) zu unterscheiden. (B) CD45+ Sputumzellen, die mit Isotyp-Antikörpern für FITC/AF488 gefärbt sind, werden verwendet, um die Tore auf die negative Population zu setzen (oben). Die gleichen Gatter werden auf die CD45+ Sputumzellen aufgebracht, die mit den Blutzellmarkern CD3, CD19, CD66b und CD206 (unten) gefärbt sind. (C) Quadrantengatter werden auf die cd45- Sputumzellen gelegt, die mit Isotypkontrollen (oben) gefärbt sind, und aus der Sputumprobe, die mit den Epithelmarkern pan-cytokeratin (panCK) und EpCAM (unten) gefärbt ist, auf die CD45-Zellen aufgetragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Gating-Strategie zum Ausschluss von Ablagerungen, Klumpen und toten Zellen von gefärbten Sputumzellen auf drei durchflusszytometrischen Plattformen. Zwei große Sputumproben wurden verarbeitet, gepoolt, markiert und in drei gleiche Portionen aufgeteilt, um sie auf den Durchflusszytometern Navios EX (A), LSR II (B) und Lyric (C) aufzunehmen. Obere Reihe: Sputumproben wurden eingezäunt (rote Box), um sehr kleine und große Trümmer auszuschließen. Zweite Reihe: Der große rote Kasten im Navios EX-Diagramm stellt ein Einschlusstor dar, das die Zellen einschließt, aber Trümmer ausschließt. Der gestrichelte kleine rote Kasten, der im LSR II-Diagramm zu sehen ist, stellt ein Ausschlusstor dar, um Trümmer aus der weiteren Analyse zu entfernen. Weitere Optimierungen mit dem Lyric sind erforderlich, um festzustellen, wo debris exclusion gating benötigt wird. Daher ist in diesem Grundstück kein Tor vorhanden. Dritte Reihe: Rote rechteckige Tore enthalten lebende Zellen zur weiteren Analyse. Untere Reihe: Polygontor hat einzelne Zellen, indem Dubletten ausgeschlossen werden, die außerhalb der Diagonale des Tores liegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Gating-Strategie für Sputum, gefärbt für Blut- und Epithelmarker auf drei durchflusszytometrischen Plattformen. Die in Abbildung 6 dargestellte Analyse wird in Abbildung 7 fortgesetzt; alle lebensfähigen Einzelzellen (untere Reihe, Abbildung 6) wurden in CD45+- und CD45-Populationen unterteilt (erste Reihe, Abbildung 7), so dass blutzellspezifische Marker und epithelzellspezifische Marker diese Populationen weiter abgrenzen konnten. Zweite Reihe: Profil der Blutzellmarker CD3/CD19/CD66b und CD206 aus CD45+ Zellen. Dritte Reihe: Epithelzellmarker panCK und EpCAM aus CD45-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Antikörper/Färbung | Zweck |
| FVS510 | Lebensfähigkeitsfleck |
| Anti-human CD45 – PE | Pan-Leukozyt-Marker; PE-Kompensation |
| Anti-Human CD66b - FITC | Granulozyten-Marker |
| Anti-Mensch CD3 – Alexa488 | T-Zell-Marker |
| Anti-Mensch CD19 – Alexa488 | B-Zell-Marker; FITC/Alexa488 Kompensation |
| Anti-human CD206 – PE-CF594 | Lungenmakrophagen-Marker; PE-CF594 Kompensation |
| Anti-human EpCAM – PE-CF594 | Epithelzellmarker; PE-CF594 Kompensation |
| Anti-humanes Panzytokeratin (panCK) – Alexa488 | Marker für Epithelzellen |
| IgG1κ – Alexa488 | CD3/CD19/panCK Isotyp-Steuerung |
| IgG1κ – FITC | CD66b-Isotyp-Steuerung |
| IgG1κ – PE-CF594 | CD206/EpCAM Isotype-Steuerung |
| Anti-Mensch CD45 – BV510 | FVS510 Entschädigung |
Tabelle 1: Verwendete Antikörper und Lebensfähigkeitsflecken. Liste der Antikörper und Lebensfähigkeitsfarbstoffe, die in diesem Protokoll verwendet werden. Angegeben sind die zellulären Untergruppen, die sie jeweils identifizieren.
