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Medicine

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा गुणवत्ता-नियंत्रित थूक विश्लेषण

Published: August 9, 2021 doi: 10.3791/62785
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1bioAffinity Technologies, 2Department of Cell Systems & Anatomy, The University of Texas Health Science Center at San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन में थूक को अलग करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है और मानक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफार्मों पर सेलुलर सबसेट के बाद के लक्षण वर्णन का वर्णन करता है।

Abstract

थूक, व्यापक रूप से फेफड़ों के स्वास्थ्य को समझने के लिए सेलुलर सामग्री और अन्य माइक्रोएनवायरमेंटल विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, पारंपरिक रूप से साइटोलॉजी-आधारित तरीकों का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। इसकी उपयोगिता सीमित है क्योंकि स्लाइड पढ़ना समय लेने वाला है और इसके लिए अत्यधिक विशिष्ट कर्मियों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, व्यापक मलबे और बहुत अधिक स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं (एसईसी), या गाल कोशिकाओं की उपस्थिति, अक्सर निदान के लिए अपर्याप्त नमूना प्रदान करती है। इसके विपरीत, फ्लो साइटोमेट्री सेलुलर आबादी के उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिंग के लिए अनुमति देता है, जबकि एक साथ मलबे और एसईसी को छोड़कर।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन, एंटीबॉडी दाग और सेलुलर आबादी को ठीक करने और एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर नमूने प्राप्त करने के लिए थूक को अलग करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है। एक गेटिंग रणनीति जो मलबे, मृत कोशिकाओं (एसईसी सहित) और सेल डबल्स के बहिष्करण का वर्णन करती है, यहां प्रस्तुत की गई है। इसके अलावा, यह काम यह भी बताता है कि हेमटोपोइएटिक और उपकला वंश के सबसेट को चिह्नित करने के लिए भेदभाव (सीडी) 45 सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के एक समूह के आधार पर व्यवहार्य, एकल थूक कोशिकाओं का विश्लेषण कैसे किया जाए। एक गुणवत्ता नियंत्रण उपाय भी सबूत के रूप में फेफड़ों-विशिष्ट मैक्रोफेज की पहचान करके प्रदान किया जाता है कि एक नमूना फेफड़ों से प्राप्त होता है और लार नहीं होता है। अंत में, यह प्रदर्शित किया गया है कि इस विधि को तीन प्रवाह साइटोमीटर पर विश्लेषण किए गए एक ही रोगी से थूक प्रोफाइल प्रदान करके विभिन्न साइटोमेट्रिक प्लेटफार्मों पर लागू किया जा सकता है; Navios पूर्व, LSR द्वितीय, और गीत. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को ब्याज के अतिरिक्त सेलुलर मार्करों को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफ़ॉर्म पर एक पूरे थूक के नमूने का विश्लेषण करने के लिए एक विधि यहां प्रस्तुत की गई है जो थूक को फेफड़ों की बीमारी के उच्च-थ्रूपुट निदान के विकास के लिए उपयुक्त बनाती है।

Introduction

प्रवाह साइटोमीटर के हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर में तकनीकी प्रगति ने एक साथ कई अलग-अलग सेल आबादी की पहचान करना संभव बना दिया है1,2,3,4। हेमटोपोइएटिक सेल अनुसंधान में प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग, उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा प्रणाली 2 और हेमटोपोइएटिक सिस्टम 5 के सेलुलर पदानुक्रम की बेहतर समझ के साथ-साथ विभिन्न रक्त कैंसर की भीड़ के नैदानिक अंतर को जन्म दिया है6,7,8। यद्यपि अधिकांश थूक कोशिकाएं हेमटोपोइएटिक मूल की हैं9,10,11, फ्लो साइटोमेट्री को नैदानिक उद्देश्यों के लिए थूक विश्लेषण पर व्यापक रूप से लागू नहीं किया गया है। हालांकि, कई अध्ययनों से पता चलता है कि थूक (कोशिकाओं का सबसे महत्वपूर्ण सबसेट) में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का मूल्यांकन अस्थमा और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) 12,13,14,15 जैसी बीमारियों के निदान और / या निगरानी में बहुत मदद कर सकता है। इसके अलावा, उपकला-विशिष्ट मार्करों का अस्तित्व जो प्रवाह साइटोमेट्री में उपयोग किया जा सकता है, थूक, फेफड़ों की उपकला कोशिकाओं में कोशिकाओं के निम्नलिखित सबसे महत्वपूर्ण सबसेट की पूछताछ की अनुमति देता है।

विभिन्न ऊतक मूल के कई अलग-अलग सेल आबादी का विश्लेषण करने की क्षमता के अलावा, एक प्रवाह साइटोमीटर अपेक्षाकृत कम अवधि में बड़ी संख्या में कोशिकाओं का मूल्यांकन कर सकता है। इसकी तुलना में, स्लाइड-आधारित, साइटोलॉजिकल प्रकार के विश्लेषणों के लिए अक्सर अत्यधिक विशिष्ट कर्मियों और / या उपकरणों की आवश्यकता होती है। ये विश्लेषण श्रम-गहन हो सकते हैं, जो थूक के नमूने का केवल एक अनुपात विश्लेषण किया जा रहा है16 की ओर जाता है।

तीन महत्वपूर्ण मुद्दे प्रवाह साइटोमेट्री में थूक के व्यापक उपयोग को सीमित करते हैं। पहला मुद्दा थूक के संग्रह से संबंधित है। थूक को एक हफ खांसी के माध्यम से एकत्र किया जाता है जो फेफड़ों से बलगम को मौखिक गुहा में निष्कासित करता है, बाद में एक संग्रह कप में थूकता है। चूंकि बलगम मौखिक गुहा के माध्यम से यात्रा करता है, इसलिए एसईसी संदूषण की एक उच्च संभावना है। यह संदूषण नमूना विश्लेषण को जटिल बनाता है, लेकिन समस्या को आसानी से एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर ठीक कर दिया जाता है, जैसा कि इस अध्ययन में दिखाया गया है।

हर कोई अनायास थूक का उत्पादन नहीं कर सकता है; इसलिए, कई उपकरणों को एक गैर-आक्रामक तरीके से थूक संग्रह के साथ सहायता करने के लिए विकसित किया गया है17। नेबुलाइज़र एक ऐसा उपकरण है और इसे विश्वसनीय थूक के नमूनों का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है18,19,20। हालांकि नेबुलाइज़र गैर-आक्रामक रूप से थूक एकत्र करने का एक बहुत ही प्रभावी तरीका है, इसके उपयोग के लिए अभी भी विशेष कर्मियों के साथ एक चिकित्सा सुविधा में एक सेटिंग की आवश्यकता होती है21। इसके विपरीत, फेफड़ों की बांसुरी 22,23,24 और एकापेला 16,25 जैसे हैंडहेल्ड उपकरणों का उपयोग घर पर किया जा सकता है क्योंकि वे बहुत उपयोगकर्ता के अनुकूल हैं। ये सहायता उपकरण दोनों सुरक्षित और लागत प्रभावी हैं।

हमारे लिए, अकापेला ने फेफड़ों की बांसुरी 16 की तुलना में लगातार बेहतर परिणाम दिए, और इसलिए, एकापेला डिवाइस को थूक संग्रह के लिए चुना गया है। एक 3-दिवसीय संग्रह नमूना तय किया गया था क्योंकि थूक का उपयोग करने का प्राथमिक उद्देश्य फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने वाले परीक्षण 16 को विकसित करना है। यह दिखाया गया है कि 3-दिवसीय नमूना 1- या 2-दिवसीय नमूने 26,27,28 की तुलना में फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने की संभावना को बढ़ाता है। हालांकि, थूक संग्रह के अन्य तरीके विभिन्न उद्देश्यों के लिए बेहतर हो सकते हैं। यदि यहां वर्णित एक की तुलना में एक अलग थूक संग्रह विधि का उपयोग किया जाता है, तो प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक एंटीबॉडी या डाई को सावधानीपूर्वक टाइटरेट करने की सिफारिश की जाती है; बहुत कम डेटा उपलब्ध है कि विभिन्न थूक संग्रह विधियां प्रवाह साइटोमेट्री के लिए लक्षित प्रोटीन को कैसे प्रभावित करती हैं।

निदान के लिए थूक का उपयोग करने के लिए उत्साह को कम करने वाला दूसरा मुद्दा, मुख्य रूप से प्रवाह साइटोमेट्री से संबंधित है, सेल संख्या है। समस्या एक विश्वसनीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं का संग्रह है। दो अध्ययनों से पता चला है कि गैर-इनवेसिव तरीकों द्वारा एकत्र किए गए थूक के नमूनों में, एक सहायता उपकरण की मदद से, पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाएं होती हैं जिनका उपयोग नैदानिक निदान या अनुसंधान अध्ययनों में किया जा सकता है16,24। हालांकि, इन अध्ययनों में से किसी ने भी प्रवाह साइटोमेट्री से संबंधित सेल संख्याओं के मुद्दे को संबोधित नहीं किया।

