Summary
이 프로토콜은 가래를 단일 셀 서스펜션으로 분리하고 표준 흐름 세포 측정 플랫폼에서 셀룰러 하위 집합의 후속 특성화를 결합하는 효율적인 방법을 설명합니다.
Abstract
가래는 세포 함량 및 폐의 건강을 이해하기 위해 다른 미세 환경 적 특징을 연구하는 데 널리 사용되며, 전통적으로 세포학 기반 방법론을 사용하여 분석됩니다. 슬라이드를 읽는 데 시간이 많이 걸리며 고도로 전문화된 인력이 필요하기 때문에 유틸리티가 제한됩니다. 더욱이, 광범위한 파편과 너무 많은 편평상피 세포 (SEC) 또는 뺨 세포의 존재는 종종 진단을 위해 부적당한 견본을 렌더링합니다. 대조적으로, 유동 세포측정은 동시에 파편과 SEC를 제외하면서 세포 집단의 높은 처리량 phenotyping을 허용합니다.
여기에 제시된 프로토콜은 단일 세포 현탁액, 항체 얼룩 및 세포 집단을 고치고, 유동 세포 측정 플랫폼에서 샘플을 획득하는 효율적인 방법을 설명합니다. 파편, 죽은 세포 (SE포함) 및 세포 이중제의 배제를 설명하는 게이팅 전략이 여기에 제시됩니다. 또한, 이 작품은 또한 조혈 및 상피 계보 하위 집합을 특성화하기 위해 분화(CD)45 양성 및 음수 집단의 클러스터를 기반으로 실행 가능한 단일 가래 세포를 분석하는 방법을 설명한다. 품질 관리 측정은 또한 견본이 폐에서 파생되고 타액이 아니라는 것을 기록으로 폐 특정 대식세포를 확인해서 제공됩니다. 마지막으로, 이 방법은 3개의 유동 세포계에서 분석된 동일한 환자에게서 가래 프로파일을 제공함으로써 상이한 세포측정 플랫폼에 적용될 수 있다는 것이 입증되었다; 나비오스 EX, LSR II 및 가사. 더욱이, 이 프로토콜은 관심의 추가 세포 마커를 포함하도록 수정될 수 있다. 유동 세포측정 플랫폼에서 전체 가래 샘플을 분석하는 방법이 여기에 제시되어 폐 질환의 고처리량 진단을 개발하기 위해 가래가 가능하도록 합니다.
Introduction
흐름 세포계의 하드웨어 및 소프트웨어의 기술적 발전으로 인해 많은 별개의 세포 집단을 동시에 식별할 수 있게 되었습니다1,2,3,4. 조혈 세포 연구에서 유동 세포계의 활용은 예를 들어, 면역 체계2및 조혈계의 세포 계층 구조에 대한 훨씬 더 나은 이해를 주도하고 있으며, 다양한 혈액암의 진단 구별을 이끌어 냈다6,7,8. 대부분의 가래 세포는 조혈 기원9,10,11이지만, 유동 세포분석은 진단 목적을 위해 가래 분석에 널리 적용되지 않았습니다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 가래에 있는 면역 세포 인구의 평가 (세포의 가장 중요한 부분 집합)가 천식과 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)12,13,14,15와 같은 질병을 진단 및/또는 모니터링하는 데 큰 도움이 될 수 있음을 시사한다. 더욱이, 유동 세포측정에 사용될 수 있는 상피 특이적 마커의 존재는 가래, 폐 상피 세포에서 세포의 다음 가장 중요한 부분 집합의 심문을 허용한다.
다른 조직 기원의 많은 뚜렷한 세포 집단을 분석하는 기능 이외에, 유동 세포계는 상대적으로 짧은 기간에 많은 수의 세포를 평가할 수 있다. 이에 비해 슬라이드 기반 의 세포학적 유형의 분석에는 고도로 전문화된 인력 및/또는 장비가 필요한 경우가 많습니다. 이러한 분석은 노동 집약적 일 수 있으며, 이는 분석되는 가래 샘플의 비율만으로 이어집니다16.
세 가지 중요한 문제는 유동 세포 측정에 가래의 광범위한 사용을 제한합니다. 첫 번째 문제는 가래 의 컬렉션에 관한 것입니다. 가래는 폐에서 구강으로 점액을 추방하는 허프 기침을 통해 수집되어 수집 컵에 침을 뱉습니다. 점액은 구강을 통과하기 때문에 SEC 오염의 가능성이 높습니다. 이 오염은 표본 분석을 복잡하게 하지만 이 연구에서와 같이 유동 사이토메트릭 플랫폼에서 문제가 쉽게 수정됩니다.
모든 사람이 자발적으로 가래를 생산할 수 있는 것은 아닙니다. 따라서, 비침습적 방식으로 가래 수집을 지원하기 위해 여러 장치가 개발되었다17. 분무기는 이러한 장치 중 하나이며 신뢰할 수있는 가래 샘플18,19,20을 생성하는 것으로 나타났습니다. 분무기는 비침습적으로 가래를 수집하는 매우 효과적인 방법이지만, 그 사용은 여전히 전문 인력이있는 의료 시설에서 설정이 필요합니다21. 대조적으로, 폐 플루트22,23,24 및 아카펠라16,25와 같은 핸드헬드 장치는 매우 사용자 친화적이기 때문에 집에서 사용할 수 있다. 이러한 보조 장치는 안전하고 비용 효율적입니다.
우리를 위해, 아카펠라는 폐 플루트16 보다는 일관되게 더 나은 결과를 주었고, 그러므로, 아카펠라 장치는 가래 수집을 위해 선택되었습니다. 가래를 사용하기 위한 주된 목적은 폐암 검출 시험16을 개발하는 것이기 때문에 3일 수집 샘플이 결정되었다. 3일 샘플은 1일 또는 2일 샘플26,27,28에 비해 폐암 검출 가능성을 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 다른 가래 수집 방법은 다른 목적을 위해 바람직할 수 있다. 상이한 가래 수집 방법이 여기에 기재된 것과 다른 가래 수집 방법이 사용되는 경우, 유동 세포 측정 분석에 사용되는 각 항체 또는 염료를 신중하게 적정하게 적정화하는 것이 좋습니다. 아주 작은 데이터는 다른 가래 수집 방법이 유동 세포측정을 위한 표적으로 한 단백질에 어떻게 영향을 미치는지에 유효합니다.
주로 유동 세포측정과 관련된 진단을 위한 가래사용에 대한 열정을 약화시키는 두 번째 문제점은 세포수이다. 문제는 신뢰할 수 있는 분석을 위한 충분한 실행 가능한 셀의 집합입니다. 두 가지 연구는 보조 장치의 도움으로 비 침습적 인 방법에 의해 수집 된 가래 샘플이 임상 진단 또는 연구 연구에서 활용할 수있는 충분한 실행 가능한 세포를 포함하고 있음을 입증16,24. 그러나, 이러한 연구의 어느 쪽도 흐름 세포 측정에 관한 세포 수의 문제를 해결.
