Summary
Denne protokollen beskriver en effektiv metode for å dissosiere sputum i en enkelt celle suspensjon og den påfølgende karakteriseringen av cellulære delsett på standard flow cytometriske plattformer.
Abstract
Sputum, som er mye brukt til å studere cellulært innhold og andre mikromiljøfunksjoner for å forstå lungens helse, analyseres tradisjonelt ved hjelp av cytologibaserte metoder. Verktøyet er begrenset fordi lesing av lysbildene er tidkrevende og krever høyt spesialisert personell. Videre gjør omfattende rusk og tilstedeværelsen av for mange squamous epitelceller (SECs), eller kinnceller, ofte en prøve utilstrekkelig for diagnose. I motsetning gir strømningscytometri mulighet for høy gjennomstrømning fenotyping av cellulære populasjoner samtidig som rusk og SECer utelates.
Protokollen som presenteres her beskriver en effektiv metode for å dissosiere sputum i en enkelt celle suspensjon, antistoff flekk og fikse cellulære populasjoner, og skaffe prøver på en strømning cytometrisk plattform. En gating strategi som beskriver utelukkelse av rusk, døde celler (inkludert SECs) og celle dobler presenteres her. Videre forklarer dette arbeidet også hvordan man analyserer levedyktige, enkle sputumceller basert på en klynge av differensiering (CD) 45 positive og negative populasjoner for å karakterisere hematopoietiske og epiteliale avgrensningsundergrupper. Et kvalitetskontrolltiltak er også gitt ved å identifisere lungespesifikke makrofager som bevis på at en prøve er avledet fra lungen og ikke er spytt. Til slutt har det blitt demonstrert at denne metoden kan brukes på forskjellige cytometriske plattformer ved å gi sputumprofiler fra samme pasient analysert på tre strømningscytometere; Navios EX, LSR II og Lyric. Videre kan denne protokollen endres for å inkludere flere mobilmarkører av interesse. En metode for å analysere en hel sputumprøve på en strømningscytometrisk plattform presenteres her som gjør sputum egnet for å utvikle høygjennomstrømningsdiagnostikk av lungesykdom.
Introduction
Tekniske fremskritt innen maskinvare og programvare for flytcytometere har gjort det mulig å identifisere mange forskjellige cellepopulasjoner samtidig1,2,3,4. Utnyttelsen av strømningscytometeret i hematopoietisk celleforskning har for eksempel ført til en mye bedre forståelse av immunsystemet2 og det cellulære hierarkiet i det hematopoietiske systemet5, samt det diagnostiske skillet mellom en rekke forskjellige blodkreft6,7,8. Selv om de fleste sputumceller er av hematopoietisk opprinnelse9,10,11, har strømningscytometri ikke blitt mye brukt på sputumanalyse for diagnostiske formål. Flere studier tyder imidlertid på at evalueringen av immuncellepopulasjoner i sputum (den viktigste undergruppen av celler) kan være til stor hjelp ved diagnostisering og/eller overvåking av sykdommer som astma og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS)12,13,14,15. Videre tillater eksistensen av epitelspesifikke markører som kan brukes i strømningscytometri forhør av følgende mest signifikante undergruppe av celler i sputum, lungeepitelceller.
I tillegg til evnen til å analysere mange forskjellige cellepopulasjoner av forskjellig vevsopprinnelse, kan et strømningscytometer evaluere et stort antall celler på relativt kort tid. Til sammenligning krever lysbildebaserte, cytologiske typer analyser ofte høyt spesialisert personell og/eller utstyr. Disse analysene kan være arbeidskrevende, noe som fører til at bare en andel av sputumprøven analyseres16.
Tre kritiske spørsmål begrenser den utbredte bruken av sputum i strømningscytometri. Det første problemet gjelder innsamling av sputum. Sputum samles gjennom en huff hoste som utviser slim fra lungene inn i munnhulen, og spytter deretter inn i en oppsamlingskopp. Siden slimet beveger seg gjennom munnhulen, er det stor sjanse for SEC-forurensning. Denne forurensningen kompliserer prøveanalysen, men problemet rettes lett på en strømningscytometrisk plattform, som vist i denne studien.
Ikke alle kan produsere sputum spontant; Derfor er flere enheter utviklet for å hjelpe til med sputumsamlingen på en ikke-invasiv måte17. Forstøveren er en slik enhet og har vist seg å produsere pålitelige sputumprøver18,19,20. Selv om forstøveren er en svært effektiv måte å ikke invasivt samle sputum på, krever bruken fortsatt en innstilling på et medisinsk anlegg med spesialisert personell21. I motsetning til dette kan håndholdte enheter som lungefløyten22,23,24 og acapella16,25 brukes hjemme siden de er veldig brukervennlige. Disse hjelpeenhetene er både trygge og kostnadseffektive.
For oss ga acapella konsekvent bedre resultater enn lungefløyten16, og derfor er acapella-enheten valgt for sputumsamlinger. En 3-dagers samlingsprøve ble bestemt fordi hovedformålet med bruk av sputum er å utvikle en lungekreftdeteksjonstest16. Det har vist seg at en 3-dagers prøve øker sannsynligheten for lungekreftdeteksjon sammenlignet med en 1- eller 2-dagers prøve26,27,28. Imidlertid kan andre metoder for sputumsamling være å foretrekke for forskjellige formål. Hvis en annen sputumoppsamlingsmetode brukes enn den som er beskrevet her, anbefales det å nøye titrate hvert antistoff eller fargestoff som brukes til strømningscytometrisk analyse; svært lite data er tilgjengelig om hvordan ulike sputuminnsamlingsmetoder påvirker de målrettede proteinene for strømningscytometri.
Det andre problemet som demper entusiasmen for å bruke sputum for diagnostikk, hovedsakelig relatert til strømningscytometri, er cellenummer. Problemet er innsamling av tilstrekkelige levedyktige celler for en pålitelig analyse. To studier viste at sputumprøver samlet inn ved ikke-invasive metoder, ved hjelp av en hjelpeenhet, inneholder nok levedyktige celler som kan brukes i klinisk diagnose eller forskningsstudier16,24. Imidlertid tok ingen av disse studiene opp spørsmålet om celletall angående strømningscytometri.
For studiene som danner grunnlaget for denne protokollen, ble det samlet inn sputumprøver fra deltakere med høy risiko for å utvikle lungekreft etter godkjente institusjonelle retningslinjer for hvert studiested. Høyrisikodeltakere ble definert som mellom 55-75 år, etter å ha røkt 30 pakkeår og ikke sluttet å røyke i løpet av de siste 15 årene. Pasienter ble vist hvordan man bruker acapella-enheten i henhold til produsentens instruksjoner29 og samlet sputum i tre påfølgende dager hjemme. Prøven ble oppbevart i kjøleskapet til siste oppsamling. På den siste innsamlingsdagen ble prøven sendt til laboratoriet over natten med en frossen kald pakke. Prøvene ble behandlet til en enkelt celle suspensjon den dagen de ble mottatt. Med denne metoden for sputumsamling oppnås mer enn nok levedyktige celler for en pålitelig strømningscytometrisk analyse.
