Summary
Este protocolo descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular e a subsequente caracterização de subconjuntos celulares em plataformas citométricas de fluxo padrão.
Abstract
O sputum, amplamente utilizado para estudar o conteúdo celular e outras características microambientais para entender a saúde do pulmão, é tradicionalmente analisado por meio de metodologias baseadas em citologia. Sua utilidade é limitada porque a leitura dos slides é demorada e requer pessoal altamente especializado. Além disso, detritos extensos e a presença de muitas células epiteliais escamosas (SECs), ou células da bochecha, muitas vezes torna uma amostra inadequada para o diagnóstico. Em contraste, a citometria de fluxo permite fenotipagem de alto rendimento de populações celulares, excluindo simultaneamente detritos e SECs.
O protocolo aqui apresentado descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular, mancha de anticorpos e fixar populações celulares, e adquirir amostras em uma plataforma citométrica de fluxo. Uma estratégia de gating que descreve a exclusão de detritos, células mortas (incluindo SECs) e doublets de células é apresentada aqui. Além disso, este trabalho também explica como analisar células de escarro única viáveis baseadas em um aglomerado de diferenciação (CD)45 populações positivas e negativas para caracterizar subconjuntos de linhagem hematopoiética e epitelial. Uma medida de controle de qualidade também é fornecida pela identificação de macrófagos específicos do pulmão como evidência de que uma amostra é derivada do pulmão e não é saliva. Finalmente, foi demonstrado que este método pode ser aplicado a diferentes plataformas citométricas, fornecendo perfis de escarro do mesmo paciente analisado em três citómetros de fluxo; Navios EX, LSR II e Lyric. Além disso, este protocolo pode ser modificado para incluir marcadores celulares adicionais de interesse. Um método para analisar uma amostra de escarro inteira em uma plataforma citométrica de fluxo é apresentado aqui que torna a escarro favorável para o desenvolvimento de diagnósticos de alta produtividade de doenças pulmonares.
Introduction
Os avanços técnicos no hardware e software de citómetros de fluxo permitiram identificar muitas populações celulares distintas simultaneamente1,2,3,4. A utilização do citómetro de fluxo na pesquisa de células hematopoiéticas, por exemplo, levou a uma compreensão muito melhor do sistema imunológico2 e da hierarquia celular do sistema hematopoiético5, bem como a distinção diagnóstica de uma infinidade de diferentes cânceres sanguíneos6,7,8. Embora a maioria das células de escarro sejam de origem hematopoiética9,10,11, a citometria de fluxo não tem sido amplamente aplicada à análise de escarro para fins diagnósticos. No entanto, vários estudos sugerem que a avaliação das populações de células imunes na escarro (o subconjunto mais significativo de células) pode ser de grande ajuda no diagnóstico e/ou monitoramento de doenças como asma e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)12,13,14,15. Além disso, a existência de marcadores epiteliais específicos que podem ser usados na citometria de fluxo permite o interrogatório do subconjunto mais significativo de células em escarro, células epiteliais pulmonares.
Além da capacidade de analisar muitas populações celulares distintas de diferentes origens teciduais, um citômetro de fluxo pode avaliar um grande número de células em um período relativamente curto. Em comparação, os tipos de análises cológicas baseadas em slides muitas vezes requerem pessoal e/ou equipamento altamente especializados. Essas análises podem ser intensivas em mão-de-obra, o que leva a apenas uma proporção da amostra de escarro que está sendo analisada16.
Três questões críticas limitam o uso generalizado de escarro na citometria de fluxo. A primeira questão diz respeito à coleta de escarro. A saliva é coletada através de uma tosse que expele muco dos pulmões para a cavidade oral, posteriormente cuspindo em um copo de coleta. Uma vez que o muco viaja através da cavidade oral, há uma alta chance de contaminação sec. Essa contaminação complica a análise da amostra, mas o problema é facilmente corrigido em uma plataforma citométrica de fluxo, como mostrado neste estudo.
Nem todo mundo pode produzir escarro espontaneamente; por isso, vários dispositivos foram desenvolvidos para auxiliar na coleta de escarro de forma não invasiva17. O nebulizador é um desses dispositivos e tem sido mostrado para produzir amostras de escarro confiáveis18,19,20. Embora o nebulizador seja uma forma muito eficaz de coleta não invasiva, seu uso ainda requer uma configuração em uma instalação médica com pessoal especializado21. Em contraste, dispositivos portáteis como a flauta pulmonar22,23,24 e o acapella16,25 podem ser usados em casa, pois são muito fáceis de usar. Estes dispositivos de assistência são seguros e econômicos.
Para nós, a acapella deu resultados consistentemente melhores do que a flauta pulmonar16 e, portanto, o dispositivo de acapella foi escolhido para coleções de escarro. Uma amostra de coleta de 3 dias foi decidida porque o objetivo principal do uso de escarro é desenvolver um teste de detecção de câncer de pulmão16. Foi demonstrado que uma amostra de 3 dias aumenta a probabilidade de detecção de câncer de pulmão em comparação com uma amostra de 1 ou 2 dias26,27,28. No entanto, outros métodos de coleta de escarro podem ser preferíveis para diferentes propósitos. Se um método de coleta de escarro diferente for utilizado do que o descrito aqui, recomenda-se titular cuidadosamente cada anticorpo ou corante usado para análise citométrica de fluxo; muito poucos dados estão disponíveis sobre como diferentes métodos de coleta de escarro afetam as proteínas-alvo para citometria de fluxo.
A segunda questão que amortece o entusiasmo pelo uso de escarro para diagnósticos, principalmente relacionados à citometria de fluxo, é o número de células. O problema é a coleta de células viáveis suficientes para uma análise confiável. Dois estudos demonstraram que amostras de escarro coletadas por métodos não invasivos, com a ajuda de um dispositivo auxiliar, contêm células viáveis suficientes que podem ser utilizadas em diagnóstico clínico ou estudos de pesquisa16,24. No entanto, nenhum desses estudos abordou a questão dos números celulares relativos à citometria de fluxo.
