Summary
このプロトコルは、標準的なフローサイトメトリックプラットフォーム上の単一細胞懸濁液に痰を解離し、その後の細胞サブセットの特性を分類するための効率的な方法を説明する。
Abstract
肺の健康状態を理解するために細胞内容やその他の微小環境特徴を研究するために広く使用されている痰は、従来、細胞学ベースの方法論を用いて分析されている。スライドの読み取りには時間がかかり、高度に専門的な人員が必要であるため、そのユーティリティは限られています。さらに、広範な破片およびあまりにも多くの扁平上皮細胞(SIC)、または頬細胞の存在は、しばしば診断に不十分なサンプルをレンダリングする。対照的に、フローサイトメトリーは、破片やSICを同時に除外しながら、細胞集団のハイスループットのフェノタイピングを可能にします。
ここで提示されるプロトコルは、痰を単一細胞懸濁液に解き分け、抗体染色および細胞集団を固定し、フローサイトメトリクスプラットフォーム上でサンプルを取得する効率的な方法を説明する。デブリ、死細胞(SICを含む)および細胞ダブレットの排除を記述する格言戦略がここに提示される。さらに、この研究はまた、分化(CD)45正および負の集団のクラスターに基づいて生存可能な単一の痰細胞を分析し、造血および上皮系のサブセットを特徴付ける方法を説明する。また、サンプルが肺由来で唾液ではないことを示す証拠として、肺特異的マクロファージを同定することで、品質管理の尺度が提供される。最後に、この方法は、3つのフローサイトメーターで分析された同じ患者の痰プロファイルを提供することによって、異なるサイトメトリックプラットフォームに適用できることが実証されています。ナビオスEX、LSR II、および歌詞。さらに、このプロトコルは、関心のある追加の細胞マーカーを含むように変更することができる。フローサイトメトリックプラットフォーム上で全体の喀痰サンプルを分析する方法をここでは紹介し、肺疾患のハイスループット診断を開発するために痰を有効にします。
Introduction
フローサイトメーターのハードウェアとソフトウェアの技術的進歩により、多くの異なる細胞集団を同時に1,2,3,4個同定することが可能になりました。例えば造血細胞研究におけるフローサイトメーターの利用は、免疫系2および造血系5の細胞階層の理解を大幅に向上させ、また多数の異なる血液癌の診断的区別を6,7,8に導いた。ほとんどの喀痰細胞は造血起源9,10,11であるが、血流サイトメトリーは診断目的で喀痰解析に広く適用されていない。しかし、いくつかの研究は、痰(細胞の最も重要なサブセット)における免疫細胞集団の評価が喘息および慢性閉塞性肺疾患(COPD)12,13,14,15などの疾患の診断および/またはモニタリングに大きな助けとなる可能性があることを示唆している。さらに、フローサイトメトリーに使用できる上皮特異的マーカーの存在は、痰、肺上皮細胞における細胞の次の最も重要なサブセットの尋問を可能にする。
異なる組織起源の多くの異なる細胞集団を分析する能力に加えて、フローサイトメーターは比較的短い期間で多数の細胞を評価することができる。それに比べて、スライドベースの細胞学的なタイプの分析には、多くの場合、高度に専門性の高い人員や機器が必要です。これらの分析は、作業集約的であり、分析される痰サンプルの割合に過ぎない。
3つの重大な問題は、フローサイトメトリーにおける痰の広範な使用を制限する。最初の問題は、痰のコレクションに関連しています。痰は、肺から口腔に粘液を排出するハフ咳を通して収集され、その後、コレクションカップに唾を吐く。粘液は口腔内を通過するので、SEC汚染の可能性が高い。この汚染は検体分析を複雑にしますが、この研究で示されるように、フローサイトメトリックプラットフォーム上で問題が容易に修正されます。
誰もが自発的に痰を作り出すことができるわけではありません。したがって、いくつかの装置は、非侵襲的な方法で痰の収集を支援するために開発された17。ネブライザーは、そのような装置の1つであり、信頼性の高い痰サンプル18,19,20を生成することが示されている。ネブライザーは、非侵襲的に痰を収集する非常に効果的な方法であるが、その使用はまだ専門の人員21を有する医療施設での設定を必要とする。対照的に、肺フルート22,23,24やacapella16,25などのハンドヘルドデバイスは、非常にユーザーフレンドリーであるため、自宅で使用することができます。これらの補助装置は安全で費用効果が高い。
私たちにとって、アカペラは肺flute16よりも一貫して良い結果を与えたので、アカペラ装置は痰のコレクションのために選ばれました。痰を使用する主な目的は、肺癌検出テスト16を開発することであるため、3日間の採取サンプルが決定されました。3日間のサンプルは、1日または2日間のサンプル26,27,28と比較して肺癌検出の可能性を高めることが示されている。しかしながら、痰の収集の他の方法は、異なる目的のために好ましいかもしれない。ここで説明した痰の収集方法とは異なる場合は、フローサイトメトリクス分析に使用される各抗体または色素を注意深く評価することをお勧めします。異なる喀痰の収集方法がフローサイトメトリーの標的タンパク質にどのような影響を与えるかについては、ごくわずかなデータが利用できます。
第二の問題は、主にフローサイトメトリーに関連する診断に痰を使用するための熱意を減衰させる、細胞数である。問題は、信頼性の高い分析に十分な生存細胞の収集です。2つの研究は、非侵襲的な方法によって収集された痰サンプルが、補助装置の助けを借りて、臨床診断または研究研究で利用できる十分な生存細胞を含み、16,24を示した。しかし、これらの研究はいずれもフローサイトメトリーに関する細胞数の問題に取り組まないようにした。
このプロトコルの基礎となる研究では、各研究部位に対して承認された制度ガイドラインに従って、肺癌を発症する危険性が高い参加者から喀痰サンプルを採取した。リスクの高い参加者は55年から75年の間と定義され、30パック年を吸い、過去15年以内に禁煙しなかった。患者は、メーカーの指示に従ってアカペラ装置を使用する方法を示された29 、自宅で3日間連続して痰を採取した。サンプルは最後のコレクションまで冷蔵庫に保管していました。最終採取日に、サンプルは冷凍コールドパックで一晩実験室に出荷されました。サンプルは、受け取った日に単一の細胞懸濁液に処理された。この喀痰収集法により、信頼性の高いフローサイトメトリック解析のために十分以上の生存細胞が得られます。
