フローサイトメトリーによる品質管理痰解析

Summary

このプロトコルは、標準的なフローサイトメトリックプラットフォーム上の単一細胞懸濁液に痰を解離し、その後の細胞サブセットの特性を分類するための効率的な方法を説明する。

Abstract

肺の健康状態を理解するために細胞内容やその他の微小環境特徴を研究するために広く使用されている痰は、従来、細胞学ベースの方法論を用いて分析されている。スライドの読み取りには時間がかかり、高度に専門的な人員が必要であるため、そのユーティリティは限られています。さらに、広範な破片およびあまりにも多くの扁平上皮細胞(SIC)、または頬細胞の存在は、しばしば診断に不十分なサンプルをレンダリングする。対照的に、フローサイトメトリーは、破片やSICを同時に除外しながら、細胞集団のハイスループットのフェノタイピングを可能にします。

ここで提示されるプロトコルは、痰を単一細胞懸濁液に解き分け、抗体染色および細胞集団を固定し、フローサイトメトリクスプラットフォーム上でサンプルを取得する効率的な方法を説明する。デブリ、死細胞(SICを含む)および細胞ダブレットの排除を記述する格言戦略がここに提示される。さらに、この研究はまた、分化(CD)45正および負の集団のクラスターに基づいて生存可能な単一の痰細胞を分析し、造血および上皮系のサブセットを特徴付ける方法を説明する。また、サンプルが肺由来で唾液ではないことを示す証拠として、肺特異的マクロファージを同定することで、品質管理の尺度が提供される。最後に、この方法は、3つのフローサイトメーターで分析された同じ患者の痰プロファイルを提供することによって、異なるサイトメトリックプラットフォームに適用できることが実証されています。ナビオスEX、LSR II、および歌詞。さらに、このプロトコルは、関心のある追加の細胞マーカーを含むように変更することができる。フローサイトメトリックプラットフォーム上で全体の喀痰サンプルを分析する方法をここでは紹介し、肺疾患のハイスループット診断を開発するために痰を有効にします。

Introduction

フローサイトメーターのハードウェアとソフトウェアの技術的進歩により、多くの異なる細胞集団を同時に^1,2,3,4個同定することが可能^{になりました}。例えば造血細胞研究におけるフローサイトメーターの利用は、免疫系²および造血系⁵の細胞階層の理解を大幅に向上させ、また多数の異なる血液癌の診断的区別^を6,7,8に^導いた。ほとんどの喀痰細胞は造血起源^9,10,11であるが、血流サイトメトリーは診断目的で喀痰解析に広く適用されていない。しかし、いくつかの研究は、痰(細胞の最も重要なサブセット)における免疫細胞集団の評価が喘息および慢性閉塞性肺疾患(COPD)^12,13,14,15などの疾患の診断および/またはモニタリングに大きな助けとなる可能性があることを示唆している。さらに、フローサイトメトリーに使用できる上皮特異的マーカーの存在は、痰、肺上皮細胞における細胞の次の最も重要なサブセットの尋問を可能にする。

異なる組織起源の多くの異なる細胞集団を分析する能力に加えて、フローサイトメーターは比較的短い期間で多数の細胞を評価することができる。それに比べて、スライドベースの細胞学的なタイプの分析には、多くの場合、高度に専門性の高い人員や機器が必要です。これらの分析は、作業集約的であり、分析される痰サンプルの割合に過^ぎない。

3つの重大な問題は、フローサイトメトリーにおける痰の広範な使用を制限する。最初の問題は、痰のコレクションに関連しています。痰は、肺から口腔に粘液を排出するハフ咳を通して収集され、その後、コレクションカップに唾を吐く。粘液は口腔内を通過するので、SEC汚染の可能性が高い。この汚染は検体分析を複雑にしますが、この研究で示されるように、フローサイトメトリックプラットフォーム上で問題が容易に修正されます。

誰もが自発的に痰を作り出すことができるわけではありません。したがって、いくつかの装置は、非侵襲的な方法で痰の収集を支援するために開発された¹⁷。ネブライザーは、そのような装置の1つであり、信頼性の高い痰サンプル18,19,20を生成することが示されている。ネブライザーは、非侵襲的に痰を収集する非常に効果的な方法であるが、その使用はまだ専門の人員²¹を有する医療施設での設定を必要とする。対照的に、肺フルート^22,23,24やacapella16,25などのハンドヘルドデバイスは、非常にユーザーフレンドリーであるため、自宅で使用することができます。これらの補助装置は安全で費用効果が高い。