Para os estudos que formam a base para este protocolo, foram coletadas amostras de escarro de participantes de alto risco para o desenvolvimento de câncer de pulmão seguindo diretrizes institucionais aprovadas para cada local de estudo. Os participantes de alto risco foram definidos entre 55 e 75 anos, tendo fumado 30 anos de embalagem e não ter parado de fumar nos últimos 15 anos. Os pacientes foram mostrados como usar o dispositivo de acapella de acordo com as instruções do fabricante29 e coletaram escarro por três dias consecutivos em casa. A amostra foi mantida na geladeira até a última coleta. No último dia de coleta, a amostra foi enviada ao laboratório durante a noite com um pacote frio congelado. As amostras foram processadas em uma única suspensão celular no dia em que foram recebidas. Com este método de coleta de escarro, mais do que suficientes células viáveis são obtidas para uma análise citométrica de fluxo confiável.
Por fim, e relacionado com a emissão anterior do número de células, é a questão de como liberar as células de escarro de seu ambiente mucinoso. Como as células podem ser mantidas viáveis e criar uma única suspensão celular que não obstrua o citómetro de fluxo? Baseado no trabalho inicial de Pizzichini et al.30 e Miller et al.31, este protocolo descreve um método fácil e confiável para o processamento de escarro em uma única suspensão celular adequada para análise citométrica de fluxo. Este método tem utilizado diretrizes bem estabelecidas na citometria de fluxo32,33,34 para desenvolver uma estratégia eficiente de rotulagem de anticorpos para identificar células hematopoiéticas e epiteliais em escarro e fornecer configurações de instrumentos, medidas de controle de qualidade e diretrizes de análise padronizando a análise de escarro em uma plataforma citométrica de fluxo.
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Protocol
Todas as etapas do processamento de escarro são realizadas em um gabinete de segurança biológica com equipamentos de proteção individual adequados.
1. Preparação do reagente antes de iniciar a dissociação do escarro
- Descongele 1% Paraformaldeído (PFA), 25 mL por amostra no gelo e mantenha frio até o uso.
ATENÇÃO: O PFA é tóxico por inalação e contato com a pele. Prepare o fixador de acordo com as instruções do fabricante e congele a -20 °C em alíquotas de 25 mL até usar. - Aproxime o peso da amostra e descongele 0,1% Dithiothreitol (DTT) para a etapa 2.2 e leve-a a 37 °C. (As alíquotas de DTT devem ser armazenadas a -20 °C antes do uso.)
- Leve 0,5% N-acetil-L-cisteína (NAC) até 37 °C para a etapa 2.2. (O NAC deve ser feito fresco semanalmente e armazenado a 4 °C antes do uso.)
2. Dissociação de sputum
- Pese a amostra de escarro para determinar os volumes de reagentes de dissociação.
NOTA: Considera-se que uma amostra é pequena se o peso inicial for ≤3 g, médio se > 3 g, mas ≤ 8 g, grande se >8, mas ≤16 g, e extra-grande se uma amostra pesa >16 g. As indicações pequenas, médias, grandes e extra-grandes serão utilizadas em todo o protocolo. A quantidade de reagentes necessários para dissociação e rotulagem diferem de acordo com o tamanho da amostra de escarro. - Transfira uma pequena amostra para um tubo cônico limpo de 50 mL, uma amostra média para uma garrafa descartável de plástico de 250 mL limpa, ou uma amostra grande e extra-grande para uma garrafa descartável de plástico limpa de 500 mL. Adicione 1 mL/g de peso amostral de 0,5% NAC e 4 mL/g de peso amostral de 0,1% DTT.
- Vórtice em velocidade máxima (para 15 s), e depois arrasa em temperatura ambiente (em velocidade máxima) por 15 minutos.
- Diluir a amostra com quatro volumes da Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hank (com base no volume total de amostras + reagentes) para neutralizar o NAC e o DTT; vórtice rapidamente em velocidade máxima e rocha em temperatura ambiente por 5 minutos em velocidade máxima.
- Filtre a suspensão da célula através de um filtro de célula de malha de nylon de 100 μm em um ou mais tubos de centrífuga cônica de 50 mL para criar uma suspensão unicelular.
- Centrifugar as células a 800 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernasce, combine todas as pelotas em um tubo cônico de 15 mL e depois lave as pelotas com HBSS usando as mesmas condições.
- Resuspengem a pelota celular em um volume de tampão determinado pelo peso inicial da amostra de escarro.
NOTA: Uma pequena amostra é resuspendida em 250 μL de HBSS. Uma amostra média é resuspendida em 760 μL de HBSS. Amostras grandes e extra-grandes são resuspendidas em 1460 μL de HBSS. - Pegue uma alíquota da suspensão da célula para uma contagem de células viva/morta usando o Trypan Blue.
NOTA: Para uma amostra pequena, use 5 μL. Para uma amostra média, grande ou extra-grande, use 10 μL. Diluir 1:10 com HBSS.- Misture 10 μL da diluição do escarro com 30 μL de 0,4% Trypan Blue para obter uma diluição amostral final de 1:40. Carregue nas câmaras de contagem de um hemócito para uma contagem de células.
NOTA: Pode ser necessário ajustar a diluição final se os números de células estiverem muito baixos ou muito altos para obter uma contagem precisa. Consultar Guiot et al.20 para distinguir corretamente células de escarro de SECs e detritos é fortemente recomendado aqui. Isso é essencial para uma contagem de células precisa.
- Misture 10 μL da diluição do escarro com 30 μL de 0,4% Trypan Blue para obter uma diluição amostral final de 1:40. Carregue nas câmaras de contagem de um hemócito para uma contagem de células.
- Da amostra extra-grande, remova 50 x 106 células do total e adicione a um novo tubo com HBSS adicionado o suficiente para criar um volume total de 1700 μL.
NOTA: Considere esta uma amostra grande para o restante do protocolo. As amostras restantes podem ser descartadas ou usadas para outros fins.
