Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Анализ мокроты с контролем качества с помощью проточной цитометрии

Published: August 9, 2021 doi: 10.3791/62785
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1bioAffinity Technologies, 2Department of Cell Systems & Anatomy, The University of Texas Health Science Center at San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол описывает эффективный метод диссоциации мокроты на одноклеточную суспензию и последующую характеристику клеточных подмножеств на стандартных проточных цитометрических платформах.

Abstract

Мокрота, широко используемая для изучения клеточного содержания и других микроокружающих особенностей для понимания здоровья легких, традиционно анализируется с использованием методологий, основанных на цитологии. Его полезность ограничена, потому что чтение слайдов отнимает много времени и требует узкоспециализированного персонала. Кроме того, обширный мусор и наличие слишком большого количества плоских эпителиальных клеток (STEC) или клеток щек часто делают образец неадекватным для диагностики. Напротив, проточная цитометрия позволяет осуществлять высокопроизводительное фенотипирование клеточных популяций, одновременно исключая мусор и СЭК.

Протокол, представленный здесь, описывает эффективный метод диссоциации мокроты на одну клеточную суспензию, окрашивания антител и фиксации клеточных популяций, а также получения образцов на проточной цитометрической платформе. Здесь представлена стратегия гатинга, которая описывает исключение мусора, мертвых клеток (включая SEC) и дублетов клеток. Кроме того, эта работа также объясняет, как анализировать жизнеспособные одиночные клетки мокроты на основе кластера дифференцировки (CD) 45 положительных и отрицательных популяций для характеристики подмножеств кроветворной и эпителиальной линии. Мера контроля качества также обеспечивается путем идентификации специфических для легких макрофагов в качестве доказательства того, что образец получен из легкого и не является слюной. Наконец, было продемонстрировано, что этот метод может быть применен к различным цитометрическим платформам путем предоставления профилей мокроты от одного и того же пациента, проанализированных на трех проточных цитометрах; Navios EX, LSR II и Lyric. Кроме того, этот протокол может быть модифицирован для включения дополнительных клеточных маркеров, представляющих интерес. Здесь представлен метод анализа целого образца мокроты на проточной цитометрической платформе, что делает мокроту пригодной для разработки высокопроизводительной диагностики заболеваний легких.

Introduction

Технические достижения в аппаратном и программном обеспечении проточных цитометров позволили идентифицировать множество различных клеточных популяций одновременно1,2,3,4. Например, использование проточного цитометра в исследованиях гемопоэтических клеток привело к гораздо лучшему пониманию иммунной системы2 и клеточной иерархии кроветворной системы5, а также к диагностическому различию множества различных видов рака крови6,7,8. Хотя большинство клеток мокроты имеют кроветворное происхождение9,10,11, проточная цитометрия не получила широкого применения для анализа мокроты в диагностических целях. Тем не менее, несколько исследований показывают, что оценка популяций иммунных клеток в мокроте (наиболее значительное подмножество клеток) может оказать большую помощь в диагностике и / или мониторинге таких заболеваний, как астма и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) 12,13,14,15. Более того, наличие эпителиально-специфических маркеров, которые могут быть использованы в проточной цитометрии, позволяет опрашивать следующие наиболее значимые подмножества клеток в мокроте, эпителиальные клетки легких.

В дополнение к способности анализировать множество различных клеточных популяций различного происхождения тканей, проточный цитометр может оценивать большое количество клеток за относительно короткий период. Для сравнения, цитологические виды анализов на основе слайдов часто требуют узкоспециализированного персонала и/или оборудования. Эти анализы могут быть трудоемкими, что приводит к анализу только части образца мокроты16.

Три критических вопроса ограничивают широкое использование мокроты в проточной цитометрии. Первый вопрос касается сбора мокроты. Мокрота собирается через кашель, который выталкивает слизь из легких в ротовую полость, впоследствии плевая в чашку для сбора. Поскольку слизь проходит через ротовую полость, существует высокая вероятность загрязнения SEC. Это загрязнение усложняет анализ образцов, но проблема легко устраняется на проточной цитометрической платформе, как показано в этом исследовании.

Не каждый может производить мокроту спонтанно; поэтому было разработано несколько устройств для оказания помощи в сборе мокроты неинвазивным способом17. Небулайзер является одним из таких устройств и, как было показано, производит надежные образцы мокроты18,19,20. Хотя небулайзер является очень эффективным способом неинвазивного сбора мокроты, его использование все же требует установки в медицинском учреждении со специализированным персоналом21. Напротив, портативные устройства, такие как легочная флейта22,23,24 и acapella16,25, могут использоваться дома, поскольку они очень удобны для пользователя. Эти вспомогательные устройства безопасны и экономичны.

Для нас акапелла давала стабильно лучшие результаты, чем легочная флейта16, и поэтому для сбора мокроты было выбрано устройство акапеллы. Было принято решение о 3-дневном сборе образца, поскольку основной целью использования мокроты является разработка теста на выявление рака легких16. Было показано, что 3-дневный образец увеличивает вероятность обнаружения рака легких по сравнению с 1- или 2-дневным образцом26,27,28. Однако другие методы сбора мокроты могут быть предпочтительнее для других целей. Если используется другой метод сбора мокроты, чем описанный здесь, рекомендуется тщательно титровать каждое антитело или краситель, используемый для проточного цитометрического анализа; имеется очень мало данных о том, как различные методы сбора мокроты влияют на целевые белки для проточной цитометрии.

Второй проблемой, ослабляющей энтузиазм по поводу использования мокроты для диагностики, в первую очередь связанной с проточной цитометрией, является количество клеток. Проблема заключается в сборе достаточного количества жизнеспособных клеток для достоверного анализа. Два исследования показали, что образцы мокроты, собранные неинвазивными методами с помощью вспомогательного устройства, содержат достаточно жизнеспособных клеток, которые могут быть использованы в клинической диагностике или научных исследованиях16,24. Однако ни в одном из этих исследований не рассматривался вопрос о количестве клеток, касающихся проточной цитометрии.

Для исследований, которые составляют основу для этого протокола, образцы мокроты были собраны у участников с высоким риском развития рака легких в соответствии с утвержденными институциональными руководящими принципами для каждого места исследования. Участники с высоким риском были определены как люди в возрасте от 55 до 75 лет, курившие 30 лет и не бросившие курить в течение последних 15 лет. Пациентам показывали, как использовать аппарат акапеллы согласно инструкции производителя29 и собирали мокроту в течение трех дней подряд в домашних условиях. Образец хранился в холодильнике до последнего сбора. В последний день сбора образец был отправлен в лабораторию на ночь с замороженным холодным пакетом. Образцы были обработаны в одноклеточную суспензию в день их получения. При таком методе сбора мокроты получается более чем достаточно жизнеспособных клеток для надежного проточного цитометрического анализа.