Til slutt, og relatert til det forrige cellenummerproblemet, er spørsmålet om hvordan du frigjør sputumcellene fra det mucinøse miljøet. Hvordan kan cellene holdes levedyktige og skape en enkelt cellefjæring som ikke tetter strømningscytometeret? Basert på innledende arbeid av Pizzichini et al.30 og Miller et al.31, beskriver denne protokollen en enkel og pålitelig metode for sputumbehandling i en enkelt cellefjæring som er egnet for strømningscytometrisk analyse. Denne metoden har brukt veletablerte retningslinjer i flow cytometry32,33,34 for å utvikle en effektiv antistoffmerkingsstrategi for å identifisere hematopoietiske og epitelceller i sputum og gi instrumentinnstillinger, kvalitetskontrolltiltak og analyseretningslinjer som standardiserer sputumanalyse på en strømningscytometrisk plattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle trinn i sputumbehandlingen utføres i et biologisk sikkerhetsskap med passende personlig verneutstyr.
1. Reagensforberedelse før du starter sputum dissosiasjon
- Tine 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml per prøve på is, og hold deg kald til bruk.
FORSIKTIG: PFA er giftig ved innånding og hudkontakt. Forbered fikseringsmiddelet i henhold til produsentens instruksjoner og frys ved -20 °C i 25 ml aliquots til bruk. - Omtrent vekten av prøven og tine nok 0,1% Dithiothreitol (DTT) for trinn 2.2 og bringe den til 37 °C. (Aliquots av DTT skal oppbevares ved -20 °C før bruk.)
- Ta med nok 0,5 % N-acetyl- L-cystein (NAC) opp til 37 °C i trinn 2.2. (NAC skal gjøres frisk ukentlig og oppbevares ved 4 °C før bruk.)
2. Sputum dissosiasjon
- Vei sputumprøven for å bestemme volumene av dissosiasjonsreagenser.
MERK: En prøve anses å være liten hvis startvekten er ≤3 g, middels hvis >3 g, men ≤8 g, stor hvis >8, men ≤16 g, og ekstra stor hvis en prøve veier >16 g. Indikasjonene små, mellomstore, store og ekstra store vil bli brukt i hele protokollen. Mengden reagenser som kreves for dissosiasjon og merking varierer i henhold til størrelsen på sputumprøven. - Overfør en liten prøve til et rent 50 ml konisk rør, en middels prøve til en ren 250 ml plast engangsflaske, eller en stor og ekstra stor prøve til en ren 500 ml plast engangsflaske. Tilsett 1 ml/g prøvevekt på 0,5 % NAC og 4 ml/g prøvevekt på 0,1 % DTT.
- Virvel ved maksimal hastighet (for 15 s), og deretter stein ved romtemperatur (ved maksimal hastighet) i 15 min.
- Fortynn prøven med fire volumer av Hanks balanserte saltløsning (HBSS) (basert på det totale volumet av prøve + reagenser) for å nøytralisere NAC og DTT; vortex raskt ved maksimal hastighet og stein ved romtemperatur i 5 min ved maksimal hastighet.
- Filtrer celleopphenget gjennom 100 μm nylonnettcellesil(er) i ett eller flere 50 ml koniske sentrifugerør(er) for å lage en encellet suspensjon.
- Sentrifuger cellene ved 800 x g i 10 min ved 4 °C. Aspirer supernatanten, kombiner alle pellets i ett 15 ml konisk rør, og vask deretter pelletsene med HBSS med samme forhold.
- Resuspend cellepellet i et volum buffer bestemt av den opprinnelige vekten av sputumprøven.
MERK: En liten prøve er resuspendert i 250 μL HBSS. En middels prøve er resuspendert i 760 μL HBSS. Store og ekstra store prøver resuspenderes i 1460 μL HBSS. - Ta en aliquot av celle suspensjon for en levende / død celle teller ved hjelp av Trypan Blue.
MERK: For en liten prøve, bruk 5 μL. For en middels, stor eller ekstra stor prøve, bruk 10 μL. Fortynn 1:10 med HBSS.- Bland 10 μL av sputumfortynning med 30 μL 0,4% Trypan Blue for å oppnå en endelig prøvefortynning på 1:40. Last inn i tellekamrene til et hemocytometer for et celleantall.
MERK: Det kan være nødvendig å justere den endelige fortynning hvis cellenumrene er for lave eller for høye til å oppnå et nøyaktig antall. Rådgivning Guiot et al.20 for riktig å skille sputumceller fra SVS og rusk anbefales sterkt her. Dette er viktig for et nøyaktig celleantall.
- Bland 10 μL av sputumfortynning med 30 μL 0,4% Trypan Blue for å oppnå en endelig prøvefortynning på 1:40. Last inn i tellekamrene til et hemocytometer for et celleantall.
- Fra den ekstra store prøven fjerner du 50 x 106 celler fra totalen og legger til et nytt rør med nok tilsatt HBSS til å skape et totalt volum på 1700 μL.
MERK: Se på dette som en stor prøve for resten av protokollen. Rester av prøver kan kastes eller brukes til andre formål.
3. Antistoff og levedyktighet fargestoff farging
- Valg av antistoff og fargestoff
MERK: Tabell 1 viser antistoffene og levedyktighetsfargene som brukes i denne protokollen og cellepopulasjonene de identifiserer.- Merk rørene som inneholder sputumcellene (se tabell 2 for etiketter).
- Bruk 5 ml strømningscytometrirør (kompatibelt med strømningscytometeret som brukes) for prøverøret med de uoppdagede cellene og røret med isotypekontrollen. Bruk 15 ml koniske rør til blod- og epitelrørprøver.
MERK: Disse prøvene overføres til strømning av cytometrirør etter antistofffarging og fiksering.
- Merk kompensasjonsrørene (tabell 3).
MERK: Bruk 5 ml strømningscytometrirør som er kompatible med strømningscytometeret som brukes. - Tilsett mengden HBSS, antistoff og/eller fargestoff til hvert av sputumcellerørene og kompensasjonsrørene som angitt i henholdsvis tabell 2 og tabell 3.
MERK: Tilsett buffer (HBBS), antistoffer og fargestoffer på alle rørene før du tilsetter celler eller kompensasjonsperler for å sikre at alle rørenes fargetid er konsistent. - Legg til mengden sputumcellevolum som er oppført i tabell 2 , i analyserørene.
- Legg til kompensasjonsperler i kompensasjonsrørene som er oppført i tabell 3.
- Inkuber alle rørene (analyse- og kompensasjonsrørene) på is, beskyttet mot lys, i 35 min. Fyll deretter rørene med iskald HBSS og sentrifuge ved 4 °C i 10 minutter ved 800 x g.
- For kompensasjonsrørene aspirerer du supernatanten så nær pelletsene som mulig og flikker pelletsene for å løsne.
- Tilsett 0,5 ml kald HBSS i kompensasjonsrørene, oppbevar dem på isen ved 4 °C og beskytt dem mot lys til det er nødvendig for strømningscytometrianalyse.