3. Mancha de corante anticorpo e viabilidade
- Escolha de anticorpos e corante de coloração
NOTA: A Tabela 1 mostra os anticorpos e o corante de viabilidade que são utilizados neste protocolo e as populações celulares que identificam.- Rotule os tubos que contêm as células de escarro (ver Tabela 2 para etiquetas).
- Use tubos de citometria de fluxo de 5 mL (compatíveis com o citômetro de fluxo utilizado) para o tubo de amostra com as células não manchadas e o tubo com o controle do isótipo. Use tubos cônicos de 15 mL para as amostras de sangue e tubo epitelial.
NOTA: Estas amostras serão transferidas para tubos de citometria de fluxo após a coloração e fixação de anticorpos.
- Rotule os tubos de compensação (Tabela 3).
NOTA: Utilize tubos de citometria de fluxo de 5 mL compatíveis com o cítmetro de fluxo que está sendo utilizado. - Adicione a quantidade de HBSS, anticorpos e/ou corantes a cada um dos tubos de células de escarro e tubos de compensação, conforme indicado na Tabela 2 e Na Tabela 3, respectivamente.
NOTA: Adicione tampão (HBBS), anticorpos e corante a todos os tubos antes de adicionar células ou contas de compensação para garantir que o tempo de coloração de todos os tubos seja consistente. - Adicione as quantidades de volume de células de escarro listadas na Tabela 2 aos tubos de ensaio.
- Adicione contas de compensação aos tubos de compensação conforme listado na Tabela 3.
- Incubar todos os tubos (tubos de ensaio e compensação) no gelo, protegidos da luz, por 35 minutos. Em seguida, encha os tubos com HBSS gelado e centrífuga a 4 °C por 10 min a 800 x g.
- Para os tubos de compensação, aspire o supernante o mais próximo possível das pelotas e aperte as pelotas para soltar.
- Adicione 0,5 mL de HBSS frio aos tubos de compensação, armazene-os no gelo a 4 °C e proteja-os da luz até que seja necessário para a análise da citometria de fluxo.
- Aspire o supernatante do isótipo, sangue e tubos epiteliais não contidos após a centrifugação (passo 3.6 da seção de coloração de anticorpos) e solte as pelotas apertando os tubos.
4. Fixação com 1% de paraformaldeído (PFA)
- Adicione a PFA fria de 1% (que deve ser descongelada até agora) aos tubos não localizados, isótipo, sangue e epitelial; 2 mL para os tubos de isótipo e isótipo não manchados, e 10 mL para os tubos sanguíneos e epiteliais.
- Incubar os tubos no gelo, protegidos da luz por 1h. Vórtice rapidamente em velocidade máxima após 30 min.
- Encha os tubos com HBSS gelado. Em seguida, tubos de centrífugas a 4 °C por 10 min a 1600 x g.
- Aspire o máximo de supernasce possível sem perturbar a pelota celular e aperte o tubo com os dedos para soltar as células.
- Adicione 200 μL de HBSS frio aos tubos de isótipo e isótipo não manchados.
- Calcule o volume de HBSS para resuspensão do sangue e tubo epitelial de acordo com a contagem total de células.
NOTA: Volume de resuspensão = 0,15 x [contagem total de células (etapa 8 de dissociação de escarro) / 106]. Use 50 x 106 como contagem de células para uma amostra extra-grande. - Armazene todos os tubos de amostra e compensação, protegidos da luz no gelo a 4 °C até que a análise da citometria de fluxo seja realizada.
NOTA: Este protocolo não foi testado para armazenamento por mais de 24 horas.
5. Aquisição de dados no cicímetro de fluxo
- Aplique procedimentos de inicialização adequados para o cítmetro de fluxo que está sendo utilizado.
NOTA: Esta seção do protocolo pressupõe que a pessoa que opera o citômetro de fluxo é treinada no uso do instrumento disponível a eles, especialmente no que diz respeito aos procedimentos diários, incluindo a verificação da estabilidade dos sistemas ópticos e fluidos, técnicas para padronizar a dispersão de luz e intensidade de fluorescência, bem como calcular e aplicar a matriz de compensação correta. - Use a mistura de contas do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) para garantir que as tensões de dispersão para a frente e dispersão lateral sejam definidas para colocar as contas NIST para cobrir todo o enredo sem colocar as contas muito perto dos eixos.
NOTA: Esta etapa é crucial para garantir que detritos menores que 5 μm possam ser eliminados por meio da análise pós-aquisição. Dependendo do citómetro de fluxo utilizado, esteja atento que as menores contas não estão sendo excluídas com o limiar (ao usar o LSR II ou o Lyric) ou com o alto discriminador (usando o citômetro de fluxo Navios EX). Para o Navios EX, foi utilizado um ganho de 2 para a dispersão dianteira e lateral, uma tensão de 236 para dispersão para a frente e 250 para dispersão lateral. Para o LSR II, foi utilizada uma tensão de dispersão para a frente de 165 e uma tensão de dispersão lateral de 190. - Defina a vazão para médio (LSR II) ou alto (Navios EX).
NOTA: A taxa média ou alta de fluxo para a maioria dos instrumentos pode ser usada para adquirir os tubos de escarro. É importante notar que o uso muito lento de uma taxa de fluxo ou muito diluído da amostra pode resultar na fixação das células, resultando em um aumento do vórtice que não é desejado. Portanto, a adesão ao volume calculado de resuspensão na etapa 4.6 deve resultar em densidade celular que pode ser adquirida rapidamente, mas não entupir a máquina. - Ajuste as tensões para cada parâmetro utilizado para os parâmetros de dispersão e fluorescentes para colocar as populações celulares na escala. Use os números com a estratégia de gating como orientação sobre como ajustar as tensões de acordo.
NOTA: Certifique-se de que todos os parâmetros necessários sejam selecionados na janela de seleção de parâmetros antes da aquisição ou que os dados não sejam adquiridos. - Adquira os dados da amostra de escarro não manchada primeiro, seguido pela amostra manchada de isótipo, e depois o tubo sanguíneo e o tubo epitelial.
NOTA: Se a suspensão da célula estiver muito concentrada para permitir que o citômetro de fluxo execute as amostras sem entupimento, as amostras podem ser diluídas com HBSS.