Наконец, и в связи с предыдущей проблемой с номером клеток, является вопрос о том, как освободить клетки мокроты из муцинозной среды. Как сохранить жизнеспособность клеток и создать одноклеточную суспензию, которая не засоряет проточный цитометр? Основываясь на первоначальной работе Pizzichini et al.30 и Miller et al.31, этот протокол описывает простой и надежный метод обработки мокроты в одноклеточную суспензию, которая подходит для проточного цитометрического анализа. Этот метод использовал хорошо зарекомендовавшие себя руководящие принципы в проточной цитометрии32,33,34 для разработки эффективной стратегии маркировки антител для идентификации гемопоэтических и эпителиальных клеток в мокроте и предоставления настроек приборов, мер контроля качества и руководящих принципов анализа, стандартизирующих анализ мокроты на проточной цитометрической платформе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все этапы обработки мокроты выполняются в шкафу биологической безопасности с соответствующими средствами индивидуальной защиты.

1. Подготовка реагентов перед началом диссоциации мокроты

  1. Разморозьте 1% параформальдегида (PFA), 25 мл на образец на льду, и держите холодным до использования.
    ВНИМАНИЕ: PFA токсичен при вдыхании и контакте с кожей. Приготовьте фиксатор в соответствии с инструкциями производителя и заморозьте при -20 °C в 25 мл аликвот до использования.
  2. Приблизите массу образца и разморожите достаточно 0,1% дитиотрейтола (DTT) для шага 2,2 и доведите его до 37 °C. (Аликвоты DTT следует хранить при -20 °C перед использованием.)
  3. Доведите достаточное количество 0,5% N-ацетил-L-цистеина (NAC) до 37 °C для шага 2,2. (NAC следует делать свежим еженедельно и хранить при 4 °C перед использованием.)

2. Диссоциация мокроты

  1. Взвесьте образец мокроты для определения объемов диссоциационных реагентов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец считается небольшим, если первоначальный вес составляет ≤3 г, средним, если >3 г, но ≤8 г, большим, если >8, но ≤16 г, и очень большим, если образец весит >16 г. Показания малые, средние, большие и сверхбольшие будут использоваться на протяжении всего протокола. Количество реагентов, необходимых для диссоциации и маркировки, различается в зависимости от размера образца мокроты.
  2. Перенесите небольшой образец в чистую коническую трубку объемом 50 мл, средний образец в чистую пластиковую одноразовую бутылку объемом 250 мл или большой и очень большой образец в чистую пластиковую одноразовую бутылку объемом 500 мл. Добавьте 1 мл/г массы образца 0,5% NAC и 4 мл/г массы образца 0,1% DTT.
  3. Вихрь на максимальной скорости (в течение 15 с), а затем раскачка при комнатной температуре (на максимальной скорости) в течение 15 мин.
  4. Разбавить образец четырьмя объемами сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS) (на основе общего объема образца + реагентов) для нейтрализации NAC и DTT; быстро вихрь на максимальной скорости и камень при комнатной температуре в течение 5 мин на максимальной скорости.
  5. Фильтруйте клеточную суспензию через сетчатый (сетчатые фильтры) нейлоновой сетки 100 мкм в одну или несколько конических центрифужных трубок (трубок) емкостью 50 мл для создания одноэлементной суспензии.
  6. Центрифугирование клеток при 800 х г в течение 10 мин при 4 °C. Аспирировать супернатант, соединить все гранулы в одной конической трубке объемом 15 мл, а затем промыть гранулы HBSS, используя те же условия.
  7. Повторно суспендируют ячейку гранулы в объеме буфера, определяемом начальным весом образца мокроты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой образец повторно суспендируется в 250 мкл HBSS. Образец среды повторно суспендируется в 760 мкл HBSS. Большие и очень большие образцы повторно суспендируются в 1460 мкл HBSS.
  8. Возьмите аликвоту клеточной суспензии для подсчета живых/мертвых клеток с помощью Trypan Blue.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для небольшого образца используйте 5 мкл. Для среднего, большого или очень большого образца используйте 10 мкл. Разбавьте 1:10 HBSS.
    1. Смешайте 10 мкл разбавления мокроты с 30 мкл 0,4% трипанового синего для достижения окончательного разбавления образца 1:40. Загрузка в счетные камеры гемоцитометра для подсчета клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться скорректировать окончательное разбавление, если количество ячеек слишком низкое или слишком высокое для достижения точного подсчета. Здесь настоятельно рекомендуется проконсультироваться с Guiot et al.20 для правильного различения клеток мокроты от STEC и мусора. Это важно для точного подсчета клеток.
  9. Из очень большого образца удалите 50 x 106 клеток из общего количества и добавьте в новую пробирку с достаточным количеством добавленного HBSS, чтобы создать общий объем 1700 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Считайте это большой выборкой для остальной части протокола. Оставшиеся образцы могут быть выброшены или использованы для других целей.

3. Окрашивание антителами и жизнеспособностью красителей

  1. Выбор антител и окрашивающего красителя
    ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 показаны антитела и краситель жизнеспособности, которые используются в этом протоколе, и популяции клеток, которые они идентифицируют.
    1. Маркировка пробирок, содержащих клетки мокроты (этикетки см. в таблице 2 ).
    2. Используйте проточные цитометрические трубки объемом 5 мл (совместимые с используемым проточным цитометром) для пробоотборника с неокрашенными клетками и трубки с контролем изотипа. Используйте конические пробирки по 15 мл для образцов крови и эпителиальных пробирок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти образцы будут перенесены в проточные цитометрические трубки после окрашивания и фиксации антител.
  2. Маркировка компенсационных трубок (табл. 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте проточные цитометрические трубки объемом 5 мл, совместимые с используемым проточным цитометром.
  3. Добавьте количество HBSS, антитела и/или красителя к каждой из пробирок клеток мокроты и компенсационных пробирок, как указано в Таблице 2 и Таблице 3, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте буфер (HBBS), антитела и краситель во все трубки перед добавлением клеток или компенсационных шариков, чтобы обеспечить согласованность времени окрашивания всех трубок.
  4. Добавьте в пробирки количество клеток мокроты, указанное в таблице 2 .
  5. Добавьте компенсационные шарики к компенсационным трубкам, перечисленным в таблице 3.
  6. Высиживать все трубки (пробирные и компенсационные трубки) на льду, защищенном от света, в течение 35 мин. Затем заполните пробирки ледяным HBSS и центрифугой при 4 °C в течение 10 мин при 800 х г.
  7. Для компенсационных трубок аспирируйте супернатант как можно ближе к гранулам и щелкните гранулами, чтобы ослабить.
  8. Добавьте 0,5 мл холодного HBSS в компенсационные трубки, храните их на льду при 4 °C и защищайте их от света до тех пор, пока это не понадобится для анализа проточной цитометрии.
  9. Аспирировать супернатант из незапятнанных изотипов, крови и эпителиальных трубок после центрифугирования (этап 3.6 из секции окрашивания антител) и ослабить гранулы, щелкнув трубками.