इस प्रोटोकॉल के लिए आधार बनाने वाले अध्ययनों के लिए, प्रत्येक अध्ययन स्थल के लिए अनुमोदित संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करते हुए फेफड़ों के कैंसर के विकास के लिए उच्च जोखिम वाले प्रतिभागियों से थूक के नमूने एकत्र किए गए थे। उच्च जोखिम वाले प्रतिभागियों को 55-75 वर्षों के बीच के रूप में परिभाषित किया गया था, जिन्होंने 30 पैक-वर्षों में धूम्रपान किया था और पिछले 15 वर्षों के भीतर धूम्रपान नहीं छोड़ा था। रोगियों को दिखाया गया था कि निर्माता के निर्देशों के अनुसार एकापेला डिवाइस का उपयोग कैसे किया जाए29 और घर पर लगातार तीन दिनों तक थूक एकत्र किया गया। नमूने को अंतिम संग्रह तक रेफ्रिजरेटर में रखा गया था। अंतिम संग्रह के दिन, नमूने को एक जमे हुए ठंडे पैक के साथ रात भर प्रयोगशाला में भेज दिया गया था। नमूनों को उस दिन एक एकल सेल निलंबन में संसाधित किया गया था जिस दिन वे प्राप्त हुए थे। थूक संग्रह की इस विधि के साथ, एक विश्वसनीय प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं से अधिक प्राप्त किया जाता है।

अंत में, और पिछले सेल नंबर मुद्दे से संबंधित, यह सवाल है कि थूक कोशिकाओं को इसके म्यूकिनस वातावरण से कैसे जारी किया जाए। कोशिकाओं को व्यवहार्य कैसे रखा जा सकता है और एक एकल सेल निलंबन बनाया जा सकता है जो प्रवाह साइटोमीटर को रोक नहींता है? Pizzichini et al.30 और Miller et al.31 द्वारा प्रारंभिक काम के आधार पर, यह प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन में थूक प्रसंस्करण के लिए एक आसान और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है जो प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। इस विधि ने थूक में हेमटोपोइएटिक और उपकला कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक कुशल एंटीबॉडी लेबलिंग रणनीति विकसित करने और एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर थूक विश्लेषण को मानकीकृत करने वाले उपकरण सेटिंग्स, गुणवत्ता नियंत्रण उपायों और विश्लेषण दिशानिर्देशों को प्रदान करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री 32,33,34 में अच्छी तरह से स्थापित दिशानिर्देशों का उपयोग किया है।

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Protocol

थूक प्रसंस्करण के सभी चरणों को उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणके साथ एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है।

1. थूक पृथक्करण शुरू करने से पहले अभिकर्मक तैयारी

  1. 1% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए), बर्फ पर प्रति नमूना 25 मिलीलीटर पिघलाएं, और उपयोग होने तक ठंडा रखें।
    सावधानी: पीएफए साँस लेना और त्वचा के संपर्क से विषाक्त है। निर्माता के निर्देशों के अनुसार फिक्सेटिव तैयार करें और उपयोग करने तक 25 एमएल एलीकोट में -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
  2. नमूने के वजन का अनुमान लगाएं और चरण 2.2 के लिए पर्याप्त 0.1% Dithiothreitol (DTT) पिघलाएं और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर लाएं। (डीटीटी के एलीकोट को उपयोग करने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
  3. चरण 2.2 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक पर्याप्त 0.5% एन-एसिटाइल- एल-सिस्टीन (एनएसी) लाएं। (एनएसी को ताजा साप्ताहिक बनाया जाना चाहिए और उपयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।

2. थूक पृथक्करण

  1. पृथक्करण अभिकर्मकों की मात्रा निर्धारित करने के लिए थूक के नमूने का वजन करें।
    नोट: एक नमूना छोटा माना जाता है यदि प्रारंभिक वजन ≤3 ग्राम है, मध्यम यदि >3 ग्राम है लेकिन ≤8 ग्राम है, तो बड़ा है यदि >8 लेकिन ≤16 ग्राम है, और अतिरिक्त बड़ा है यदि एक नमूना >16 ग्राम वजन करता है। छोटे, मध्यम, बड़े और अतिरिक्त बड़े संकेतों का उपयोग पूरे प्रोटोकॉल में किया जाएगा। पृथक्करण और लेबलिंग के लिए आवश्यक अभिकर्मकों की मात्रा थूक के नमूने के आकार के अनुसार भिन्न होती है।
  2. एक साफ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए एक छोटा सा नमूना स्थानांतरित करें, एक साफ 250 मिलीलीटर प्लास्टिक डिस्पोजेबल बोतल के लिए एक मध्यम नमूना, या एक साफ 500 मिलीलीटर प्लास्टिक डिस्पोजेबल बोतल के लिए एक बड़ा और अतिरिक्त बड़ा नमूना। 0.5% एनएसी का 1 एमएल / जी नमूना वजन और 0.1% डीटीटी का 4 एमएल / जी नमूना वजन जोड़ें।
  3. अधिकतम गति (15 सेकंड के लिए) पर भंवर, और फिर 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (अधिकतम गति पर) पर रॉक करें।
  4. एनएसी और डीटीटी को बेअसर करने के लिए हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) (नमूना + अभिकर्मकों की कुल मात्रा के आधार पर) के चार संस्करणों के साथ नमूने को पतला करें; भंवर जल्दी से अधिकतम गति पर और अधिकतम गति पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रॉक।
  5. एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए एक या अधिक 50 mL शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (ओं) में 100 μm नायलॉन जाल सेल छलनी (ओं) के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 800 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। Supernatant aspirate, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सभी छर्रों गठबंधन, और फिर एक ही शर्तों का उपयोग कर HBSS के साथ छर्रों धोना।
  7. थूक के नमूने के प्रारंभिक वजन द्वारा निर्धारित बफर की मात्रा में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    नोट: एक छोटा सा नमूना HBSS के 250 μL में resuspended है। एक मध्यम नमूना HBSS के 760 μL में पुन: निलंबित है। बड़े और अतिरिक्त बड़े नमूनों को एचबीएसएस के 1460 μL में फिर से निलंबित किया जाता है।
  8. ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके एक जीवित / मृत सेल गिनती के लिए सेल निलंबन का एक एलीकोट लें।
    नोट: एक छोटे से नमूने के लिए, 5 μL का उपयोग करें। एक मध्यम, बड़े या अतिरिक्त-बड़े नमूने के लिए, 10 μL का उपयोग करें। HBSS के साथ 1:10 पतला करें।
    1. 1:40 के अंतिम नमूना कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए 0.4% ट्रिपैन ब्लू के 30 μL के साथ थूक कमजोर पड़ने के 10 μL मिश्रण। एक सेल गिनती के लिए एक hemocytometer के गिनती कक्षों में लोड करें।
      नोट:: यदि सेल संख्याएँ एक सटीक गणना प्राप्त करने के लिए बहुत कम या बहुत अधिक हैं, तो अंतिम कमजोर पड़ने को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है। SECs और मलबे से थूक कोशिकाओं को सही ढंग से अलग करने के लिए Guiot et al.20 से परामर्श करना यहां दृढ़ता से अनुशंसित है। यह एक सटीक सेल गिनती के लिए आवश्यक है।
  9. अतिरिक्त-बड़े नमूने से, कुल से 50 x 106 कोशिकाओं को हटा दें और 1700 μL की कुल मात्रा बनाने के लिए पर्याप्त जोड़े गए HBSS के साथ एक नई ट्यूब में जोड़ें।
    नोट:: यह प्रोटोकॉल के शेष के लिए एक बड़ा नमूना पर विचार करें। बचे हुए नमूनों को छोड़ दिया जा सकता है या अन्य उद्देश्यों के लिए उपयोग किया जा सकता है।