이 프로토콜에 대한 기초를 형성하는 연구를 위해, 가래 견본은 각 연구 사이트에 대한 승인된 기관 지침에 따라 폐암 개발을 위한 고위험에 참가자에게서 집합되었습니다. 고위험 참가자는 55-75 년 사이 정의 되었습니다., 훈제 30 팩 년 지난 15 년 이내에 흡연을 종료 하지 않은. 환자는 제조 업체의 지침에 따라 아카펠라 장치를 사용하는 방법을 보여주었다29 집에서 3 일 연속 가래를 수집. 샘플은 마지막 컬렉션까지 냉장고에 보관되었습니다. 마지막 수집 일에, 샘플은 냉동 차가운 팩과 함께 하룻밤 실험실로 배송되었다. 샘플은 수신된 날에 단일 세포 현탁액으로 처리되었습니다. 가래 수집의 이 방법을 사용하여, 믿을 수 있는 유동 세포 측정 분석을 위해 충분한 실행 가능한 세포이상을 얻습니다.
마지막으로, 이전 세포 번호 문제와 관련, 그 뮤추얼 환경에서 가래 세포를 방출하는 방법의 문제입니다. 세포는 어떻게 실행 가능한 유지하고 흐름 세포계를 막히지 않는 단일 세포 현탁액을 만들 수 있습니까? Pizzichini et al.30 및 Miller 외.31의 초기 작업을 기반으로, 이 프로토콜은 유동 세포 측정 분석에 적합한 단일 세포 현탁액으로 가래 처리를 위한 쉽고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 유동 세포측정32,33,34에 잘 확립된 가이드라인을 사용하여 가래에 있는 조혈 및 상피 세포를 식별하고 계측기 설정, 품질 관리 조치 및 유동 세포 측정 플랫폼에서 가래 분석을 표준화하는 분석 지침을 제공하기 위한 효율적인 항체 라벨링 전략을 개발했습니다.
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Protocol
가래 처리의 모든 단계는 적절한 개인 보호 장비와 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
1. 가래 해리를 시작하기 전에 시약 준비
- 1% 파라포름알데히드(PFA), 얼음 샘플당 25mL를 해동하고, 사용할 때까지 차갑게 유지하십시오.
주의: PFA는 흡입 및 피부 접촉에 의해 유독합니다. 제조업체의 지시에 따라 고정을 준비하고 사용할 때까지 25 mL 알리코에서 -20 °C에서 동결하십시오. - 시료의 중량을 근사화하고 2.2단계의 경우 0.1% 디티오트레이톨(DTT)을 충분히 해동하고 37°C로 가져온다. (DTT의 알리쿼트는 사용하기 전에 -20°C에 보관해야 합니다.)
- 2.2단계의 경우 최대 37°C까지 0.5% N-아세틸-L-시스테인(NAC)을 가져오십시오. (NAC는 매주 신선하게 만들어 사용하기 전에 4 °C에서 저장해야합니다.)
2. 가래 해리
- 가래 시료의 무게를 측정하여 해리 시약의 양을 결정합니다.
참고: 샘플은 초기 중량이 ≤3g인 경우, 중간체가 ≤3g인 경우, 중간체가 >3g이지만 ≤8g, >8하지만 ≤16g의 경우 크고, 샘플의 무게가 >16g인 경우 초대형으로 간주됩니다. 작은 표시, 중간, 큰 및 초대형 표시는 프로토콜 전체에 걸쳐 사용됩니다. 절단 및 라벨링에 필요한 시약의 양은 가래 샘플의 크기에 따라 다릅니다. - 작은 샘플을 깨끗한 50mL 원추형 튜브, 중간 시료를 깨끗한 250mL 플라스틱 일회용 병으로 옮기거나 크고 초대형 샘플을 깨끗한 500mL 플라스틱 일회용 병에 옮기. 0.5% NAC의 1mL/g 샘플 무게와 0.1% DTT의 4mL/g 샘플 무게를 추가합니다.
- 최대 속도(15초)의 소용돌이를 한 다음 실온(최대 속도)에서 15분 동안 바위를 휘두를 수 있습니다.
- NAC 및 DTT를 중화시키기 위해 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)의 4부량으로 샘플을 희석시키는 데; 최대 속도로 빠르게 소용돌이를 가하고 최대 속도로 5 분 동안 실온에서 바위를 흔들수 있습니다.
- 100 μm 나일론 메쉬 셀 스트레이너를 통해 셀 서스펜션을 하나 이상의 50mL 원심분리기 튜브로 필터링하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다.
- 4°C에서 10분 동안 800 x g 의 세포 원심분리기. 수퍼내티컬을 흡습하고, 모든 펠릿을 15mL 원뿔튜브에 결합한 다음 동일한 조건을 사용하여 HBSS로 펠릿을 세척합니다.
- 가래 샘플의 초기 중량에 의해 결정된 버퍼의 부피에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
참고: 작은 샘플은 HBSS의 250 μL에서 재중단됩니다. 중간 시료는 HBSS의 760 μL에서 재중단됩니다. 크고 초대형 시료는 1460μL의 HBSS에서 재중단됩니다. - Trypan Blue를 사용하여 라이브/데드 셀 카운트에 대한 셀 서스펜션의 알리쿼트(aliquot)를 복용하십시오.
참고: 작은 샘플의 경우 5 μL을 사용합니다. 중간, 크고 초대형 시료의 경우 HBSS로 10 μL을 사용합니다.- 가래 희석의 10 μL을 0.4% Trypan Blue의 30 μL과 혼합하여 1:40의 최종 샘플 희석을 달성합니다. 세포 수를 위해 혈종계의 카운팅 챔버에 적재합니다.
참고: 정확한 수를 달성하기 위해 셀 수가 너무 낮거나 너무 높으면 최종 희석을 조정해야 할 수 있습니다. SEC와 파편으로부터 가래 세포를 올바르게 구별하기 위한 Guiot 등.20 을 상담하는 것이 좋습니다. 이것은 정확한 세포 수에 필수적입니다.
- 가래 희석의 10 μL을 0.4% Trypan Blue의 30 μL과 혼합하여 1:40의 최종 샘플 희석을 달성합니다. 세포 수를 위해 혈종계의 카운팅 챔버에 적재합니다.
- 초대형 샘플에서 총 50 x 106 셀을 제거하고 HBSS를 추가하여 새로운 튜브에 추가하여 총 1700 μL의 부피를 생성합니다.
참고: 프로토콜의 나머지 부분에 대해 큰 샘플을 고려합니다. 남은 샘플을 폐기하거나 다른 목적으로 사용할 수 있습니다.