4. Фиксация 1% параформальдегидом (PFA)

  1. Добавьте холодный 1% PFA (который должен быть разморожен к настоящему времени) к неокрашенным, изотипным, кровяным и эпителиальным трубкам; 2 мл в неокрашенные и изотипные трубки и 10 мл в кровь и эпителиальные трубки.
  2. Высиживать трубки на льду, защищенном от света в течение 1 ч. Вихрь быстро на максимальной скорости через 30 мин.
  3. Наполните трубки ледяным HBSS. Затем центрифужные трубки при 4 °C в течение 10 мин при 1600 х г.
  4. Аспирируйте как можно больше супернатанта, не нарушая клеточную гранулу, и проведите пальцами по трубке, чтобы ослабить клетки.
  5. Добавьте 200 мкл холодного HBSS в неокрашенные и изотипные пробирки.
  6. Рассчитайте объем HBSS для повторного суспензии крови и эпителиальной трубки в соответствии с общим количеством клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем ресуспенсии = 0,15 x [общее количество клеток (шаг 8 диссоциации мокроты) / 106]. Используйте 50 x 106 в качестве количества ячеек для очень большого образца.
  7. Храните все пробы и компенсационные пробирки, защищенные от света на льду при 4 °C, до тех пор, пока не будет выполнен анализ проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не тестировался для хранения более 24 часов.

5. Сбор данных по проточному цитометру

  1. Примените соответствующие процедуры запуска для используемого проточного цитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола предполагает, что лицо, управляющее проточным цитометром, обучено использованию доступного ему прибора, особенно в отношении ежедневных процедур, включая проверку стабильности оптических и флюидических систем, методы стандартизации рассеяния света и интенсивности флуоресценции, а также расчет и применение правильной компенсационной матрицы.
  2. Используйте смесь бусин Национального института стандартов и технологий (NIST), чтобы гарантировать, что напряжения прямого рассеяния и бокового рассеяния установлены для размещения бусин NIST, чтобы охватить весь участок, не размещая бусины слишком близко к осям.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы мусор размером менее 5 мкм мог быть устранен путем анализа после сбора. В зависимости от используемого проточного цитометра, имейте в виду, что мельчайшие шарики не исключаются с порогом (при использовании LSR II или Lyric) или с высоким дискриминатором (с использованием проточного цитометра Navios EX). Для Navios EX коэффициент усиления использовался для прямого и бокового рассеяния, напряжение 236 для прямого рассеяния и 250 для бокового рассеяния. Для LSR II использовалось напряжение прямого рассеяния 165 и напряжение бокового рассеяния 190.
  3. Установите скорость потока на среднюю (LSR II) или высокую (Navios EX).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя или высокая скорость потока для большинства инструментов может быть использована для получения трубок мокроты. Важно отметить, что использование слишком медленного расхода или слишком разбавленного образца может привести к оседанию клеток, что приводит к увеличению вихрей, что нежелательно. Таким образом, соблюдение рассчитанного объема повторного суспензии на этапе 4.6 должно привести к клеточной плотности, которая может быть получена быстро, но не засоряет машину.
  4. Отрегулируйте напряжения для каждого параметра, используемого для параметров рассеяния и флуоресцентных параметров, чтобы поместить популяции клеток на шкалу. Используйте цифры со стратегией захвата в качестве руководства о том, как соответствующим образом регулировать напряжение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все необходимые параметры выбраны в окне выбора параметров перед получением или что данные не будут получены.
  5. Сначала соберите данные для неокрашенного образца мокроты, затем образца, окрашенного изотипом, а затем пробирки крови и эпителиальной трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клеточная суспензия слишком концентрирована, чтобы позволить проточному цитометру запускать образцы без засорения, образцы могут быть дополнительно разбавлены HBSS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол был разработан с учетом клинических лабораторных условий. При разработке протокола основное внимание уделялось простоте, эффективности и воспроизводимости. Было установлено, что самым трудоемким этапом в обработке мокроты был подсчет клеток. Поэтому протокол настроен таким образом, что обработка мокроты и маркировка клеток могут выполняться независимо от подсчета клеток без потери времени. Точный подсчет клеток, который все еще необходим для надлежащего разбавления образца для беспрепятственного запуска, затем может быть получен в течение инкубационного периода маркировки антител.

Этот протокол использует измерение веса мокроты вместо подсчета клеток в качестве указания на то, сколько антител / красителя использовать для оптимальной маркировки клеток. Однако существует большая степень вариаций в весе образцов мокроты; из 126 образцов, которые были проанализированы, вес варьировался от 0,57 г до 38,30 г. Рисунок 1А показывает, что корреляция между весом мокроты и выходом клеток не является сильной. Поэтому выборки были разделены на четыре категории; средний вес образцов составлял 2,1 г для небольших образцов, 5,0 г для средних образцов, 11,2 г для крупных образцов и 22,0 г для сверхбольших образцов (рисунок 1В). Тем не менее, все еще были образцы, которые дали гораздо больше клеток, чем ожидалось, исходя из их веса (рисунок 1C), большинство образцов были хорошо сгруппированы. Для небольших образцов средний выход клеток составлял 8,0 х 106 ячеек, для средних образцов 13,0 х 106, для больших образцов 35,4 х 106 и сверхбольших образцов 93,0 х 106.

Каждое антитело, используемое в этом протоколе, титровали. В качестве рабочей концентрации была выбрана концентрация на фазе плато (рисунок 2А) с самым высоким индексом окрашивания (рисунок 2В) кривой титрования. Изменения в количестве клеток не будут резко изменять интенсивность окрашивания. Это титрование и тестирование антител имеет важное значение и должно быть организовано с осторожностью для каждого нового антитела или красителя, используемого в этом протоколе34,35. Когда антитело титруется с осторожностью, оно должно окрашивать в 10-50 раз больше клеток, чем количество клеток, на которых было титровано антитело34,35. Пример этого принципа приведен в таблице 4. Античеловеческое антитело к CD45-PE титровали на 1 х 106 клеток общим объемом 400 мкл. Если это антитело к объему окрашивания экстраполируется в протокол (см. Таблицу 2, в которой показано количество CD45-PE и объемы окрашивания для каждого размера образца), для небольшого образца будет окрашено 0,625 х 106 клеток, 1,25 х 106 клеток будет окрашено для среднего образца и 2,5 х 106 клеток для большого образца (колонка А в таблице 4). 50-кратное превышение числа ячеек для каждой категории рассчитывается как 31,25 x 106, 62,5 x 106 и 125 x 106 ячеек соответственно (столбец B). Как показано в колонках C и D, медианное число ячеек каждой категории размеров и самая большая выборка в каждой категории находятся в пределах 50-кратного диапазона.