3. एंटीबॉडी और व्यवहार्यता डाई धुंधला

  1. एंटीबॉडी और धुंधला डाई का विकल्प
    नोट:: तालिका 1 एंटीबॉडी और व्यवहार्यता डाई जो इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है और सेल आबादी वे पहचान से पता चलता है।
    1. थूक कोशिकाओं वाली ट्यूबों को लेबल करें (लेबल के लिए तालिका 2 देखें)।
    2. 5 एमएल प्रवाह cytometry ट्यूब (प्रवाह साइटोमीटर के साथ संगत) का उपयोग करें unstained कोशिकाओं और आइसोटाइप नियंत्रण के साथ ट्यूब के साथ नमूना ट्यूब के लिए. रक्त और उपकला ट्यूब के नमूनों के लिए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों का उपयोग करें।
      नोट: इन नमूनों को एंटीबॉडी धुंधला और निर्धारण के बाद प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूबों में स्थानांतरित कर दिया जाएगा।
  2. क्षतिपूर्ति ट्यूबों को लेबल करें (तालिका 3)।
    नोट: 5 एमएल प्रवाह cytometry ट्यूब प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूब ों का उपयोग प्रवाह साइटोमीटर के साथ संगत इस्तेमाल किया जा रहा है.
  3. थूक सेल ट्यूबों और क्षतिपूर्ति ट्यूबों में से प्रत्येक में एचबीएसएस, एंटीबॉडी और / या डाई की मात्रा जोड़ें, जैसा कि क्रमशः तालिका 2 और तालिका 3 में दर्शाया गया है।
    नोट: बफर (HBBS), एंटीबॉडी, और कोशिकाओं या क्षतिपूर्ति मोतियों को जोड़ने से पहले सभी ट्यूबों के लिए डाई जोड़ें यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी ट्यूबों के धुंधला समय सुसंगत है।
  4. परख ट्यूबों के लिए तालिका 2 में सूचीबद्ध थूक सेल मात्रा की मात्रा जोड़ें.
  5. तालिका 3 में सूचीबद्ध के रूप में मुआवजा ट्यूबों के लिए मुआवजा मोतियों जोड़ें।
  6. बर्फ पर सभी ट्यूबों (परख और मुआवजा ट्यूब) incubate, प्रकाश से संरक्षित, 35 मिनट के लिए. फिर, बर्फ-ठंडे HBSS के साथ ट्यूबों को भरें और 800 x g पर 10 मिनट के लिए 4 °C पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. मुआवजे की ट्यूबों के लिए, जितना संभव हो सके छर्रों के करीब supernatant aspirate और ढीले करने के लिए छर्रों झटका।
  8. मुआवजे की ट्यूबों में 0.5 मिलीलीटर ठंडे एचबीएसएस जोड़ें, उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर स्टोर करें और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए आवश्यक होने तक उन्हें प्रकाश से बचाएं।
  9. centrifugation (एंटीबॉडी धुंधला अनुभाग से चरण 3.6) के बाद unstained आइसोटाइप, रक्त, और उपकला ट्यूबों से supernatant aspirate और ट्यूबों flicking द्वारा छर्रों ढीला.

4. 1% Paraformaldehyde (पीएफए) के साथ निर्धारण

  1. ठंडे 1% पीएफए (जिसे अब तक पिघलाया जाना चाहिए) को बिना दाग, आइसोटाइप, रक्त और उपकला ट्यूबों में जोड़ें; बिना दाग और आइसोटाइप ट्यूबों के लिए 2 मिलीलीटर, और रक्त और उपकला ट्यूबों के लिए 10 मिलीलीटर।
  2. बर्फ पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें, 1 घंटे के लिए प्रकाश से संरक्षित। भंवर जल्दी से अधिकतम गति पर 30 मिनट के बाद.
  3. बर्फ-ठंडे HBSS के साथ ट्यूबों को भरें। फिर, 1600 x g पर 10 मिनट के लिए 4 °C पर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब।
  4. सेल गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना supernatant aspirate और कोशिकाओं को ढीला करने के लिए उंगलियों के साथ ट्यूब झटका।
  5. unstained और आइसोटाइप ट्यूबों के लिए ठंडे HBSS के 200 μL जोड़ें।
  6. कुल सेल गिनती के अनुसार रक्त और उपकला ट्यूब के पुन: निलंबन के लिए एचबीएसएस की मात्रा की गणना करें।
    नोट: पुनर्सप्ति आयतन = 0.15 x [कुल सेल गिनती (थूक पृथक्करण का चरण 8) / 106]। एक अतिरिक्त-बड़े नमूने के लिए सेल गणना के रूप में 50 x 106 का उपयोग करें।
  7. सभी नमूना और क्षतिपूर्ति ट्यूबों को स्टोर करें, जो 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर प्रकाश से संरक्षित हैं जब तक कि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण नहीं किया जाता है।
    नोट:: इस प्रोटोकॉल को 24 घंटे से अधिक के लिए संग्रहण के लिए परीक्षण नहीं किया गया है।

5. प्रवाह साइटोमीटर पर डेटा अधिग्रहण

  1. उपयोग किए जा रहे प्रवाह साइटोमीटर के लिए उपयुक्त स्टार्टअप प्रक्रियाओं को लागू करें।
    नोट: प्रोटोकॉल का यह खंड मानता है कि प्रवाह साइटोमीटर का संचालन करने वाले व्यक्ति को उनके लिए उपलब्ध उपकरण के उपयोग में प्रशिक्षित किया जाता है, विशेष रूप से प्रकाशिकी और तरल पदार्थ प्रणालियों की स्थिरता की जांच करने, प्रकाश स्कैटर और प्रतिदीप्ति तीव्रता के मानकीकरण के लिए तकनीकों सहित दैनिक प्रक्रियाओं से संबंधित, साथ ही साथ सही मुआवजा मैट्रिक्स की गणना और लागू करना।
  2. राष्ट्रीय मानक और प्रौद्योगिकी संस्थान (NIST) मोतियों के मिश्रण का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए करें कि आगे स्कैटर और साइड स्कैटर वोल्टेज को अक्षों के बहुत करीब मोतियों को रखे बिना पूरे भूखंड को फैलाने के लिए NIST मोतियों को रखने के लिए सेट किया गया है।
    नोट: यह चरण यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि 5 μm से छोटे मलबे को पोस्ट-अधिग्रहण विश्लेषण को गेटिंग करके समाप्त किया जा सकता है। उपयोग किए जाने वाले प्रवाह साइटोमीटर के आधार पर, ध्यान रखें कि सबसे छोटे मोतियों को दहलीज के साथ बाहर नहीं रखा जा रहा है (एलएसआर II या गीत का उपयोग करते समय) या उच्च भेदभावपूर्ण (Navios EX प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके) के साथ। Navios EX के लिए, 2 के लाभ का उपयोग आगे और साइड स्कैटर के लिए किया गया था, आगे स्कैटर के लिए 236 का वोल्टेज, और साइड स्कैटर के लिए 250। LSR II के लिए, 165 के एक आगे स्कैटर वोल्टेज और 190 के एक साइड स्कैटर वोल्टेज का उपयोग किया गया था।
  3. प्रवाह दर को मध्यम (LSR II) या उच्च (Navios EX) पर सेट करें.
    नोट: अधिकांश उपकरणों के लिए मध्यम या उच्च प्रवाह दर का उपयोग थूक ट्यूबों को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रवाह दर के बहुत धीमी गति से उपयोग करने या नमूने के बहुत पतला होने के परिणामस्वरूप कोशिकाओं का निपटान हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप भंवर में वृद्धि हो सकती है जो वांछित नहीं है। इसलिए, चरण 4.6 में परिकलित पुन: निलंबन वॉल्यूम का पालन करने के परिणामस्वरूप सेलुलर घनत्व होना चाहिए जिसे जल्दी से प्राप्त किया जा सकता है लेकिन मशीन को बंद नहीं किया जा सकता है।
  4. स्कैटर और फ्लोरोसेंट पैरामीटर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक पैरामीटर के लिए वोल्टेज को समायोजित करें ताकि सेल आबादी को पैमाने पर रखा जा सके। तदनुसार वोल्टेज को समायोजित करने के तरीके पर मार्गदर्शन के रूप में गेटिंग रणनीति के साथ आंकड़ों का उपयोग करें।
    नोट:: सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक पैरामीटर पैरामीटर ्स पैरामीटर चयन विंडो में अधिग्रहण से पहले चयनित हैं या वह डेटा अधिग्रहित नहीं किया जाएगा।
  5. पहले बिना दाग वाले थूक के नमूने के लिए डेटा प्राप्त करें, इसके बाद आइसोटाइप-दाग नमूना, और फिर रक्त ट्यूब और उपकला ट्यूब।
    नोट:: यदि सेल निलंबन भी प्रवाह साइटोमीटर clogging के बिना नमूने चलाने के लिए अनुमति देने के लिए केंद्रित है, तो नमूने HBSS के साथ आगे पतला किया जा सकता है।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल को एक नैदानिक प्रयोगशाला सेटिंग को ध्यान में रखते हुए विकसित किया गया था। प्रोटोकॉल के विकास के दौरान ध्यान सादगी, दक्षता और पुनरुत्पादन पर था। यह पाया गया कि थूक के प्रसंस्करण में सबसे अधिक समय लेने वाला कदम कोशिकाओं की गिनती कर रहा था। इसलिए, प्रोटोकॉल को इस तरह से सेट किया जाता है कि थूक प्रसंस्करण और सेल लेबलिंग को समय की हानि के बिना सेल गिनती से स्वतंत्र रूप से किया जा सकता है। एक सटीक सेल गिनती, जो अभी भी एक अबाधित रन के लिए नमूने को उचित रूप से पतला करने के लिए आवश्यक है, फिर एंटीबॉडी लेबलिंग इनक्यूबेशन अवधि के दौरान प्राप्त की जा सकती है।