最後に、以前の細胞数問題に関連して、痰細胞をそのマス状環境からどのように放出させるかという問題である。細胞を生存可能に保ち、フローサイトメーターを詰まらせない単一細胞懸濁液を作り出す方法は?Pizzichini et al.30およびMillerら31の初期の研究に基づいて、このプロトコルは、フローサイトメトリック分析に適した単一の細胞懸濁液への痰処理のための容易で信頼性の高い方法を記述する。この方法は、フローサイトメトリ32,33,34の定評のあるガイドラインを用いて、喀痰中の造血細胞および上皮細胞を同定し、計器設定、品質管理措置、および流体細胞測定プラットフォーム上で痰分析を標準化する分析ガイドラインを提供するための効率的な抗体標識戦略を開発しました。
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Protocol
痰処理のすべてのステップは、適切な個人用保護具を備えた生物学的安全キャビネットで行われます。
1. 痰解離開始前の試薬製剤
- 1%パラホルムアルデヒド(PFA)、氷上のサンプルあたり25 mLを解凍し、使用するまで冷たく保ちます。
注意:PFAは吸入および皮膚接触によって有毒である。メーカーの指示に従って固定液を準備し、使用するまで25 mLアリコートで-20°Cで凍結します。 - サンプルの重量に近いし、ステップ2.2のために十分な0.1%ジチオトレイトール(DTT)を解凍し、37°Cに持って来ます。 (DTTのアリコートは使用前に-20 °Cで保存する必要があります。
- ステップ2.2のために37 °Cまで十分な0.5%N-アセチル-L-システイン(NAC)を持って来なさい。(NACは毎週新鮮にして、使用前に4°Cで保管してください。
2. 痰解離
- 痰サンプルの重量を量って解離試薬の量を決定します。
注: サンプルは、最初のウェイトが ≤3 g、>3 g が ≤8 g の場合は中程度、>が 16 g ≤ 場合は大きい、サンプルが >16 g の場合は特大である場合は小さいと見なされます。小、中、大、および超大の表示は、プロトコル全体で使用されます。解離や標識に必要な試薬の量は、痰サンプルの大きさによって異なります。 - 小さなサンプルを清潔な50 mL円錐形チューブ、中程度のサンプルを清潔な250 mLプラスチック製使い捨てボトルに、または大型の超大型サンプルを、清潔な500 mLプラスチック製の使い捨てボトルに移します。0.5%のNACと0.1%DTTの4 mL/gサンプル重量の1 mL/gサンプル重量を加えます。
- 最高速度(15sの場合)で渦を起こしてから、室温(最高速度)で15分間揺れ動きます。
- NAC と DTT を中和するために、4 つの量のハンクのバランス塩溶液 (HBSS) (サンプル + 試薬の総量に基づく) でサンプルを希釈します。最高速度で素早く渦を、最高速度で5分間室温で揺れ動く。
- 100 μm ナイロンメッシュセルストレーナーを通して、1つ以上の50 mL円錐遠心分離チューブにセルサスペンションをフィルターして、単一細胞懸濁液を作成します。
- 4°Cで10分間800xgで細胞を遠心分離する。 上清を吸引し、1本の15mL円錐状チューブに入ったペレットを全て結合し、同じ条件でHBSSでペレットを洗浄します。
- 細胞ペレットを、痰サンプルの初期重量によって決定されるバッファーの体積で再懸濁する。
メモ:小さなサンプルは、HBSSの250 μLで再懸濁されます。中程度のサンプルは、HBSSの760 μLで再懸濁されます。大きなサンプルと超大型サンプルは、1460 μLのHBSSで再懸濁されます。 - トリパンブルーを使用してライブ/デッドセルカウントのための細胞サスペンションのアリコートを取ります。
メモ:小さなサンプルの場合は5μLを使用してください。中型、大、または特大サンプルの場合は、10 μL を使用します。- 0.4%のトリパンブルーの30 μLと痰希釈の10 μLを混合して、1:40の最終サンプル希釈を達成します。細胞数のためのヘモサイトメーターの計数室にロードします。
メモ: セル数が小さすぎる場合や、セル数が多すぎて正確な数を得るには、最終的な希釈を調整する必要があります。痰細胞とSECsや破片を正しく区別するためのGuiotら.20 のコンサルティングを強く推奨します。これは、正確なセル数に不可欠です。
- 0.4%のトリパンブルーの30 μLと痰希釈の10 μLを混合して、1:40の最終サンプル希釈を達成します。細胞数のためのヘモサイトメーターの計数室にロードします。
- 超大型サンプルから、合計から50 x 106 個のセルを取り出し、HBSSを十分に追加して新しいチューブに追加して、合計体積1700 μLを作成します。
注: プロトコルの残りの部分については、このサンプルを大きなサンプルと考えてください。残ったサンプルは廃棄するか、または他の目的のために使用することができる。
3. 抗体と生起性染料染色
- 抗体と染色染料の選択
注: 表 1 は、このプロトコルで使用されている抗体および生存率染料と、それらが識別する細胞集団を示しています。- 痰セルを含むチューブにラベルを付けます(ラベルについては 表2 を参照)。
- 未染色細胞とチューブとアイソタイプコントロールを有するチューブとサンプルチューブに5mLフローサイトメトリーチューブ(使用されるフローサイトメーターと互換性がある)を使用してください。血液および上皮管サンプルに15 mL円錐形チューブを使用してください。
注:これらのサンプルは、抗体染色および固定に続いてフローサイトメトリーチューブに移されます。
- 補償管にラベルを付けます(表3)。
注:使用されているフローサイトメーターと互換性のある5 mLフローサイトメトリーチューブを使用してください。 - 表 2 および 表3に示すように、それぞれHBSS、抗体および/または色素の量を痰細胞チューブおよび補償管に加える。
注:細胞または補償ビーズを追加する前にすべてのチューブにバッファー(HBBS)、抗体、および染料を追加して、すべてのチューブの染色時間が一貫していることを確認してください。 - 表2に記載されている痰細胞容積量をアッセイチューブに加えます。