Несмотря на очевидные различия в размерах и выходе клеток между различными размерами образцов мокроты, средний процент загрязнения SEC в каждой категории очень похож. На рисунке 3А показан процент SEC, обнаруженных в отдельных образцах, стратифицированных в соответствии с их весовой категорией мокроты. Основная проблема была связана с STEC, поскольку эти клетки являются репрезентативными не для легочной ткани, а для полости рта. Тем не менее, среднее загрязнение SEC составляет менее 20% для всех категорий. На рисунке 3B показан процент жизнеспособных клеток, обнаруженных в этих образцах. Исключая SEC, средняя жизнеспособность составила примерно 72% для малых, средних и крупных категорий размеров выборки. Он был немного выше (79%) для сверхбольшой категории.

На рисунке 4 показана типичная стратегия гастики для отделения интересующих клеток мокроты от мусора, мертвых клеток (которые также включают загрязняющие SECs36) и клеточных сгустков. На рисунке 4A показано использование шариков NIST для установки затворов для удаления мусора размером менее 5 мкм или более 30 мкм, в то время как на рисунке 4B этот затвор применяется к ячейкам мокроты. На рисунке 4C показан типичный профиль мокроты при рассмотрении как ширина бокового рассеяния (SSC-W) против ширины прямого рассеяния (FSC-W), ширина затвора. Этот профиль используется для устранения мелкого мусора, который появляется вдоль осей SSC-W и FSC-W. Устранение мертвых клеток показано на рисунках 4D и 4E. Незапятнанный элемент управления (рисунок 4D) используется для определения отсечки позитивности FVS510; клетки, которые окрашивают положительные для FVS510 выше отрицательного контроля, считаются мертвыми и не будут использоваться в анализе клеток мокроты (рисунок 4E). Наконец, для удаления дублетов ячеек из анализа применяется синглетный затвор, который показан на рисунке 4F. Таким образом, клетки, которые прошли через селекционные ворота, показанные на рисунках 4B, рисунке 4C, рисунке 4E и рисунке 4F , представляют собой живые, одиночные клетки мокроты, готовые к последующему анализу с антителами, используемыми в этом протоколе.

Использование антитела против CD45 в этом протоколе маркировки позволяет разделить живые одиночные клетки мокроты на клеточный компартмент крови (CD45+) и некровный (CD45-) клеточный компартмент. К последней категории относятся эпителиальные клетки и другие негрябные клетки. Верхний профиль на рисунке 5А показывает использование неокрашенного образца мокроты для установки отсечки для позитивности CD45, что делает затворы для захвата клеток CD45+ и CD45-клеток. Нижний профиль фиг.5А показывает оба этих затвора, нанесенных на образец мокроты, окрашенный антителом против CD45. Окрашивание дополнительными антителами затем используется для идентификации специфических популяций клеток крови в затворе CD45+ (рисунок 5B) и других популяциях клеток без крови, включая эпителиальные популяции в CD45-gate (рисунок 5C). На обоих рисунках верхние профили показывают, как окрашенная изотипом мокрота используется для установки двойных отрицательных популяций, тогда как нижние профили показывают окрашенные антителами клетки мокроты. На рисунке 5B (внизу) показаны шесть различных клеточных популяций CD45+, созданных с помощью коктейля антител, обнаруживаемых в канале флуоресценции (FL) 1 (антитела против CD66b, CD3, CD19) и анти-CD206, обнаруживаемого в канале FL3. Эксперименты по сортировке показали, что специфические для легких макрофаги находятся в затворах, идентифицированных с M. Таким образом, наличие клеток в этих воротах указывает на то, что образец мокроты был получен из легкого и не был слюной (Bederka et al., рукопись в процессе подготовки). На рисунке 5C (внизу) показаны квадранты затвора, созданные с помощью антипан-цитокератина (panCK), обнаруживаемого в канале FL1, и антител к молекуле адгезии противоэпителиальных клеток (EpCAM), обнаруживаемых в канале FL3 среди клеток МОКРОТЫ.

Этот протокол маркировки был тщательно протестирован на Navios EX и LSR II. Некоторые предварительные эксперименты были проведены на Lyric, но без обширной оптимизации инструментов, которая была сделана для двух других машин. Поэтому подробные настройки инструмента предусмотрены для Navios EX и LSR II в листе Материалов, но не для Lyric. Для понимания сходства и вариаций между этими тремя проточными цитометрическими платформами, которые могут быть использованы для анализа клеток мокроты, профили, полученные от различных машин, можно сравнить на рисунке 6 и рисунке 7. Два больших образца мокроты были обработаны, объединены, маркированы, разделены на три равные части и впоследствии получены на каждом проточном цитометре, упомянутом выше. На рисунке 6, который похож на рисунок 4, сравнивается стратегия уничтожения мусора, мертвых клеток и клеточных скоплений. На рисунке 7, который идентичен рисунку 5, сравниваются профили крови и небелебные профили с данными, полученными на различных проточных цитометрах.

Сравнение различных профилей, полученных от трех различных проточных цитометров, показывает, что с каждым прибором можно наблюдать одни и те же основные профили. Следует обратить внимание на такие различия, как графики SSC-W/FSC-W (ширина затвора) (рисунок 6, вторая строка) и линейные шкалы точечных графиков (рисунки 6 и 7). Диаграмма ширины рассеяния, сгенерированная на Navios EX, показывает вентиль включения (красную рамку), что означает, что все ячейки, включенные в ворота, дополнительно анализируются; события по осям в левом нижнем углу исключаются. Графики точечной ширины на ЛСР II и Лирике не показывают аналогичного наложения событий по этим же осям. Это несоответствие, вероятно, связано с очень чувствительным порогом, используемым на Navios EX, что приводит к некоторым небольшим обломкам в предыдущем затворе исключения размера (верхний ряд рисунка 6). Иногда мусор виден вдоль осей в профиле ширины рассеяния, сгенерированном на LSRII, но он находится в правом нижнем углу. В этих случаях для исключения этих событий из дальнейшего анализа используется исключающий затвор (о чем свидетельствует пунктирная красная рамка в среднем профиле в строке 2 на рисунке 6).

В то время как логарифмические шкалы немного отличаются на участках между Navios EX и цитометрами Lyric и LSR II, у Navios EX есть возможность получать данные, используя более десятилетий. Реализация дополнительных десятилетий зависит от контекста эксперимента и желаемой чувствительности для визуализации интересующих популяций.

Дополнительным заметным отличием цитометров Navios EX и LSR II и Lyric является внешний вид профиля синглетных ворот. Цитометр Navios EX оснащен прямоугольной проточной ячейкой с другим углом сбора, чем lSR II. Navios EX содержит три программно управляемых угла сбора для оптимизации прямого угла рассеяния света для достижения чувствительности, соответствующей размеру частиц для анализа. Полигональные затворы для цитометра Navios EX необходимо будет отрегулировать под немного меньшим углом, чем синглетные ворота для LSRII. Синглетные ворота для Lyric могут быть оптимизированы для получения профиля, аналогичного тому, который можно увидеть в LSR II. Используя образец мокроты, коэффициент масштабирования площади необходимо оптимизировать для каждого лазера на Lyric, чтобы достичь синглетного затвора, аналогичного LSR II.