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Representative Results
Este protocolo foi desenvolvido com um ambiente de laboratório clínico em mente. O foco durante o desenvolvimento do protocolo foi a simplicidade, eficiência e reprodutibilidade. Verificou-se que o passo mais demorado no processamento da escarro era contar as células. Portanto, o protocolo é configurado de tal forma que o processamento de escarro e rotulagem celular possam ser realizados independentemente da contagem celular sem perda de tempo. Uma contagem de células precisa, que ainda é necessária para diluir a amostra adequadamente para uma corrida desobstruída, pode então ser obtida durante o período de incubação de rotulagem de anticorpos.
Este protocolo usa uma medida de peso de escarro em vez de uma contagem de células como uma indicação de quanto anticorpo/corante usar para rotulagem celular ideal. No entanto, há um grande grau de variação no peso das amostras de escarro; das 126 amostras analisadas, o peso variou de 0,57 g a 38,30 g. A Figura 1A mostra que a correlação entre peso escarro e rendimento celular não é forte. Portanto, as amostras foram divididas em quatro categorias; os pesos medianos das amostras foram de 2,1 g para amostras pequenas, 5,0 g para amostras médias, 11,2 g para amostras grandes e 22,0 g para amostras extra-grandes (Figura 1B). No entanto, ainda havia amostras que produziam muito mais células do que o esperado com base em seu peso (Figura 1C), a maioria das amostras agrupadas bem. Para amostras pequenas, o rendimento médio das células foi de 8,0 x 106 células, para amostras médias 13,0 x 106, para amostras grandes 35,4 x 106, e amostras extra-grandes 93,0 x 106.
Cada anticorpo usado neste protocolo foi titulado. Foi escolhida uma concentração na fase do planalto (Figura 2A) com o maior índice de coloração (Figura 2B) da curva de titulação. Variações nos números de células não alterarão drasticamente a intensidade da coloração. Esta titulação e teste de anticorpos é essencial e deve ser configurado com cuidado para cada novo anticorpo ou corante usado neste protocolo34,35. Quando um anticorpo é titulado com cuidado, ele deve manchar de 10 a 50 vezes mais células do que o número de células em que o anticorpo foi titulado34,35. Um exemplo deste princípio está previsto na Tabela 4. O anticorpo anti-humano CD45-PE foi titulado em 1 x 106 células em um volume total de 400 μL. Se este anticorpo para o volume de coloração for extrapolado para o protocolo (ver Tabela 2, que mostra a quantidade CD45-PE e os volumes de coloração para cada tamanho amostral), para uma pequena amostra, 0,625 x 106 células serão manchadas, 1,25 x 106 células serão manchadas para uma amostra média, e 2,5 x 106 células para uma grande amostra (coluna A na Tabela 4). Calcula-se um excesso de 50 vezes no número celular para cada categoria, com 31,25 x 106, 62,5 x 106 e 125 x 106 células, respectivamente (coluna B). Como mostrado nas colunas C e D, o número de células medianas de cada categoria de tamanho e a maior amostra em cada categoria estão bem dentro da faixa de 50 vezes.
Apesar das diferenças aparentes de tamanho e rendimento celular entre os vários tamanhos das amostras de escarro, a contaminação mediana por cento SEC em cada categoria é muito semelhante. A Figura 3A mostra o percentual de SECs encontrados em amostras individuais, estratificados de acordo com a categoria de peso da escarro. A principal preocupação foi com as SECs, uma vez que essas células não são representativas do tecido pulmonar, mas da cavidade oral. No entanto, a contaminação média da SEC é inferior a 20% para todas as categorias. A Figura 3B mostra a porcentagem de células viáveis encontradas nessas amostras. Excluindo as SECs, a viabilidade média foi de aproximadamente 72% para as categorias de tamanho amostral pequeno, médio e grande. Foi ligeiramente maior (79%) para a categoria extra-grande.
A Figura 4 mostra uma estratégia típica de gating para separar as células de escarro de interesse de detritos, células mortas (que também inclui os SECs 36 contaminantes) e aglomerados de células. A Figura 4A mostra o uso de contas NIST para definir portões para eliminar detritos menores que 5 μm ou maiores que 30 μm, enquanto a Figura 4B aplica este portão em células de escarro. A Figura 4C mostra um perfil típico de escarro quando visto como largura de dispersão lateral (SSC-W) contra largura de dispersão para a frente (FSC-W), o portão de largura. Este perfil é usado para eliminar pequenos detritos que se apresentam ao longo dos eixos SSC-W e FSC-W. A eliminação de células mortas é mostrada nas Figuras 4D e Figura 4E. O controle não identificado (Figura 4D) é usado para determinar o corte para positividade FVS510; células que mancham positivo para FVS510 acima do controle negativo são consideradas mortas e não serão utilizadas na análise de células de escarro (Figura 4E). Por fim, um portão singlet é aplicado para remover dobras celulares da análise, que é mostrada na Figura 4F. Assim, as células que passaram pelos portões de seleção mostrados nas Figuras 4B, Figura 4C, Figura 4E e Figura 4F representam células de escarro vivas e únicas prontas para análise subsequente com os anticorpos utilizados neste protocolo.