- 表 3 に示すように、補正ビードを補正管に追加します。
- 氷の上のすべてのチューブ(アッセイおよび補償チューブ)を、光から保護し、35分間インキュベートします。その後、氷冷HBSSと遠心分離機を4°Cで800xgで10分間充填 します。
- 補償管の場合、ペレットにできるだけ近い上清を吸引し、ペレットをフリックして緩めます。
- 0.5 mLの冷たいHBSSを補償管に加え、4°Cの氷の上に保管し、フローサイトメトリー分析に必要になるまで光から保護します。
- 遠心分離後の非染色アイソタイプ、血液、上皮管から上皮管を吸引し、チューブをフリックしてペレットを緩めた。
4. 1%パラホルムアルデヒド(PFA)による固定
- 未染色の、アイソタイプ、血液、および上皮管に冷たい1%PFA(現在では解凍されるべき)を加える。2 mLを非染色およびアイソタイプチューブに、血液および上皮管に10 mLとした。
- 氷上のチューブをインキュベートし、1時間光から保護します。30分後に最高速度で素早く渦を起たします。
- 氷冷HBSSでチューブを充填します。次いで、遠心管を4°Cで1600xgで10分間10分間用 いた。
- 細胞ペレットを邪魔することなくできるだけ多くの上清を吸引し、指でチューブをフリックして細胞を緩めます。
- 200 μL のコールド HBSS を、未染色およびアイソタイプのチューブに追加します。
- 総細胞数に従って血液および上皮管の再懸濁のためのHBSSの容積を計算する。
注: 再懸濁液量 = 0.15 x [総セル数(痰解離のステップ 8)/106]。特大サンプルのセル数として 50 x 106 を使用します。 - フローサイトメトリー分析が行われるまで、氷上の光から4°Cで保護されたすべてのサンプルおよび補償チューブを保管してください。
注: このプロトコルは、24 時間を超えるストレージのテストは行っていません。
5. フローサイトメーターでのデータ取得
- 使用しているフローサイトメーターに対して適切な起動手順を適用します。
注:プロトコルのこのセクションでは、フローサイトメーターを操作する人は、特に光学系および流体システムの安定性のチェック、光散乱および蛍光強度を標準化するための技術、および正しい補償行列の計算と適用を含む日常的な手順に関して、利用可能な機器の使用に関する訓練を受けていることを前提としています。 - 国立標準技術研究所(NIST)ビーズを混合して、前方散乱電圧と側面散乱電圧を設定して、ビーズを軸に近づけずにプロット全体に分散するようにNISTビーズを配置します。
注:このステップは、取得後の分析をゲートすることにより、5 μm未満の破片を確実に除去するために重要です。使用するフローサイトメーターによっては、最小のビーズがしきい値(LSR IIまたはリリックを使用する場合)または高い識別子(Navios EXフローサイトメーターを使用)で除外されないことに注意してください。Navios EXでは、フォワードとサイドの散乱には2のゲイン、前方散乱には236、サイドスキャッタには250の電圧が使用されました。LSR IIでは、順方向散乱電圧165、側散乱電圧190を使用した。 - 流量を中(LSR II)または高(Navios EX)に設定します。
メモ:ほとんどの機器の中流量または高流量は、痰管の獲得に使用できます。流量が遅すぎたり、サンプルが希薄化しすぎると細胞が沈降し、望ましくない渦が増える可能性があることに注意することが重要です。したがって、ステップ4.6で計算されたリサスペンション体積に付着すると、迅速に取得できるが、機械を詰まらせない細胞密度をもたらすはずである。 - 散乱パラメータと蛍光パラメータに使用する各パラメータの電圧を調整して、細胞集団をスケールに配置します。それに応じて電圧を調整する方法のガイダンスとして、格言戦略との数字を使用してください。
注: 必要なすべてのパラメータが取得前のパラメータ選択ウィンドウで選択されているか、データが取得されないことを確認してください。 - 最初に未染色痰サンプルのデータを取得し、次いでアイソタイプ染色サンプル、次に血液管および上皮管を取得する。
注:細胞懸濁液が集中しすぎて、フローサイトメーターが詰まることなくサンプルを実行できない場合、サンプルはHBSSでさらに希釈される可能性があります。
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Representative Results
このプロトコルは、臨床検査室を念頭に置いて開発されました。プロトコルの開発中に焦点は、シンプルさ、効率、および再現性でした。痰の処理における最も時間のかかるステップは、細胞を数えることであることがわかった。したがって、プロトコルは、時間を失うことなく細胞数とは無関係に喀痰処理および細胞標識を行うことができるように設定される。正確な細胞数は、妨げられない実行のためにサンプルを適切に希釈するために必要であり、抗体標識インキュベーション期間中に得ることができます。
このプロトコルは、最適な細胞標識に使用する抗体/色素の量を示すものとして、細胞数の代わりに痰重量測定を使用します。しかし、痰サンプルの重量には大きな変動があります。分析された126個のサンプルのうち、重量は0.57gから38.30gの範囲で、 図1A は痰重量と細胞収率の相関が強くないことを示している。したがって、サンプルは4つのカテゴリに分かれていました。サンプルの重量の中央値は、小さいサンプルの場合は2.1g、中サンプルの場合は5.0g、大サンプルの場合は11.2 g、特大サンプルでは22.0 gであった(図1B)。しかし、重量に基づいて予想よりもはるかに多くの細胞を得るサンプルがまだ存在し(図1C)、サンプルの大半はうまくクラスター化しました。小さいサンプルの場合、中央値の細胞収量は8.0 x 106 細胞であり、中サンプル13.0 x 106、大サンプル35.4 x 106、および特大サンプル93.0 x 106であった。