Все профили, показанные на рисунках с 4 по 7 , были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10.6. Файлы .fcs можно найти в FlowRepository (https://flowrepository.org) под идентификаторами FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ и FR-FCM-Z3MM и могут использоваться для практики анализа мокроты, как показано на этих рисунках.

Figure 1
Рисунок 1: Вес мокроты и выход клеток. (А) Показана связь между массой мокроты, определяемой до обработки, и общим выходом клеток, определяемым после обработки с помощью гемоцитометра. Каждый маркер представляет собой отдельный образец, всего 126. (B) Образцы мокроты были стратифицированы на четыре категории в зависимости от их веса: небольшие для образцов весом до 3 г, средние для образцов весом более 3 г до 8 г, крупные для образцов весом более 8 г до 16 г и очень большие образцы для образцов весом более 16 г. (С) Показано распределение выхода клеток для образцов в каждой категории. Красные полосы в (B) и (C) представляют медианные значения в каждой категории. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Титрование антител для античеловеческого CD45-PE. (A) Кривая титрования CD45-PE (IgG1) со средней интенсивностью флуоресценции (MFI) положительной популяции по сравнению с концентрацией плато антител CD45-PE при 1 мкг/мл. (B) Кривая титрования, показывающая индекс окрашивания по отношению к концентрации антител, показывает, что самый высокий индекс окрашивания составляет 1 мкг/мл. Индекс окрашивания рассчитывался как: [CD45 MFI положительная популяция - CD45 MFI отрицательная популяция] / [2 * Стандартное отклонение]. На основании Фиг.2А и Фиг.2В в качестве оптимальной концентрации для антитела CD45-PE было выбрано 1 мкг/мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Доля SEC и мертвых клеток в образцах мокроты согласуется между четырьмя весовыми категориями. (A) Доля SEC в образцах мокроты классифицируется в соответствии с их весовой категорией. Процент загрязнения SEC определялся гемоцитометром как часть общего количества клеток. (B) Жизнеспособность клеток образцов мокроты, исключая SECS, определяемая гемоцитометром и методом исключения трипанового синего цвета. Для каждого графика красные линии представляют медианные значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Стратегия гаширования для исключения мусора, мертвых клеток и дублетов в образце мокроты. (A) Бусины NIST размерами 5 мкм, 20 мкм и 30 мкм использовались для установки ворот, обозначенных красным прямоугольником, для исключения мусора размером менее 5 мкм и более крупного мусора выше 30 мкм и близко к оси. (B) Образец мокроты был получен с использованием тех же напряжений для прямого и бокового рассеяния, что и у шариков NIST. Ворота, созданные в пункте (А), были применены для исключения мусора. С) Мелкий мусор вблизи оси был исключен на этом графике ширины рассеяния. (D) Для установления отсечения (красной линии) для отрицательной, незапятнанной популяции для красителя жизнеспособности использовался образец неокрашенной мокроты. Е) Светотеневая граница, созданная в D, наносилась на окрашенный образец мокроты с образованием ворот (красного ящика) для включения живых жизнеспособных клеток. (F) Синглетные ворота, обозначенные красным многоугольником, исключают ячейки, которые не падают на диагональ, устраняя дублеты и/или сгустки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Стратегия переноса клеток мокроты в клетки крови и некровные клетки. (А) Неокрашенные клетки мокроты, полученные из синглетного затвора, используются для установки отсечения (красная линия) на отрицательной популяции для CD45 (вверху). Отсечка от верхнего профиля наносится на окрашенный образец мокроты (внизу) для дифференциации CD45 положительных (CD45+) и отрицательных популяций (CD45-). (B) Клетки мокроты CD45+, окрашенные антителами изотипа для FITC/AF488, используются для установки ворот на отрицательной популяции (сверху). Те же затворы наносятся на клетки мокроты CD45+, окрашенные маркерами клеток крови CD3, CD19, CD66b и CD206 (внизу). (C) Квадрантные затворы помещают на cd45-клетки мокроты, окрашенные изотипными контрольными элементами (сверху) и наносят на CD45-клетки из образца мокроты, окрашенного эпителиальными маркерами панцитокератина (panCK) и EpCAM (снизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Стратегия гаширования для исключения мусора, скоплений и мертвых клеток окрашенных клеток мокроты на трех проточных цитометрических платформах. Два больших образца мокроты были обработаны, объединены, маркированы и разделены на три равные части для приобретения на проточных цитометрах Navios EX (A), LSR II (B) и Lyric (C). Верхний ряд: Образцы мокроты были закрыты (красная коробка), чтобы исключить очень мелкий и крупный мусор. Второй ряд: большая красная рамка на графике Navios EX представляет собой ворота включения, которые включают ячейки, но исключают мусор. Пунктирная маленькая красная коробочка, видимая на участке ЛСР II, представляет собой исключающие ворота для устранения мусора из дальнейшего анализа. Необходима дальнейшая оптимизация с Lyric, чтобы определить, где требуется удаление мусора. Поэтому на этом участке нет никаких ворот. Третий ряд: красные прямоугольные ворота включают живые клетки для дальнейшего анализа. Нижний ряд: полигональные ворота имеют одиночные ячейки, исключая дублеты, которые выходят за диагональ ворот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Стратегия гаширования мокроты, окрашенной для маркеров крови и эпителия на трех проточных цитометрических платформах. Анализ, показанный на рисунке 6 , продолжается на рисунке 7; все жизнеспособные одиночные клетки (нижний ряд, рисунок 6) были разделены на CD45+ и CD45- популяции (первый ряд, рисунок 7), так что маркеры, специфичные для клеток крови, и эпителиальные клеточные специфические маркеры могли дополнительно очертить эти популяции. Второй ряд: профиль маркеров клеток крови CD3/CD19/CD66b и CD206 из клеток CD45+ . Третий ряд: эпителиальные клеточные маркеры panCK и EpCAM из CD45-клеток . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Антитело/пятно Цель
ФВС510 Пятно жизнеспособности
Античеловеческий CD45 – ПЭ Панлейкоцитарный маркер;  Компенсация ЧП
Античеловеческий CD66b – FITC Гранулоцитарный маркер
Античеловеческий CD3 — Alexa488 Маркер Т-клеток
Античеловеческий CD19 – Alexa488 Маркер В-клеток; Компенсация FITC/Alexa488
Античеловеческий CD206 – PE-CF594 Маркер макрофагов легких;  Компенсация PE-CF594
Античеловеческая EpCAM – PE-CF594 Маркер эпителиальных клеток;  Компенсация PE-CF594
Античеловеческий панцитокератин (panCK) – Alexa488 Маркер эпителиальных клеток
IgG1κ – Alexa488 Контроль изотипа CD3/CD19/panCK
IgG1κ – FITC Контроль изотипа CD66b
IgG1κ – ПЭ-CF594 Контроль изотипов CD206/EpCAM
Античеловеческий CD45 – BV510 Компенсация FVS510

Таблица 1: Используются антитела и пятна жизнеспособности. Список антител и красителей жизнеспособности, используемых в этом протоколе. Указываются клеточные подмножества, которые они идентифицируют.