- Aspirer supernatanten fra den unstained isotypen, blodet og epitelrørene etter sentrifugering (trinn 3.6 fra antistofffargingsdelen) og løsne pelletsene ved å flikke rørene.
4. Fiksering med 1% paraformaldehyd (PFA)
- Tilsett kald 1% PFA (som skal tines nå) til de unstained, isotype, blod og epitelrør; 2 ml til de uoppdagede og isotype rørene, og 10 ml til blod og epitelrør.
- Inkuber rørene på is, beskyttet mot lys i 1 time. Virvel raskt med maksimal hastighet etter 30 min.
- Fyll rørene med iskald HBSS. Deretter sentrifugerer rør ved 4 °C i 10 minutter ved 1600 x g.
- Aspirer så mye supernatant som mulig uten å forstyrre cellepellet og flikk røret med fingrene for å løsne cellene.
- Tilsett 200 μL kaldt HBSS til de uoppdagede og isotyperørene.
- Beregn volumet av HBSS for resuspension av blod og epitelrør i henhold til det totale celleantallet.
MERK: Spenningsvolum = 0,15 x [totalt celleantall (trinn 8 i sputumdissosiasjon) / 106]. Bruk 50 x 106 som celleantall for en ekstra stor prøve. - Oppbevar alle prøve- og kompensasjonsrør, beskyttet mot lys på isen ved 4 °C til strømningscytometrianalysen utføres.
MERK: Denne protokollen er ikke testet for lagring i mer enn 24 timer.
5. Datainnsamling på strømningscytometeret
- Bruk passende oppstartsprosedyrer for strømningscytometeret som brukes.
MERK: Denne delen av protokollen forutsetter at personen som bruker strømningscytometeret er opplært i bruk av instrumentet som er tilgjengelig for dem, spesielt når det gjelder daglige prosedyrer, inkludert kontroll av stabiliteten til optikk- og fluidikksystemene, teknikker for standardisering av lysspredning og fluorescensintensitet, samt beregning og bruk av riktig kompensasjonsmatrise. - Bruk blandingen av National Institute of Standards and Technology (NIST) perler for å sikre at fremoverspredning og sidespredningsspenninger er satt til å plassere NIST-perlene for å spenne over hele tomten uten å plassere perlene for nær aksene.
MERK: Dette trinnet er avgjørende for å sikre at rusk mindre enn 5 μm kan elimineres ved å gating etter oppkjøpsanalyse. Avhengig av strømningscytometeret som brukes, vær oppmerksom på at de minste perlene ikke blir utelukket med terskelen (når du bruker LSR II eller Lyric) eller med den høye diskriminatoren (ved hjelp av Navios EX flow cytometer). For Navios EX ble en gevinst på 2 brukt til fremover- og sidespredning, en spenning på 236 for fremoverspredning og 250 for sidespredning. For LSR II ble det brukt en fremoverspredningsspenning på 165 og en sidespredningsspenning på 190. - Sett strømningshastigheten til middels (LSR II) eller høy (Navios EX).
MERK: Middels eller høy strømningshastighet for de fleste instrumenter kan brukes til å skaffe sputumrørene. Det er viktig å merke seg at bruk av for langsom strømningshastighet eller for fortynning av prøven kan føre til at cellene legger seg, noe som resulterer i økt virvelsetting som ikke er ønsket. Derfor bør det å følge det beregnede resuspensasjonsvolumet i trinn 4.6 resultere i cellulær tetthet som kan oppnås raskt, men ikke tette maskinen. - Juster spenningene for hver parameter som brukes for sprednings- og fluorescerende parametere for å plassere cellepopulasjonene på skalaen. Bruk tallene med gatingstrategien som veiledning om hvordan du justerer spenningene deretter.
MERK: Forsikre deg om at alle nødvendige parametere er valgt i parametervalgvinduet før anskaffelsen, eller at data ikke vil bli samlet inn. - Samle inn data for den unstained sputum prøven først, etterfulgt av isotype-farget prøve, og deretter blodrøret og epitelrøret.
MERK: Hvis cellefjæringen er for konsentrert til at strømningscytometeret kan kjøre prøvene uten tilstopping, kan prøvene fortynnes ytterligere med HBSS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen ble utviklet med tanke på et klinisk laboratorium. Fokuset under utviklingen av protokollen var på enkelhet, effektivitet og reproduserbarhet. Det ble funnet at det mest tidkrevende trinnet i behandlingen av sputum telte cellene. Derfor er protokollen satt opp på en slik måte at sputumbehandling og cellemerking kan utføres uavhengig av celletelling uten tap av tid. Et nøyaktig celleantall, som fortsatt er nødvendig for å fortynne prøven på riktig måte for en uhindret løp, kan deretter oppnås under antistoffmerking inkubasjonsperioden.
Denne protokollen bruker et sputumvektmål i stedet for et celleantall som en indikasjon på hvor mye antistoff/fargestoff som skal brukes til optimal cellemerking. Det er imidlertid stor grad av variasjon i vekten av sputumprøvene; av de 126 prøvene som ble analysert, varierte vekten fra 0,57 g til 38,30 g. Figur 1A viser at sammenhengen mellom sputumvekt og celleutbytte ikke er sterk. Derfor ble prøvene delt inn i fire kategorier; Medianvektene i prøvene var 2,1 g for små prøver, 5,0 g for middels prøver, 11,2 g for store prøver og 22,0 g for ekstra store prøver (figur 1B). Imidlertid var det fortsatt prøver som ga langt flere celler enn forventet basert på deres vekt (figur 1C), de fleste prøvene klynget pent. For små prøver var median celleutbytte 8,0 x 106 celler, for middels utvalg 13,0 x 106, for store prøver 35,4 x 106 og ekstra store prøver 93,0 x 106.
Hvert antistoff som ble brukt i denne protokollen ble titrert. En konsentrasjon på platåfasen (figur 2A) med den høyeste fargingsindeksen (figur 2B) av titreringskurven ble valgt som arbeidskonsentrasjon. Variasjoner i celletall vil ikke dramatisk endre fargeintensiteten. Denne antistofftitrering og testing er viktig og bør settes opp med forsiktighet for hvert nytt antistoff eller fargestoff som brukes i denne protokollen34,35. Når et antistoff titreres med forsiktighet, bør det flekke 10 til 50 ganger flere celler enn antall celler som antistoffet ble titrert34,35. Et eksempel på dette prinsippet finnes i tabell 4. Det antimenneskelig CD45-PE antistoffet ble titrert på 1 x 106 celler i et totalt volum på 400 μL. Hvis dette antistoffet mot fargevolum ekstrapoleres til protokollen (se tabell 2, som viser CD45-PE-mengden og fargevolumene for hver prøvestørrelse), for en liten prøve vil 0,625 x 106 celler bli farget, 1,25 x 106 celler vil bli farget for en middels prøve og 2,5 x 106 celler for en stor prøve (kolonne A i tabell A). Et overskudd på 50 ganger i celletall for hver kategori beregnes til henholdsvis 31,25 x 106, 62,5 x 106 og 125 x 106 celler (kolonne B). Som vist i kolonne C og D, er mediancellenummeret for hver størrelseskategori og det største utvalget i hver kategori godt innenfor området med 50 bretter.