यह प्रोटोकॉल इष्टतम सेल लेबलिंग के लिए उपयोग करने के लिए कितना एंटीबॉडी / डाई का उपयोग करने के लिए एक संकेत के रूप में एक सेल गिनती के बजाय एक थूक वजन माप का उपयोग करता है। हालांकि, थूक के नमूनों के वजन में भिन्नता की एक बड़ी डिग्री है; विश्लेषण किए गए 126 नमूनों में से, वजन 0.57 ग्राम से 38.30 ग्राम तक था । चित्र 1 ए से पता चलता है कि थूक वजन और सेल उपज के बीच सहसंबंध मजबूत नहीं है। इसलिए, नमूनों को चार श्रेणियों में विभाजित किया गया था; नमूनों का औसत वजन छोटे नमूनों के लिए 2.1 ग्राम, मध्यम नमूनों के लिए 5.0 ग्राम, बड़े नमूनों के लिए 11.2 ग्राम और अतिरिक्त-बड़े नमूनों के लिए 22.0 ग्राम था (चित्रा 1 बी)। हालांकि, अभी भी ऐसे नमूने थे जो अपने वजन (चित्रा 1 सी) के आधार पर अपेक्षा से कहीं अधिक कोशिकाओं को प्राप्त करते थे, अधिकांश नमूने अच्छी तरह से क्लस्टर किए गए थे। छोटे नमूनों के लिए, औसत सेल उपज 8.0 x 106 कोशिकाएं, मध्यम नमूनों के लिए 13.0 x 106, बड़े नमूनों के लिए 35.4 x 106, और अतिरिक्त-बड़े नमूने 93.0 x 106 थी।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक एंटीबॉडी को टाइट्रेट किया गया था। अनुमापन वक्र के उच्चतम धुंधला सूचकांक (चित्रा 2 बी) के साथ पठार चरण (चित्रा 2 ए) पर एक एकाग्रता को काम करने वाली एकाग्रता के रूप में चुना गया था। सेल संख्याओं में भिन्नता नाटकीय रूप से धुंधला तीव्रता को नहीं बदलेगी। यह एंटीबॉडी अनुमापन और परीक्षण आवश्यक है और इस प्रोटोकॉल 34,35 में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक नए एंटीबॉडी या डाई की देखभाल के साथ स्थापित किया जाना चाहिए। जब एक एंटीबॉडी को देखभाल के साथ टिटरेट किया जाता है, तो इसे कोशिकाओं की संख्या की तुलना में 10 से 50 गुना अधिक कोशिकाओं को दागना चाहिए, जिस पर एंटीबॉडी को 34,35 टिटरेट किया गया था। इस सिद्धांत का एक उदाहरण तालिका 4 में दिया गया है। एंटी-ह्यूमन CD45-PE एंटीबॉडी को 400 μL की कुल मात्रा में 1 x 106 कोशिकाओं पर titrated किया गया था। यदि धुंधला मात्रा के लिए इस एंटीबॉडी को प्रोटोकॉल के लिए extrapolated है (तालिका 2 देखें, जो CD45-PE मात्रा और प्रत्येक नमूना आकार के लिए धुंधला मात्रा दिखाता है), एक छोटे से नमूने के लिए, 0.625 x 106 कोशिकाओं को दाग दिया जाएगा, 1.25 x 106 कोशिकाओं को एक मध्यम नमूने के लिए दाग दिया जाएगा, और एक बड़े नमूने के लिए 2.5 x 106 कोशिकाएं (तालिका 4 में कॉलम ए)। प्रत्येक श्रेणी के लिए सेल संख्या में 50 गुना अधिक की गणना क्रमशः 31.25 x 106, 62.5 x 106 और 125 x 106 कक्षों के रूप में की जाती है, क्रमशः (कॉलम बी)। जैसा कि कॉलम C और D में दिखाया गया है, प्रत्येक आकार श्रेणी की माध्यिका कक्ष संख्या और प्रत्येक श्रेणी में सबसे बड़ा नमूना 50-गुना सीमा के भीतर अच्छी तरह से हैं।

थूक के नमूनों के विभिन्न आकारों के बीच आकार और सेल उपज में स्पष्ट अंतर के बावजूद, प्रत्येक श्रेणी में औसत प्रतिशत एसईसी संदूषण बहुत समान है। चित्रा 3A व्यक्तिगत नमूनों में पाए जाने वाले एसईसी के प्रतिशत को दर्शाता है, जो उनके थूक वजन श्रेणी के अनुसार स्तरीकृत होता है। मुख्य चिंता एसईसी के साथ थी क्योंकि ये कोशिकाएं फेफड़ों के ऊतकों के प्रतिनिधि नहीं हैं, बल्कि मौखिक गुहा की हैं। हालांकि, औसत एसईसी संदूषण सभी श्रेणियों के लिए 20% से कम है। चित्रा 3B इन नमूनों में पाए जाने वाले व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत को दर्शाता है। एसईसी को छोड़कर, छोटे, मध्यम और बड़े नमूना आकार श्रेणियों के लिए औसत व्यवहार्यता लगभग 72% थी। यह अतिरिक्त-बड़ी श्रेणी के लिए थोड़ा अधिक (79%) था।

चित्रा 4 मलबे, मृत कोशिकाओं (जिसमें दूषित SECs36 भी शामिल है) से ब्याज की थूक कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विशिष्ट गेटिंग रणनीति दिखाता है, और सेल clumps। चित्रा 4A 5 μm से छोटे या 30 μm से बड़े मलबे को खत्म करने के लिए गेट सेट करने के लिए NIST मोतियों के उपयोग को दर्शाता है, जबकि चित्रा 4B थूक कोशिकाओं पर इस गेट को लागू करता है। चित्रा 4C एक विशिष्ट थूक प्रोफ़ाइल दिखाता है जब साइड स्कैटर चौड़ाई (SSC-W) के रूप में देखा जाता है, तो आगे स्कैटर चौड़ाई (FSC-W), चौड़ाई गेट के खिलाफ। इस प्रोफ़ाइल का उपयोग छोटे मलबे को खत्म करने के लिए किया जाता है जो एसएससी-डब्ल्यू और एफएससी-डब्ल्यू अक्षों के साथ खुद को प्रस्तुत करता है। मृत कोशिकाओं के उन्मूलन को चित्र 4D और चित्र 4E में दिखाया गया है। Unstained नियंत्रण (चित्रा 4D) FVS510 सकारात्मकता के लिए कट-ऑफ निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है; नकारात्मक नियंत्रण के ऊपर FVS510 के लिए सकारात्मक दाग कोशिकाओं को मृत माना जाता है और थूक सेल विश्लेषण (चित्रा 4E) में उपयोग नहीं किया जाएगा। अंत में, विश्लेषण से सेल डबल्स को हटाने के लिए एक सिंगल गेट लागू किया जाता है, जिसे चित्र 4 एफ में दिखाया गया है। इस प्रकार, जिन कोशिकाओं ने इसे चित्र 4B, चित्रा 4C, चित्रा 4E और चित्रा 4F में दिखाए गए चयन द्वारों के माध्यम से बनाया है, वे इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के साथ बाद के विश्लेषण के लिए तैयार लाइव, एकल थूक कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं।