| Tube (Etikett) | Stichprobenumfang* | HBSS (μL) | FVS510 (μL) | CD45 (μL) | Andere Antikörper (μL) | Zellen § (μL) | |||
| Ungefleckt | klein | 80 | 20 | ||||||
| Mittel | 50 | 50 | |||||||
| groß | 50 | 50 | |||||||
| IgG1κ - Alexa488 | IgG1κ- FITC | IgG1κ - PE-CF594 | |||||||
| Isotype-Steuerung | klein | 60.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 20 | |
| Mittel | 30.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| groß | 30.25 | 1 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| CD-206 | CD3 | CD-19 | CD66b | ||||||
| Blut | klein | 92.875 | 1.5 | 25 | 1.875 | 5 | 1.25 | 7.5 | 115 |
| Mittel | 65.75 | 3 | 50 | 3.75 | 10 | 2.5 | 15 | 350 | |
| groß | 102.5 | 10 | 100 | 7.5 | 20 | 5 | 30 | 725 | |
| EpCAM | PanCK | ||||||||
| Epithelial | klein | 96.5 | 1.5 | 25 | 10 | 2 | 115 | ||
| Mittel | 73 | 3 | 50 | 20 | 4 | 350 | |||
| groß | 117 | 10 | 100 | 40 | 8 | 725 | |||
| * Proben werden als klein, mittel oder groß betrachtet, basierend auf dem Gewicht, das in Schritt 1 des Sputumdissoziationsabschnitts des Protokolls bestimmt wurde. | |||||||||
| § Zellen sollten hinzugefügt werden, nachdem alle Reagenzien verteilt wurden, einschließlich derjenigen in den Kompensationsröhrchen (Tabelle 3). | |||||||||
Tabelle 2: Gehalt der Röhrchen mit Sputumzellen. Verwenden Sie diese Tabelle wie im Protokoll angegeben, um die angegebenen Mengen an Antikörpern und Lebensfähigkeitsfärbung für die entsprechende Stichprobengröße hinzuzufügen.
| Tube (Etikett) | Zugesetzte Reagenzien (μL) | Reagenzien hinzugefügt (Drop) | ||||||
| HBSS | CD45-PE | CD206-PE-CF594 | EpCAM-PE-CF594 | CD19-Alexa488 | CD45-BV510 | CompBead (+) | CompBead * (-) | |
| PE-Comp. | 76 | 4 | x | x | x | x | 1 | 1 |
| PE-CF594 komp. | 72 | x | 4 | 4 | x | x | 1 | 1 |
| Alexa488/FITC komp. | 60 | x | x | x | 20 | x | 1 | 1 |
| BV510 komp. | 60 | x | x | x | x | 20 | 1 | 1 |
| * Die positiven (+) und negativen (-) Kügelchen sollten zugegeben werden , nachdem alle Reagenzien verteilt und die Röhrchen in Tabelle 2 hergestellt wurden. | ||||||||
| comp. = Entschädigung | ||||||||
Tabelle 3: Inhalt der Kompensationsröhrchen. Verwenden Sie diese Tabelle, wie im Protokoll angegeben, um die angegebenen Antikörpervolumina zu den Kompensationsperlen hinzuzufügen.