3. 항체 및 생존 성 염료 염색
- 항체 및 염색염 선택
참고: 표 1 은 이 프로토콜과 그들이 식별하는 세포 집단에 사용되는 항체 및 생존성 염료를 보여줍니다.- 가래 세포를 포함하는 튜브에 라벨을 부착합니다(레이블의 표 2 참조).
- 비염색세포와 관과 함께 시료튜브에 대해 5mL 유동 세포측정관(사용된 유동 세포계와 호환)을 사용한다. 혈액 및 상피 관 샘플에 15 mL 원피스 튜브를 사용합니다.
참고: 이 견본은 항체 염색 및 고정다음 혈류 세포측정관으로 옮겨질 것입니다.
- 보상 튜브에 라벨을 부착합니다(표 3).
참고: 사용 중인 유동 세포계와 호환되는 5mL 유동 세포측정관을 사용하십시오. - 표 2 및 표 3에 표시된 바와 같이 각각의 가래 세포 튜브 및 보상 튜브에 HBSS, 항체 및/또는 염료의 양을 추가합니다.
참고: 모든 튜브의 염색 시간이 일관되도록 세포 또는 보상 구슬을 추가하기 전에 모든 튜브에 버퍼(HBBS), 항체 및 염료를 추가합니다. - 표 2에 나열된 가래 세포 볼륨의 양을 분석 튜브에 추가합니다.
- 표 3에 나열된 보상 튜브에 보상 구슬을 추가합니다.
- 빛으로부터 보호되는 얼음에 모든 튜브(분석 및 보상 튜브)를 35분 동안 배양합니다. 그런 다음 800 x g에서 10 분 동안 4 °C에서 얼음 차가운 HBSS 및 원심 분리기로 튜브를 채웁니다.
- 보상 튜브의 경우, 가능한 한 펠릿에 가까운 슈퍼 나탄을 흡인하고 풀기 위해 펠릿을 쓸어.
- 보상 튜브에 0.5 mL의 차가운 HBSS를 추가하고 4 ° C의 얼음에 저장하고 유동 세포 분석에 필요할 때까지 빛으로부터 보호하십시오.
- 원심분리 후 얼룩이 없는 동위형, 혈액 및 상피 관으로부터 상퍼를 흡인하고(항체 염색 섹션에서 3.6단계) 튜브를 가볍게 하여 펠릿을 풀어줍니다.
4. 1% 파라포름알데히드 (PFA)로 고정
- 감기 1% PFA (지금까지 해동해야) 얼룩되지 않은, 동종형, 혈액 및 상피 튜브에 추가; 2 mL을 염색되지 않은 및 동형 튜브에, 혈액 및 상피 튜브에 10 mL.
- 1시간 동안 빛으로부터 보호되는 얼음에 튜브를 배양합니다. 30분 후 최대 속도로 빠르게 소용돌이를 가합니다.
- 얼음 차가운 HBSS로 튜브를 채웁니다. 그런 다음 원심분리기 튜브는 4°C에서 1600 x g에서 10분 동안 합니다.
- 세포 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 슈퍼 나티를 흡인하고 세포를 느슨하게손가락으로 튜브를 쓸어 넘깁니다.
- 200 μL의 차가운 HBSS를 얼룩이 없는 및 이소타입 튜브에 추가합니다.
- 총 세포 수에 따라 혈액 및 상피 관의 재발을 위해 HBSS의 부피를 계산합니다.
참고 : 재서스펜션 볼륨 = 0.15 x [총 세포 수 (가래 의 8 단계) / 106]. 초대형 샘플의 셀 수로 50 x 106 을 사용합니다. - 모든 샘플 및 보정 튜브를 저장하여 유동 세포 측정 분석이 수행될 때까지 얼음의 빛으로부터 보호됩니다.
참고: 이 프로토콜은 24시간 이상 저장소에 대해 테스트되지 않았습니다.
5. 유동 세포계에 대한 데이터 수집
- 사용되는 흐름 사이토미터에 적합한 시작 절차를 적용합니다.
참고: 이 프로토콜의 이 섹션에서는 유동 세포계를 운영하는 사람이 사용할 수 있는 계측기의 사용에 대해 교육을 받았으며, 특히 광학 및 유체 시스템의 안정성 확인, 광 산란 및 형광 강도 표준화를 위한 기술, 올바른 보상 매트릭스를 계산하고 적용하는 등의 일상적인 절차에 관한 것으로 가정합니다. - 국립 표준 기술 연구소 (NIST) 구슬의 혼합물을 사용하여 앞으로 분산 및 측면 산란 전압이 구슬을 축에 너무 가까이 두지 않고 전체 플롯에 걸쳐 NIST 구슬을 배치하도록 설정되어 있는지 확인합니다.
참고: 이 단계는 5μm 미만의 이물질을 인수 후 분석을 통해 제거할 수 있도록 하는 데 매우 중요합니다. 사용되는 유동 세포계에 따라 가장 작은 구슬이 임계값(LSR II 또는 가사를 사용할 때) 또는 높은 차별(Navios EX 흐름 사이토미터 사용)으로 제외되지 않는다는 점을 염두에 두어야 합니다. Navios EX의 경우, 전방 및 측면 분산, 전방 분산용 236의 전압, 측면 분산에 대해 250의 게인이 사용되었다. LSR II의 경우, 165의 전방 산란 전압과 190의 측면 산란 전압이 사용되었습니다. - 유량을 중간(LSR II) 또는 높음(Navios EX)으로 설정합니다.
참고: 대부분의 기기의 중간 또는 높은 유량은 가래 튜브를 획득하는 데 사용할 수 있습니다. 유량의 너무 느리거나 시료의 너무 희석을 사용하면 세포가 침전되어 바람직하지 않은 소용돌이가 증가할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 4.6 단계에서 계산된 리서스펜션 볼륨을 준수하면 신속하게 획득할 수 있지만 기계를 막지 는 않는 셀룰러 밀도가 발생합니다. - 분산 및 형광 파라미터에 사용되는 각 매개 변수에 대한 전압을 조정하여 세포 모집단을 스케일에 배치합니다. 게이팅 전략과 함께 수치를 사용하여 전압을 조정하는 방법에 대한 지침으로 사용합니다.
참고: 필요한 모든 매개 변수가 수집 하기 전에 매개 변수 선택 창에서 선택 되거나 데이터를 수집 하지 않습니다 있는지 확인 합니다. - 먼저 얼룩이 없는 가래 샘플에 대한 데이터를 획득한 다음, 동형 염색 샘플, 그리고 혈액 관 및 상피 관에 대한 데이터를 수집합니다.
참고: 세포 현탁액이 너무 집중되어 서세포계가 막힘 없이 시료를 실행할 수 있도록 하는 경우, 샘플은 HBSS로 더 희석될 수 있다.