इस लेबलिंग प्रोटोकॉल में एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी का उपयोग रक्त (सीडी 45 +) सेल डिब्बे और एक गैर-रक्त (सीडी 45-) सेल डिब्बे में लाइव, एकल थूक कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देता है। उत्तरार्द्ध श्रेणी में उपकला कोशिकाएं और अन्य गैर-रक्त कोशिकाएं शामिल हैं। चित्रा 5A में शीर्ष प्रोफ़ाइल CD45 सकारात्मकता के लिए कट-ऑफ सेट करने के लिए एक अप्रकाशित थूक के नमूने के उपयोग को दर्शाता है, CD45+ कोशिकाओं और CD45- कोशिकाओं को कैप्चर करने के लिए गेट्स को प्रस्तुत करता है। चित्रा 5A के नीचे प्रोफ़ाइल से पता चलता है कि इन दोनों फाटकों को एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी के साथ दाग वाले थूक के नमूने पर लागू किया गया है। अतिरिक्त एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने का उपयोग तब सीडी 45 + गेट (चित्रा 5 बी) और अन्य गैर-रक्त कोशिका आबादी के भीतर रक्त कोशिका-विशिष्ट आबादी की पहचान करने के लिए किया जाता है, जिसमें सीडी 45- गेट (चित्रा 5 सी) में उपकला आबादी शामिल है। दोनों आंकड़ों में, शीर्ष प्रोफाइल दिखाते हैं कि डबल नकारात्मक आबादी को सेट करने के लिए आइसोटाइप-दाग वाले थूक का उपयोग कैसे किया जाता है, जबकि नीचे की प्रोफाइल एंटीबॉडी-दागदार थूक कोशिकाओं को दिखाती है। चित्रा 5B (नीचे) छह अलग-अलग CD45+ सेल आबादी को प्रतिदीप्ति (FL) 1 चैनल (एंटी-CD66b, CD3, CD19 एंटीबॉडी) और FL3 चैनल में पता लगाने योग्य एंटी-CD206 में पता लगाने योग्य एंटीबॉडी के कॉकटेल के साथ बनाया गया है। सॉर्टिंग प्रयोगों से पता चला है कि फेफड़ों के विशिष्ट मैक्रोफेज एम के साथ पहचाने जाने वाले द्वारों में रहते हैं। इन फाटकों में कोशिकाओं की उपस्थिति इस प्रकार इंगित करती है कि थूक का नमूना फेफड़ों से लिया गया था और लार नहीं था (बेडरका एट अल। चित्रा 5C (नीचे) विरोधी पैन-साइटोकेराटिन (panCK) FL1 चैनल और विरोधी उपकला सेल आसंजन अणु (EpCAM) एंटीबॉडी CD45- थूक कोशिकाओं के बीच FL3 चैनल में पता लगाने योग्य एंटीबॉडी में पता लगाने योग्य के साथ बनाई गई गेटिंग चतुर्भुज से पता चलता है।

इस लेबलिंग प्रोटोकॉल को बड़े पैमाने पर Navios EX और LSR II पर परीक्षण किया गया है। कुछ प्रारंभिक प्रयोगों गीत पर प्रदर्शन किया गया था, लेकिन व्यापक साधन अनुकूलन है कि अन्य दो मशीनों के लिए किया गया था के बिना. इसलिए, विस्तृत साधन सेटिंग्स Navios पूर्व और सामग्री शीट में LSR द्वितीय के लिए प्रदान की जाती हैं, लेकिन गीत के लिए नहीं। इन तीन प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफार्मों के बीच समानताओं और भिन्नताओं को समझने के लिए जिनका उपयोग थूक कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, विभिन्न मशीनों से प्राप्त प्रोफाइल की तुलना चित्र 6 और चित्रा 7 में की जा सकती है। दो बड़े थूक के नमूनों को संसाधित किया गया, पूल किया गया, लेबल किया गया, तीन बराबर भागों में विभाजित किया गया, और बाद में ऊपर उल्लिखित प्रत्येक प्रवाह साइटोमीटर पर अधिग्रहित किया गया। चित्रा 6, जो चित्रा 4 के समान है, मलबे, मृत कोशिकाओं और सेल clumps को खत्म करने के लिए गेटिंग रणनीति की तुलना करता है। चित्रा 7, जो चित्रा 5 के समान है, विभिन्न प्रवाह साइटोमीटर पर प्राप्त डेटा से रक्त और गैर-रक्त प्रोफाइल की तुलना करता है।

तीन अलग-अलग प्रवाह साइटोमीटर से प्राप्त विभिन्न प्रोफाइल की तुलना करने से पता चलता है कि प्रत्येक उपकरण के साथ एक ही मूल प्रोफाइल देखा जा सकता है। ध्यान देने के लिए अंतर एसएससी-डब्ल्यू / एफएससी-डब्ल्यू (चौड़ाई गेट) भूखंड (चित्रा 6, दूसरी पंक्ति) और स्कैटर भूखंडों के रैखिक तराजू (आंकड़े 6 और 7) हैं। Navios EX पर उत्पन्न स्कैटर चौड़ाई प्लॉट एक समावेश द्वार (लाल बॉक्स) दिखाता है, जिसका अर्थ है कि गेट में शामिल सभी कोशिकाओं का आगे विश्लेषण किया जाता है; बाएँ-नीचे कोने में अक्षों के साथ घटनाओं को बाहर रखा गया है। LSR II पर तितर बितर चौड़ाई भूखंडों, और गीत इन एक ही अक्षों के साथ घटनाओं की एक समान जमा नहीं दिखाते हैं। यह विसंगति नेवियोस ईएक्स पर उपयोग की जाने वाली बहुत संवेदनशील दहलीज के कारण होने की संभावना है, जिससे पिछले आकार-बहिष्करण गेट ( चित्रा 6 की शीर्ष पंक्ति) में कुछ छोटे मलबे की ओर जाता है। अवसर पर, मलबे को LSRII पर उत्पन्न स्कैटर चौड़ाई प्रोफ़ाइल में कुल्हाड़ियों के साथ देखा जाता है, लेकिन यह दाएं-नीचे के कोने में है। उन मामलों में, एक बहिष्करण गेट (जैसा कि चित्रा 6 की पंक्ति 2 में मध्य प्रोफ़ाइल में धराशायी लाल बॉक्स द्वारा इंगित किया गया है) का उपयोग इन घटनाओं को आगे के विश्लेषण से समाप्त करने के लिए किया जाता है।

जबकि लॉग तराजू Navios EX और गीत और LSR II साइटोमीटर के बीच भूखंडों पर थोड़ा अलग दिखाई देते हैं, Navios EX के पास अधिक दशकों का उपयोग करके डेटा प्राप्त करने का विकल्प है। अधिक दशकों को लागू करना प्रयोग के संदर्भ और ब्याज की आबादी की कल्पना करने के लिए वांछित संवेदनशीलता पर निर्भर करता है।

Navios EX और LSR II और Lyric cytometers के बीच एक अतिरिक्त उल्लेखनीय अंतर singlet गेट की प्रोफ़ाइल की उपस्थिति है। Navios EX साइटोमीटर LSR II की तुलना में एक अलग संग्रह कोण के साथ एक आयताकार प्रवाह सेल से सुसज्जित है। Navios EX में तीन सॉफ़्टवेयर-नियंत्रित संग्रह कोण शामिल हैं जो विश्लेषण करने के लिए कण आकार के लिए उपयुक्त संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए आगे के कोण प्रकाश स्कैटर को अनुकूलित करते हैं। Navios EX साइटोमीटर के लिए बहुभुज गेट को LSRII के लिए singlet गेट की तुलना में थोड़ा कम कोण में समायोजित करने की आवश्यकता होगी। गीत के लिए singlet गेट को LSR II के साथ देखे जाने वाले प्रोफ़ाइल के समान प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। थूक के नमूने का उपयोग करते हुए, क्षेत्र स्केलिंग कारक को एलएसआर II के समान एक सिंगल गेट प्राप्त करने के लिए गीत पर प्रत्येक लेजर के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी।