| Zellennummer (x 106) | ||||
| Ein | B | C | D | |
| Stichprobenumfang | Im Färbevolumen * | 50-facher Zugriff ¶ | Medianprobe (Faltzugriff) # | Größte Stichprobe (faltbarer Zugriff) # |
| Klein | 0.625 | 31.25 | 8.0 (12.8) | 24.77 (39.6) |
| Mittel | 1.25 | 62.5 | 13.0 (10.4) | 48.87 (39.1) |
| Groß | 2.5 | 125 | 35.4 (14.2) | 113.5 (45.4) |
| * Im Protokoll verwendete Färbevolumina (Tabelle 2). Die Zellzahl wird aus der Art und Weise extrapoliert, wie die Titrationskurve durchgeführt wurde; 1 μg/ml CD45-PE und 1 x 106 Zellen pro 200 μL. | ||||
| ¶ 50-facher Zugriff auf Zellennummern in Spalte A. | ||||
| # Der Fold-Zugriff in den Spalten C und D wird berechnet, indem die in den Zellen der Spalten C oder D dargestellte Zahl durch die Zahl in der entsprechenden Zelle in Spalte A dividiert wird. | ||||
Tabelle 4: Anti-Human-CD45-PE-Konzentration für alle Proben in jeder Probengrößenkategorie.
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Discussion
Der zelluläre Gehalt des Sputums umfasst eine Vielzahl von weit reichenden Zellen, oft begleitet von vielen Trümmern37. Darüber hinaus erfordert die Sputumanalyse eine Qualitätskontrolle, die bestätigt, dass die Probe aus der Lunge und nicht aus der Mundhöhle entnommen wird38. Daher ist es nicht so einfach, Sputum mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, wie es beispielsweise bei Blut der Fall ist, das eine viel sauberere und homogenere Zellsuspension freisetzt. Dieses Protokoll hat all diese Probleme angegangen: Bereitstellung von Instrumenteneinstellungen mit Perlen bestimmter Größe, um sicherzustellen, dass sowohl die kleinsten als auch die größten Zellpopulationen nachgewiesen werden können, eine Gating-Strategie zur Beseitigung von Ablagerungen, Zellklumpen, kontaminierenden SECs und anderen toten Zellen und schließlich eine Qualitätskontrollmaßnahme, um sicherzustellen, dass eine Sputumprobe aus der Lunge stammt und nicht hauptsächlich Speichel ist.
Es gibt kritische Schritte im Protokoll bei der Arbeit mit Sputum, die es wert sind, hervorgehoben zu werden. Erstens kann die Zellausbeute drastisch durch die Anzahl der Nylonzellsiebe beeinflusst werden, die in Schritt 2.5 des Sputumdissoziationsteils des Protokolls verwendet werden. Mehrere Siebe können erforderlich sein, um zu vermeiden, dass zu viele Zellen aufgrund einer Verstopfung des Siebes verloren gehen. Wenn sich der Durchfluss durch die Siebe merklich verlangsamt hat, sollte ein neues Sieb verwendet werden. Zweitens kann das Zellpellet von Sputumproben sehr locker sein, insbesondere wenn eine hohe Kontamination von SECs vorliegt. Daher ist es wichtig, beim Entfernen des Überstands nach dem Zentrifugieren der Proben nicht zu nahe am Pellet zu aspirieren. Das Absaugen zu nahe am Pellet kann zu Zellverlust, wenn nicht sogar zum Verlust des gesamten Pellets führen. Drittens erfordert dieses Protokoll einen Fixierungsschritt. Dies erhält die Zellen und ihr Färbeprofil und dient als Sicherheitsmaßnahme zum Schutz des Durchflusszytometerbetreibers. Das Ausführen von Proben auf bestimmten Durchflusszytometern kann aufgrund des Potenzials für die Aerosolproduktion erhöhte biologische Gefahren darstellen39. Die PFA-Fixierung hilft, den Bediener vor potenziellen Krankheitserregern in der Sputumprobe zu schützen. Viertens, und vielleicht der schwierigste Aspekt bei der Vorbereitung von Sputumproben für die durchflusszytometrische Analyse, ist die Zellzählung. Die Zellzählung ist aufgrund der großen Vielfalt der im Sputum vorhandenen Zelltypen kompliziert. Zählmaschinen sind oft durch den Zellgrößenbereich begrenzt, den sie erfassen können, und sind daher weniger zuverlässig als ein Hämozytometer. Die