Til tross for de tilsynelatende forskjellene i størrelse og celleutbytte mellom de forskjellige størrelsene på sputumprøvene, er median prosent SEC-forurensning i hver kategori svært lik. Figur 3A viser prosentandelen av SECer som finnes i individuelle prøver, stratifisert i henhold til deres sputumvektkategori. Hovedbekymringen var med SECs siden disse cellene ikke er representative for lungevev, men av munnhulen. Imidlertid er den gjennomsnittlige SEC-forurensningen mindre enn 20% for alle kategorier. Figur 3B viser prosentandelen av levedyktige celler som finnes i disse prøvene. Ekskludert SECene var den gjennomsnittlige levedyktigheten omtrent 72 % for kategoriene for små, mellomstore og store utvalgsstørrelser. Den var litt høyere (79 %) for den ekstra store kategorien.
Figur 4 viser en typisk gatingstrategi for å skille sputumcellene av interesse fra rusk, døde celler (som også inkluderer de forurensende SECs36) og celleklumper. Figur 4A viser bruken av NIST-perler for å stille inn porter for å eliminere rusk som er mindre enn 5 μm eller større enn 30 μm, mens figur 4B bruker denne porten på sputumceller. Figur 4C viser en typisk sputumprofil når den vises som sidespekket bredde (SSC-W) mot fremoverspredningsbredde (FSC-W), breddeporten. Denne profilen brukes til å eliminere små rusk som presenterer seg langs SSC-W- og FSC-W-aksene. Eliminering av døde celler er vist i figur 4D og figur 4E. Den unstained kontrollen (figur 4D) brukes til å bestemme cut-off for FVS510 positivitet; celler som flekker positivt for FVS510 over den negative kontrollen, anses som døde og vil ikke bli brukt i sputumcelleanalysen (figur 4E). Til slutt brukes en singlet gate for å fjerne celledobler fra analysen, som vises i figur 4F. Dermed representerer cellene som har kommet seg gjennom valgportene vist i figur 4B, figur 4C, figur 4E og figur 4F levende, enkle sputumceller klare for etterfølgende analyse med antistoffene som brukes i denne protokollen.
Bruken av anti-CD45-antistoffet i denne merkingsprotokollen gjør det mulig å separere levende, enkle sputumceller i et blodcellerom (CD45+) og et ikke-blod (CD45-) cellerom. Sistnevnte kategori inkluderer epitelceller og andre ikke-blodlegemer. Toppprofilen i figur 5A viser bruken av en uoppdaget sputumprøve for å sette avskjæringen for CD45-positivitet, noe som gjør portene til å fange CD45+-celler og CD45-celler. Den nederste profilen i figur 5A viser begge disse portene som brukes på en sputumprøve farget med anti-CD45-antistoffet. Farging med ytterligere antistoffer brukes deretter til å identifisere blodcellespesifikke populasjoner i CD45+-porten (figur 5B) og andre ikke-blodcellepopulasjoner, inkludert epitelpopulasjoner i CD45-porten (figur 5C). I begge tallene viser toppprofilene hvordan isotypefarget sputum brukes til å sette de doble negative populasjonene, mens bunnprofilene viser antistofffargede sputumceller. Figur 5B (nederst) viser seks forskjellige CD45+ cellepopulasjoner opprettet med cocktail av antistoffer som kan påvises i fluorescens (FL) 1 kanal (anti-CD66b, CD3, CD19 antistoffer) og anti-CD206 detekterbar i FL3-kanalen. Sorteringseksperimenter har avdekket at lungespesifikke makrofager ligger i portene identifisert med M. Tilstedeværelsen av celler i disse portene indikerer dermed at sputumprøven ble avledet fra lungen og ikke var spytt (Bederka et al., manuskript som forberedelse). Figur 5C (nederst) viser de gating kvadrantene som er opprettet med anti-pan-cytokeratin (panCK) detekterbar i FL1-kanalen og anti-epitelcelleadhesjonsmolekylet (EpCAM) antistoffer som kan påvises i FL3-kanalen blant CD45-sputumcellene.
Denne merkingsprotokollen er grundig testet på Navios EX og LSR II. Noen foreløpige eksperimenter ble utført på Lyric, men uten den omfattende instrumentoptimaliseringen som ble gjort for de to andre maskinene. Derfor er detaljerte instrumentinnstillinger gitt for Navios EX og LSR II i materialarket, men ikke for Lyric. For å forstå likhetene og variasjonene mellom disse tre strømningscytometriske plattformene som kan brukes til å analysere sputumceller, kan profiler hentet fra de ulike maskinene sammenlignes i figur 6 og figur 7. To store sputumprøver ble behandlet, samlet, merket, delt inn i tre like deler, og deretter anskaffet på hvert strømningscytometer nevnt ovenfor. Figur 6, som ligner på figur 4, sammenligner gatingstrategien for å eliminere rusk, døde celler og celleklumper. Figur 7, som er identisk med figur 5, sammenligner blod- og ikke-blodprofiler fra dataene som er samlet inn på de ulike strømningscytometerne.
Sammenligning av de ulike profilene hentet fra de tre forskjellige strømningscytometerne viser at de samme grunnleggende profilene kan observeres med hvert instrument. Forskjellene å være oppmerksom på er SSC-W/FSC-W (breddeport) plottene (figur 6, andre rad) og de lineære skalaene til scatter-plottene (figur 6 og 7). Spredningsbreddeplottet som genereres på Navios EX, viser en inkluderingsport (rød boks), noe som betyr at alle celler som er inkludert i porten, analyseres ytterligere. Hendelsene langs aksene i venstre hjørne utelates. Spredte breddeplott på LSR II, og Lyric viser ikke en lignende forekomst av hendelser langs de samme aksene. Dette avviket skyldes sannsynligvis den svært følsomme terskelen som brukes på Navios EX, noe som fører til noen små rusk i den forrige størrelsesekskluderingsporten (øverste rad i figur 6). Noen ganger ses rusk langs aksene i scatterbreddeprofilen som genereres på LSRII, men det er i høyre nedre hjørne. I slike tilfeller brukes en ekskluderingsport (som angitt av den stiplede røde boksen i den midterste profilen i rad 2 i figur 6) til å eliminere disse hendelsene fra videre analyse.
Mens loggskalaene ser litt annerledes ut på plottene mellom Navios EX og Lyric- og LSR II-cytometerne, har Navios EX muligheten til å skaffe data ved hjelp av flere tiår. Implementering av flere tiår avhenger av konteksten av eksperimentet og ønsket følsomhet for å visualisere interessepopulasjonene.