चित्रा 4 से चित्रा 7 में दिखाए गए सभी प्रोफाइल का विश्लेषण FlowJo सॉफ़्टवेयर, संस्करण 10.6 के साथ किया गया था। .fcs फ़ाइलें FlowRepository (https://flowrepository.org) में ID FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ, और FR-FCM-Z3MM के तहत पाई जा सकती हैं और इन आंकड़ों में सचित्र के रूप में थूक विश्लेषण का अभ्यास करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: थूक वजन और सेल उपज। (ए) चित्रित थूक वजन के बीच का संबंध है, जो प्रसंस्करण से पहले निर्धारित किया जाता है, और कुल सेल उपज, एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके प्रसंस्करण के बाद निर्धारित किया जाता है। प्रत्येक बुलेट एक व्यक्तिगत नमूने का प्रतिनिधित्व करता है, कुल मिलाकर 126। (बी) थूक के नमूनों को उनके वजन के आधार पर चार श्रेणियों में स्तरीकृत किया गया था: 3 ग्राम तक वजन वाले नमूनों के लिए छोटे, 8 ग्राम तक 3 ग्राम से अधिक वजन के नमूनों के लिए मध्यम, 8 ग्राम से अधिक वजन वाले नमूनों के लिए बड़े, 16 ग्राम तक 8 ग्राम से अधिक वजन वाले नमूनों के लिए बड़े, और 16 ग्राम से अधिक वजन वाले लोगों के लिए अतिरिक्त बड़े नमूने (सी) दिखाया गया है प्रत्येक श्रेणी में नमूनों के लिए सेल उपज का वितरण। (B) और (C) में लाल सलाखों प्रत्येक श्रेणी में माध्यिका मानों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: विरोधी मानव CD45-PE के लिए एंटीबॉडी अनुमापन. (ए) CD45-PE (IgG1) अनुमापन वक्र सकारात्मक आबादी की माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) के साथ 1 μg/mL पर CD45-PE एंटीबॉडी पठारों की सांद्रता बनाम प्लॉट किया गया है। (बी) एंटीबॉडी एकाग्रता बनाम धुंधला सूचकांक को दर्शाने वाले अनुमापन वक्र से पता चलता है कि उच्चतम धुंधला सूचकांक 1 μg / mL पर है। स्टेनिंग इंडेक्स की गणना इस रूप में की गई थी: [CD45 MFI सकारात्मक जनसंख्या - CD45 MFI नकारात्मक जनसंख्या] / [2 * मानक विचलन]। चित्रा 2A और चित्रा 2B के आधार पर, 1 μg / mL को CD45-PE एंटीबॉडी के लिए इष्टतम एकाग्रता के रूप में चुना गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: थूक के नमूनों में SECs और मृत कोशिकाओं का अनुपात चार वजन श्रेणियों के बीच संगत है। (A) थूक के नमूनों में SECs के अनुपात को उनके वजन श्रेणी के अनुसार वर्गीकृत किया गया है। प्रतिशत एसईसी संदूषण कुल सेल गिनती के हिस्से के रूप में हेमोसाइटोमीटर द्वारा निर्धारित किया गया था। (बी) एसईसीएस को छोड़कर थूक के नमूनों की सेल व्यवहार्यता, हेमोसाइटोमीटर और ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण विधि द्वारा निर्धारित की जाती है। प्रत्येक ग्राफ के लिए, लाल रेखाएं माध्यिका मानों का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक थूक के नमूने में मलबे, मृत कोशिकाओं, और doublets को बाहर करने के लिए गेटिंग रणनीति। (ए) 5 μm, 20 μm, और 30 μm आकार के NIST मोतियों का उपयोग लाल बॉक्स द्वारा इंगित गेट को सेट करने के लिए किया गया था ताकि 5 μm से छोटे मलबे और 30 μm से ऊपर और अक्ष के करीब मलबे को बाहर किया जा सके। (बी) एक थूक का नमूना आगे और साइड स्कैटर के लिए एक ही वोल्टेज का उपयोग करके प्राप्त किया गया था जैसा कि एनआईएसटी मोतियों का है। (ए) में बनाए गए गेट को मलबे को बाहर करने के लिए लागू किया गया था। (सी) अक्ष के करीब छोटे मलबे को इस स्कैटर चौड़ाई भूखंड में बाहर रखा गया था। (डी) व्यवहार्यता डाई के लिए नकारात्मक, बिना दाग वाली आबादी के लिए कट-ऑफ (लाल रेखा) सेट करने के लिए एक बिना दाग वाले थूक के नमूने का उपयोग किया गया था। (ई) डी में बनाए गए कट-ऑफ को लाइव, व्यवहार्य कोशिकाओं को शामिल करने के लिए एक गेट (लाल बॉक्स) बनाने के लिए दागदार थूक के नमूने पर लागू किया गया था। (एफ) लाल बहुभुज द्वारा इंगित सिंगल गेट उन कोशिकाओं को बाहर करता है जो विकर्ण पर नहीं गिरते हैं, डबल्स और / या क्लंप को समाप्त करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र5: थूक कोशिकाओं की रक्त और गैर-रक्त कोशिका डिब्बों में गेटिंग रणनीति। (A) सिंगल गेट से व्युत्पन्न बिना दाग वाले थूक कोशिकाओं का उपयोग CD45 (शीर्ष) के लिए नकारात्मक आबादी पर कट-ऑफ (लाल रेखा) सेट करने के लिए किया जाता है। शीर्ष प्रोफ़ाइल से कट-ऑफ को CD45 सकारात्मक (CD45+) और नकारात्मक आबादी (CD45-) को अलग करने के लिए दागदार थूक के नमूने (नीचे) पर लागू किया जाता है। (बी) FITC / AF488 के लिए आइसोटाइप एंटीबॉडी के साथ सना हुआ CD45 + थूक कोशिकाओं का उपयोग नकारात्मक आबादी (शीर्ष) पर गेट सेट करने के लिए किया जाता है। एक ही गेट CD45 + थूक कोशिकाओं के लिए रक्त कोशिका मार्करों CD3, CD19, CD66b, और CD206 (नीचे) के साथ सना हुआ करने के लिए लागू कर रहे हैं। (सी) चतुर्थांश गेट्स को सीडी 45- थूक कोशिकाओं पर रखा जाता है जो आइसोटाइप नियंत्रण (शीर्ष) के साथ सना हुआ होता है और उपकला मार्कर पैन-साइटोकेराटिन (पैनकेके) और ईपीसीएएम (नीचे) के साथ दागदार थूक के नमूने से सीडी 45- कोशिकाओं पर लागू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: तीन प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफार्मों पर मलबे, clumps, और दाग थूक कोशिकाओं की मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए गेटिंग रणनीति। दो बड़े थूक के नमूनों को संसाधित किया गया, पूल किया गया, लेबल किया गया, और Navios EX (A), LSR II (B), और Lyric (C) प्रवाह साइटोमीटर पर अधिग्रहण के लिए तीन बराबर भागों में विभाजित किया गया। शीर्ष पंक्ति: थूक के नमूनों को बहुत छोटे और बड़े मलबे को बाहर करने के लिए गेटेड (लाल बॉक्स) किया गया था। दूसरी पंक्ति: Navios EX प्लॉट में बड़ा लाल बॉक्स एक समावेशन गेट का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें कोशिकाएं शामिल हैं लेकिन मलबे को शामिल नहीं करता है। LSR II प्लॉट में देखा गया धराशायी छोटा लाल बॉक्स आगे के विश्लेषण से मलबे को खत्म करने के लिए एक बहिष्करण गेट का प्रतिनिधित्व करता है। गीत के साथ आगे अनुकूलन यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक है कि मलबे बहिष्करण गेटिंग की आवश्यकता कहां है। इसलिए उस प्लॉट में कोई गेट मौजूद नहीं है। तीसरी पंक्ति: लाल आयताकार फाटकों में आगे के विश्लेषण के लिए लाइव कोशिकाएं शामिल हैं। निचली पंक्ति: बहुभुज गेट में गेट के विकर्ण के बाहर गिरने वाले डबल्स को छोड़कर एकल कोशिकाएं होती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: तीन प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफार्मों पर रक्त और उपकला मार्करों के लिए दागदार थूक के लिए गेटिंग रणनीति। चित्र 6 में दिखाया गया विश्लेषण चित्र 7 में जारी रखा गया है; सभी व्यवहार्य, एकल कोशिकाओं (नीचे की पंक्ति, चित्रा 6) को CD45+ और CD45- आबादी (पहली पंक्ति, चित्रा 7) में विभाजित किया गया था, ताकि रक्त कोशिका-विशिष्ट मार्कर और उपकला सेल-विशिष्ट मार्कर इन आबादी को और अधिक चित्रित कर सकें। दूसरी पंक्ति: CD45+ कोशिकाओं से रक्त कोशिका मार्करों CD3/CD19/CD66b और CD206 की प्रोफ़ाइल. तीसरी पंक्ति: उपकला सेल मार्करों panCK और CD45- कोशिकाओं से EpCAM. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एंटीबॉडी / दाग लक्ष्य
FVS510 व्यवहार्यता दाग
विरोधी मानव CD45 - पीई पैन-ल्यूकोसाइट मार्कर;  पीई क्षतिपूर्ति
विरोधी मानव CD66b - FITC ग्रैनुलोसाइट्स मार्कर
विरोधी मानव CD3 - Alexa488 टी सेल मार्कर
विरोधी मानव CD19 - Alexa488 बी सेल मार्कर; FITC/Alexa488 मुआवजा
विरोधी मानव CD206 - पीई-CF594 फेफड़े के मैक्रोफेज मार्कर;  पीई-CF594 मुआवजा
विरोधी मानव EpCAM - पीई-CF594 उपकला सेल मार्कर;  पीई-CF594 मुआवजा
एंटी-ह्यूमन पैन-साइटोकेराटिन (पैनके) - एलेक्सा488 उपकला सेल मार्कर
IgG1π – Alexa488 CD3/CD19/panCK आइसोटाइप नियंत्रण
IgG1π – FITC CD66b आइसोटाइप नियंत्रण
IgG1π – PE-CF594 CD206/EpCAM आइसोटाइप नियंत्रण
विरोधी मानव CD45 - BV510 FVS510 मुआवजा