このプロトコルで使用される各抗体を滴定した。滴定曲線の最も高い染色指数を有する高原相(図2A)上の濃度(図2B)を、作業濃度として選択した。細胞数の変動は、染色強度を劇的に変化させることはありません。この抗体の滴定および試験は必須であり、このプロトコル34,35で使用される新しい抗体または色素ごとに注意してセットアップする必要があります。抗体を注意して滴定する場合、抗体が滴定された細胞の数よりも10〜50倍多くの細胞を染色する必要があります34,35。この原則の例を表 4 に示します。抗ヒトCD45-PE抗体を、合計400μLの1 x 106細胞で滴定した。この染色量に対する抗体がプロトコルに外挿される場合(各サンプルサイズのCD45-PE量と染色量を示す表2を参照)、小さなサンプルについては、0.625 x 106細胞が染色され、1.25 x 106細胞が大きなサンプルに対して染色され、表2.5 x 106細胞が大きい場合に染色されます。各カテゴリのセル数の 50 倍の超過分は、それぞれ 31.25 x 106、62.5 x 106、および 125 x 106 のセル (列 B) と計算されます。列 C および D に示すように、各サイズ カテゴリの中央値セル番号と各カテゴリの最大サンプルは、50 倍の範囲内にあります。
痰サンプルの様々なサイズ間のサイズと細胞収量の明らかな違いにもかかわらず、各カテゴリの中央値%SEC汚染は非常に似ています。 図3A は、個々のサンプルに見られるSCCの割合を示し、それらの痰重量カテゴリに従って階層化した。主な関心事は、これらの細胞が肺組織を代表するものではなく、口腔の代表であるため、SICにあった。しかし、SECの平均汚染は、すべてのカテゴリーで20%未満です。 図3B は、これらのサンプルで見つかった生存細胞の割合を示す。SFCを除くと、平均生存率は、小、中、および大規模のサンプルサイズカテゴリで約72%でした。特大カテゴリーではやや高い(79%)。
図4は、目的の喀痰細胞をデブリ、死細胞(汚染SECs36も含む)、および細胞塊から分離する典型的な格子化戦略を示す。図4Aは、5μm以下または30μm未満の破片を除去するためのゲートを設定するためのNISTビーズの使用を示し、図4Bは痰細胞にこのゲートを適用します。図4Cは、前方散乱幅(FSC−W)に対して側面散乱幅(SSC−W)として見た場合の典型的な痰プロファイルを示す、幅ゲート。このプロファイルは、SSC-W 軸と FSC-W 軸に沿って表示される小さな破片を除去するために使用されます。死細胞の除去は図4Dおよび図4Eに示される。非染色制御(図4D)は、FVS510陽性のカットオフを決定するために使用されます。負のコントロールより上のFVS510に対して正の染色をする細胞は死んだと考えられ、痰細胞分析では使用されません(図4E)。最後に、シングルゲートを適用して、解析からセルダブレットを除去します(図4Fを参照)。したがって、図4Bに示す選択ゲートを通してそれを行った細胞は、図4C、図4E、および図4Fは、このプロトコルで使用される抗体を用いて後続の分析に備えて、単一の痰細胞を表す。
この標識プロトコルで抗CD45抗体を使用することで、生きた単一の痰細胞を血液(CD45+)細胞コンパートメントおよび非血液(CD45-)細胞コンパートメントに分離することができます。後者のカテゴリは、上皮細胞および他の非血液細胞を含む。 図5A のトッププロファイルは、CD45陽性のカットオフを設定するために染色されていない痰サンプルを使用して、ゲートをレンダリングしてCD45+ 細胞およびCD45- 細胞を捕捉することを示しています。 図5A の下方のプロファイルは、抗CD45抗体で染色された痰試料に適用されたこれらのゲートの両方を示す。その後、CD45+ ゲート内の血液細胞特異的集団(図5B)およびCD45- ゲート内の上皮集団を含む他の非血液細胞集団を同定するために、追加の抗体による染色が使用される(図5C)。両方の図で、上のプロファイルは、アイソタイプ染色痰が二重負母集団を設定するためにどのように使用されているかを示し、一方、下のプロファイルは抗体染色痰細胞を示す。 図5B (下段)は、蛍光(FL)1チャネル(抗CD66b、CD3、CD19抗体)およびFL3チャネルで検出可能な抗CD206で検出可能な抗体のカクテルで作成された6種類のCD45+ 細胞集団を示す。選別実験は、肺特異的なマクロファージがMで同定された門に存在することを明らかにした。したがって、これらのゲート内の細胞の存在は、痰サンプルが肺に由来し、唾液ではないことを示している(Bederkaら、準備中の原稿)。 図5C (下段)は、FL1チャネルで検出可能な抗汎サイトケラチン(panCK)および抗上皮細胞接着分子(EpCAM)抗体を用いて作成した格子形象限を、CD45- 痰細胞の中からFL3チャネルで検出可能なものである。
このラベリングプロトコルは、Navios EXおよびLSR IIで広範囲にテストされています。いくつかの予備実験は、Lyricで行われましたが、他の2つのマシンに対して行われた広範な機器の最適化は行われませんでした。したがって、詳細なインストゥルメント設定は、材料シートの Navios EX と LSR II に対して提供されますが、リリックには提供されません。痰細胞の解析に使用できるこれら3つのフローサイトメトリクスプラットフォーム間の類似点と変動を理解するために、さまざまな機械から得られたプロファイルを図6と図7で比較することができます。2つの大きな喀痰サンプルを処理し、プールし、標識し、3つの等しい部分に分離し、その後、上述した各フローサイトメーターで取得した。図 4 に似た図 6 は、破片、死んだ細胞、および細胞の束を除去するための格言戦略を比較しています。図7は図5と同じで、様々なフローサイトメーターで取得したデータから血液プロファイルと非血液プロファイルを比較します。
3つの異なるフローサイトメーターから得られた様々なプロファイルを比較すると、各機器で同じ基本的なプロファイルを観察できることを示しています。注意する必要がある違いは、SSC-W/FSC-W(幅ゲート)プロット(図6、2行目)と散布図の線形スケール(図6 および 7)です。Navios EX で生成された散布図は、インクルージョン ゲート(赤いボックス)を示し、ゲートに含まれるすべてのセルがさらに解析されることを意味します。左下隅の軸に沿ったイベントは除外されます。LSR II とリリックの散布幅プロットでは、同じ軸に沿った同様のイベントデポジットは表示されません。この不一致は、Navios EX で使用される非常に敏感なしきい値が原因である可能性が高く、前のサイズ除外ゲート( 図 6 の上列)に小さな破片が発生します。LSRIIで生成された散乱幅プロファイルの軸に沿って破片が見られる場合がありますが、右下隅にあります。このような場合、除外ゲート ( 図 6 の行 2 の中央のプロファイルのダッシュ付き赤いボックスで示されている) を使用して、これらのイベントを分析から除外します。