En ekstra merkbar forskjell mellom Navios EX og LSR II og Lyric cytometers er utseendet på profilen til singlet gate. Navios EX cytometer er utstyrt med en rektangulær strømningscelle med en annen oppsamlingsvinkel enn LSR II. Navios EX inneholder tre programvarestyrte oppsamlingsvinkler for å optimalisere fremovervinkellysspredningen for å oppnå følsomheten som passer for partikkelstørrelsen å analysere. Polygonporten for Navios EX cytometer må justeres til en litt lavere vinkel enn singlet gate for LSRII. Singlet gate for Lyric kan optimaliseres for å få en profil som ligner på den som er sett med LSR II. Ved hjelp av sputumprøven må områdeskaleringsfaktoren optimaliseres for hver laser på Lyric for å oppnå en enkeltport som ligner på LSR II.
Alle profilene som vises i figur 4 til figur 7 , ble analysert med FlowJo-programvare, versjon 10.6. FCS-filene finnes i FlowRepository (https://flowrepository.org), under IDs FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ og FR-FCM-Z3MM og kan brukes til å praktisere sputumanalysen som illustrert i disse tallene.
Figur 1: Sputumvekter og celleutbytte. (A) Avbildet er forholdet mellom sputumvekt, bestemt før behandling, og totalt celleutbytte, bestemt etter behandling ved hjelp av et hemocytometer. Hvert punkt representerer et enkelt utvalg, totalt 126. (B) Sputumprøver ble stratifisert i fire kategorier basert på deres vekt: liten for prøver som veier opp til 3 g, medium for prøver som veier mer enn 3 g opp til 8 g, stor for prøver som veier mer enn 8 g opp til 16 g, og ekstra store prøver for de som veier mer enn 16 g. (C) Vist er fordelingen av celleutbytte for prøvene i hver kategori. De røde stolpene i (B) og (C) representerer medianverdiene i hver kategori. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Antistofftitrering for antimenneskelig CD45-PE. (A) CD45-PE (IgG1) titreringskurven med gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av den positive populasjonen plottet versus konsentrasjonen av CD45-PE antistoffplatåer ved 1 μg/ml. (B) Titreringskurven som viser fargingsindeksen kontra antistoffkonsentrasjonen viser at den høyeste fargingsindeksen er på 1 μg/ml. Fargeindeks ble beregnet som: [CD45 MFI positiv populasjon - CD45 MFI negativ populasjon] / [2 * Standardavvik]. Basert på figur 2A og figur 2B ble 1 μg/ml valgt som optimal konsentrasjon for CD45-PE-antistoffet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Andelen SPC-er og døde celler i sputumprøver er konsistent blant de fire vektkategoriene. (A) Andelen SECer i sputumprøver klassifiseres i henhold til vektkategorien. Prosentandelen SEC-forurensning ble bestemt av hemocytometer som en del av det totale celleantallet. (B) Celle levedyktighet av sputumprøver unntatt SECS, bestemt av hemocytometer og trypan blå eksklusjonsmetoden. For hvert diagram representerer de røde linjene medianverdiene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Gatingstrategi for å ekskludere rusk, døde celler og dobler i en sputumprøve. (A) NIST perler av størrelse 5 μm, 20 μm og 30 μm ble brukt til å sette porten indikert av den røde boksen for å utelukke rusk mindre enn 5 μm og større rusk over 30 μm og nær aksen. (B) En sputumprøve ble anskaffet ved hjelp av de samme spenningene for fremover- og sidespredningen som NIST-perlene. Porten som ble opprettet i (A), ble brukt til å utelate rusk. (C) Små rusk nær aksen ble utelukket i denne spredningsbredden. (D) En unstained sputum prøve ble brukt til å sette cut-off (rød linje) for den negative, unstained populasjonen for levedyktighet fargestoff. (E) Avskjæringen som ble opprettet i D ble brukt på den fargede sputumprøven for å danne en port (rød boks) for å inkludere levende, levedyktige celler. (F) Singlet gate indikert av den røde polygonen utelukker celler som ikke faller på diagonalen, eliminerer dobler og / eller klumper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Gating strategi for sputumceller i blod og ikke-blodcelle rom. (A) Unstained sputum celler avledet fra singlet gate brukes til å sette cut-off (rød linje) på den negative populasjonen for CD45 (topp). Avskjæringen fra toppprofilen brukes på den fargede sputumprøven (nederst) for å skille CD45-positiv (CD45+) og negative populasjoner (CD45-). (B) CD45+ sputumceller farget med isotypeantistoffer for FITC/AF488 brukes til å stille portene på den negative populasjonen (øverst). De samme portene brukes på CD45+ sputumcellene som er farget med blodcellemarkørene CD3, CD19, CD66b og CD206 (nederst). (C) Kvadrantportene plasseres på CD45-sputumcellene som er farget med isotypekontroller (øverst) og påføres CD45-cellene fra sputumprøven farget med epitelmarkørene pan-cytokeratin (panCK) og EpCAM (bunn). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Gatingstrategi for å utelukke rusk, klumper og døde celler av fargede sputumceller på tre strømningscytometriske plattformer. To store sputumprøver ble behandlet, samlet, merket og delt inn i tre like deler for anskaffelse på Navios EX (A), LSR II (B) og Lyric (C) flowcytometers. Øverste rad: Sputumprøver ble inngjerdet (rød boks) for å utelukke svært små og store rusk. Andre rad: Den store røde boksen i Navios EX-plottet representerer en inkluderingsport som inkluderer cellene, men ekskluderer rusk. Den stiplede lille røde boksen sett i LSR II-plottet representerer en ekskluderingsport for å eliminere rusk fra videre analyse. Ytterligere optimalisering med Lyric er nødvendig for å avgjøre hvor rusk ekskludering gating er nødvendig. Derfor er det ingen port til stede i den tomten. Tredje rad: Røde rektangulære porter inkluderer levende celler for videre analyse. Nederste rad: Polygonporten har enkeltceller ved å utelate doble celler som faller utenfor diagonalen på porten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Gatingstrategi for sputum farget for blod- og epitelmarkører på tre strømningscytometriske plattformer. Analysen vist i figur 6 fortsetter i figur 7; Alle levedyktige, enkeltceller (nederste rad, figur 6) ble delt inn i CD45+ og CD45-populasjoner (første rad, figur 7), slik at blodcellespesifikke markører og epitelcellespesifikke markører ytterligere kunne avgrense disse populasjonene. Andre rad: profil av blodcellemarkører CD3 / CD19 / CD66b og CD206 fra CD45 + celler. Tredje rad: epitelcellemarkører panCK og EpCAM fra CD45-celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Antistoff/flekk | Hensikt |
| FVS510 | Levedyktighetsflekk |
| Anti-menneskelig CD45 – PE | Pan-leukocytt markør; PE-kompensasjon |
| Anti-menneskelig CD66b – FITC | Granulocyttmarkør |
| Anti-menneskelig CD3 – Alexa488 | T-celleindikator |
| Anti-menneskelig CD19 – Alexa488 | B-celleindikator; FITC/Alexa488 kompensasjon |
| Anti-menneskelig CD206 – PE-CF594 | Lunge makrofag markør; PE-CF594 kompensasjon |
| Anti-menneskelig EpCAM – PE-CF594 | Epitelial cellemarkør; PE-CF594 kompensasjon |
| Anti-menneskelig pan-cytokeratin (panCK) – Alexa488 | Epitelial cellemarkør |
| IgG1κ – Alexa488 | CD3/CD19/panCK-isotypekontroll |
| IgG1κ – FITC | CD66b isotype kontroll |
| IgG1κ – PE-CF594 | CD206/EpCAM isotypekontroll |
| Anti-menneskelig CD45 – BV510 | FVS510 kompensasjon |
Tabell 1: Antistoffer og levedyktighetsflekker som brukes. Liste over antistoffer og levedyktighetsfargestoffer som brukes i denne protokollen. Indikert er de cellulære delsettene de hver identifiserer.