O uso do anticorpo anti-CD45 neste protocolo de rotulagem permite a separação de células de escarro ao vivo e único em um compartimento celular de sangue (CD45+) e um compartimento celular não-sanguíneo (CD45-). Esta última categoria inclui células epiteliais e outras células não-sanguíneas. O perfil superior na Figura 5A mostra o uso de uma amostra de escarro não manchada para definir o corte para positividade CD45, tornando os portões para capturar células CD45+ e células CD45. O perfil inferior da Figura 5A mostra ambos os portões aplicados a uma amostra de escarro manchada com o anticorpo anti-CD45. A coloração com anticorpos adicionais é então usada para identificar populações específicas de células sanguíneas dentro do portão CD45+ (Figura 5B) e outras populações não-sanguíneas, incluindo populações epiteliais no portão CD45 (Figura 5C). Em ambos os números, os principais perfis mostram como o escarro manchado de isótipo é usado para definir as populações duplas negativas, enquanto os perfis inferiores mostram as células de escarro manchadas de anticorpos. A Figura 5B (inferior) mostra seis diferentes populações de células CD45+ criadas com o coquetel de anticorpos detectáveis no canal fluorescência (FL) 1 (anti-CD66b, CD3, anticorpos CD19) e anti-CD206 detectáveis no canal FL3. Experimentos de triagem revelaram que macrófagos específicos do pulmão residem nos portões identificados com M. A presença de células nesses portões indica, assim, que a amostra de escarro foi derivada do pulmão e não foi saliva (Bederka et al., manuscrito em preparação). A Figura 5C (inferior) mostra os quadrantes gating criados com o anti-pan-cytokeratin (panCK) detectável no canal FL1 e anticorpos anti-epiteliais (EpCAM) detectáveis no canal FL3 entre as células cd45-escarro.
Este protocolo de rotulagem foi amplamente testado nos Navios EX e no LSR II. Alguns experimentos preliminares foram realizados na Lyric, mas sem a extensa otimização de instrumentos que foi feita para as outras duas máquinas. Portanto, estão previstas configurações detalhadas de instrumentos para os Navios EX e o LSR II na folha de Materiais, mas não para a Letra. Para entender as semelhanças e variações entre essas três plataformas citométricas de fluxo que podem ser utilizadas para analisar células de escarro, perfis obtidos das várias máquinas podem ser comparados na Figura 6 e Figura 7. Duas grandes amostras de escarro foram processadas, agrupadas, rotuladas, separadas em três porções iguais e posteriormente adquiridas em cada citmetro de fluxo mencionado acima. A Figura 6, semelhante à Figura 4, compara a estratégia de gating para eliminar detritos, células mortas e aglomerados de células. A Figura 7, idêntica à Figura 5, compara os perfis sanguíneos e não sanguíneos dos dados adquiridos nos vários citómetros de fluxo.
Comparar os vários perfis obtidos dos três diferentes citómetros de fluxo mostra que os mesmos perfis básicos podem ser observados com cada instrumento. As diferenças a serem observadas são as parcelas SSC-W/FSC-W (portão de largura) (Figura 6, segunda linha) e as escalas lineares das parcelas de dispersão (Figuras 6 e 7). O lote de largura de dispersão gerado no Navios EX mostra um portão de inclusão (caixa vermelha), o que significa que todas as células incluídas no portão são mais analisadas; os eventos ao longo dos eixos no canto inferior esquerdo são excluídos. As parcelas de largura de dispersão no LSR II e lyric não mostram um depósito semelhante de eventos ao longo desses mesmos eixos. Essa discrepância é provavelmente devido ao limiar muito sensível usado no Navios EX, levando a alguns pequenos detritos no portão de exclusão de tamanho anterior (linha superior da Figura 6). Na ocasião, detritos são vistos ao longo dos eixos no perfil de largura de dispersão gerado no LSRII, mas está no canto inferior direito. Nesses casos, um portão de exclusão (conforme indicado pela caixa vermelha tracejada no perfil médio da linha 2 da Figura 6) é usado para eliminar esses eventos de análises posteriores.
Enquanto as escalas de log aparecem ligeiramente diferentes nas parcelas entre os navios EX e os citómetros Lyric e LSR II, o Navios EX tem a opção de adquirir dados usando mais décadas. A implementação de mais décadas depende do contexto do experimento e da sensibilidade desejada para visualizar as populações de interesse.
Uma diferença notável adicional entre os citómetros Navios EX e LSR II e Lírico é o aparecimento do perfil do portão singlet. O citómetro Navios EX é equipado com uma célula de fluxo retangular com um ângulo de coleta diferente do LSR II. O Navios EX contém três ângulos de coleta controlados por software para otimizar a dispersão de luz de ângulo dianteiro para obter a sensibilidade apropriada para o tamanho das partículas analisar. O portão de polígono do citômetro Navios EX precisará ser ajustado a um ângulo ligeiramente mais baixo do que o portão singlet para o LSRII. O singlet gate para o Lyric pode ser otimizado para obter um perfil semelhante ao visto com o LSR II. Usando a amostra de escarro, o fator de dimensionamento da área precisaria ser otimizado para cada laser na Letra para alcançar um único portão semelhante ao LSR II.
Todos os perfis mostrados na Figura 4 à Figura 7 foram analisados com o software FlowJo, versão 10.6. Os arquivos .fcs podem ser encontrados no FlowRepository (https://flowrepository.org), sob os IDs FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ e FR-FCM-Z3MM e podem ser usados para praticar a análise de escarro conforme ilustrado nessas figuras.