Трубка (этикетка) Размер выборки* HBSS (мкл) FVS510 (мкл) CD45 (мкл) Другие антитела (мкл) Клетки § (мкл)
Безупречный маленький 80 20
Терпимая 50 50
большой 50 50
IgG1κ - Алекса488 IgG1κ- FITC IgG1κ - ПЭ-CF594
Контроль изотипов маленький 60.65 0.6 10 2 6 0.75 20
Терпимая 30.65 0.6 10 2 6 0.75 50
большой 30.25 1 10 2 6 0.75 50
СД206 СД3 СД19 СД66б
Кровь маленький 92.875 1.5 25 1.875 5 1.25 7.5 115
Терпимая 65.75 3 50 3.75 10 2.5 15 350
большой 102.5 10 100 7.5 20 5 30 725
ЭпкАМ ПанКК
Эпителиальный маленький 96.5 1.5 25 10 2 115
Терпимая 73 3 50 20 4 350
большой 117 10 100 40 8 725
* Образцы считаются малыми, средними или большими в зависимости от веса, определенного на этапе 1 раздела протокола о диссоциации мокроты.
§ Клетки должны быть добавлены после того, как все реагенты были распределены, в том числе в компенсационных трубках (таблица 3).

Таблица 2: Содержание трубок с клетками мокроты. Используйте эту таблицу, как указано в протоколе, чтобы добавить указанные объемы антител и пятна жизнеспособности для соответствующего размера выборки.

Трубка (этикетка) Добавленные реагенты (мкл) Реагенты добавлены (капли)
HBSS CD45-ПЭ CD206-PE-CF594 ЭПКАМ-ПЭ-CF594 CD19-Алекса488 СД45-БВ510 КомпБаус (+) КомпШарик * (-)
ПЭ комп. 76 4 x x x x 1 1
ПЭ-CF594 комп. 72 x 4 4 x x 1 1
Alexa488/FITC комп. 60 x x x 20 x 1 1
BV510 комп. 60 x x x x 20 1 1
* Положительные (+) и отрицательные (-) шарики следует добавлять после того, как все реагенты были распределены и трубки в таблице 2 были подготовлены.
comp. = компенсация

Таблица 3: Содержание компенсационных трубок. Используйте эту таблицу, как указано в протоколе, чтобы добавить указанные объемы антител к компенсационным шарикам.

Номер ячейки (x 106)
A B C D
Размер выборки В объеме окрашивания * 50-кратный доступ Медианная выборка (доступ к сгибу) # Наибольший образец (доступ к сгибу) #
Маленький 0.625 31.25 8.0 (12.8) 24.77 (39.6)
Терпимая 1.25 62.5 13.0 (10.4) 48.87 (39.1)
Большой 2.5 125 35.4 (14.2) 113.5 (45.4)
* Объемы окрашивания, используемые в протоколе (таблица 2).  Номер ячейки экстраполируется на основе того, как была выполнена кривая титрования; 1 мкг/мл CD45-PE и 1 x 106 клеток на 200 мкл.
50-кратный доступ к номерам ячеек в столбце A.
# сгиб доступа в столбцах C и D вычисляется путем деления числа, представленного в ячейках столбцов C или D, на число в соответствующей ячейке в столбце A.

Таблица 4: Античеловеческая концентрация CD45-PE для всех образцов в каждой категории размеров выборки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Клеточное содержание мокроты включает в себя большое разнообразие обширных клеток, часто сопровождающихся большим количеством мусора37. Кроме того, анализ мокроты требует контроля качества, который подтверждает, что образец взят из легкого, а не из ротовой полости38. Поэтому проанализировать мокроту с помощью проточной цитометрии не так просто, как, например, для крови, которая выделяет гораздо более чистую и однородную клеточную суспензию. Этот протокол решает все эти вопросы: предоставление настроек приборов с использованием шариков определенного размера для обеспечения того, чтобы можно было обнаружить как самые маленькие, так и самые большие популяции клеток, стратегия гашения для устранения мусора, клеточных скоплений, загрязняющих STEC и других мертвых клеток, и, наконец, мера контроля качества для обеспечения того, чтобы образец мокроты был из легких, а не в основном слюной.

В протоколе есть критические шаги в работе с мокротой, на которые стоит обратить внимание. Во-первых, на выход клеток может резко повлиять количество нейлоновых клеточных сетчатых фильтров, используемых на этапе 2,5 части протокола, касающейся диссоциации мокроты. Может потребоваться несколько сетчатых фильтров, чтобы избежать потери слишком большого количества клеток из-за засорения ситечка. Когда поток через сетчатые фильтры заметно замедлился, следует использовать новый сетчатый фильтр. Во-вторых, гранулы клеток образцов мокроты могут быть очень рыхлыми, особенно если имеется высокое загрязнение СЭС. Поэтому важно не аспирировать слишком близко к грануле при удалении супернатанта после центрифугирования образцов. Аспирация слишком близко к грануле может привести к потере клетки, если не к потере всей гранулы. В-третьих, этот протокол требует шага фиксации. Это сохраняет клетки и их профиль окрашивания и служит мерой безопасности для защиты оператора проточного цитометра. Запуск образцов на некоторых проточных цитометрах может представлять повышенную биологическую опасность из-за возможности производства аэрозолей39. Фиксация PFA помогает защитить оператора от потенциальных патогенов в образце мокроты. В-четвертых, и, возможно, самым сложным аспектом подготовки образцов мокроты к проточному цитометрическому анализу, является подсчет клеток. Подсчет клеток затруднен из-за большого разнообразия типов клеток, присутствующих в мокроте. Счетные машины часто ограничены диапазоном размеров клеток, который они могут захватить, и поэтому менее надежны, чем гемоцитометр. Тем не менее, подсчет клеток образцов мокроты гемоцитометром, который превосходно описан Guiot et al.20, утомителен и требует практики, чтобы стать опытным. Точный номер ячейки имеет жизненно важное значение для определения конечного объема повторного суспензии образца, чтобы обеспечить разумную скорость потока и предотвратить засорение в проточном цитометре. Наличие очень больших СЭК в мокроте и множества более мелких клеточных сгустков, которые не разбиваются буфером диссоциации и не улавливаются фильтрами, увеличивают вероятность засорения проточного цитометра. Поэтому рекомендуется потратить некоторое время на определение наилучшей концентрации/скорости потока в клетке для сбора данных с помощью имеющегося проточного цитометра. Кроме того, убедитесь, что проточный цитометр имеет соответствующий размер проточной ячейки и сопла (или зонда), способного измерять большие популяции клеток, присутствующих в мокроте.