私たちにとって、アカペラは肺^flute16よりも一貫して良い結果を与えたので、アカペラ装置は痰のコレクションのために選ばれました。痰を使用する主な目的は、肺癌検出テスト¹⁶を開発することであるため、3日間の採取サンプルが決定されました。3日間のサンプルは、1日または2日間のサンプル^26,27,28と比較して肺癌検出の可能性を高めることが示されている。しかしながら、痰の収集の他の方法は、異なる目的のために好ましいかもしれない。ここで説明した痰の収集方法とは異なる場合は、フローサイトメトリクス分析に使用される各抗体または色素を注意深く評価することをお勧めします。異なる喀痰の収集方法がフローサイトメトリーの標的タンパク質にどのような影響を与えるかについては、ごくわずかなデータが利用できます。

第二の問題は、主にフローサイトメトリーに関連する診断に痰を使用するための熱意を減衰させる、細胞数である。問題は、信頼性の高い分析に十分な生存細胞の収集です。2つの研究は、非侵襲的な方法によって収集された痰サンプルが、補助装置の助けを借りて、臨床診断または研究研究で利用できる十分な生存細胞を含み^、16,24を示した。しかし、これらの研究はいずれもフローサイトメトリーに関する細胞数の問題に取り組まないようにした。

このプロトコルの基礎となる研究では、各研究部位に対して承認された制度ガイドラインに従って、肺癌を発症する危険性が高い参加者から喀痰サンプルを採取した。リスクの高い参加者は55年から75年の間と定義され、30パック年を吸い、過去15年以内に禁煙しなかった。患者は、メーカーの指示に従ってアカペラ装置を使用する方法を示^された29 、自宅で3日間連続して痰を採取した。サンプルは最後のコレクションまで冷蔵庫に保管していました。最終採取日に、サンプルは冷凍コールドパックで一晩実験室に出荷されました。サンプルは、受け取った日に単一の細胞懸濁液に処理された。この喀痰収集法により、信頼性の高いフローサイトメトリック解析のために十分以上の生存細胞が得られます。

最後に、以前の細胞数問題に関連して、痰細胞をそのマス状環境からどのように放出させるかという問題である。細胞を生存可能に保ち、フローサイトメーターを詰まらせない単一細胞懸濁液を作り出す方法は?Pizzichini et ^al.30およびMillerら³¹の初期の研究に基づいて、このプロトコルは、フローサイトメトリック分析に適した単一の細胞懸濁液への痰処理のための容易で信頼性の高い方法を記述する。この方法は、フローサイトメトリ^32,33,34の定評のあるガイドラインを用いて、喀痰中の造血細胞および上皮細胞を同定し、計器設定、品質管理措置、および流体細胞測定プラットフォーム上で痰分析を標準化する分析ガイドラインを提供するための効率的な抗体標識戦略を開発しました。

Protocol

痰処理のすべてのステップは、適切な個人用保護具を備えた生物学的安全キャビネットで行われます。 1. 痰解離開始前の試薬製剤 1%パラホルムアルデヒド(PFA)、氷上のサンプルあたり25 mLを解凍し、使用するまで冷たく保ちます。注意:PFAは吸入および皮膚接触によって有毒である。メーカーの指示に従って固定液を準備し、使用するまで25 mLアリコートで-20°C?…

Representative Results

このプロトコルは、臨床検査室を念頭に置いて開発されました。プロトコルの開発中に焦点は、シンプルさ、効率、および再現性でした。痰の処理における最も時間のかかるステップは、細胞を数えることであることがわかった。したがって、プロトコルは、時間を失うことなく細胞数とは無関係に喀痰処理および細胞標識を行うことができるように設定される。正確な細胞数は、妨げられ?…

Discussion

痰の細胞含有量は、多くの場合、多くの破片³⁷を伴う広い範囲の細胞の多種多様を含む。さらに、喀痰分析には、サンプルが口腔³⁸の代わりに肺から採取されることを確認する品質管理が必要である。したがって、血液の場合ほどフローサイトメトリーによって痰を分析することは簡単ではなく、例えば、はるかにクリーンで均質な細胞懸濁液を放出する。…

Materials

1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061