Zellzählung von Sputumproben mittels Hämozytometer, die von Guiot et al.20 hervorragend beschrieben wird, ist jedoch mühsam und erfordert Übung, um kompetent zu werden. Eine genaue Zellzahl ist entscheidend für die Bestimmung des endgültigen Resuspensionsvolumens der Probe, um eine angemessene Durchflussrate zu ermöglichen und Verstopfungen im Durchflusszytometer zu verhindern. Das Vorhandensein der sehr großen SECs im Sputum und die vielen kleineren Zellklumpen, die weder durch den Dissoziationspuffer aufgebrochen noch von den Filtern aufgefangen werden, erhöhen die Wahrscheinlichkeit, dass das Durchflusszytometer verstopft wird. Daher wird empfohlen, einige Zeit damit zu verbringen, die beste Zellkonzentration / Durchflussrate für die Datenerfassung mit dem verfügbaren Durchflusszytometer zu bestimmen. Stellen Sie außerdem sicher, dass das Durchflusszytometer über die geeignete Durchflusszellen- und Düsengröße (oder Sonde) verfügt, die in der Lage ist, die größeren Zellpopulationen im Sputum zu messen.
Selbst wenn die Kompetenz in der Zellzählung erreicht wurde, ist dies immer noch ein zeitaufwendiger Prozess. Daher basiert die Bestimmung der Reagenzien für die Zellmarkierung in diesem Protokoll auf der Stichprobengröße (gemessen nach Gewicht) und nicht auf der Zellzahl. Dies ermöglicht eine effizientere Nutzung der Zeit, da die manuelle Zellzählung während der Zeit abgeschlossen werden kann, die für die Färbung des Antikörpers und des Lebensfähigkeitsfarbstoffs benötigt wird. Es gibt jedoch drei bemerkenswerte Ausnahmen. Ist eine Probe >16 g (die sogenannten extragroßen Proben), sollte die manuelle Zellzählung vor der Färbung erfolgen, damit teure Reagenzien konserviert werden können, indem nur 25 x 106 Zellen für die Blut- und Epithelröhrchen gebeizt werden. Diese Zellnummer gibt sehr zuverlässige Profile in den in diesem Protokoll beschriebenen Einstellungen. Eine weitere mögliche Ausnahme ist der Fall einer sehr kleinen Stichprobe. Die Schätzung ist, dass ein Minimum von 1-2 x 106 Zellen für die durchflusszytometrische Analyse, wie in diesem Protokoll dargestellt, benötigt wird, um zuverlässige Profile zu erzeugen (Daten nicht gezeigt). Wenn eine Probe weniger als 1-2 x 106 Zellen enthält, lohnt es sich daher möglicherweise nicht, mit dem Verfahren fortzufahren, da das Endergebnis wahrscheinlich inakzeptabel ist.
Spezifische Markierungsreagenzien, die gut auf peripheren Blutzellen oder Zelllinien wirken, können auf Blutzellen, die im Sputum enthalten sind, sehr unterschiedlich wirken (unveröffentlichte Beobachtungen). Daher wird empfohlen, jeden Antikörper oder andere Markierungsreagenzien nach gut etablierten Protokollen34,35 zu titrieren, bevor sie in Durchflusszytometrie-Experimenten verwendet werden. Die meisten Antikörpertitrationen sollten bei der Färbung bis zu 10- bis 50-fache vergleichbare Ergebnisse liefern; Es wird jedoch empfohlen, zusätzliche Titrationen mit Zellzahlen durchzuführen, die höher als dieser Bereich sind34. Wenn eine Reagenzienkonzentration bestimmt wurde, ist es wichtig, die Inkubationszeit dieses Reagenzes wie im eigentlichen Experiment einzuhalten. Aus diesem Grund betont das Protokoll, dass alle Puffer und Reagenzien zu den Röhrchen hinzugefügt werden, bevor die Zellen oder Kompensationsperlen hinzugefügt werden. Diese Reihenfolge der Zugabe von Reagenzien und Zellen/Kügelchen zusammen ermöglicht eine höhere Konsistenz der Markierungszeiten. Wenn die experimentelle Inkubationszeit aus irgendeinem Grund nicht ähnlich der für die Antikörper-/Farbstofftitration verwendeten Zeit gehalten werden kann, sollte diese mit einer in den Experimenten durchführbaren Inkubationszeit wiederholt werden.