Даже когда навыки подсчета клеток достигнуты, это все еще трудоемкий процесс. Таким образом, определение реагентов для маркировки клеток в этом протоколе основано на размере выборки (оцениваемом по весу), а не на количестве клеток. Это позволяет более эффективно использовать время, поскольку ручной подсчет клеток может быть завершен в течение времени, необходимого для окрашивания антителом и жизнеспособности красителя. Тем не менее, есть три заметных исключения из этого. Если образец составляет >16 г (так называемые сверхбольшие образцы), ручной подсчет клеток должен происходить перед окрашиванием, чтобы дорогостоящие реагенты можно было сохранить, окрашивая только 25 х 106 клеток каждая для крови и эпителиальных трубок. Этот номер ячейки дает очень надежные профили в настройках, описанных в этом протоколе. Другим потенциальным исключением является случай очень маленькой выборки. Оценка заключается в том, что для анализа проточной цитометрии, представленного в этом протоколе, требуется минимум 1-2 х 106 клеток (данные не показаны). Поэтому, если образец содержит менее 1-2 х 106 клеток, возможно, не стоит продолжать процедуру, поскольку конечный результат, скорее всего, будет неприемлемым.

Специфические маркировочные реагенты, которые хорошо работают на клетках периферической крови или клеточных линиях, могут работать очень по-разному на клетках крови, содержащихся в мокроте (неопубликованные наблюдения). Поэтому рекомендуется титровать каждое антитело или другие маркировочные реагенты в соответствии с устоявшимися протоколами34,35 перед их использованием в экспериментах по проточной цитометрии. Большинство титрований антител должны давать сопоставимые результаты при окрашивании до 10-50 раз; однако рекомендуется проводить дополнительное титрование с номерами ячеек выше этого диапазона34. Когда концентрация реагента определена, важно сохранить время инкубации этого реагента таким же, как и в фактическом эксперименте. По этой причине протокол требует добавления всех буферов и реагентов в трубки до добавления клеток или компенсационных шариков. Этот порядок добавления реагентов и клеток / бусин вместе обеспечивает более высокую согласованность во времени маркировки. Если по какой-либо причине время экспериментальной инкубации не может быть сохранено таким же, как время, используемое для титрования антител/красителей, последнее следует повторить со временем инкубации, которое возможно во время экспериментов.

Образцы мокроты широко используются в качестве диагностического образца для изучения патофизиологии различных заболеваний, поражающих легкие. Туберкулез40,41, ХОБЛ13,42, астма43, муковисцидоз44,45, рак легких46,47,48 и ревматоидный артрит49 являются одними из многих заболеваний, где мокрота была изучена из-за того, что она является неинвазивно полученным образцом. Совсем недавно, во время пандемии коронавируса, мокрота использовалась для выявления длительного вирусного выделения у пациентов, госпитализированных с коронавирусной болезнью 2019 (COVID-19)50.

Различные технологии, включая обратную транскрипцию-полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР), анализ белка, микроскопию и проточную цитометрию, были использованы для выявления специфических для заболевания маркеров в мокроте. Использование проточной цитометрической платформы для анализа образцов мокроты широко не используется, но ее использование увеличивается. С недавними достижениями в технологии проточных цитометров3,51,52, а также достижениями в области химии флуорофоров, генерацией новых клонов антител и разработкой различных красителей для идентификации популяций мертвых клеток51,53,54, возможность разработки панелей антител, направленных на диагностику заболеваний человека, резко возросла. Кроме того, недавний толчок к автоматизации анализа проточных цитометрических данных55,56 устранит потенциальную предвзятость при ручном чтении и интерпретации данных о потоке. Эти новые разработки в области проточной цитометрии значительно облегчат исследование мокроты в качестве клинической диагностики.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы являются бывшими или нынешними сотрудниками bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