Figura 1: Pesos de escarro e rendimento celular. (A) Retratado é a relação entre o peso da escarro, determinado antes do processamento, e o rendimento total da célula, determinado após o processamento usando um hemócito. Cada bala representa uma amostra individual, 126 no total. (B) As amostras de escarro foram estratificadas em quatro categorias com base em seu peso: pequenas para amostras que pesam até 3 g, médias para amostras que pesam mais de 3 g até 8 g, grandes para amostras que pesam mais de 8 g até 16 g, e amostras extra-grandes para aquelas que pesam mais de 16 g. (C) Mostrada é a distribuição do rendimento celular para as amostras em cada categoria. As barras vermelhas em (B) e (C) representam os valores medianos em cada categoria. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Titulação de anticorpos para CD45-PE anti-humano. (A) A curva de titulação CD45-PE (IgG1) com a intensidade média de fluorescência (IM) da população positiva plotada versus a concentração dos platôs de anticorpos CD45-PE a 1 μg/mL. (B) Curva de titulação representando o índice de coloração versus a concentração de anticorpos mostra que o maior índice de coloração está em 1 μg/mL. O índice de coloração foi calculado como: [População positiva de IMF CD45 - população negativa cd45 MFI] / [2 * Desvio Padrão]. Com base na Figura 2A e Figura 2B, 1 μg/mL foi escolhida como a concentração ideal para o anticorpo CD45-PE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Proporção de SECs e células mortas em amostras de escarro é consistente entre as quatro categorias de peso. (A) A proporção de SECs em amostras de escarro é classificada de acordo com sua categoria de peso. A contaminação percentual da SEC foi determinada pelo hemócito como parte da contagem total de células. (B) Viabilidade celular de amostras de escarro excluindo SECS, determinada pelo hemócito e pelo método de exclusão azul trypan. Para cada gráfico, as linhas vermelhas representam os valores medianos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Estratégia de gating para excluir detritos, células mortas e dobras em uma amostra de escarro. (A) Contas NIST de tamanhos de 5 μm, 20 μm e 30 μm foram usadas para definir o portão indicado pela caixa vermelha para excluir detritos menores que 5 μm e detritos maiores acima de 30 μm e perto do eixo. (B) Uma amostra de escarro foi adquirida utilizando as mesmas tensões para a dispersão dianteira e lateral das contas NIST. O portão criado em (A) foi aplicado para excluir detritos. (C) Foram excluídos pequenos detritos próximos ao eixo nesta parcela de largura de dispersão. (D) Uma amostra de escarro não manchada foi utilizada para definir o corte (linha vermelha) para a população negativa e não manchada para o corante de viabilidade. (E) O corte criado em D foi aplicado à amostra de escarro manchada para formar um portão (caixa vermelha) para incluir células vivas e viáveis. (F) O portão de singlet indicado pelo polígono vermelho exclui células que não caem na diagonal, eliminando dobras e/ou aglomerados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: A estratégia de gating de células de escarro em compartimentos sanguíneos e não-glóbulos. (A) Células de escarro não manchadas derivadas do portão singlet são usadas para definir o corte (linha vermelha) na população negativa para CD45 (topo). O recorte do perfil superior é aplicado à amostra de escarro manchada (inferior) para diferenciar cd45 positivo (CD45+) e populações negativas (CD45-). (B) Células de escarro CD45+ manchadas com anticorpos isótipos para FITC/AF488 são usadas para definir os portões na população negativa (topo). Os mesmos portões são aplicados às células de escarro CD45+ manchadas com marcadores de células sanguíneas CD3, CD19, CD66b e CD206 (inferior). (C) Os portões do quadrante são colocados nas células cd45- escarro manchadas com controles isótipos (superior) e aplicadas às células CD45 da amostra de escarro manchadas com os marcadores epiteliais pan-cytokeratin (panCK) e EpCAM (inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Estratégia de gating para excluir detritos, aglomerados e células mortas de células de escarro manchadas em três plataformas citométricas de fluxo. Duas grandes amostras de escarro foram processadas, agrupadas, rotuladas e divididas em três porções iguais para aquisição nos citómetros de fluxo Navios EX (A), LSR II (B) e nos citómetros de fluxo Lírico (C). Linha superior: Amostras de escarro foram fechadas (caixa vermelha) para excluir detritos muito pequenos e grandes. Segunda linha: A grande caixa vermelha no lote Navios EX representa um portão de inclusão que inclui as células, mas exclui detritos. A pequena caixa vermelha tracejada vista no lote LSR II representa um portão de exclusão para eliminar detritos de análises posteriores. Mais otimização com a Letra é necessária para determinar onde a exclusão de detritos é necessária. Portanto, nenhum portão está presente nessa trama. Terceira linha: portões retangulares vermelhos incluem células vivas para análise posterior. Linha inferior: o portão do polígono tem células únicas, excluindo doublets que caem fora da diagonal do portão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Estratégia de gating para escarro manchada para sangue e marcadores epiteliais em três plataformas citométricas de fluxo. A análise apresentada na Figura 6 continua na Figura 7; todas as células únicas viáveis (linha inferior, Figura 6) foram divididas em populações CD45+ e CD45 (primeira linha, Figura 7), de modo que marcadores específicos de células sanguíneas e marcadores epiteliais específicos das células poderiam delinear ainda mais essas populações. Segunda linha: perfil dos marcadores de células sanguíneas CD3/CD19/CD66b e CD206 de células CD45+. Terceira linha: marcadores de células epiteliais panCK e EpCAM de células CD45. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Anticorpo/mancha | Propósito |
| FVS510 | Mancha de viabilidade |
| CD45 anti-humano – PE | Marcador pan-leucócito; Compensação de PE |
| CD66b anti-humano – FITC | Marcador de granulocito |
| CD3 anti-humano – Alexa488 | Marcador de célula T |
| CD19 anti-humano – Alexa488 | Marcador de célula B; Compensação FITC/Alexa488 |
| CD anti-humano206 – PE-CF594 | Marcador de macrófago pulmonar; Compensação PE-CF594 |
| Epcam anti-humana - PE-CF594 | Marcador celular epitelial; Compensação PE-CF594 |
| Pan-cytokeratin anti-humano (panCK) – Alexa488 | Marcador celular epitelial |
| IgG1κ - Alexa488 | Controle isótipo CD3/CD19/panCK |
| IgG1κ - FITC | Controle do isótipo CD66b |
| IgG1κ - PE-CF594 | Controle de isótipo CD206/EpCAM |
| CD45 anti-humano – BV510 | Compensação FVS510 |
Tabela 1: Anticorpos e manchas de viabilidade utilizadas. Lista de anticorpos e corante de viabilidade usado neste protocolo. Indicados são os subconjuntos celulares que cada um identifica.