तालिका 1: एंटीबॉडी और व्यवहार्यता दाग का उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी और व्यवहार्यता डाई की सूची। संकेतित सेलुलर सबसेट हैं जिन्हें वे प्रत्येक पहचानते हैं।

ट्यूब (लेबल) नमूना आकार * HBSS (μL) FVS510 (μL) CD45 (μL) अन्य एंटीबॉडी (μL) कोशिकाएं § (μL)
बिना दाग के छोटा 80 20
मध्यम 50 50
विशाल 50 50
IgG1π - Alexa488 IgG1π- FITC IgG1π - PE-CF594
आइसोटाइप नियंत्रण छोटा 60.65 0.6 10 2 6 0.75 20
मध्यम 30.65 0.6 10 2 6 0.75 50
विशाल 30.25 1 10 2 6 0.75 50
CD206 CD3 CD19 CD66b
रक्त छोटा 92.875 1.5 25 1.875 5 1.25 7.5 115
मध्यम 65.75 3 50 3.75 10 2.5 15 350
विशाल 102.5 10 100 7.5 20 5 30 725
EpCAM PanCK
उपकला छोटा 96.5 1.5 25 10 2 115
मध्यम 73 3 50 20 4 350
विशाल 117 10 100 40 8 725
* नमूनों को प्रोटोकॉल के थूक पृथक्करण अनुभाग के चरण 1 में निर्धारित वजन के आधार पर छोटा, मध्यम या बड़ा माना जाता है।
§ सभी अभिकर्मकों को वितरित किए जाने के बाद कोशिकाओं को जोड़ा जाना चाहिए, जिसमें मुआवजा ट्यूब (तालिका 3) में शामिल हैं।

तालिका 2: थूक कोशिकाओं के साथ ट्यूबों की सामग्री। उपयुक्त नमूना आकार के लिए एंटीबॉडी और व्यवहार्यता दाग के निर्दिष्ट वॉल्यूम जोड़ने के लिए प्रोटोकॉल में संदर्भित के रूप में इस तालिका का उपयोग करें।

ट्यूब (लेबल) अभिकर्मक जोड़े गए (μL) अभिकर्मकों जोड़ा गया (ड्रॉप)
HBSS CD45-PE CD206-PE-CF594 EpCAM-PE-CF594 CD19-Alexa488 CD45-BV510 CompBead (+) CompBead * (-)
पीई कॉम्प। 76 4 x x x x 1 1
पीई-CF594 comp. 72 x 4 4 x x 1 1
Alexa488/FITC comp. 60 x x x 20 x 1 1
BV510 comp. 60 x x x x 20 1 1
* सकारात्मक (+) और नकारात्मक (-) मोतियों को सभी अभिकर्मकों को वितरित किए जाने के बाद जोड़ा जाना चाहिए और तालिका 2 में ट्यूबों को तैयार किया गया है।
comp. = मुआवजा

तालिका 3: क्षतिपूर्ति ट्यूबों की सामग्री। क्षतिपूर्ति मोतियों के लिए एंटीबॉडी के निर्दिष्ट वॉल्यूम जोड़ने के लिए प्रोटोकॉल में संदर्भित के रूप में इस तालिका का उपयोग करें।

कक्ष संख्या (x 106)
एक B C D
नमूना आकार धुंधला मात्रा में * 50 गुना पहुँच माध्यिका नमूना (गुना पहुँच) # सबसे बड़ा नमूना (गुना पहुँच) #
छोटा 0.625 31.25 8.0 (12.8) 24.77 (39.6)
मध्यम 1.25 62.5 13.0 (10.4) 48.87 (39.1)
विशाल 2.5 125 35.4 (14.2) 113.5 (45.4)
* प्रोटोकॉल (तालिका 2) में इस्तेमाल किया मात्रा धुंधला.  सेल संख्या को इस बात से एक्सट्रपलेटेड किया जाता है कि अनुमापन वक्र कैसे किया गया था; CD45-PE के 1 μg/mL और प्रति 200 μL 1 x 106 कोशिकाएं।
कॉलम ए में सेल नंबरों की 50 गुना पहुंच।
# स्तंभ C और D में गुना पहुँच स्तंभ C या D के कक्षों में प्रस्तुत संख्या को स्तंभ A में संगत कक्ष में संख्या से विभाजित करके परिकलित की जाती है.

तालिका 4: प्रत्येक नमूना आकार श्रेणी में सभी नमूनों के लिए एंटी-ह्यूमन CD45-PE एकाग्रता।

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Discussion

थूक की सेलुलर सामग्री में व्यापक कोशिकाओं की एक बड़ी विविधता शामिल है, जो अक्सर बहुत सारे मलबे के साथ होती है37। इसके अलावा, थूक विश्लेषण के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण की आवश्यकता होती है जो पुष्टि करता है कि नमूना मौखिक गुहा 38 के बजाय फेफड़ों से एकत्र किया गया है। इसलिए, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा थूक का विश्लेषण करना उतना आसान नहीं है जितना कि यह रक्त के लिए है, उदाहरण के लिए, जो बहुत अधिक क्लीनर और सजातीय सेल निलंबन जारी करता है। इस प्रोटोकॉल ने इन सभी मुद्दों को संबोधित किया है: यह सुनिश्चित करने के लिए विशिष्ट आकार के मोतियों का उपयोग करके उपकरण सेटिंग्स प्रदान करना कि सबसे छोटी और सबसे बड़ी सेल आबादी दोनों का पता लगाया जा सकता है, मलबे, सेल क्लंप्स को खत्म करने के लिए एक गेटिंग रणनीति, एसईसी और अन्य मृत कोशिकाओं को दूषित करना, और अंत में, थूक का नमूना सुनिश्चित करने के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण उपाय ज्यादातर लार होने के बजाय फेफड़ों से है।

थूक के साथ काम करने में प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं जो इंगित करने के लायक हैं। सबसे पहले, सेल उपज को प्रोटोकॉल के थूक पृथक्करण भाग के चरण 2.5 में उपयोग किए जाने वाले नायलॉन सेल स्ट्रेनर्स की संख्या से काफी प्रभावित किया जा सकता है। छलनी के क्लॉगिंग के कारण बहुत अधिक कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए कई छलनी की आवश्यकता हो सकती है। जब छलनी के माध्यम से प्रवाह काफी धीमा हो गया है, तो एक नए छलनी का उपयोग किया जाना चाहिए। दूसरा, थूक के नमूनों की कोशिका गोली बहुत ढीली हो सकती है, खासकर यदि एसईसी का उच्च संदूषण है। इसलिए, नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करने के बाद supernatant को हटाने पर गोली के बहुत करीब aspirate नहीं करना आवश्यक है। गोली के बहुत करीब aspirating सेल हानि में परिणाम हो सकता है, अगर पूरे गोली का नुकसान नहीं है. तीसरा, इस प्रोटोकॉल के लिए एक निर्धारण चरण की आवश्यकता होती है। यह कोशिकाओं और उनके धुंधला प्रोफ़ाइल को संरक्षित करता है और प्रवाह साइटोमीटर ऑपरेटर की रक्षा के लिए एक सुरक्षा उपाय के रूप में कार्य करता है। कुछ प्रवाह साइटोमीटर पर चलने वाले नमूने एयरोसोल उत्पादन की क्षमता के कारण बढ़े हुए जैविक खतरों को प्रस्तुत कर सकते हैं39। पीएफए निर्धारण थूक के नमूने में संभावित रोगजनकों से ऑपरेटर की रक्षा करने में मदद करता है। चौथा, और शायद प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए थूक के नमूनों को तैयार करने का सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू, सेल गिनती है। थूक में मौजूद सेल प्रकारों की बड़ी विविधता के कारण सेल की गिनती जटिल है। गिनती मशीनें अक्सर सेल आकार सीमा द्वारा सीमित होती हैं जो वे कैप्चर कर सकते हैं और इसलिए हेमोसाइटोमीटर की तुलना में कम विश्वसनीय होते हैं। हालांकि, हेमोसाइटोमीटर द्वारा थूक के नमूनों की सेल गिनती, जिसे Guiot et al.20 द्वारा उत्कृष्ट रूप से वर्णित किया गया है, थकाऊ है और कुशल बनने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है। एक सटीक सेल संख्या एक उचित प्रवाह दर के लिए अनुमति देने और प्रवाह साइटोमीटर में क्लॉग को रोकने के लिए नमूने की अंतिम पुनरावृत्ति मात्रा को निर्धारित करने में महत्वपूर्ण है। थूक में बहुत बड़े एसईसी की उपस्थिति और कई छोटे सेल clumps जो पृथक्करण बफर द्वारा टूटे नहीं जाते हैं, न ही फिल्टर द्वारा पकड़े जाते हैं, प्रवाह साइटोमीटर को अवरुद्ध करने की संभावना को बढ़ाते हैं। इसलिए, उपलब्ध प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण के लिए सर्वोत्तम सेल एकाग्रता / प्रवाह दर का निर्धारण करने में कुछ समय बिताने की सिफारिश की जाती है। इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि प्रवाह साइटोमीटर में उपयुक्त प्रवाह सेल और नोजल आकार (या जांच) है जो थूक में मौजूद बड़ी कोशिका आबादी को मापने में सक्षम है।