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Representative Results
이 프로토콜은 임상 실험실 설정을 염두에 두고 개발되었습니다. 프로토콜을 개발하는 동안 초점은 단순성, 효율성 및 재현성에 있었습니다. 가래 처리에서 가장 시간이 많이 소요되는 단계가 세포를 세는 것으로 나타났습니다. 따라서, 프로토콜은 가래 처리 및 세포 라벨링이 시간 손실 없이 세포 계산과 독립적으로 수행될 수 있는 방식으로 설정된다. 가려지지 않은 실행을 위해 시료를 적절히 희석하는 데 여전히 필요한 정확한 세포 수는 항체 라벨링 인큐베이션 기간 동안 얻을 수 있다.
이 프로토콜은 세포 수 대신 가래 중량 측정을 최적의 세포 라벨링에 사용할 항체/염료의 표시로 사용합니다. 그러나, 가래 샘플의 무게에 큰 정도의 변화가 있다; 분석된 126개의 샘플 중, 무게는 0.57g내지 38.30g까지 다양 하였다. 따라서 샘플은 네 가지 범주로 나뉘었다. 샘플의 중앙값은 작은 시료의 경우 2.1g, 중간 시료의 경우 5.0g, 대형 시료의 경우 11.2g, 초대형 시료의 경우 22.0g이었다(그림 1B). 그러나, 그들의 무게에 근거를 둔 예상보다 훨씬 더 많은 세포를 산출하는 견본이 아직도 있었습니다 (그림 1C), 견본의 대다수는 멋지게 군집했습니다. 작은 샘플의 경우, 중간 세포 수율은 8.0 x 106 세포, 중간 샘플 13.0 x 106, 대형 샘플 35.4 x 106 및 초대형 샘플 93.0 x 106이었다.
이 프로토콜에 사용된 각 항체는 적정화되었다. 적정 곡선의 가장 높은 염색 지수(도 2B)를 가진 고원상상(도 2A)에 대한 농도가 작업 농도로 선택되었다. 세포 수의 변이는 염색 강도를 크게 변경하지 않습니다. 이 항체 적정 및 시험은 필수적이고 이 프로토콜에 사용된 각각의 새로운 항체 또는 염료를 주의해서 설치되어야 합니다34,35. 항체가 주의를 기울여 성화될 때, 항체가 적정된 세포의 수보다 10~50배 더 많은 세포를 염색해야 한다34,35. 이 원리의 예는 표 4에 제공됩니다. 항인간 CD45-PE 항체는 400 μL의 총 부피에서 1 x 106 세포에 적정하였다. 이 항체가 염색 부피가 프로토콜에 추정되는 경우(각 샘플 크기에 대한 CD45-PE 수량 및 염색 량을 나타내는 표 2 참조), 작은 샘플에 대해 0.625 x 106 세포가 염색되고, 1.25 x 106 세포는 중간 샘플에 대해 염색되고, 1.5 x 106 세포는 중간 샘플에 대해 염색되고, 2.5 x 106 세포는 대형 주(표 4)에 대해 염색될 것이다. 각 범주에 대한 셀 번호의 50배 초과값은 각각 31.25 x 106, 62.5 x 106 및 125 x 106셀(열 B)으로 계산됩니다. 열 C 및 D에 도시된 바와 같이 각 크기 범주의 중앙값 셀 수와 각 범주에서 가장 큰 샘플은 50배 범위 내에 있습니다.
가래 샘플의 다양한 크기 사이의 크기와 세포 수율의 명백한 차이에도 불구하고 각 범주의 평균 %SEC 오염은 매우 유사합니다. 그림 3A 는 가래 중량 범주에 따라 계층화된 개별 샘플에서 발견되는 SEC의 백분율을 보여줍니다. 주요 관심사는 이 세포가 폐 조직의 대표가 아니라 구강의 대표이기 때문에 SECs와 함께 있었습니다. 그러나 모든 카테고리의 평균 SEC 오염은 20% 미만입니다. 그림 3B 는 이러한 샘플에서 발견되는 실행 가능한 세포의 백분율을 보여줍니다. SEC를 제외한 평균 생존 가능성은 소형, 중형 및 대형 샘플 크기 범주의 경우 약 72%였습니다. 초대형 카테고리의 경우 약간 높았습니다(79%).
도 4는 관심 있는 가래 세포를 이물질, 죽은 세포(오염SECs36 포함) 및 세포 덩어리로부터 분리하는 전형적인 게이팅 전략을 나타낸다. 도 4A는 NIST 구슬을 사용하여 5 μm 이하 또는 30 μm 이상의 이물질을 제거하기 위해 게이트를 설정하고 그림 4B는 가래 세포에 이 게이트를 적용합니다. 도 4C는 전방 분산 폭(FSC-W), 너비 게이트에 대한 측면 분산 폭(SSC-W)으로 볼 때 일반적인 가래 프로파일을 나타낸다. 이 프로파일은 SSC-W 및 FSC-W 축을 따라 나타나는 작은 파편을 제거하는 데 사용됩니다. 죽은 세포의 제거는 그림 4D 및 도 4E에 표시됩니다. 스테인드 컨트롤(도 4D)은 FVS510 양성에 대한 컷오프를 결정하는 데 사용됩니다. 음의 대조군 위에 FVS510에 대해 양성 얼룩이 있는 세포는 죽은 것으로 간주되며 가래 세포 분석에서 사용되지 않습니다(도 4E). 마지막으로, 도 4F에 도시된 분석에서 셀 더블을 제거하기 위해 단일 게이트가 적용됩니다. 따라서, 도 4B, 도 4C, 도 4E 및 도 4F에 도시된 선택 게이트를 통해 이를 만든 세포는 본 프로토콜에 사용되는 항체를 이용한 후속 분석을 위한 라이브, 단일 가래 세포를 나타낸다.