| Tubo (etiqueta) | Tamanho da amostra* | HBSS (μL) | FVS510 (μL) | CD45 (μL) | Outros anticorpos (μL) | Células § (μL) | |||
| Sem acordo | pequeno | 80 | 20 | ||||||
| Média | 50 | 50 | |||||||
| grande | 50 | 50 | |||||||
| IgG1κ - Alexa488 | IgG1κ- FITC | IgG1κ - PE-CF594 | |||||||
| Controle de isótipo | pequeno | 60.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 20 | |
| Média | 30.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| grande | 30.25 | 1 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| CD206 | CD3 | CD19 | CD66b | ||||||
| Sangue | pequeno | 92.875 | 1.5 | 25 | 1.875 | 5 | 1.25 | 7.5 | 115 |
| Média | 65.75 | 3 | 50 | 3.75 | 10 | 2.5 | 15 | 350 | |
| grande | 102.5 | 10 | 100 | 7.5 | 20 | 5 | 30 | 725 | |
| EpCAM | PanCK | ||||||||
| Epitelial | pequeno | 96.5 | 1.5 | 25 | 10 | 2 | 115 | ||
| Média | 73 | 3 | 50 | 20 | 4 | 350 | |||
| grande | 117 | 10 | 100 | 40 | 8 | 725 | |||
| * As amostras são consideradas pequenas, médias ou grandes com base no peso determinado na etapa 1 da seção de dissociação da escarro do protocolo. | |||||||||
| § As células devem ser adicionadas após a distribuição de todos os reagentes, incluindo os dos tubos de compensação (Tabela 3). | |||||||||
Tabela 2: Conteúdo de tubos com células de escarro. Use esta tabela como referenciada no protocolo para adicionar os volumes especificados de anticorpos e mancha de viabilidade para o tamanho adequado da amostra.
| Tubo (etiqueta) | Reagentes adicionados (μL) | Reagentes adicionados (gota) | ||||||
| HBSS | CD45-PE | CD206-PE-CF594 | EpCAM-PE-CF594 | CD19-Alexa488 | CD45-BV510 | CompBead (+) | CompBead * (-) | |
| PE comp. | 76 | 4 | x | x | x | x | 1 | 1 |
| PE-CF594 comp. | 72 | x | 4 | 4 | x | x | 1 | 1 |
| Alexa488/FITC comp. | 60 | x | x | x | 20 | x | 1 | 1 |
| BV510 comp. | 60 | x | x | x | x | 20 | 1 | 1 |
| * As contas positivas (+) e negativas (-) devem ser adicionadas após a distribuição de todos os reagentes e os tubos na Tabela 2. | ||||||||
| comp. = compensação | ||||||||
Tabela 3: Conteúdo de tubos de compensação. Use esta tabela como referenciada no protocolo para adicionar os volumes especificados de anticorpos às contas de compensação.
| Número de celular (x 106) | ||||
| Um | B | C | D | |
| Tamanho da amostra | Em volume de coloração * | Acesso 50 vezes | Amostra mediana (acesso à dobra) # | Maior amostra (acesso à dobra) # |
| Pequeno | 0.625 | 31.25 | 8.0 (12.8) | 24.77 (39.6) |
| Média | 1.25 | 62.5 | 13.0 (10.4) | 48.87 (39.1) |
| Grande | 2.5 | 125 | 35.4 (14.2) | 113.5 (45.4) |
| * Volumes de coloração utilizados no protocolo (Tabela 2). O número celular é extrapolado de como a curva de titulação foi realizada; 1 μg/mL de CD45-PE e 1 x 106 células por 200 μL. | ||||
| Acesso 50 vezes aos números de celular na Coluna A. | ||||
| # o acesso da dobra nas colunas C e D são calculados dividindo o número apresentado nas células das colunas C ou D pelo número na célula correspondente na coluna A. | ||||
Tabela 4: Concentração anti-humana de CD45-PE para todas as amostras em cada categoria de tamanho amostral.
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Discussion
O conteúdo celular da escarro inclui uma grande variedade de células amplas, muitas vezes acompanhadas por muitos detritos37. Além disso, a análise da escarro requer um controle de qualidade que confirme que a amostra é coletada do pulmão em vez da cavidade oral38. Portanto, não é tão simples analisar a escarro por citometria de fluxo como é para o sangue, por exemplo, que libera uma suspensão celular muito mais limpa e homogênea. Este protocolo abordou todas essas questões: fornecendo configurações de instrumentos usando contas de tamanho específico para garantir que tanto as menores e maiores populações celulares possam ser detectadas, uma estratégia de gating para eliminar detritos, aglomerados de células, secs contaminantes e outras células mortas, e, por último, uma medida de controle de qualidade para garantir que uma amostra de sputum seja do pulmão em vez de ser principalmente saliva.
Existem passos críticos no protocolo em trabalhar com escarro que vale a pena apontar. Primeiro, o rendimento celular pode ser drasticamente impactado pelo número de filtros de células de nylon usados na etapa 2.5 da parte de dissociação do escarro do protocolo. Vários filtros podem ser necessários para evitar perder muitas células devido ao entupimento do coador. Quando o fluxo através dos filtros diminuiu visivelmente, um novo filtro deve ser usado. Em segundo lugar, a pelota celular de amostras de escarro pode ser muito solta, especialmente se houver alta contaminação de SECs. Portanto, é essencial não aspirar muito perto da pelota ao remover o sobrenante após centrifugar as amostras. Aspirar muito perto da pelota pode resultar em perda celular, se não perda de toda a pelota. Terceiro, este protocolo requer uma etapa de fixação. Isso preserva as células e seu perfil de coloração e serve como medida de segurança para proteger o operador do citrômetro de fluxo. Amostras em execução em determinados citómetros de fluxo podem apresentar maiores riscos biológicos devido ao potencial de produção de aerossol39. A fixação pfa ajuda a proteger o operador de possíveis patógenos na amostra de escarro. Em quarto lugar, e talvez o aspecto mais desafiador da preparação de amostras de escarro para análise citométrica de fluxo, é a contagem de células. A contagem de células é complicada devido à grande variedade de tipos de células presentes na escarro. As máquinas de contagem são muitas vezes limitadas pela faixa de tamanho celular que podem capturar e, portanto, são menos confiáveis do que um hemócito. No entanto, a contagem celular de amostras de escarro por hemócito, que é excelentemente descrita por Guiot et al.20, é tediosa e requer prática para se tornar proficiente. Um número de célula preciso é vital para determinar o volume final de resuspensão da amostra para permitir uma taxa de fluxo razoável e evitar tamancos no citômetro de fluxo. A presença dos SECs muito grandes na escarro e das muitas aglomerações de células menores que não são quebradas pelo tampão de dissociação, nem capturadas pelos filtros, aumentam a probabilidade de entupir o citómetro de fluxo. Portanto, recomenda-se gastar algum tempo determinando a melhor taxa de concentração/fluxo celular para aquisição de dados usando o citômetro de fluxo disponível. Além disso, certifique-se de que o citómetro de fluxo tenha a célula de fluxo apropriada e o tamanho do bocal (ou sonda) capaz de medir as populações celulares maiores presentes na escarro.
Mesmo quando a proficiência na contagem celular foi alcançada, ainda é um processo demorado. Portanto, a determinação dos reagentes para rotulagem celular neste protocolo baseia-se no tamanho da amostra (como julgado pelo peso) em vez do número celular. Isso permite um uso mais eficiente do tempo, uma vez que a contagem manual de células pode ser completada durante o tempo necessário para a coloração de anticorpos e cantagem de corante de viabilidade. No entanto, há três exceções notáveis a isso. Se uma amostra for >16 g (as chamadas amostras extra-grandes), a contagem manual de células deve ocorrer antes da coloração para que reagentes caros possam ser conservados apenas manchando 25 x 106 células cada para os tubos sanguíneos e epiteliais. Este número de celular fornece perfis muito confiáveis nas configurações descritas neste protocolo. Outra exceção potencial é o caso de uma amostra muito pequena. A estimativa é que um mínimo de células de 1-2 x 106 são necessárias para a análise da citometria de fluxo, conforme apresentado neste protocolo, para gerar perfis confiáveis (dados não mostrados). Portanto, se uma amostra contém menos de 1-2 x 106 células, pode não valer a pena continuar com o procedimento, uma vez que o resultado final provavelmente será inaceitável.
Reagentes de rotulagem específicos que funcionam bem em células sanguíneas periféricas ou linhas celulares podem funcionar de forma muito diferente em células sanguíneas contidas em escarro (observações inéditas). Portanto, recomenda-se titular cada anticorpo ou outro reagente de rotulagem de acordo com protocolos bem estabelecidos34,35 antes de serem usados em experimentos de citometria de fluxo. A maioria das titulações de anticorpos deve dar resultados comparáveis ao colorar até 10 a 50 vezes; no entanto, é aconselhável fazer titulações adicionais com números de células superiores a esse intervalo34. Quando uma concentração de reagente é determinada, é essencial manter o tempo de incubação desse reagente o mesmo que no experimento real. Por essa razão, o protocolo enfatiza a adição de todos os tampão e reagentes aos tubos antes que as células ou contas de compensação sejam adicionadas. Esta ordem de adição de reagentes e células/contas em conjunto permite maior consistência nos tempos de rotulagem. Se, por alguma razão, o tempo de incubação experimental não pode ser mantido semelhante ao usado para titulação de anticorpos/corantes, este último deve ser repetido com um tempo de incubação que é viável durante os experimentos.
Amostras de escarro têm sido amplamente utilizadas como um espécime diagnóstico para estudar a fisiopatologia de várias doenças que afetam o pulmão. Tuberculose40,41, DPOC13,42, asma43, fibrose cística44,45, câncer de pulmão46,47,48 e artrite reumatoide49 estão entre as muitas doenças onde o escarro tem sido estudado devido à vantagem de ser um espécime não invasivo. Mais recentemente, durante a pandemia do coronavírus, o escarro tem sido usado para detectar derramamento viral prolongado em pacientes internados com doença coronavírus 2019 (COVID-19)50.
Várias tecnologias, incluindo transcrição reversa-reação em cadeia de polimerase (RT-PCR), análise de proteínas, microscopia e citometria de fluxo, têm sido usadas para identificar marcadores específicos de doenças na escarro. O uso de uma plataforma citométrica de fluxo para analisar amostras de escarro não é amplamente utilizado, mas seu uso aumenta. Com os recentes avanços na tecnologia de citómetros de fluxo3,51,52, bem como avanços nas químicas dos fluoroforos, geração de novos clones de anticorpos e desenvolvimento de vários corantes para identificar populações de células mortas51,53,54, a possibilidade de projetar painéis de anticorpos destinados ao diagnóstico de doenças humanas aumentou drasticamente. Além disso, o recente impulso para automatizar a análise dos dados citométricos de fluxo55,56 eliminará o viés potencial na leitura manual e interpretação dos dados de fluxo. Esses novos desenvolvimentos na citometria de fluxo facilitarão significativamente a exploração da escarro como diagnóstico clínico.
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Disclosures
Todos os autores são funcionários antigos ou atuais da bioAffinity Technologies.
Acknowledgments
Queremos agradecer a David Rodriguez por sua ajuda com a preparação da figura. As amostras de sputum foram realizadas no BD LSR II no UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, apoiado pela UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) e UL1 TR001120 (bolsa CTSA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Paraformaldehyde Flow-Fix | Polysciences | 25037 | |
| 100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
| 50 mL conical falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Alexa488 anti-human CD19 | BioLegend | 302219 | |
| Alexa488 anti-human CD3 | BioLegend | 300415 | |
| Alexa488 anti-human cytokeratin | BioLegend | 628608 | |
| Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype | BioLegend | 400129 | |
| BV510 anti-human CD45 | BioLegend | 304036 | |
| CD66b FITC isotype | BD Biosciences | 555748 | |
| CompBead Plus Compensation Beads | BD Biosciences | 560497 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
| CS&T beads | BD Biosciences | 655051 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| FITC anti-human CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 564406 | |
| FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
| FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| NAC | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NIST Beads, 05 μM | Polysciences | 64080 | |
| NIST Beads, 20 μM | Polysciences | 64160 | |
| NIST Beads, 30 μM | Polysciences | 64170 | |
| PE anti-human CD45 | BioLegend | 304039 | |
| PE-CF594 anti-human EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
| PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype | BD Biosciences | 562292 | |
| PE-CR594 anti-human CD206 | BD Biosciences | 564063 | |
| Sodium citrate dihydrate | EMD | SX0445-1 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 |
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