यहां तक कि जब सेल गिनती में प्रवीणता हासिल की गई है, तब भी यह एक समय लेने वाली प्रक्रिया है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में सेल लेबलिंग के लिए अभिकर्मकों का निर्धारण सेल संख्या के बजाय नमूना आकार (जैसा कि वजन से आंका जाता है) पर आधारित है। यह समय के अधिक कुशल उपयोग के लिए अनुमति देता है क्योंकि मैनुअल सेल गिनती एंटीबॉडी और व्यवहार्यता डाई धुंधला के लिए आवश्यक समय के दौरान पूरी की जा सकती है। हालांकि, इसके लिए तीन उल्लेखनीय अपवाद हैं। यदि एक नमूना >16 ग्राम (तथाकथित अतिरिक्त-बड़े नमूने) है, तो मैनुअल सेल की गिनती को धुंधला होने से पहले होना चाहिए ताकि महंगे अभिकर्मकों को रक्त और उपकला ट्यूबों के लिए केवल 25 x 106 कोशिकाओं को धुंधला करके संरक्षित किया जा सके। यह कक्ष संख्या इस प्रोटोकॉल में वर्णित सेटिंग्स में बहुत विश्वसनीय प्रोफ़ाइल देती है. एक और संभावित अपवाद एक बहुत छोटे नमूने का मामला है। अनुमान यह है कि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए न्यूनतम 1-2 x 106 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है जैसा कि विश्वसनीय प्रोफाइल (डेटा नहीं दिखाया गया है) उत्पन्न करने के लिए इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया गया है। इसलिए, यदि किसी नमूने में 1-2 x 106 से कम कोशिकाएं होती हैं, तो यह प्रक्रिया के साथ जारी रखने के लायक नहीं हो सकता है क्योंकि अंतिम परिणाम संभवतः अस्वीकार्य होगा।

विशिष्ट लेबलिंग अभिकर्मक जो परिधीय रक्त कोशिकाओं या सेल लाइनों पर अच्छी तरह से काम करते हैं, थूक (अप्रकाशित टिप्पणियों) में निहित रक्त कोशिकाओं पर बहुत अलग तरीके से काम कर सकते हैं। इसलिए, प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोगों में उपयोग किए जाने से पहले अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल 34,35 के अनुसार प्रत्येक एंटीबॉडी या अन्य लेबलिंग अभिकर्मकों को टिटरेट करने की सिफारिश की जाती है। अधिकांश एंटीबॉडी अनुमापन को तुलनीय परिणाम देना चाहिए जब 10 से 50 गुना तक धुंधला हो जाता है; हालांकि, यह सलाह दी जाती है कि उस श्रेणी 34 से अधिक सेल संख्याओं के साथ अतिरिक्त अनुमापन करें। जब एक अभिकर्मक एकाग्रता निर्धारित की गई है, तो उस अभिकर्मक के इनक्यूबेशन समय को वास्तविक प्रयोग के समान रखना आवश्यक है। उस कारण से, प्रोटोकॉल कोशिकाओं या क्षतिपूर्ति मोतियों को जोड़ने से पहले ट्यूबों में सभी बफर और अभिकर्मकों को जोड़ने पर जोर देता है। अभिकर्मकों और कोशिकाओं / मोतियों को एक साथ जोड़ने का यह क्रम लेबलिंग समय में उच्च स्थिरता के लिए अनुमति देता है। यदि, किसी कारण से, प्रयोगात्मक इनक्यूबेशन समय को एंटीबॉडी / डाई अनुमापन के लिए उपयोग किए जाने वाले समय के समान नहीं रखा जा सकता है, तो उत्तरार्द्ध को एक इनक्यूबेशन समय के साथ दोहराया जाना चाहिए जो प्रयोगों के दौरान संभव है।

थूक के नमूनों को व्यापक रूप से फेफड़ों को प्रभावित करने वाली विभिन्न बीमारियों के पैथोफिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए नैदानिक नमूने के रूप में उपयोग किया गया है। तपेदिक 40,41, सीओपीडी 13,42, अस्थमा 43, सिस्टिक फाइब्रोसिस 44,45, फेफड़ों के कैंसर 46,47,48, और संधिशोथ 49 कई बीमारियों में से हैं जहां थूक का अध्ययन गैर-आक्रामक रूप से प्राप्त नमूना होने के लाभ के कारण किया गया है। हाल ही में, कोरोनोवायरस महामारी के दौरान, थूक का उपयोग कोरोनोवायरस रोग 2019 (कोविड -19) 50 के साथ अस्पताल में भर्ती रोगियों में लंबे समय तक वायरल शेडिंग का पता लगाने के लिए किया गया है।

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर), प्रोटीन विश्लेषण, माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री सहित विभिन्न प्रौद्योगिकियों का उपयोग थूक में रोग-विशिष्ट मार्करों की पहचान करने के लिए किया गया है। थूक के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म का उपयोग व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया जाता है, लेकिन इसका उपयोग बढ़ जाता है। फ्लो साइटोमीटर 3,51,52 की तकनीक में हाल ही में प्रगति के साथ-साथ फ्लोरोफोर के रसायन विज्ञान में प्रगति, नए एंटीबॉडी क्लोन की पीढ़ी, और मृत कोशिका आबादी की पहचान करने के लिए विभिन्न रंगों के विकास 51,53,54, मानव रोगों का निदान करने के उद्देश्य से एंटीबॉडी पैनलों को डिजाइन करने की संभावना नाटकीय रूप से बढ़ गई है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमेट्रिक डेटा 55,56 के विश्लेषण को स्वचालित करने के लिए हाल ही में धक्का मैन्युअल रूप से पढ़ने और प्रवाह डेटा की व्याख्या करने में संभावित पूर्वाग्रह को समाप्त कर देगा। प्रवाह साइटोमेट्री में ये नए विकास नैदानिक नैदानिक के रूप में थूक की खोज को काफी सुविधाजनक बनाएंगे।

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Disclosures

सभी लेखक bioAffinity Technologies के अतीत या वर्तमान कर्मचारी हैं।

Acknowledgments

हम आंकड़े की तैयारी के साथ उनकी सहायता के लिए डेविड रोड्रिगेज को धन्यवाद देना चाहते हैं। थूक के नमूने यूटी हेल्थ सैन एंटोनियो फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन सुविधा में बीडी एलएसआर II पर चलाए गए थे, जो यूटी हेल्थ, एनआईएच-एनसीआई पी 30 सीए054174-20 (यूटी हेल्थ में सीटीआरसी) और यूएल 1 टीआर 001120 (सीटीएसए अनुदान) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix Polysciences 25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 Fisher Scientific 08-771-19
3 M NaOH EMD SX0593-1
50 mL conical falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
Alexa488 anti-human CD19 BioLegend 302219
Alexa488 anti-human CD3 BioLegend 300415
Alexa488 anti-human cytokeratin BioLegend 628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype BioLegend 400129
BV510 anti-human CD45 BioLegend 304036
CD66b FITC isotype BD Biosciences 555748
CompBead Plus Compensation Beads BD Biosciences 560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL Fisher Scientific 09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL Fisher Scientific 09-761-10
CS&T beads BD Biosciences 655051
DTT Fisher Scientific BP172-5
FITC anti-human CD66b GeneTex GTX75907
Fixable Viability Stain BD Biosciences 564406
FlowCheck Beckman Coulter A69183
FlowSet Beckman Coulter A69184
HBSS Fisher Scientific 14-175-095
NAC Sigma-Aldrich A9165
NIST Beads, 05 μM Polysciences 64080
NIST Beads, 20 μM Polysciences 64160
NIST Beads, 30 μM Polysciences 64170
PE anti-human CD45 BioLegend 304039
PE-CF594 anti-human EpCAM BD Biosciences 565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype BD Biosciences 562292
PE-CR594 anti-human CD206 BD Biosciences 564063
Sodium citrate dihydrate EMD SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061

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Grayson, M., Lai, S. C., Bederka, L. H., Araujo, P., Sanchez, J., Reveles, X. T., Rebel, V. I., Rebeles, J. Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (174), e62785, doi:10.3791/62785 (2021).

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