| Rør (etikett) | Størrelse på eksempel* | HBSS (μL) | FVS510 (μL) | CD45 (μL) | Andre antistoffer (μL) | Celler § (μL) | |||
| Ikke pågrepet | liten | 80 | 20 | ||||||
| Middels | 50 | 50 | |||||||
| stor | 50 | 50 | |||||||
| IgG1κ - Alexa488 | IgG1κ- FITC | IgG1κ - PE-CF594 | |||||||
| Isotype-kontroll | liten | 60.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 20 | |
| Middels | 30.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| stor | 30.25 | 1 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| CD206 | CD3 | CD19 | CD66b | ||||||
| Blod | liten | 92.875 | 1.5 | 25 | 1.875 | 5 | 1.25 | 7.5 | 115 |
| Middels | 65.75 | 3 | 50 | 3.75 | 10 | 2.5 | 15 | 350 | |
| stor | 102.5 | 10 | 100 | 7.5 | 20 | 5 | 30 | 725 | |
| EpCAM | PanCK | ||||||||
| Epitelial | liten | 96.5 | 1.5 | 25 | 10 | 2 | 115 | ||
| Middels | 73 | 3 | 50 | 20 | 4 | 350 | |||
| stor | 117 | 10 | 100 | 40 | 8 | 725 | |||
| * Prøver betraktes som små, mellomstore eller store basert på vekt fastsatt i trinn 1 i sputumdissosiasjonsdelen av protokollen. | |||||||||
| § Celler bør tilsettes etter at alle reagenser er distribuert, inkludert de i kompensasjonsrørene (tabell 3). | |||||||||
Tabell 2: Innhold av rør med sputumceller. Bruk denne tabellen som referert i protokollen for å legge til de angitte volumene av antistoffer og levedyktighetsflekker for riktig prøvestørrelse.
| Rør (etikett) | Reagenser tilsatt (μL) | Reagenser lagt til (slipp) | ||||||
| HBSS | CD45-PE | CD206-PE-CF594 | EpCAM-PE-CF594 | CD19-Alexa488 | CD45-BV510 | CompBead (+) | CompBead * (-) | |
| PE-sammensetning | 76 | 4 | x | x | x | x | 1 | 1 |
| PE-CF594 comp. | 72 | x | 4 | 4 | x | x | 1 | 1 |
| Alexa488/FITC-sammensetning. | 60 | x | x | x | 20 | x | 1 | 1 |
| BV510 komp. | 60 | x | x | x | x | 20 | 1 | 1 |
| * De positive (+) og negative (-) perlene skal tilsettes etter at alle reagenser er fordelt og rørene i tabell 2 er utarbeidet. | ||||||||
| comp. = kompensasjon | ||||||||
Tabell 3: Innhold av kompensasjonsrør. Bruk denne tabellen som referert i protokollen for å legge til de angitte volumene av antistoffer mot kompensasjonsperlene.
| Cellenummer (x 106) | ||||
| En | B | C | D | |
| Størrelse på utvalg | I farging volum * | 50 ganger tilgang ¶ | Median prøve (foldetilgang) # | Største eksempel (brettetilgang) # |
| Liten | 0.625 | 31.25 | 8.0 (12.8) | 24.77 (39.6) |
| Middels | 1.25 | 62.5 | 13.0 (10.4) | 48.87 (39.1) |
| Stor | 2.5 | 125 | 35.4 (14.2) | 113.5 (45.4) |
| * Fargevolumer som brukes i protokollen (tabell 2). Cellenummeret ekstrapoleres fra hvordan titreringskurven ble utført. 1 μg/ml CD45-PE og 1 x 106 celler per 200 μL. | ||||
| ¶ 50 ganger tilgang til cellenumre i kolonne A. | ||||
| # foldetilgang i kolonne C og D beregnes ved å dele tallet som presenteres i cellene i kolonne C eller D med tallet i den tilsvarende cellen i kolonne A. | ||||
Tabell 4: Antimenneskelig CD45-PE-konsentrasjon for alle prøver i hver utvalgsstørrelseskategori.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det cellulære innholdet av sputum inkluderer et stort utvalg av brede celler, ofte ledsaget av mye rusk37. I tillegg krever sputumanalyse en kvalitetskontroll som bekrefter at prøven samles inn fra lungen i stedet for munnhulen38. Derfor er det ikke så enkelt å analysere sputum ved strømningscytometri som det er for blod, for eksempel, som frigjør en mye renere og homogen cellefjæring. Denne protokollen har adressert alle disse problemene: å gi instrumentinnstillinger ved hjelp av spesifikke størrelsesperler for å sikre at både de minste og største cellepopulasjonene kan oppdages, en gatingstrategi for å eliminere rusk, celleklumper, forurensende SVS og andre døde celler, og til slutt et kvalitetskontrolltiltak for å sikre at en sputumprøve er fra lungen i stedet for å være for det meste spytt.
Det er kritiske trinn i protokollen i arbeidet med sputum som er verdt å påpeke. For det første kan celleutbyttet påvirkes drastisk av antall nyloncellesiler som brukes i trinn 2.5 av sputumdissosiasjonsdelen av protokollen. Flere siler kan være nødvendig for å unngå å miste for mange celler på grunn av tilstopping av silen. Når strømmen gjennom silene har bremset merkbart, bør en ny sil brukes. For det andre kan cellepellet av sputumprøver være veldig løs, spesielt hvis det er høy forurensning av SECer. Derfor er det viktig å ikke aspirere for nær pellet når du fjerner supernatanten etter sentrifugering av prøvene. Aspirering for nær pellets kan føre til celletap, om ikke tap av hele pellets. For det tredje krever denne protokollen et fikseringstrinn. Dette bevarer cellene og deres fargeprofil og fungerer som et sikkerhetstiltak for å beskytte strømningscytometeroperatøren. Løpeprøver på visse strømningscytometere kan utgjøre økte biologiske farer på grunn av potensialet for aerosolproduksjon39. PFA-fikseringen bidrar til å beskytte operatøren mot potensielle patogener i sputumprøven. For det fjerde, og kanskje det mest utfordrende aspektet ved å forberede sputumprøver for strømningscytometrisk analyse, er celletelling. Celletelling er komplisert på grunn av det store utvalget av celletyper som er tilstede i sputumet. Tellemaskiner er ofte begrenset av cellestørrelsesområdet de kan fange og er derfor mindre pålitelige enn et hemocytometer. Celletelling av sputumprøver av hemocytometer, som er utmerket beskrevet av Guiot et al.20, er imidlertid kjedelig og krever praksis for å bli dyktig. Et nøyaktig cellenummer er avgjørende for å bestemme prøvens endelige resuspensjonsvolum for å muliggjøre en rimelig strømningshastighet og forhindre tilstopping i strømningscytometeret. Tilstedeværelsen av de svært store SPC-ene i sputumet og de mange mindre celleklumpene som ikke brytes opp av dissosiasjonsbufferen, og heller ikke fanget av filtrene, øker sannsynligheten for å tette strømningscytometeret. Derfor anbefales det å bruke litt tid på å bestemme den beste cellekonsentrasjonen / strømningshastigheten for datainnsamling ved hjelp av det tilgjengelige strømningscytometeret. I tillegg må du sørge for at strømningscytometeret har riktig strømningscelle og dysestørrelse (eller sonde) som er i stand til å måle de større cellepopulasjonene som er tilstede i sputumet.