Sputumproben wurden häufig als diagnostische Probe verwendet, um die Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen der Lunge zu untersuchen. Tuberkulose40,41, COPD13,42, Asthma43, Mukoviszidose44,45, Lungenkrebs46,47,48 und rheumatoide Arthritis49 gehören zu den vielen Krankheiten, bei denen Sputum aufgrund des Vorteils, dass es sich um eine nicht-invasive Probe handelt, untersucht wurde. In jüngerer Zeit, während der Coronavirus-Pandemie, wurde Sputum verwendet, um eine anhaltende Virusausscheidung bei Patienten zu erkennen, die mit der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19)50 ins Krankenhaus eingeliefert wurden.
Verschiedene Technologien, darunter reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), Proteinanalyse, Mikroskopie und Durchflusszytometrie, wurden verwendet, um krankheitsspezifische Marker im Sputum zu identifizieren. Die Verwendung einer durchflusszytometrischen Plattform zur Analyse von Sputumproben ist nicht weit verbreitet, aber ihre Verwendung nimmt zu. Mit den jüngsten Fortschritten in der Technologie der Durchflusszytometer3,51,52 sowie Fortschritten in der Chemie von Fluorophoren, der Erzeugung neuer Antikörperklone und der Entwicklung verschiedener Farbstoffe zur Identifizierung toter Zellpopulationen51,53,54 hat sich die Möglichkeit, Antikörper-Panels zur Diagnose menschlicher Krankheiten zu entwickeln, dramatisch erhöht. Darüber hinaus wird der jüngste Vorstoß zur Automatisierung der Analyse durchflusszytometrischer Daten55,56 die potenzielle Verzerrung beim manuellen Lesen und Interpretieren von Durchflussdaten beseitigen. Diese neuen Entwicklungen in der Durchflusszytometrie werden die Erforschung von Sputum als klinische Diagnostik erheblich erleichtern.
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Disclosures
Alle Autoren sind ehemalige oder aktuelle Mitarbeiter von bioAffinity Technologies.
Acknowledgments
Wir danken David Rodriguez für seine Unterstützung bei der Figurenvorbereitung. Sputum-Proben wurden auf dem BD LSR II in der UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility durchgeführt, unterstützt von UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC bei UT Health) und UL1 TR001120 (CTSA-Zuschuss).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Paraformaldehyde Flow-Fix | Polysciences | 25037 | |
| 100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
| 50 mL conical falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Alexa488 anti-human CD19 | BioLegend | 302219 | |
| Alexa488 anti-human CD3 | BioLegend | 300415 | |
| Alexa488 anti-human cytokeratin | BioLegend | 628608 | |
| Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype | BioLegend | 400129 | |
| BV510 anti-human CD45 | BioLegend | 304036 | |
| CD66b FITC isotype | BD Biosciences | 555748 | |
| CompBead Plus Compensation Beads | BD Biosciences | 560497 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
| CS&T beads | BD Biosciences | 655051 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| FITC anti-human CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 564406 | |
| FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
| FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| NAC | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NIST Beads, 05 μM | Polysciences | 64080 | |
| NIST Beads, 20 μM | Polysciences | 64160 | |
| NIST Beads, 30 μM | Polysciences | 64170 | |
| PE anti-human CD45 | BioLegend | 304039 | |
| PE-CF594 anti-human EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
| PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype | BD Biosciences | 562292 | |
| PE-CR594 anti-human CD206 | BD Biosciences | 564063 | |
| Sodium citrate dihydrate | EMD | SX0445-1 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 |
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