ログスケールはNavios EXとリリックとLSR IIのサイトメーターの間のプロットでわずかに異なって見えますが、Navios EXは何十年も使用してデータを取得するオプションを持っています。より多くの数十年を実装することは、実験の文脈と関心のある集団を視覚化するために望ましい感度に依存します。
ナビオスEXとLSR IIとリリックサイトメーターの他の顕著な違いは、シングルゲートのプロファイルの外観です。Navios EXのサイトメーターはLSR IIとは異なったコレクションの角度が付いている長方形の流れのセルが装備されている。Navios EXは、分析する粒子サイズに適した感度を達成するために、前方角度光散乱を最適化するために、ソフトウェア制御の収集角度を3つ含みます。Navios EX サイトメーターのポリゴン ゲートは、LSRII のシングル ゲートよりもわずかに低い角度に調整する必要があります。歌詞のシングルゲートは、LSR IIと同様のプロファイルを得るように最適化することができます。痰サンプルを使用して、LSR IIと同様のシングルゲートを達成するために、リリックのレーザーごとに領域スケーリング係数を最適化する必要があります。
図 4 ~ 図 7 に示すプロファイルはすべて、FlowJo ソフトウェアバージョン 10.6 で分析されました。fcs ファイルは、フローレポジトリ (https://flowrepository.org)、ID FR-FCM-Z3MJ、FR-FCM-Z3MJ、および FR-FCM-Z3MM で見つけることができ、これらの図に示すように、痰分析の練習に使用できます。
図1:痰重量と細胞収量(A)は、喀痰重量との関係、処理前に決定され、全細胞収量と、ヘモサイトメーターを用いて処理後に決定される。各弾丸は個々のサンプルを表し、合計で126個です。(B)痰サンプルは、その重量に基づいて4つのカテゴリに階層化された:3 gまでの重量を量るサンプルの小さ、最大8g以上の重量を量るサンプルの媒体、最大16gまでの8g以上の重量を量るサンプルの大きいサンプル、および16gを超えるもののための超大型サンプル(C)各カテゴリーのサンプルの細胞収量の分布を示す。(B)と(C)の赤いバーは、各カテゴリの中央値を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:抗ヒトCD45-PEの抗体滴定 (A) プロットされた陽性集団の平均蛍光強度(MFI)と、1μg/mLのCD45-PE抗体プラトーの濃度を示すCD45-PE(IgG1)滴定曲線。(B)抗体濃度に対する染色指数を示す滴定曲線は、染色指数が1μg/mLで最も高い。染色指数は次のように計算した:[CD45 MFI陽性母集団−CD45 MFI負母集団]/[2*標準偏差]。 図2A および 図2Bに基づき、CD45-PE抗体の最適濃度として1μg/mLを選択しました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:痰サンプル中のSECsと死細胞の割合は、4つの重量カテゴリーの間で一貫しています。 (A)痰サンプル中のSICの割合は、重量カテゴリに従って分類されています。SEC汚染率は、総細胞数の一部としてヘモサイトメーターによって決定された。(B)SECSを除いた痰サンプルの細胞生存率は、ヘモサイトメーターおよびトリパンブルー排除法によって決定される。各グラフの赤い線は中央値を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:喀痰サンプル中の破片、死細胞、およびダブレットを除外するためのギャティング戦略。 (A) サイズ5 μm、20 μm、および 30 μm の NIST ビーズを使用して、赤いボックスで示されるゲートをセットし、5 μm 未満の破片と30 μm以上の大きな破片を除外しました。(B) プットムサンプルは、NISTビーズと同じ前方散乱と側面散乱に対して同じ電圧を使用して取得した。(A)で作成されたゲートは、破片を除外するために適用されました。(C)軸に近い小さな破片をこの散乱幅プロットで除外した。(D)非染色痰サンプルを使用して、生存性染料に対する陰性の未染色集団に対してカットオフ(赤線)を設定した。 (E) Dで作成されたカットオフを、染色された痰サンプルに適用し、生きた生存可能な細胞を含むゲート(赤い箱)を形成した。(F) 赤のポリゴンで示されるシングル ゲートは、対角線に落ちないセルを除外し、ダブレットや束を除去します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:血液および非血液細胞区画への喀痰細胞のゲーティング戦略(A)シングルゲートに由来する未染色痰細胞を、CD45(上)の負の集団にカットオフ(赤線)を設定するために使用される。上部プロファイルからのカットオフは、CD45陽性(CD45+)と負の集団(CD45-)を区別するために、染色痰サンプル(下)に適用されます。(B)FITC/AF488用アイソタイプ抗体で染色されたCD45+痰細胞は、陰性集団(上)にゲートを設定するために使用される。同じゲートが、血液細胞マーカーCD3、CD19、CD66b、およびCD206(下)で染色されたCD45+痰細胞に適用されます。(C)象限ゲートは、CD45-痰細胞にアイソタイプコントロール(上)を付け、上皮マーカーパンサイトケラチン(panCK)およびEpCAM(下)で染色された痰サンプルからCD45-細胞に適用される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:3つのフローサイトメトリックプラットフォーム上の染色された痰細胞の破片、塊、死細胞を除外するGating戦略。 2つの大きな喀痰サンプルを処理、プール、標識、およびナビオスEX(A)、LSR II(B)、およびリリック(C)フローサイトメーターで取得するために3つの等しい部分に分割した。上の行:痰サンプルは非常に小さく、大きい破片を除外するためにゲート(赤い箱)でした。2 行目: Navios EX プロットの大きな赤いボックスは、セルを含むが破片を除外する包含ゲートを表します。LSR IIプロットに見られる破線の小さな赤い箱は、さらなる分析から破片を排除するための除外ゲートを表しています。リリックによるさらなる最適化は、デブリ排除のガッティングが必要な場所を決定するために必要です。したがって、そのプロットにはゲートはありません。3行目:赤い長方形のゲートには、さらなる分析のための生きた細胞が含まれています。下の行: ポリゴン ゲートには、ゲートの対角線の外側に落ちる二重奏を除外することで、単一のセルが含まれます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:3つのフローサイトメトリックプラットフォーム上の血液および上皮マーカーに対して染色された喀痰の採座戦略。図 6 に示す分析は図 7 で続きます。すべての生存可能な単一細胞(下行、図6)は、CD45+およびCD45-集団(第1行、図7)に分けられ、血液細胞特異的マーカーおよび上皮細胞特異的マーカーがこれらの集団をさらに引き出すことができるようにした。2行目:CD45+細胞からの血液細胞マーカーCD3/CD19/CD66bおよびCD206のプロファイル。3行目:上皮細胞マーカー、CD45-細胞からのパンクおよびEpCAM。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 抗体/染色 | 目的 |
| FVS510 | 生存性染色 |
| アンチヒト CD45 – PE | 汎白血球マーカー; PE補償 |
| アンチヒューマン CD66b – FITC | グラニューロキテマーカー |
| アンチヒューマンCD3 – Alexa488 | T 細胞マーカー |
| アンチヒューマン CD19 – Alexa488 | B セル マーカー;FITC/アレクサ488補償 |
| アンチヒューマン CD206 – PE-CF594 | 肺マクロファージマーカー; PE-CF594補償 |
| アンチヒューマンエプカム – PE-CF594 | 上皮細胞マーカー; PE-CF594補償 |
| 抗ヒト汎サイトケラチン (パンク) – Alexa488 | 上皮細胞マーカー |
| IgG1κ – アレクサ488 | CD3/CD19/パンCKアイソタイプコントロール |
| イググ1κ – フィット | CD66b アイソタイプ制御 |
| IgG1κ – PE-CF594 | CD206/EpCAMアイソタイプ制御 |
| アンチヒューマン CD45 – BV510 | FVS510補償 |
表1:使用する抗体及び生存率染色。 このプロトコルで使用される抗体および生存性染料のリスト。それぞれが識別する細胞サブセットが示されています。
| チューブ(ラベル) | サンプルサイズ* | HBSS (μL) | FVS510 (μL) | CD45 (μL) | その他の抗体 (μL) | セル § (μL) | |||
| 汚れず | 小さい | 80 | 20 | ||||||
| 中程度 | 50 | 50 | |||||||
| 大きい | 50 | 50 | |||||||
| IgG1κ - アレクサ488 | イググ1κ - フィット | IgG1κ - PE-CF594 | |||||||
| アイソタイプ制御 | 小さい | 60.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 20 | |
| 中程度 | 30.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| 大きい | 30.25 | 1 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| CD206 | CD3 | CD19 | CD66b | ||||||
| 血 | 小さい | 92.875 | 1.5 | 25 | 1.875 | 5 | 1.25 | 7.5 | 115 |
| 中程度 | 65.75 | 3 | 50 | 3.75 | 10 | 2.5 | 15 | 350 | |
| 大きい | 102.5 | 10 | 100 | 7.5 | 20 | 5 | 30 | 725 | |
| エプカム | パンク | ||||||||
| 上皮 | 小さい | 96.5 | 1.5 | 25 | 10 | 2 | 115 | ||
| 中程度 | 73 | 3 | 50 | 20 | 4 | 350 | |||
| 大きい | 117 | 10 | 100 | 40 | 8 | 725 | |||
| * サンプルは、プロトコルの痰解離セクションのステップ1で決定された重量に基づいて、小、中、または大きいとみなされます。 | |||||||||
| § 報酬チューブ内のものを含め、すべての試薬が分布した 後 に細胞を添加する必要があります(表3)。 | |||||||||
表2:痰細胞を有するチューブの含有量。 プロトコルで参照されている表を使用して、適切なサンプルサイズに対して、指定された量の抗体と生存性染色を追加します。
| チューブ(ラベル) | 試薬を添加 (μL) | 試薬を添加(ドロップ) | ||||||
| HBSS | CD45-PE | CD206-PE-CF594 | エプカム-PE-CF594 | CD19-アレクサ488 | CD45-BV510 | コンビーズ (+) | コンビーズ * (-) | |
| PEコンプ。 | 76 | 4 | x | x | x | x | 1 | 1 |
| PE-CF594コンプ。 | 72 | x | 4 | 4 | x | x | 1 | 1 |
| アレクサ488/FITCコンプ。 | 60 | x | x | x | 20 | x | 1 | 1 |
| BV510コンプ。 | 60 | x | x | x | x | 20 | 1 | 1 |
| * 陽性(+)および陰性(-)ビーズは、すべての試薬が配布され、表2のチューブが準備された 後 に添加する必要があります。 | ||||||||
| コンプ=報酬 | ||||||||
表3:補償管の内容 この表は、プロトコルで参照されているとおりに使用して、指定された量の抗体を補正ビーズに追加します。
| セル番号 (x 106) | ||||
| ある | B | C | D | |
| サンプルサイズ | 染色量* | 50倍のアクセス ¶ | 中央値サンプル(折りたたみアクセス) # | 最大サンプル(折りたたみアクセス) # |
| 小さい | 0.625 | 31.25 | 8.0 (12.8) | 24.77 (39.6) |
| 中程度 | 1.25 | 62.5 | 13.0 (10.4) | 48.87 (39.1) |
| 大きい | 2.5 | 125 | 35.4 (14.2) | 113.5 (45.4) |
| * プロトコルで使用されるボリュームの染色(表2)。 細胞数は、滴定曲線の実行方法から外挿されます。CD45-PEの1 μg/mLおよび200 μLあたり1 x 106 細胞。 | ||||
| ¶ 列 A のセル番号の 50 倍のアクセス。 | ||||
| # 列 C および D のフォールド アクセスは、列 C または D のセルに示される数値を列 A の対応するセルの数値で割って計算されます。 | ||||
表4:各サンプルサイズカテゴリーにおける全てのサンプルに対する抗ヒトCD45-PE濃度。
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Discussion
痰の細胞含有量は、多くの場合、多くの破片37を伴う広い範囲の細胞の多種多様を含む。さらに、喀痰分析には、サンプルが口腔38の代わりに肺から採取されることを確認する品質管理が必要である。したがって、血液の場合ほどフローサイトメトリーによって痰を分析することは簡単ではなく、例えば、はるかにクリーンで均質な細胞懸濁液を放出する。このプロトコルは、特定のサイズのビーズを使用して計器の設定を提供して、最小および最大の細胞集団の両方を検出できるようにするため、破片、細胞の塊、SECsおよび他の死んだ細胞を汚染するゲージ戦略、そして最後に、痰サンプルが主に唾液ではなく肺からのものであることを保証するための品質管理措置である。
プロトコルには、指摘する価値のある痰を扱う上で重要なステップがあります。まず、細胞収量は、プロトコルの痰解離部分のステップ2.5で使用されるナイロンセルストレーナーの数によって大きな影響を受けることができます。複数のストレーナーは、ストレーナーの詰まりのためにあまりにも多くの細胞を失うことを避けるために必要とされるかもしれません。ストレーナーを通る流れが著しく減速した場合は、新しいストレーナーを使用する必要があります。第二に、特にSCCの汚染が高い場合、痰サンプルの細胞ペレットは非常に緩いことができます。そのため、試料を遠心した後に上清を除去する際にペレットに近づきすぎないように吸引することが不可欠である。ペレットに近すぎると、ペレット全体が失われなければ細胞損失が生じる可能性があります。第三に、このプロトコルは固定手順を必要とします。これは細胞およびそれらの染色プロフィールを維持し、流れのサイトメーターオペレータを保護する安全処置として役立つ。特定のフローサイトメーターでサンプルを実行すると、エアロゾル生産の可能性に起因する生物学的ハザードの増加を示す可能性があります39。PFAの固定は痰のサンプルの潜在的な病原体からオペレータを保護するのを助ける。第4に、フローサイトメトリック解析のために痰サンプルを調製する最も困難な側面は、細胞数です。細胞数は、喀痰中に存在する細胞タイプの多様性が大きいため複雑である。計数機は、多くの場合、彼らが捕獲することができる細胞サイズの範囲によって制限され、従って、ヘモサイトメーターよりも信頼性が低い。しかし、ギオットら20で優れた記述を行うヘモサイトメーターによる喀痰サンプルの細胞数は退屈であり、熟練する練習が必要である。正確な細胞数は、合理的な流量を可能にし、フローサイトメーターの詰まりを防ぐために、サンプルの最終的な再懸濁液量を決定する上で不可欠です。喀痰中の非常に大きなSICの存在と、解離バッファによって分割されていない多くの小さな細胞塊が存在し、フィルタによって捕捉されず、フローサイトメーターが詰まる可能性が高まります。したがって、利用可能なフローサイトメーターを使用して、データ取得に最適な細胞濃度/流量を決定するのに時間を費やすことをお勧めします。さらに、フローサイトメーターが適切なフローセルとノズルサイズ(またはプローブ)を持っていることを確認して、喀痰中に存在するより大きな細胞集団を測定することができます。
細胞数の熟練度が達成された場合でも、それはまだ時間のかかるプロセスです。したがって、このプロトコルにおける細胞標識の試薬の決定は、細胞数ではなくサンプルサイズ(重量で判断される)に基づいている。これにより、手動細胞数は、抗体および生用色素染色に必要な時間の間に完了することができるので、時間のより効率的な使用を可能にします。ただし、これには3つの顕著な例外があります。サンプルが>16 g(いわゆる超大型サンプル)の場合、血液および上皮管に対してそれぞれ25 x 106 個の細胞を染色するだけで高価な試薬を保存できるように、手動の細胞数は染色前に発生する必要があります。このセル番号は、このプロトコルで説明されている設定で非常に信頼性の高いプロファイルを提供します。もう 1 つの潜在的な例外は、非常に小さいサンプルの場合です。このプロトコルで示されているフローサイトメトリー解析では、信頼性の高いプロファイルを生成するために、少なくとも1〜2 x 106 のセルが必要であると推定されます(データは示されていません)。したがって、サンプルに含まれるセルが 1 ~2 x 106 未満の場合、最終的な結果は許容できない可能性があるため、手順を続行する価値がない可能性があります。
末梢血細胞や細胞株にうまく働く特異的な標識試薬は、痰に含まれる血液細胞で非常に異なって働くかもしれません(未発表の観察)。したがって、フローサイトメトリー実験で使用される前に、確立されたプロトコル34,35に従って各抗体または他の標識試薬を評価することが推奨されます。ほとんどの抗体滴定は、10〜50倍まで染色する場合に同等の結果を与える必要があります。ただし、セル番号が範囲34より大きい場合は、追加の滴定を行うことをお勧めします。試薬濃度が決められた場合、実際の実験と同じその試薬のインキュベーション時間を保つことが不可欠です。そのため、プロトコルは、細胞または補償ビーズが追加される前に、チューブにすべてのバッファーと試薬を追加することを強調します。試薬と細胞/ビーズを一緒に添加するこの順序は、標識時間のより高い一貫性を可能にします。何らかの理由で、実験インキュベーション時間が抗体/色素滴定に使用される時間と同様に保つことができない場合、後者は実験中に可能なインキュベーション時間で繰り返す必要があります。
痰サンプルは、肺に影響を及ぼす様々な病気の病態生理を研究するための診断標本として広く使用されている。結核40、41、COPD13、42、喘息43、嚢胞性線維症44、45、肺癌46、47、48、および関節リウマチは 、痰が非侵襲的に得られた検体であるという利点のために研究されている多くの疾患の一つである。さらに最近では、コロナウイルス大流行の間に、喀痰がコロナウイルス病2019(COVID-19)50で入院した患者の長期のウイルス流出を検出するために使用されてきた。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、タンパク質分析、顕微鏡、フローサイトメトリーなど、さまざまな技術が使用され、痰中の疾患特異的マーカーを同定しています。フローサイトメトリクスプラットフォームを使用して痰サンプルを分析することは広く使用されていませんが、その使用は増加します。フローサイトメーター3,51,52の技術の進歩、フルオロフォアの化学、新しい抗体クローンの生成、死細胞集団を同定するための様々な色素の開発が進む中、ヒト疾患の診断を目的とした抗体パネルを設計する可能性が飛躍的に高まっています。さらに、フローサイトメトリックデータ55,56の解析を自動化するための最近のプッシュは、フローデータを手動で読み取り、解釈する際の潜在的なバイアスを排除します。フローサイトメトリーにおけるこれらの新しい開発は、臨床診断としての痰の探索を大幅に促進する。
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Disclosures
著者は全員、バイオアフィニティ・テクノロジーズの過去または現在の従業員です。
Acknowledgments
ダビド・ロドリゲスのフィギュア準備に対する彼の支援に感謝したいと思います。痰サンプルは、UTヘルス、NIH-NCI P30 CA054174-20(UTヘルスのCTRC)およびUL1 TR001120(CTSA助成金)によってサポートされているUTヘルスサンアントニオフローサイトメトリー共有リソース施設のBD LSR IIで実行されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Paraformaldehyde Flow-Fix | Polysciences | 25037 | |
| 100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
| 50 mL conical falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Alexa488 anti-human CD19 | BioLegend | 302219 | |
| Alexa488 anti-human CD3 | BioLegend | 300415 | |
| Alexa488 anti-human cytokeratin | BioLegend | 628608 | |
| Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype | BioLegend | 400129 | |
| BV510 anti-human CD45 | BioLegend | 304036 | |
| CD66b FITC isotype | BD Biosciences | 555748 | |
| CompBead Plus Compensation Beads | BD Biosciences | 560497 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
| CS&T beads | BD Biosciences | 655051 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| FITC anti-human CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 564406 | |
| FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
| FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| NAC | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NIST Beads, 05 μM | Polysciences | 64080 | |
| NIST Beads, 20 μM | Polysciences | 64160 | |
| NIST Beads, 30 μM | Polysciences | 64170 | |
| PE anti-human CD45 | BioLegend | 304039 | |
| PE-CF594 anti-human EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
| PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype | BD Biosciences | 562292 | |
| PE-CR594 anti-human CD206 | BD Biosciences | 564063 | |
| Sodium citrate dihydrate | EMD | SX0445-1 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 |
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