이 라벨링 프로토콜에서 항 CD45 항체를 사용하면 살아있는 단일 가래 세포를 혈액(CD45+) 세포 구획 및 비혈액(CD45-) 세포 구획으로 분리할 수 있습니다. 후자의 범주는 상피 세포 및 그밖 비 혈액 세포를 포함합니다. 그림 5A 의 상단 프로파일은 CD45 양성에 대한 컷오프를 설정하는 스테인드 가래 샘플의 사용을 보여 주며, 게이트는 CD45+ 셀 및 CD45- 셀을 캡처하도록 렌더링합니다. 도 5A 의 바닥 프로파일은 항 CD45 항체로 염색된 가래 샘플에 적용된 이 두 게이트를 모두 나타낸다. 추가 항체를 가진 염색은 CD45- 게이트 내의 혈액 세포 특이적 집단을 식별하는 데 사용됩니다 (도 5B) 및 CD45- 게이트에 있는 상피 집단을 포함하여 그밖 비 혈액 세포 집단 (도 5C). 두 수치 모두에서, 상단 프로파일은 이중 음수 집단을 설정하는 데 이소타입 얼룩가래 가래가 어떻게 사용되는지 보여주고, 바닥 프로파일은 항체 염색 가래 세포를 보여줍니다. 도 5B (bottom)는 FL3 채널에서 검출가능한 형광(FL) 1 채널(항 CD66b, CD3, CD19 항체) 및 항 CD206에서 검출가능한 항체의 칵테일로 생성된 6개의 다른 CD45+ 세포 집단을 나타낸다. 선별 실험은 폐 특이적 대식세포가 M로 확인된 게이트에 상주한다는 것을 밝혔습니다. 따라서 이러한 게이트에 있는 세포의 존재는 가래 견본이 폐에서 파생되고 타액이 아니었다는 것을 나타냅니다 (Bederka et al., 준비에 있는 원고). 도 5C (bottom)는 FL1 채널 및 항상피 세포 접착 분자(EpCAM) 항체에서 검출가능한 항범 세포케라틴(panCK)으로 생성된 게이팅 사분면을 CD45- 가래 세포 중 FL3 채널에서 검출할 수 있다.
이 라벨링 프로토콜은 Navios EX 및 LSR II에서 광범위하게 테스트되었습니다. 일부 예비 실험은 가사에서 수행되었지만 다른 두 기계에 대해 수행 된 광범위한 계측기 최적화없이 수행되었습니다. 따라서 재료 시트의 Navios EX 및 LSR II에는 자세한 계측기 설정이 제공되지만 가사에는 제공되지 않습니다. 가래 세포를 분석하는 데 사용할 수 있는 이들 3개의 유량 세포측정 플랫폼 간의 유사점 및 변형을 이해하기 위해 다양한 기계에서 얻은 프로파일은 도 6 및 도 7에서 비교될 수 있다. 2개의 큰 가래 견본은 처리되고, 풀로, 표지되고, 3개의 동등한 부분으로 분리되고, 그 후에 위에서 언급한 각 유동 사이토미터에 취득되었습니다. 그림 4와 유사한 그림 6은 이물질, 죽은 세포 및 세포 덩어리를 제거하기위한 게이팅 전략을 비교합니다. 도 7은 도 5와 동일하며, 다양한 흐름 사이토미터에서 획득한 데이터로부터 혈액 및 비혈액 프로파일을 비교한다.
세 가지 다른 유동 세포계로부터 얻은 다양한 프로파일을 비교하면 각 계측기에서 동일한 기본 프로파일을 관찰할 수 있음을 보여 집니다. 주의를 기울여야 할 차이점은 SSC-W/FSC-W(너비 게이트) 플롯(그림 6, 두 번째 행) 및 분산 플롯의 선형 축척(그림 6 및 7)입니다. Navios EX에서 생성된 분산 폭 플롯은 포함 게이트(red box)를 나타내며, 이는 게이트에 포함된 모든 셀이 더 분석됨을 의미합니다. 왼쪽 하단 모서리의 축을 따라 이벤트가 제외됩니다. LSR II의 분산 폭 플롯과 가사는 이러한 동일한 축을 따라 유사한 이벤트 예치가 표시되지 않습니다. 이러한 불일치는 Navios EX에서 사용되는 매우 민감한 임계값으로 인해 이전 크기 배제 게이트( 그림 6의 맨 위 행)에 작은 파편이 생겨나기 때문일 수 있습니다. 때때로, 파편은 LSRII에서 생성 된 산란 폭 프로파일의 축을 따라 볼 수 있지만, 오른쪽 하단 모서리에 있습니다. 이러한 경우 제외 게이트( 도 6의 행 2의 가운데 프로파일의 가운데 프로파일에 있는 파선된 빨간색 상자로 표시)가 추가 분석에서 이러한 이벤트를 제거하는 데 사용됩니다.
로그 스케일은 Navios EX와 가사와 LSR II 사이토미터 사이의 플롯에서 약간 다르게 보이지만 Navios EX는 수십 년 더 많은 데이터를 사용하여 데이터를 수집할 수 있습니다. 더 많은 수십 년을 구현하는 것은 실험의 맥락과 관심있는 인구를 시각화하는 원하는 감도에 달려 있습니다.
Navios EX와 LSR II 및 가사 사이토미터 사이의 또 다른 주목할만한 차이점은 단일 게이트의 프로파일의 모양입니다. Navios EX 세포계에는 LSR II와 는 다른 수집 각도를 가진 직사각형 유동 셀이 장착되어 있습니다. Navios EX에는 입자 크기분석에 적합한 감도를 달성하기 위해 전방 각도 광 산란을 최적화하는 세 가지 소프트웨어 제어 수집 각도가 포함되어 있습니다. Navios EX 세포계의 다각형 게이트는 LSRII의 단일 게이트보다 약간 낮은 각도로 조정되어야 합니다. 가사에 대한 단일 게이트는 LSR II와 유사한 프로파일을 얻기 위해 최적화 할 수 있습니다. 가래 샘플을 사용하여, 영역 스케일링 계수는 LSR II와 유사한 단일 게이트를 달성하기 위해 가사에 각 레이저에 최적화될 필요가 있을 것이다.
그림 4에서 그림 7에 표시된 모든 프로파일은 FlowJo 소프트웨어, 버전 10.6으로 분석되었습니다. .fcs 파일은 FlowRepository(https://flowrepository.org), IDs FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ 및 FR-FCM-Z3MM하에서 찾을 수 있으며 이러한 수치에 도시된 바와 같이 가래 분석을 연습하는 데 사용할 수 있다.
도 1: 가래 중량 및 세포 수율. (A) 묘사된 가래 중량, 처리 전에 결정된 및 총 세포 수율 사이의 관계, 혈류계를 이용하여 처리 후 결정된다. 각 글머리 기호는 개별 샘플을 나타내며 총 126개입니다. (B) 가래 샘플은 무게에 따라 4가지 범주로 계층화되었다: 최대 3g의 표본을 위한 작은, 최대 8g까지 3g 이상의 표본을 위한 매체, 8g 이상 무게 의 샘플에 대 한 큰 16 g. (C) 16 g. (C) 각 범주의 샘플에 대 한 셀 수율의 분포를 보여 주었다. (B) 및 (C)의 빨간색 막대는 각 범주의 중앙값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 항인간 CD45-PE용 항체 적정. (A) 1 μg/mL에서 CD45-PE 항체 고원의 농도에 비해 플롯된 양성 집단의 평균 형광 강도(MFI)를 가진 CD45-PE(IgG1) 적정 곡선. (b) 항체 농도 대 염색 지수를 묘사한 적정 곡선은 가장 높은 염색 지수가 1 μg/mL이다. 염색 지수는 [CD45 MFI 양성 인구 - CD45 MFI 음수] / [2 * 표준 편차]로 계산되었습니다. 도 2A 및 도 2B에 기초하여, 1 μg/mL은 CD45-PE 항체에 대한 최적의 농도로 선택되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 가래 샘플의 SEC 및 죽은 세포의 비율은 4가지 중량 범주 중 일관되습니다. (A) 가래 샘플의 SEC 비율은 그들의 체중 범주에 따라 분류된다. 백분율 SEC 오염은 총 세포 수의 한 부분으로 혈류계에 의해 결정되었습니다. (B) 혈류계 및 트라이판 블루 배제 방법에 의해 결정된 SECS를 제외한 가래 샘플의 세포 생존가능성. 각 그래프에 대해 빨간색 선은 중앙값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 가래 샘플에서 이물질, 죽은 세포 및 두 배를 제외하기 위한 게이팅 전략. (A) NIST 구슬크기 5 μm, 20 μm 및 30 μm의 NIST 구슬은 5 μm 이상의 파편과 30 μm 이상의 파편과 축에 가까운 이물질을 배제하기 위해 빨간색 상자에 표시된 게이트를 설정하는 데 사용되었습니다. (B) NIST 구슬의 것과 동일한 전방 및 측면 분산을 위해 가래 샘플을 획득하였다. 파편을 배제하기 위해 (A)에서 생성된 게이트가 적용되었습니다. (C) 축에 가까운 작은 파편은 이 산란 폭 플롯에서 제외되었다. (D) 스테인드 가래 샘플은 생존성 염료에 대한 음수, 얼룩지지 않은 집단에 대한 컷오프(red line)를 설정하는 데 사용되었습니다. (E) D에서 생성된 컷오프는 살아있는 실행 가능한 세포를 포함하는 게이트(red box)를 형성하기 위해 스테인드 가래 샘플에 적용되었다. (F) 적색 다각형으로 표시된 단일 게이트는 대각선에 떨어지지 않는 세포를 배제하여 이중 및/또는 덩어리를 제거합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 혈액 및 비혈액 세포 구획으로 가래 세포의 게이팅 전략. (A) 단일 게이트에서 파생된 비스테인드 가래 세포는 CD45(상단)에 대한 부정적인 집단에 컷오프(red line)를 설정하는 데 사용된다. 상단 프로파일의 컷오프는 CD45 양성(CD45+) 및 음수 집단(CD45-)을 구분하기 위해 염색된 가래 샘플(아래쪽)에 적용됩니다. (B) FITC/AF488용 동위원소 항체로 염색된 CD45+ 가래 세포는 음수 집단(상단)에 게이트를 설정하는 데 사용된다. 동일한 게이트는 CD3, CD19, CD66b 및 CD206(아래)로 염색된 CD45+ 가래 세포에 적용됩니다. (C) 쿼드런트 게이트는 CD45- 가래 세포에 등색형 컨트롤(상단)으로 염색되어 상피 마커 팬 사이토케라틴(panCK) 및 EpCAM(아래)으로 염색된 가래 샘플로부터 CD45- 세포에 적용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 세 개의 유동 세포화 플랫폼에서 얼룩진 가래 세포의 파편, 덩어리 및 죽은 세포를 배제하는 게이팅 전략. 나비오스 EX(A), LSR II(B), 가사(C) 유량 사이토미터에 대한 취득을 위해 두 개의 큰 가래 샘플을 처리, 풀, 라벨, 세 개의 동등한 부분으로 나뉘었다. 상단 행: 가래 샘플은 매우 작고 큰 파편을 배제하기 위해 게이트(빨간색 상자)로 되어 있었습니다. 두 번째 행: Navios EX 플롯의 큰 빨간색 상자는 셀을 포함하지만 이물질을 제외하는 포함 게이트를 나타냅니다. LSR II 플롯에서 볼 수 있는 파선된 작은 빨간색 상자는 추가 분석에서 이물질을 제거하는 제외 게이트를 나타냅니다. 이물질 배제 게이팅이 필요한 위치를 결정하기 위해 가사와 의 추가 최적화가 필요합니다. 따라서 해당 플롯에는 게이트가 없습니다. 세 번째 행: 빨간색 직사각형 게이트에는 추가 분석을 위한 라이브 셀이 포함됩니다. 아래쪽 행: 다각형 게이트에는 게이트의 대각선 외부에 떨어지는 이중을 제외하여 단일 셀이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 세 가지 흐름 세포 측정 플랫폼에 혈액 및 상피 마커에 얼룩진 가래에 대한 게이팅 전략. 도 6 에 도시된 분석은 도 7에서 계속된다; 모든 실행 가능한 단일 세포(아래쪽 행, 도 6)는 CD45+ 와 CD45- 인구(첫 번째 행, 도 7)로 나누어 혈액 세포 특이적 마커및 상피 세포 특이적 마커가 이러한 인구를 더욱 묘사할 수 있도록 하였다. 두 번째 행: CD45+ 세포로부터 의 혈액 세포 마커 CD3/CD19/CD66b 및 CD206의 프로파일. 세 번째 행: CD45- 세포로부터 상피 세포 마커 panCK 및 EpCAM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 항체/얼룩 | 목적 |
| FVS510 | 생존 성 얼룩 |
| 안티-휴먼 CD45 – PE | 범류세포 마커; PE 보상 |
| 반인간 CD66b – FITC | 과립구 마커 |
| 반인간 CD3 – 알렉사488 | T 셀 마커 |
| 반인간 CD19 – 알렉사488 | B 세포 마커; FITC/Alexa488 보상 |
| 항인간 CD206 – PE-CF594 | 폐 대식세포 마커; PE-CF594 보상 |
| 반인간 엡캠 – PE-CF594 | 상피 세포 마커; PE-CF594 보상 |
| 항인간 범세포근 (panCK) – Alexa488 | 상피 세포 마커 |
| IgG1θ – 알렉사488 | CD3/CD19/팬CK 동종타입 제어 |
| IgG1θ – FITC | CD66b 동종형 제어 |
| IgG1θ – PE-CF594 | CD206/엡캠 동종형 제어 |
| 안티-휴먼 CD45 – BV510 | FVS510 보상 |
표 1: 항체 및 생존 성 얼룩사용. 이 프로토콜에 사용되는 항체 및 생존성 염료 목록. 표시된 셀룰러 하위 집합은 각각 식별합니다.
| 튜브 (라벨) | 샘플 크기* | HBSS (μL) | FVS510 (μL) | CD45 (μL) | 기타 항체(μL) | 셀 § (μL) | |||
| 얼룩이 없는 | 작다 | 80 | 20 | ||||||
| 보통 | 50 | 50 | |||||||
| 큰 | 50 | 50 | |||||||
| IgG1θ - 알렉사488 | IgG1θ- FITC | IgG1θ - PE-CF594 | |||||||
| 등형 제어 | 작다 | 60.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 20 | |
| 보통 | 30.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| 큰 | 30.25 | 1 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| CD206 | CD3 | CD19 | CD66b | ||||||
| 피 | 작다 | 92.875 | 1.5 | 25 | 1.875 | 5 | 1.25 | 7.5 | 115 |
| 보통 | 65.75 | 3 | 50 | 3.75 | 10 | 2.5 | 15 | 350 | |
| 큰 | 102.5 | 10 | 100 | 7.5 | 20 | 5 | 30 | 725 | |
| 엡캠 | 판크 () | ||||||||
| 상피 | 작다 | 96.5 | 1.5 | 25 | 10 | 2 | 115 | ||
| 보통 | 73 | 3 | 50 | 20 | 4 | 350 | |||
| 큰 | 117 | 10 | 100 | 40 | 8 | 725 | |||
| * 견본은 프로토콜의 가래 해리 섹션의 1 단계에서 결정된 중량에 근거를 둔 작은, 중간 또는 큰 여겨됩니다. | |||||||||
| § 모든 시약이 배분된 후에 세포를 추가해야 하며, 보상 관에 있는 분(표 3)을 포함하였습니다. | |||||||||
표 2: 가래 세포가 있는 튜브의 내용. 이 표를 프로토콜에 참조한 대로 사용하여 적절한 샘플 크기에 대한 지정된 항체 및 생존 성 얼룩을 추가합니다.
| 튜브 (라벨) | 시약 추가(μL) | 시약 추가(드롭) | ||||||
| HBSS | CD45-PE | CD206-PE-CF594 | 엡캠-PE-CF594 | CD19-알렉사488 | CD45-BV510 | 컴피비드 (+) | 컴비드 * (-) | |
| PE 컴포지션. | 76 | 4 | x | x | x | x | 1 | 1 |
| PE-CF594 컴포지션. | 72 | x | 4 | 4 | x | x | 1 | 1 |
| 알렉사488/FITC 컴포지션. | 60 | x | x | x | 20 | x | 1 | 1 |
| BV510 컴포지션. | 60 | x | x | x | x | 20 | 1 | 1 |
| * 모든 시약이 배포되고 표 2의 튜브가 준비된 후 양수(+) 및 음수(-) 구슬을 추가해야 합니다. | ||||||||
| comp. = 보상 | ||||||||
표 3: 보상 튜브의 내용. 이 테이블을 프로토콜에서 참조한 대로 사용하여 보정 구슬에 지정된 항체 의 양을 추가합니다.
| 셀 번호(x 106) | ||||
| A | B | C | D | |
| 샘플 크기 | 염색 볼륨 * | 50배 액세스 ¶ | 중앙값 샘플(접이식 액세스) # | 가장 큰 샘플 (접이식 액세스) # |
| 작다 | 0.625 | 31.25 | 8.0 (12.8) | 24.77 (39.6) |
| 보통 | 1.25 | 62.5 | 13.0 (10.4) | 48.87 (39.1) |
| 큰 | 2.5 | 125 | 35.4 (14.2) | 113.5 (45.4) |
| * 프로토콜에 사용되는 염색 볼륨 (표 2). 셀 번호는 적정 곡선이 수행된 방식에서 추정됩니다. CD45-PE의 1 μg/mL 및 200 μL 당 1 x 106 셀. | ||||
| ¶ 열 A에서 셀 번호의 50 배 액세스. | ||||
| # 열 C 및 D의 접이식 액세스는 열 A의 해당 셀의 숫자로 열 C 또는 D의 셀에 제시된 숫자를 분할하여 계산됩니다. | ||||
표 4: 각 샘플 크기 범주의 모든 샘플에 대한 항인간 CD45-PE 농도.
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Discussion
가래의 세포 함량은 광범위한 세포의 큰 다양성을 포함, 종종 파편을 많이 동반37. 또한, 가래 분석은 구강 대신 폐로부터 채취되는 시료를 확인하는 품질 관리를 필요로한다38. 따라서, 혈액, 예를 들어 훨씬 더 깨끗하고 균일한 세포 현탁액을 방출하는 혈액에 대한 것처럼 혈류 세포측정에 의해 가래를 분석하는 것은 간단하지 않다. 이 프로토콜은 이러한 모든 문제를 해결했습니다 : 가장 작은 세포 집단과 가장 큰 세포 집단을 모두 감지 할 수 있도록 특정 크기의 구슬을 사용하여 계측기 설정을 제공, 파편을 제거하기위한 게이팅 전략, 세포 덩어리, SEC 및 기타 죽은 세포를 오염, 마지막으로, 가래 샘플을 보장하기위한 품질 관리 조치는 주로 타액이 아닌 폐에서입니다.
스래텀을 작업하는 데 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 세포 수율은 프로토콜의 가래 해리 부분의 2.5 단계에서 사용되는 나일론 세포 스트레이너의 수에 의해 크게 영향을 받을 수 있다. 여러 스트레이너는 스트레이너의 막힘으로 인해 너무 많은 세포를 잃지 않도록 해야 할 수 있습니다. 스트레이너를 통한 흐름이 눈에 띄게 느려지면 새로운 스트레이너를 사용해야 합니다. 둘째, 가래 샘플의 세포 펠릿은 특히 SEC의 오염이 높은 경우 매우 느슨할 수 있습니다. 따라서 시료원심분리 후 상환을 제거할 때 펠릿에 너무 가깝게 흡인하지 않는 것이 필수적이다. 펠릿에 너무 가깝게 호흡하면 전체 펠릿의 손실이 아니라면 세포 손실이 발생할 수 있습니다. 셋째, 이 프로토콜에는 고정 단계가 필요합니다. 이것은 세포와 그들의 염색 단면도를 보존하고 유동 세포계 연산자를 보호하기 위하여 안전 측정역할을 합니다. 특정 유량 세포계에서 시료를 실행하는 것은 에어로졸 생산39의 잠재력으로 인해 증가된 생물학적 위험을 초래할 수 있다. PFA 고정은 가래 샘플의 잠재적 인 병원균으로부터 운전자를 보호하는 데 도움이됩니다. 넷째, 아마도 유동 세포 측정 분석을 위한 가래 견본을 준비하는 것의 가장 도전적인 양상은, 세포 계산입니다. 세포 계수는 가래에 존재하는 세포 유형의 큰 다양성 때문에 복잡하다. 카운팅 기계는 종종 캡처할 수 있는 셀 크기 범위에 의해 제한되므로 혈종계보다 신뢰성이 낮습니다. 그러나, 구이엇 등.20에 의해 우수하게 기술되는 혈류계에 의한 가래 샘플의 세포 세는 지루하고 능숙해지기 위한 연습이 필요합니다. 정확한 셀 넘버는 시료의 최종 재서스펜션 부피를 결정하는 데 필수적으로 합리적인 유량을 허용하고 유동 세포계의 나막신을 방지합니다. 가래 버퍼에 의해 분해되지 않고 필터에 의해 잡히거나 잡히지 않는 매우 큰 SEC및 많은 작은 세포 덩어리의 존재는 흐름 세포계를 막을 가능성을 증가시다. 따라서 사용 가능한 유량 사이토미터를 사용하여 데이터 수집을 위한 최상의 셀 농도/유량을 결정하는 데 시간을 할애하는 것이 좋습니다. 또한, 유동 세포계가 가래에 존재하는 더 큰 세포 집단을 측정할 수 있는 적절한 유동 셀 및 노즐 크기(또는 프로브)를 가지고 있는지 확인합니다.
세포 계산에 있는 숙련도가 달성된 경우에, 그것은 아직도 시간이 많이 걸리는 프로세스입니다. 따라서, 본 프로토콜에서 세포 라벨링에 대한 시약의 결정은 세포 수가 아닌 샘플 크기(중량에 의해 판단된 대로)를 기반으로 한다. 이를 통해 항체 및 생존 성 염료 염색에 필요한 시간 동안 수동 세포 수를 완료할 수 있기 때문에 시간을 보다 효율적으로 사용할 수 있습니다. 그러나 이에 대한 세 가지 주목할 만한 예외가 있습니다. 샘플이 >16g(소위 초대형 샘플)인 경우, 고가의 시약만 혈액 및 상피 튜브에 대해 각각 25 x 106 세포를 염색하여 보존할 수 있도록 수동 세포 수가 염색하기 전에 발생해야 합니다. 이 셀 번호는 이 프로토콜에 설명된 설정에서 매우 신뢰할 수 있는 프로파일을 제공합니다. 또 다른 잠재적 인 예외는 매우 작은 샘플의 경우입니다. 추정은 신뢰할 수 있는 프로파일(도시되지 않은 데이터)을 생성하기 위해 이 프로토콜에 제시된 유동 세포 분석에 최소 1-2 x 106 세포가 필요하다는 것이다. 따라서 샘플에 1-2 x 106 셀 미만이 포함되어 있는 경우 최종 결과가 허용되지 않을 수 있으므로 절차를 계속 할 가치가 없을 수 있습니다.
말초 혈액 세포 또는 세포주에서 잘 작동하는 특정 라벨시약은 가래에 포함된 혈액 세포 (공개되지 않은 관측)에서 매우 다르게 작동 할 수 있습니다. 따라서, 유동 세포측정 실험에 사용되기 전에 잘 확립된 프로토콜34,35에 따라 각 항체 또는 다른 라벨링 시약을 적티로 하는 것이 좋습니다. 대부분의 항체 적정은 10 에서 50 배까지 염색할 때 비교 가능한 결과를 주어야 합니다; 그러나, 그 range34 보다 더 높은 세포 번호와 추가 적정을 할 것이 좋습니다. 시약 농도가 결정되면 실제 실험과 동일한 시약의 잠복기를 유지하는 것이 필수적입니다. 이러한 이유로, 프로토콜은 세포 또는 보상 구슬이 추가되기 전에 모든 버퍼와 시약을 튜브에 추가하는 것을 강조합니다. 시약 및 셀/구슬을 함께 추가하는 이 순서는 라벨링 시간에 더 높은 일관성을 허용합니다. 어떤 이유로, 실험인 배양 시간이 항체/염료 적정에 사용되는 것과 유사하게 유지될 수 없다면, 후자는 실험 중에 가능한 잠복기시간으로 반복되어야 한다.
가래 샘플은 폐에 영향을 미치는 다양한 질병의 병리 생리학을 연구하기 위해 진단 시편으로 널리 사용되어 왔다. 결핵40,41, COPD13,42, 천식43, 낭포성 섬유증44,45, 폐암46,47,48, 류마티스 관절염49는 비침습적으로 수득된 표본이라는 장점으로 인해 가래가 연구되고 있는 많은 질병 중 하나입니다. 최근에는 코로나바이러스 전염병 동안, 가래는 코로나바이러스 질환으로 입원한 환자에서 장기간 바이러스 흘리기를 검출하는 데 사용되어 왔다(COVID-19)50.
역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR), 단백질 분석, 현미경 검사법 및 유동 세포측정을 포함한 다양한 기술이 가래에서 질병 특이적 마커를 식별하는 데 사용되어 왔다. 가래 샘플을 분석하기 위해 유량 세포 측정 플랫폼을 사용하는 것은 널리 사용되지 않지만 그 사용은 증가합니다. 최근 유동 세포계3,51,52기술의 발전과 형광의 화학, 신항체 클론 생성, 사세포 개체 수를 식별하기 위한 다양한 염료 의 개발 등으로 인체 질환 진단을 위한 항체 패널 설계 가능성이 크게 증가하고 있다. 또한, 최근 흐름 사이토메트릭 데이터 분석 자동화를 위한 추진55,56은 흐름 데이터를 수동으로 읽고 해석하는 잠재적 편향을 제거할 것이다. 유동 세포측정에 있는 이 새로운 발달은 임상 진단으로 가래의 탐구를 현저하게 촉진할 것입니다.
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Disclosures
모든 저자는 과거 또는 현재 의 생물 선호도 기술의 직원입니다.
Acknowledgments
데이비드 로드리게스가 피겨 준비를 해준 것에 대해 감사드립니다. 가래 샘플은 UT 헬스 샌안토니오 플로우 세포측정 공유 자원 시설에서 BD LSR II에서 실행되었으며, UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (UT Health의 CTRC) 및 UL1 TR001120 (CTSA 보조금)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Paraformaldehyde Flow-Fix | Polysciences | 25037 | |
| 100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
| 50 mL conical falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Alexa488 anti-human CD19 | BioLegend | 302219 | |
| Alexa488 anti-human CD3 | BioLegend | 300415 | |
| Alexa488 anti-human cytokeratin | BioLegend | 628608 | |
| Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype | BioLegend | 400129 | |
| BV510 anti-human CD45 | BioLegend | 304036 | |
| CD66b FITC isotype | BD Biosciences | 555748 | |
| CompBead Plus Compensation Beads | BD Biosciences | 560497 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
| CS&T beads | BD Biosciences | 655051 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| FITC anti-human CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 564406 | |
| FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
| FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| NAC | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NIST Beads, 05 μM | Polysciences | 64080 | |
| NIST Beads, 20 μM | Polysciences | 64160 | |
| NIST Beads, 30 μM | Polysciences | 64170 | |
| PE anti-human CD45 | BioLegend | 304039 | |
| PE-CF594 anti-human EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
| PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype | BD Biosciences | 562292 | |
| PE-CR594 anti-human CD206 | BD Biosciences | 564063 | |
| Sodium citrate dihydrate | EMD | SX0445-1 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 |
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