Selv når det er oppnådd ferdigheter i celletelling, er det fortsatt en tidkrevende prosess. Derfor er reagensenes bestemmelse for cellemerking i denne protokollen basert på utvalgsstørrelsen (som vurdert etter vekt) i stedet for cellenummer. Dette gir mer effektiv bruk av tid siden det manuelle celleantallet kan fullføres i løpet av den tiden som trengs for antistoffet og levedyktighetsfargestofffarging. Imidlertid er det tre bemerkelsesverdige unntak fra dette. Hvis en prøve er >16 g (de såkalte ekstra store prøvene), bør det manuelle celleantallet skje før farging, slik at dyre reagenser kan bevares ved bare å farge 25 x 106 celler hver for blod- og epitelrørene. Dette cellenummeret gir svært pålitelige profiler i innstillingene som er beskrevet i denne protokollen. Et annet potensielt unntak er tilfellet med en svært liten prøve. Beregningen er at minimum 1-2 x 106 celler er nødvendig for strømningscytometrianalysen som presentert i denne protokollen for å generere pålitelige profiler (data ikke vist). Derfor, hvis et utvalg inneholder færre enn 1-2 x 106 celler, kan det ikke være verdt å fortsette med prosedyren, siden det endelige resultatet sannsynligvis vil være uakseptabelt.
Spesifikke merkingsreagenser som fungerer godt på perifere blodlegemer eller cellelinjer, kan fungere svært forskjellig på blodceller som finnes i sputum (upubliserte observasjoner). Derfor anbefales det å titrere hvert antistoff eller andre merkingsreagenser i henhold til veletablerte protokoller34,35 før de brukes i strømningscytometriforsøk. De fleste antistofftitreringer bør gi sammenlignbare resultater når de flekker opp til 10 til 50 ganger; Det anbefales imidlertid å gjøre ytterligere titrasjoner med celletall høyere enn det området34. Når en reagenskonsentrasjon er bestemt, er det viktig å holde inkubasjonstiden til det reagenset det samme som i selve eksperimentet. Av den grunn understreker protokollen å legge til all buffer og reagenser til rørene før cellene eller kompensasjonsperlene legges til. Denne rekkefølgen for å legge til reagenser og celler / perler sammen gir høyere konsistens i merketider. Hvis den eksperimentelle inkubasjonstiden av en eller annen grunn ikke kan holdes lik den som brukes til antistoff / fargestofftitrering, bør sistnevnte gjentas med en inkubasjonstid som er mulig under eksperimenter.
Sputumprøver har blitt mye brukt som diagnostisk prøve for å studere patofysiologien til ulike sykdommer som påvirker lungen. Tuberkulose40,41, KOLS13,42, astma43, cystisk fibrose44,45, lungekreft46,47,48, og revmatoid artritt49 er blant de mange sykdommene der sputum har blitt studert på grunn av fordelen av at det er en ikke-invasivt oppnådd prøve. Mer nylig, under koronaviruspandemien, har sputum blitt brukt til å oppdage langvarig viral shedding hos pasienter innlagt på sykehus med koronavirussykdom 2019 (COVID-19)50.
Ulike teknologier, inkludert omvendt transkripsjon-polymerase kjedereaksjon (RT-PCR), proteinanalyse, mikroskopi og strømningscytometri, har blitt brukt til å identifisere sykdomsspesifikke markører i sputum. Å bruke en strømningscytometrisk plattform for å analysere sputumprøver er ikke mye brukt, men bruken øker. Med nylige fremskritt innen teknologien for strømningscytometere3,51,52, samt fremskritt i fluoroforenes kjemier, generering av nye antistoff kloner, og utvikling av ulike fargestoffer for å identifisere døde cellepopulasjoner51,53,54, har muligheten for å designe antistoffpaneler rettet mot å diagnostisere menneskelige sykdommer økt dramatisk. Videre vil det nylige presset for å automatisere analysen av strømningscytometriske data55,56 eliminere den potensielle skjevheten i manuell lesing og tolking av flytdata. Disse nye utviklingene innen strømningscytometri vil legge til rette for utforskning av sputum som klinisk diagnostikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne er tidligere eller nåværende ansatte i bioAffinity Technologies.
Acknowledgments
Vi vil takke David Rodriguez for hans hjelp med figurforberedelsene. Sputumprøver ble kjørt på BD LSR II ved UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, støttet av UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC ved UT Health) og UL1 TR001120 (CTSA grant).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Paraformaldehyde Flow-Fix | Polysciences | 25037 | |
| 100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
| 50 mL conical falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Alexa488 anti-human CD19 | BioLegend | 302219 | |
| Alexa488 anti-human CD3 | BioLegend | 300415 | |
| Alexa488 anti-human cytokeratin | BioLegend | 628608 | |
| Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype | BioLegend | 400129 | |
| BV510 anti-human CD45 | BioLegend | 304036 | |
| CD66b FITC isotype | BD Biosciences | 555748 | |
| CompBead Plus Compensation Beads | BD Biosciences | 560497 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
| CS&T beads | BD Biosciences | 655051 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| FITC anti-human CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 564406 | |
| FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
| FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| NAC | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NIST Beads, 05 μM | Polysciences | 64080 | |
| NIST Beads, 20 μM | Polysciences | 64160 | |
| NIST Beads, 30 μM | Polysciences | 64170 | |
| PE anti-human CD45 | BioLegend | 304039 | |
| PE-CF594 anti-human EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
| PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype | BD Biosciences | 562292 | |
| PE-CR594 anti-human CD206 | BD Biosciences | 564063 | |
| Sodium citrate dihydrate | EMD | SX0445-1 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 |
References
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews. Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), San Diego, Calif. 251-258 (2012).
- Robinson, J. P., Roederer, M. History of science. Flow cytometry strikes gold. Science. 350 (6262), New York, N.Y. 739-740 (2015).
- Orfao, A., et al. Immunophenotypic dissection of normal hematopoiesis. Journal of Immunological Methods. 475, 112684 (2019).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Bento, L. C., et al. The use of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: A review. Frontiers in Oncology. 7, 270 (2017).
- Della Porta, M. G., Picone, C. Diagnostic utility of flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases. 9 (1), 2017017 (2017).
- Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2), Pt 1 475-478 (2000).
- Spanevello, A., et al. Induced sputum cellularity. Reference values and distribution in normal volunteers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 162 (3), Pt 1 1172-1174 (2000).
- Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
- Hastie, A. T., et al. Mixed sputum granulocyte longitudinal impact on lung function in the severe asthma research program. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (7), 882-892 (2021).
- Hastie, A. T., et al. Association of sputum and blood eosinophil concentrations with clinical measures of COPD severity: an analysis of the SPIROMICS cohort. The Lancet. Respiratory Medicine. 5 (12), 956-967 (2017).
- Kim, J., et al. Innate immune crosstalk in asthmatic airways: Innate lymphoid cells coordinate polarization of lung macrophages. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (5), 1769-1782 (2019).
- Bai, Y., Zhou, Q., Fang, Q., Song, L., Chen, K. Inflammatory cytokines and T-Lymphocyte subsets in serum and sputum in patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 25, 2206-2210 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-Carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Hristara-Papadopoulou, A., Tsanakas, J., Diomou, G., Papadopoulou, O. Current devices of respiratory physiotherapy. Hippokratia. 12 (4), 211-220 (2008).
- Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and biochemical analysis of induced sputum from asthmatic and from healthy subjects. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
- Alexis, N., Soukup, J., Ghio, A., Becker, S. Sputum phagocytes from healthy individuals are functional and activated: a flow cytometric comparison with cells in bronchoalveolar lavage and peripheral blood. Clinical Immunology. 97 (1), 21-32 (2000).
- Guiot, J., et al. Methodology for sputum induction and laboratory processing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56612 (2017).
- Paggiaro, P. L., et al. Sputum induction. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 3-8 (2002).
- Anjuman, N., Li, N., Guarnera, M., Stass, S. A., Jiang, F. Evaluation of lung flute in sputum samples for molecular analysis of lung cancer. Clinical and Translational Medicine. 2, 15 (2013).
- Sethi, S., Yin, J., Anderson, P. K. Lung flute improves symptoms and health status in COPD with chronic bronchitis: A 26 week randomized controlled trial. Clinical and Translational Medicine. 3, 29 (2014).
- Su, J., et al. Analysis of lung flute-collected sputum for lung cancer diagnosis. Biomarker Insights. 10, 55-61 (2015).
- Naraparaju, S., Vaishali, K., Venkatesan, P., Acharya, V. A comparison of the Acapella and a threshold inspiratory muscle trainer for sputum clearance in bronchiectasis-A pilot study. Physiotherapy Theory and Practice. 26 (6), 353-357 (2010).
- Hinson, K. F., Kuper, S. W. The diagnosis of lung cancer by examination of sputum. Thorax. 18, 350-353 (1963).
- Johnston, W. W., Bossen, E. H. Ten years of respiratory cytopathology at Duke University Medical Center. I. The cytopathologic diagnosis of lung cancer during the years 1970 to 1974, noting the significance of specimen number and type. Acta Cytologica. 25 (2), 103-107 (1981).
- Ng, A. B., Horak, G. C. Factors significant in the diagnostic accuracy of lung cytology in bronchial washing and sputum samples. II. Sputum samples. Acta Cytologica. 27 (4), 397-402 (1983).
- Smiths Medical Videos. , Available from: https://videos.smiths-medical.com/search?q=acapella&page=1 (2021).
- Pizzichini, E., et al. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154 (2), 308-317 (1996).
- Miller, H. R., Phipps, P. H., Rossier, E. Reduction of nonspecific fluorescence in respiratory specimens by pretreatment with N-acetylcysteine. Journal of Clinical Microbiology. 24 (3), 470-471 (1986).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 4, Unit 4.1 (2001).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Kini, S. R. Color Atlas of Pulmonary Cytopathology. , Springer-Verlag New York, Inc. (2002).
- Papanicolaou Society of Cytopathology Task Force on Standards of Practice. Guidelines of the Papanicolaou Society of Cytopathology for the examination of cytologic specimens obtained from the respiratory tract. Diagnostic Cytopathology. 21 (1), 61-69 (1999).
- Holmes, K. L., et al. International Society for the Advancement of Cytometry cell sorter biosafety standards. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 85 (5), 434-453 (2014).
- Datta, S., Shah, L., Gilman, R. H., Evans, C. A. Comparison of sputum collection methods for tuberculosis diagnosis: a systematic review and pairwise and network meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (8), 760-771 (2017).
- Armstrong-Hough, M., et al. "Something so hard": a mixed-methods study of home sputum collection for tuberculosis contact investigation in Uganda. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease: The Official Journal of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. 22 (10), 1152-1159 (2018).
- Freeman, C. M., et al. Design of a multi-center immunophenotyping analysis of peripheral blood, sputum and bronchoalveolar lavage fluid in the Subpopulations and Intermediate Outcome Measures in COPD Study (SPIROMICS). Journal of Translational Medicine. 13, 19 (2015).
- Petsky, H. L., Li, A., Chang, A. B. Tailored interventions based on sputum eosinophils versus clinical symptoms for asthma in children and adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 8, 005603 (2017).
- Hisert, K. B., Liles, W. C., Manicone, A. M. A flow cytometric method for isolating cystic fibrosis airway macrophages from expectorated sputum. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (1), 42-50 (2019).
- Duncan, G. A., et al. Microstructural alterations of sputum in cystic fibrosis lung disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (18), 88198 (2016).
- Kemp, R. A., Reinders, D. M., Turic, B. Detection of lung cancer by automated sputum cytometry. Journal of Thoracic Oncology: Official Publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2 (11), 993-1000 (2007).
- Blandin Knight, S., et al. Progress and prospects of early detection in lung cancer. Open Biology. 7 (9), (2017).
- Gomperts, B. N., Spira, A., Elashoff, D. E., Dubinett, S. M. Lung cancer biomarkers: FISHing in the sputum for risk assessment and early detection. Cancer Prevention Research. 3 (4), Philadelphia, Pa. 420-423 (2010).
- Demoruelle, M. K., et al. Antibody responses to citrullinated and noncitrullinated antigens in the sputum of subjects with rheumatoid arthritis and subjects at risk for development of rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (4), Hoboken, N.J. 516-527 (2018).
- Wang, K., et al. Differences of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 shedding duration in sputum and nasopharyngeal swab specimens among adult inpatients with coronavirus disease 2019. Chest. 158 (5), 1876-1884 (2020).
- Chattopadhyay, P. K., Hogerkorp, C. -M., Roederer, M. A chromatic explosion: the development and future of multiparameter flow cytometry. Immunology. 125 (4), 441-449 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nature Immunology. 15 (2), 128-135 (2014).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit 9.34 (2010).
- Chattopadhyay, P. K., et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine. 12 (8), 972-977 (2006).
- Duetz, C., Bachas, C., Westers, T. M., Avan de Loosdrecht, A. A. Computational analysis of flow cytometry data in hematological malignancies: future clinical practice. Current Opinion in Oncology. 32 (2), 162-169 (2020).
- Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews. Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).