Хотим поблагодарить Давида Родригеса за помощь в подготовке фигуры. Образцы мокроты были запущены на BD LSR II в UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility при поддержке UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) и UL1 TR001120 (грант CTSA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix Polysciences 25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 Fisher Scientific 08-771-19
3 M NaOH EMD SX0593-1
50 mL conical falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
Alexa488 anti-human CD19 BioLegend 302219
Alexa488 anti-human CD3 BioLegend 300415
Alexa488 anti-human cytokeratin BioLegend 628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype BioLegend 400129
BV510 anti-human CD45 BioLegend 304036
CD66b FITC isotype BD Biosciences 555748
CompBead Plus Compensation Beads BD Biosciences 560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL Fisher Scientific 09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL Fisher Scientific 09-761-10
CS&T beads BD Biosciences 655051
DTT Fisher Scientific BP172-5
FITC anti-human CD66b GeneTex GTX75907
Fixable Viability Stain BD Biosciences 564406
FlowCheck Beckman Coulter A69183
FlowSet Beckman Coulter A69184
HBSS Fisher Scientific 14-175-095
NAC Sigma-Aldrich A9165
NIST Beads, 05 μM Polysciences 64080
NIST Beads, 20 μM Polysciences 64160
NIST Beads, 30 μM Polysciences 64170
PE anti-human CD45 BioLegend 304039
PE-CF594 anti-human EpCAM BD Biosciences 565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype BD Biosciences 562292
PE-CR594 anti-human CD206 BD Biosciences 564063
Sodium citrate dihydrate EMD SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
  2. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews. Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
  3. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), San Diego, Calif. 251-258 (2012).
  4. Robinson, J. P., Roederer, M. History of science. Flow cytometry strikes gold. Science. 350 (6262), New York, N.Y. 739-740 (2015).
  5. Orfao, A., et al. Immunophenotypic dissection of normal hematopoiesis. Journal of Immunological Methods. 475, 112684 (2019).
  6. Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
  7. Bento, L. C., et al. The use of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: A review. Frontiers in Oncology. 7, 270 (2017).
  8. Della Porta, M. G., Picone, C. Diagnostic utility of flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases. 9 (1), 2017017 (2017).
  9. Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2), Pt 1 475-478 (2000).
  10. Spanevello, A., et al. Induced sputum cellularity. Reference values and distribution in normal volunteers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 162 (3), Pt 1 1172-1174 (2000).
  11. Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
  12. Hastie, A. T., et al. Mixed sputum granulocyte longitudinal impact on lung function in the severe asthma research program. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (7), 882-892 (2021).
  13. Hastie, A. T., et al. Association of sputum and blood eosinophil concentrations with clinical measures of COPD severity: an analysis of the SPIROMICS cohort. The Lancet. Respiratory Medicine. 5 (12), 956-967 (2017).
  14. Kim, J., et al. Innate immune crosstalk in asthmatic airways: Innate lymphoid cells coordinate polarization of lung macrophages. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (5), 1769-1782 (2019).
  15. Bai, Y., Zhou, Q., Fang, Q., Song, L., Chen, K. Inflammatory cytokines and T-Lymphocyte subsets in serum and sputum in patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 25, 2206-2210 (2019).
  16. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-Carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  17. Hristara-Papadopoulou, A., Tsanakas, J., Diomou, G., Papadopoulou, O. Current devices of respiratory physiotherapy. Hippokratia. 12 (4), 211-220 (2008).
  18. Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and biochemical analysis of induced sputum from asthmatic and from healthy subjects. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
  19. Alexis, N., Soukup, J., Ghio, A., Becker, S. Sputum phagocytes from healthy individuals are functional and activated: a flow cytometric comparison with cells in bronchoalveolar lavage and peripheral blood. Clinical Immunology. 97 (1), 21-32 (2000).
  20. Guiot, J., et al. Methodology for sputum induction and laboratory processing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56612 (2017).
  21. Paggiaro, P. L., et al. Sputum induction. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 3-8 (2002).
  22. Anjuman, N., Li, N., Guarnera, M., Stass, S. A., Jiang, F. Evaluation of lung flute in sputum samples for molecular analysis of lung cancer. Clinical and Translational Medicine. 2, 15 (2013).
  23. Sethi, S., Yin, J., Anderson, P. K. Lung flute improves symptoms and health status in COPD with chronic bronchitis: A 26 week randomized controlled trial. Clinical and Translational Medicine. 3, 29 (2014).
  24. Su, J., et al. Analysis of lung flute-collected sputum for lung cancer diagnosis. Biomarker Insights. 10, 55-61 (2015).
  25. Naraparaju, S., Vaishali, K., Venkatesan, P., Acharya, V. A comparison of the Acapella and a threshold inspiratory muscle trainer for sputum clearance in bronchiectasis-A pilot study. Physiotherapy Theory and Practice. 26 (6), 353-357 (2010).
  26. Hinson, K. F., Kuper, S. W. The diagnosis of lung cancer by examination of sputum. Thorax. 18, 350-353 (1963).
  27. Johnston, W. W., Bossen, E. H. Ten years of respiratory cytopathology at Duke University Medical Center. I. The cytopathologic diagnosis of lung cancer during the years 1970 to 1974, noting the significance of specimen number and type. Acta Cytologica. 25 (2), 103-107 (1981).
  28. Ng, A. B., Horak, G. C. Factors significant in the diagnostic accuracy of lung cytology in bronchial washing and sputum samples. II. Sputum samples. Acta Cytologica. 27 (4), 397-402 (1983).
  29. Smiths Medical Videos. , Available from: https://videos.smiths-medical.com/search?q=acapella&page=1 (2021).
  30. Pizzichini, E., et al. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154 (2), 308-317 (1996).
  31. Miller, H. R., Phipps, P. H., Rossier, E. Reduction of nonspecific fluorescence in respiratory specimens by pretreatment with N-acetylcysteine. Journal of Clinical Microbiology. 24 (3), 470-471 (1986).
  32. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  33. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  34. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
  35. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 4, Unit 4.1 (2001).
  36. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  37. Kini, S. R. Color Atlas of Pulmonary Cytopathology. , Springer-Verlag New York, Inc. (2002).
  38. Papanicolaou Society of Cytopathology Task Force on Standards of Practice. Guidelines of the Papanicolaou Society of Cytopathology for the examination of cytologic specimens obtained from the respiratory tract. Diagnostic Cytopathology. 21 (1), 61-69 (1999).
  39. Holmes, K. L., et al. International Society for the Advancement of Cytometry cell sorter biosafety standards. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 85 (5), 434-453 (2014).
  40. Datta, S., Shah, L., Gilman, R. H., Evans, C. A. Comparison of sputum collection methods for tuberculosis diagnosis: a systematic review and pairwise and network meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (8), 760-771 (2017).
  41. Armstrong-Hough, M., et al. "Something so hard": a mixed-methods study of home sputum collection for tuberculosis contact investigation in Uganda. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease: The Official Journal of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. 22 (10), 1152-1159 (2018).
  42. Freeman, C. M., et al. Design of a multi-center immunophenotyping analysis of peripheral blood, sputum and bronchoalveolar lavage fluid in the Subpopulations and Intermediate Outcome Measures in COPD Study (SPIROMICS). Journal of Translational Medicine. 13, 19 (2015).
  43. Petsky, H. L., Li, A., Chang, A. B. Tailored interventions based on sputum eosinophils versus clinical symptoms for asthma in children and adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 8, 005603 (2017).
  44. Hisert, K. B., Liles, W. C., Manicone, A. M. A flow cytometric method for isolating cystic fibrosis airway macrophages from expectorated sputum. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (1), 42-50 (2019).
  45. Duncan, G. A., et al. Microstructural alterations of sputum in cystic fibrosis lung disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (18), 88198 (2016).
  46. Kemp, R. A., Reinders, D. M., Turic, B. Detection of lung cancer by automated sputum cytometry. Journal of Thoracic Oncology: Official Publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2 (11), 993-1000 (2007).
  47. Blandin Knight, S., et al. Progress and prospects of early detection in lung cancer. Open Biology. 7 (9), (2017).
  48. Gomperts, B. N., Spira, A., Elashoff, D. E., Dubinett, S. M. Lung cancer biomarkers: FISHing in the sputum for risk assessment and early detection. Cancer Prevention Research. 3 (4), Philadelphia, Pa. 420-423 (2010).
  49. Demoruelle, M. K., et al. Antibody responses to citrullinated and noncitrullinated antigens in the sputum of subjects with rheumatoid arthritis and subjects at risk for development of rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (4), Hoboken, N.J. 516-527 (2018).
  50. Wang, K., et al. Differences of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 shedding duration in sputum and nasopharyngeal swab specimens among adult inpatients with coronavirus disease 2019. Chest. 158 (5), 1876-1884 (2020).
  51. Chattopadhyay, P. K., Hogerkorp, C. -M., Roederer, M. A chromatic explosion: the development and future of multiparameter flow cytometry. Immunology. 125 (4), 441-449 (2008).
  52. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nature Immunology. 15 (2), 128-135 (2014).
  53. Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit 9.34 (2010).
  54. Chattopadhyay, P. K., et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine. 12 (8), 972-977 (2006).
  55. Duetz, C., Bachas, C., Westers, T. M., Avan de Loosdrecht, A. A. Computational analysis of flow cytometry data in hematological malignancies: future clinical practice. Current Opinion in Oncology. 32 (2), 162-169 (2020).
  56. Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews. Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).

Tags

Медицина выпуск 174
Анализ мокроты с контролем качества с помощью проточной цитометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grayson, M., Lai, S. C., Bederka, L. … More

Grayson, M., Lai, S. C., Bederka, L. H., Araujo, P., Sanchez, J., Reveles, X. T., Rebel, V. I., Rebeles, J. Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (174), e62785, doi:10.3791/62785 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter