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Medicine

Análisis de esputo de calidad controlada por citometría de flujo

Published: August 9, 2021 doi: 10.3791/62785
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1bioAffinity Technologies, 2Department of Cell Systems & Anatomy, The University of Texas Health Science Center at San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe un método eficiente para disociar el esputo en una suspensión de una sola célula y la posterior caracterización de subconjuntos celulares en plataformas citométricas de flujo estándar.

Abstract

El esputo, ampliamente utilizado para estudiar el contenido celular y otras características microambientales para comprender la salud del pulmón, se analiza tradicionalmente utilizando metodologías basadas en citología. Su utilidad es limitada porque la lectura de las diapositivas requiere mucho tiempo y requiere personal altamente especializado. Además, los desechos extensos y la presencia de demasiadas células epiteliales escamosas (SEC), o células de la mejilla, a menudo hacen que una muestra sea inadecuada para el diagnóstico. Por el contrario, la citometría de flujo permite el fenotipado de alto rendimiento de las poblaciones celulares, al tiempo que excluye los desechos y las SEC.

El protocolo presentado aquí describe un método eficiente para disociar el esputo en una suspensión de una sola célula, teñir y fijar poblaciones celulares, y adquirir muestras en una plataforma citométrica de flujo. Aquí se presenta una estrategia de cierre que describe la exclusión de escombros, células muertas (incluidas las SEC) y dobletes celulares. Además, este trabajo también explica cómo analizar células viables de esputo único basadas en un grupo de poblaciones positivas y negativas de diferenciación (CD)45 para caracterizar subconjuntos de linaje hematopoyético y epitelial. También se proporciona una medida de control de calidad mediante la identificación de macrófagos específicos del pulmón como evidencia de que una muestra se deriva del pulmón y no es saliva. Finalmente, se ha demostrado que este método se puede aplicar a diferentes plataformas citométricas proporcionando perfiles de esputo de un mismo paciente analizados en tres citómetros de flujo; Navios EX, LSR II y Lyric. Además, este protocolo se puede modificar para incluir marcadores celulares adicionales de interés. Aquí se presenta un método para analizar una muestra completa de esputo en una plataforma citométrica de flujo que hace que el esputo sea susceptible de desarrollar diagnósticos de alto rendimiento de enfermedad pulmonar.

Introduction

Los avances técnicos en el hardware y el software de los citómetros de flujo han permitido identificar muchas poblaciones celulares distintas simultáneamente1,2,3,4. La utilización del citómetro de flujo en la investigación de células hematopoyéticas, por ejemplo, ha llevado a una comprensión mucho mejor del sistema inmune2 y la jerarquía celular del sistema hematopoyético5, así como a la distinción diagnóstica de una multitud de cánceres sanguíneos diferentes6,7,8. Aunque la mayoría de las células de esputo son de origen hematopoyético9,10,11, la citometría de flujo no se ha aplicado ampliamente al análisis de esputo con fines diagnósticos. Sin embargo, varios estudios sugieren que la evaluación de las poblaciones de células inmunes en el esputo (el subconjunto más significativo de células) puede ser de gran ayuda en el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)12,13,14,15. Además, la existencia de marcadores epiteliales específicos que pueden ser utilizados en citometría de flujo permite el interrogatorio del siguiente subconjunto más significativo de células en esputo, células epiteliales pulmonares.

Además de la capacidad de analizar muchas poblaciones celulares distintas de diferentes orígenes tisulares, un citómetro de flujo puede evaluar un gran número de células en un período relativamente corto. En comparación, los tipos de análisis citológicos basados en diapositivas a menudo requieren personal y / o equipo altamente especializado. Estos análisis pueden ser intensivos en mano de obra, lo que lleva a que solo se analice una proporción de la muestra de esputo16.

Tres cuestiones críticas limitan el uso generalizado del esputo en la citometría de flujo. La primera cuestión se refiere a la recogida de esputo. El esputo se recoge a través de una tos que expulsa el moco de los pulmones a la cavidad oral, escupiendo posteriormente en una taza de recolección. Dado que el moco viaja a través de la cavidad oral, existe una alta probabilidad de contaminación por SEC. Esta contaminación complica el análisis de la muestra, pero el problema se rectifica fácilmente en una plataforma citométrica de flujo, como se muestra en este estudio.

No todo el mundo puede producir esputo espontáneamente; por lo tanto, se han desarrollado varios dispositivos para ayudar con la recolección de esputo de manera no invasiva17. El nebulizador es uno de esos dispositivos y se ha demostrado que produce muestras de esputo confiables18,19,20. Aunque el nebulizador es una forma muy efectiva de recolectar esputo de manera no invasiva, su uso aún requiere un ajuste en un centro médico con personal especializado21. Por el contrario, los dispositivos portátiles como la flauta pulmonar22,23,24 y la acapella16,25 se pueden utilizar en casa ya que son muy fáciles de usar. Estos dispositivos de asistencia son seguros y rentables.

Para nosotros, la acapella dio consistentemente mejores resultados que la flauta pulmonar16, y por lo tanto, el dispositivo de acapella ha sido elegido para las colecciones de esputo. Se decidió una muestra de recolección de 3 días porque el propósito principal del uso de esputo es desarrollar una prueba de detección de cáncer de pulmón16. Se ha demostrado que una muestra de 3 días aumenta la probabilidad de detección de cáncer de pulmón en comparación con una muestra de 1 o 2 días26,27,28. Sin embargo, otros métodos de recolección de esputo pueden ser preferibles para diferentes propósitos. Si se utiliza un método de recolección de esputo diferente al descrito aquí, se recomienda valorar cuidadosamente cada anticuerpo o colorante utilizado para el análisis citométrico de flujo; hay muy pocos datos disponibles sobre cómo los diferentes métodos de recolección de esputo afectan a las proteínas objetivo para la citometría de flujo.

El segundo problema que amortigua el entusiasmo por el uso de esputo para el diagnóstico, principalmente relacionado con la citometría de flujo, es el número de células. El problema es la recolección de suficientes células viables para un análisis confiable. Dos estudios demostraron que las muestras de esputo recolectadas por métodos no invasivos, con la ayuda de un dispositivo de asistencia, contienen suficientes células viables que pueden ser utilizadas en diagnósticos clínicos o estudios de investigación16,24. Sin embargo, ninguno de estos estudios abordó la cuestión del número de células con respecto a la citometría de flujo.

Para los estudios que forman la base de este protocolo, se recolectaron muestras de esputo de participantes con alto riesgo de desarrollar cáncer de pulmón siguiendo las pautas institucionales aprobadas para cada sitio de estudio. Los participantes de alto riesgo se definieron como entre 55 y 75 años, haber fumado 30 paquetes-año y no haber dejado de fumar en los últimos 15 años. A los pacientes se les mostró cómo usar el dispositivo de acapella de acuerdo con las instrucciones del fabricante29 y recogieron esputo durante tres días consecutivos en casa. La muestra se mantuvo en el refrigerador hasta la última recolección. El último día de recolección, la muestra se envió al laboratorio durante la noche con una compresa fría congelada. Las muestras se procesaron en una suspensión de una sola célula el día en que se recibieron. Con este método de recolección de esputo, se obtienen células viables más que suficientes para un análisis citométrico de flujo confiable.

Por último, y relacionado con el problema anterior del número de células, está la cuestión de cómo liberar las células de esputo de su entorno mucinoso. ¿Cómo se pueden mantener las células viables y crear una suspensión de una sola célula que no obstruya el citómetro de flujo? Basado en el trabajo inicial de Pizzichini et al.30 y Miller et al.31, este protocolo describe un método fácil y confiable para el procesamiento del esputo en una suspensión de una sola célula que es adecuada para el análisis citométrico de flujo. Este método ha utilizado pautas bien establecidas en citometría de flujo32,33,34 para desarrollar una estrategia eficiente de etiquetado de anticuerpos para identificar células hematopoyéticas y epiteliales en el esputo y proporcionar configuraciones de instrumentos, medidas de control de calidad y pautas de análisis que estandarizan el análisis de esputo en una plataforma citométrica de flujo.

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Protocol

Todos los pasos del procesamiento del esputo se realizan en un gabinete de seguridad biológica con el equipo de protección personal adecuado.

1. Preparación del reactivo antes de iniciar la disociación del esputo

  1. Descongele el 1% de paraformaldehído (PFA), 25 ml por muestra en hielo y manténgalo frío hasta su uso.
    PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico por inhalación y contacto con la piel. Prepare el fijador de acuerdo con las instrucciones del fabricante y congele a -20 °C en alícuotas de 25 ml hasta su uso.
  2. Aproximar el peso de la muestra y descongelar suficiente 0,1% de Ditiotreitol (TDT) para el paso 2.2 y llevarlo a 37 °C. (Las alícuotas de TDT deben almacenarse a -20 °C antes de su uso).
  3. Lleve suficiente 0.5% N-acetil-L-cisteína (NAC) hasta 37 °C para el paso 2.2. (El NAC debe hacerse fresco semanalmente y almacenarse a 4 °C antes de su uso).)

2. Disociación del esputo

  1. Pesar la muestra de esputo para determinar los volúmenes de reactivos de disociación.
    NOTA: Una muestra se considera pequeña si el peso inicial es de ≤3 g, mediana si >3 g pero ≤8 g, grande si >8 pero ≤16 g, y extra grande si una muestra pesa >16 g. Las indicaciones pequeñas, medianas, grandes y extragrandes se utilizarán en todo el protocolo. La cantidad de reactivos necesarios para la disociación y el etiquetado difiere según el tamaño de la muestra de esputo.
  2. Transfiera una muestra pequeña a un tubo cónico limpio de 50 ml, una muestra mediana a una botella desechable de plástico limpia de 250 ml, o una muestra grande y extra grande a una botella desechable de plástico limpia de 500 ml. Añadir 1 ml/g de peso muestral de 0,5% de NAC y 4 ml/g de peso muestral de 0,1% de TDT.
  3. Vórtice a velocidad máxima (durante 15 s), y luego roca a temperatura ambiente (a velocidad máxima) durante 15 min.
  4. Diluir la muestra con cuatro volúmenes de Solución Salina Equilibrada de Hank (HBSS) (basado en el volumen total de la muestra + reactivos) para neutralizar el NAC y la TDT; vórtice rápidamente a la velocidad máxima y roca a temperatura ambiente durante 5 minutos a la velocidad máxima.
  5. Filtre la suspensión celular a través de coladores celulares de malla de nylon de 100 μm en uno o más tubos de centrífuga cónica de 50 ml para crear una suspensión de una sola celda.
  6. Centrifugar las células a 800 x g durante 10 min a 4 °C. Aspire el sobrenadante, combine todos los gránulos en un tubo cónico de 15 ml y luego lave los gránulos con HBSS utilizando las mismas condiciones.
  7. Resuspend el pellet celular en un volumen de tampón determinado por el peso inicial de la muestra de esputo.
    NOTA: Una pequeña muestra se resuspende en 250 μL de HBSS. Una muestra mediana se resuspende en 760 μL de HBSS. Las muestras grandes y extragrandes se resuspenden en 1460 μL de HBSS.
  8. Tome una alícuota de la suspensión celular para un recuento de células vivas / muertas usando Trypan Blue.
    NOTA: Para una muestra pequeña, utilice 5 μL. Para una muestra mediana, grande o extragrande, use 10 μL. Diluya 1:10 con HBSS.
    1. Mezclar 10 μL de la dilución de esputo con 30 μL de Trypan Blue al 0,4% para lograr una dilución final de la muestra de 1:40. Cargue en las cámaras de conteo de un hemocitómetro para un recuento de células.
      NOTA: Puede ser necesario ajustar la dilución final si los números de células son demasiado bajos o demasiado altos para lograr un recuento preciso. Consulte a Guiot et al.20 para distinguir correctamente las células de esputo de las SEC y los desechos se recomienda encarecidamente aquí. Esto es esencial para un recuento preciso de células.
  9. De la muestra extra grande, retire 50 x 106 células del total y agréguelas a un nuevo tubo con suficiente HBSS añadido para crear un volumen total de 1700 μL.
    NOTA: Considere que se trata de un ejemplo grande para el resto del protocolo. Las muestras sobrantes pueden desecharse o utilizarse para otros fines.

3. Tinción de colorantes de anticuerpos y viabilidad

  1. Elección de anticuerpos y colorantes de tinción
    NOTA: La Tabla 1 muestra los anticuerpos y el colorante de viabilidad que se utilizan en este protocolo y las poblaciones celulares que identifican.
    1. Etiquete los tubos que contienen las celdas de esputo (consulte la Tabla 2 para las etiquetas).
    2. Utilice tubos de citometría de flujo de 5 ml (compatibles con el citómetro de flujo utilizado) para el tubo de muestra con las células no teñidas y el tubo con el control de isotipo. Use tubos cónicos de 15 ml para las muestras de sangre y tubos epiteliales.
      NOTA: Estas muestras se transferirán a tubos de citometría de flujo después de la tinción y fijación de anticuerpos.
  2. Etiquete los tubos de compensación (Tabla 3).
    NOTA: Utilice tubos de citometría de flujo de 5 ml compatibles con el citómetro de flujo que se está utilizando.
  3. Agregue la cantidad de HBSS, anticuerpo y/o colorante a cada uno de los tubos de células de esputo y tubos de compensación como se indica en la Tabla 2 y la Tabla 3, respectivamente.
    NOTA: Agregue tampón (HBBS), anticuerpos y colorante a todos los tubos antes de agregar células o perlas de compensación para garantizar que el tiempo de tinción de todos los tubos sea consistente.
  4. Agregue las cantidades de volumen de células de esputo enumeradas en la Tabla 2 a los tubos de ensayo.
  5. Agregue cuentas de compensación a los tubos de compensación como se enumera en la Tabla 3.
  6. Incubar todos los tubos (tubos de ensayo y compensación) sobre hielo, protegidos de la luz, durante 35 min. Luego, llene los tubos con HBSS helado y centrífuga a 4 °C durante 10 min a 800 x g.
  7. Para los tubos de compensación, aspire el sobrenadante lo más cerca posible de los gránulos y mueva los gránulos para aflojarlos.
  8. Agregue 0,5 ml de HBSS frío a los tubos de compensación, guárdelos en el hielo a 4 °C y protéjalos de la luz hasta que sea necesario para el análisis de citometría de flujo.
  9. Aspire el sobrenadante del isotipo, la sangre y los tubos epiteliales no manchados después de la centrifugación (paso 3.6 de la sección de tinción de anticuerpos) y afloje los gránulos moviendo los tubos.

4. Fijación con paraformaldehído al 1% (PFA)

  1. Agregue PFA frío al 1% (que ya debería descongelarse) a los tubos no manchados, isotipo, sangre y epiteliales; 2 mL a los tubos no teñidos e isotipos, y 10 mL a los tubos sanguíneos y epiteliales.
  2. Incubar los tubos sobre hielo, protegidos de la luz durante 1 h. Vórtice rápidamente a máxima velocidad después de 30 min.
  3. Llene los tubos con HBSS helado. Luego, tubos de centrífuga a 4 °C durante 10 min a 1600 x g.
  4. Aspire la mayor cantidad posible de sobrenadante sin perturbar la bolita celular y mueva el tubo con los dedos para aflojar las células.
  5. Añadir 200 μL de HBSS frío a los tubos no teñidos e isotipos.
  6. Calcule el volumen de HBSS para la resuspensión de la sangre y el tubo epitelial de acuerdo con el recuento total de células.
    NOTA: Volumen de resuspensión = 0,15 x [recuento total de células (paso 8 de disociación del esputo) / 106]. Utilice 50 x 106 como recuento de celdas para una muestra extra grande.
  7. Almacene todas las muestras y tubos de compensación, protegidos de la luz en el hielo a 4 °C hasta que se realice el análisis de citometría de flujo.
    NOTA: Este protocolo no se ha probado para su almacenamiento durante más de 24 h.

5. Adquisición de datos en el citómetro de flujo

  1. Aplique los procedimientos de arranque apropiados para el citómetro de flujo que se está utilizando.
    NOTA: Esta sección del protocolo asume que la persona que opera el citómetro de flujo está capacitada en el uso del instrumento disponible para ellos, especialmente en lo que respecta a los procedimientos diarios, incluida la verificación de la estabilidad de los sistemas ópticos y fluídicos, las técnicas para estandarizar la dispersión de la luz y la intensidad de fluorescencia, así como el cálculo y la aplicación de la matriz de compensación correcta.
  2. Utilice la mezcla de cuentas del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) para asegurarse de que los voltajes de dispersión hacia adelante y de dispersión lateral estén configurados para colocar las cuentas NIST para abarcar toda la parcela sin colocar las cuentas demasiado cerca de los ejes.
    NOTA: Este paso es crucial para garantizar que los desechos menores de 5 μm puedan eliminarse mediante el análisis posterior a la adquisición. Dependiendo del citómetro de flujo utilizado, tenga en cuenta que las cuentas más pequeñas no se excluyen con el umbral (cuando se usa el LSR II o el Lyric) o con el discriminador alto (usando el citómetro de flujo Navios EX). Para el Navios EX, se utilizó una ganancia de 2 para la dispersión delantera y lateral, un voltaje de 236 para la dispersión hacia adelante y 250 para la dispersión lateral. Para el LSR II, se utilizó un voltaje de dispersión directa de 165 y un voltaje de dispersión lateral de 190.
  3. Establezca el caudal en medio (LSR II) o alto (Navios EX).
    NOTA: El caudal medio o alto para la mayoría de los instrumentos se puede utilizar para adquirir los tubos de esputo. Es importante tener en cuenta que el uso de un caudal demasiado lento o demasiado diluido de la muestra puede provocar que las células se asienten, lo que resulta en un aumento del vórtice que no se desea. Por lo tanto, adherirse al volumen de resuspensión calculado en el paso 4.6 debería dar como resultado una densidad celular que se puede adquirir rápidamente pero no obstruir la máquina.
  4. Ajuste los voltajes para cada parámetro utilizado para los parámetros de dispersión y fluorescentes para colocar las poblaciones celulares en la escala. Utilice las figuras con la estrategia de cierre como guía sobre cómo ajustar los voltajes en consecuencia.
    NOTA: Asegúrese de que todos los parámetros necesarios se seleccionan en la ventana de selección de parámetros antes de la adquisición o que no se adquirirán los datos.
  5. Adquiera datos para la muestra de esputo no teñida primero, seguida de la muestra teñida con isotipo, y luego el tubo sanguíneo y el tubo epitelial.
    NOTA: Si la suspensión celular está demasiado concentrada para permitir que el citómetro de flujo haga funcionar las muestras sin obstruirse, las muestras pueden diluirse aún más con HBSS.

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Representative Results

Este protocolo se desarrolló teniendo en cuenta un entorno de laboratorio clínico. El enfoque durante el desarrollo del protocolo fue en la simplicidad, la eficiencia y la reproducibilidad. Se encontró que el paso más lento en el procesamiento del esputo era contar las células. Por lo tanto, el protocolo está configurado de tal manera que el procesamiento del esputo y el etiquetado celular se pueden realizar independientemente del recuento de células sin pérdida de tiempo. Luego se puede obtener un recuento celular preciso, que aún es necesario para diluir la muestra adecuadamente para una carrera sin obstáculos, durante el período de incubación del etiquetado de anticuerpos.

Este protocolo utiliza una medida de peso de esputo en lugar de un recuento de células como una indicación de la cantidad de anticuerpos / colorantes a utilizar para el etiquetado celular óptimo. Sin embargo, existe un gran grado de variación en el peso de las muestras de esputo; de las 126 muestras que se analizaron, el peso varió de 0,57 g a 38,30 g. La Figura 1A muestra que la correlación entre el peso del esputo y el rendimiento celular no es fuerte. Por lo tanto, las muestras se dividieron en cuatro categorías; los pesos medios de las muestras fueron de 2,1 g para muestras pequeñas, 5,0 g para muestras medianas, 11,2 g para muestras grandes y 22,0 g para muestras extragrandes (Figura 1B). Sin embargo, todavía había muestras que produjeron muchas más células de las esperadas en función de su peso (Figura 1C), la mayoría de las muestras se agruparon muy bien. Para muestras pequeñas, el rendimiento celular medio fue de 8,0 x 106 células, para muestras medianas 13,0 x 106, para muestras grandes 35,4 x 106 y muestras extragrandes 93,0 x 106.

Cada anticuerpo utilizado en este protocolo fue titulado. Se eligió una concentración en la fase de meseta (Figura 2A) con el índice de tinción más alto (Figura 2B) de la curva de titulación como concentración de trabajo. Las variaciones en el número de células no alterarán dramáticamente la intensidad de la tinción. Esta titulación y prueba de anticuerpos es esencial y debe configurarse con cuidado para cada nuevo anticuerpo o colorante utilizado en este protocolo34,35. Cuando un anticuerpo se titula con cuidado, debe teñir de 10 a 50 veces más células que el número de células en las que se tituló el anticuerpo34,35. Un ejemplo de este principio se proporciona en la Tabla 4. El anticuerpo anti-humano CD45-PE se tituló en 1 x 106 células en un volumen total de 400 μL. Si este anticuerpo al volumen de tinción se extrapola al protocolo (ver Tabla 2, que muestra la cantidad de CD45-PE y los volúmenes de tinción para cada tamaño de muestra), para una muestra pequeña, se teñirán 0,625 x 106 células, se teñirán 1,25 x 106 células para una muestra mediana y 2,5 x 106 células para una muestra grande (columna A en la Tabla 4). Un exceso de 50 veces en el número de celdas para cada categoría se calcula en 31,25 x 106, 62,5 x 106 y 125 x 106 celdas, respectivamente (columna B). Como se muestra en las columnas C y D, el número medio de celdas de cada categoría de tamaño y la muestra más grande en cada categoría están dentro del rango de 50 veces.

A pesar de las aparentes diferencias en el tamaño y el rendimiento celular entre los diversos tamaños de las muestras de esputo, el porcentaje medio de contaminación SEC en cada categoría es muy similar. La Figura 3A muestra el porcentaje de SEC encontrados en muestras individuales, estratificadas según su categoría de peso de esputo. La principal preocupación fue con las SEC, ya que estas células no son representativas del tejido pulmonar sino de la cavidad oral. Sin embargo, la contaminación promedio de sec es inferior al 20% para todas las categorías. La Figura 3B muestra el porcentaje de células viables encontradas en estas muestras. Excluyendo las SEC, la viabilidad promedio fue de aproximadamente el 72% para las categorías de tamaño de muestra pequeño, mediano y grande. Fue ligeramente superior (79%) para la categoría extragrande.

La Figura 4 muestra una estrategia típica de cierre para separar las células de esputo de interés de los escombros, las células muertas (que también incluyen las SEC contaminantes36) y los grupos celulares. La Figura 4A muestra el uso de perlas NIST para establecer puertas para eliminar desechos menores de 5 μm o mayores de 30 μm, mientras que la Figura 4B aplica esta puerta en las células de esputo. La Figura 4C muestra un perfil de esputo típico cuando se ve como ancho de dispersión lateral (SSC-W) contra ancho de dispersión hacia adelante (FSC-W), la puerta de ancho. Este perfil se utiliza para eliminar pequeños residuos que se presentan a lo largo de los ejes SSC-W y FSC-W. La eliminación de células muertas se muestra en las Figuras 4D y 4E. El control no manchado (Figura 4D) se utiliza para determinar el límite para la positividad de FVS510; las células que tiñen positivamente para FVS510 por encima del control negativo se consideran muertas y no se utilizarán en el análisis de células de esputo (Figura 4E). Por último, se aplica una puerta singlete para eliminar los dobletes de celda del análisis, que se muestra en la Figura 4F. Por lo tanto, las células que han pasado por las puertas de selección que se muestran en las Figuras 4B, Figura 4C, Figura 4E y Figura 4F representan células de esputo vivas y únicas listas para su posterior análisis con los anticuerpos utilizados en este protocolo.

El uso del anticuerpo anti-CD45 en este protocolo de etiquetado permite la separación de células vivas de esputo único en un compartimento de células sanguíneas (CD45+) y un compartimento de células no sanguíneas (CD45-). Esta última categoría incluye células epiteliales y otras células no sanguíneas. El perfil superior de la Figura 5A muestra el uso de una muestra de esputo no teñida para establecer el límite para la positividad de CD45, haciendo que las puertas capturen células CD45 + y células CD45. El perfil inferior de la Figura 5A muestra ambas puertas aplicadas a una muestra de esputo teñida con el anticuerpo anti-CD45. La tinción con anticuerpos adicionales se utiliza para identificar poblaciones específicas de células sanguíneas dentro de la puerta CD45+ (Figura 5B) y otras poblaciones no sanguíneas, incluidas las poblaciones epiteliales en la puerta CD45(Figura 5C). En ambas figuras, los perfiles superiores muestran cómo se utiliza el esputo teñido con isotipo para establecer las poblaciones doblemente negativas, mientras que los perfiles inferiores muestran las células de esputo teñidas con anticuerpos. La Figura 5B (abajo) muestra seis poblaciones diferentes de células CD45+ creadas con el cóctel de anticuerpos detectables en el canal 1 de fluorescencia (FL) (anticuerpos anti-CD66b, CD3, CD19) y el anti-CD206 detectable en el canal FL3. Los experimentos de clasificación han revelado que los macrófagos específicos del pulmón residen en las puertas identificadas con M. La presencia de células en estas puertas indica, por lo tanto, que la muestra de esputo se derivaba del pulmón y no era saliva (Bederka et al., manuscrito en preparación). La Figura 5C (abajo) muestra los cuadrantes de cierre creados con la anti-pan-citoqueratina (panCK) detectable en el canal FL1 y los anticuerpos anti-molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) detectables en el canal FL3 entre las células de esputo CD45.

Este protocolo de etiquetado ha sido ampliamente probado en el Navios EX y el LSR II. Se realizaron algunos experimentos preliminares en el Lyric, pero sin la extensa optimización del instrumento que se hizo para las otras dos máquinas. Por lo tanto, se proporcionan ajustes detallados del instrumento para el Navios EX y el LSR II en la hoja de Materiales, pero no para la letra. Para comprender las similitudes y variaciones entre estas tres plataformas citométricas de flujo que se pueden utilizar para analizar las células de esputo, los perfiles obtenidos de las diversas máquinas se pueden comparar en la Figura 6 y la Figura 7. Dos grandes muestras de esputo fueron procesadas, agrupadas, etiquetadas, separadas en tres porciones iguales y posteriormente adquiridas en cada citómetro de flujo mencionado anteriormente. La Figura 6, que es similar a la Figura 4, compara la estrategia de cierre para eliminar escombros, células muertas y grupos de células. La Figura 7, que es idéntica a la Figura 5, compara los perfiles sanguíneos y no sanguíneos a partir de los datos adquiridos en los diversos citómetros de flujo.

La comparación de los diversos perfiles obtenidos de los tres citómetros de flujo diferentes muestra que se pueden observar los mismos perfiles básicos con cada instrumento. Las diferencias a tener en cuenta son las gráficas SSC-W/FSC-W (width gate) (Figura 6, segunda fila) y las escalas lineales de las gráficas de dispersión (Figuras 6 y 7). El gráfico de ancho de dispersión generado en el Navios EX muestra una puerta de inclusión (caja roja), lo que significa que todas las celdas incluidas en la puerta se analizan más a fondo; se excluyen los eventos a lo largo de los ejes en la esquina inferior izquierda. Los gráficos de ancho de dispersión en el LSR II y Lyric no muestran un depósito similar de eventos a lo largo de estos mismos ejes. Esta discrepancia probablemente se deba al umbral muy sensible utilizado en el Navios EX, lo que lleva a algunos pequeños escombros en la puerta de exclusión de tamaño anterior (fila superior de la Figura 6). En ocasiones, los escombros se ven a lo largo de los ejes en el perfil de ancho de dispersión generado en el LSRII, pero está en la esquina inferior derecha. En esos casos, se utiliza una puerta de exclusión (como lo indica el cuadro rojo discontinuo en el perfil central en la fila 2 de la Figura 6) para eliminar estos eventos de un análisis posterior.

Mientras que las escalas logarítmicas parecen ligeramente diferentes en las gráficas entre el Navios EX y los citómetros Lyric y LSR II, el Navios EX tiene la opción de adquirir datos utilizando más décadas. Implementar más décadas depende del contexto del experimento y de la sensibilidad deseada para visualizar las poblaciones de interés.

Una diferencia notable adicional entre los citómetros Navios EX y LSR II y Lyric es la apariencia del perfil de la puerta singlete. El citómetro Navios EX está equipado con una celda de flujo rectangular con un ángulo de recolección diferente al del LSR II. El Navios EX contiene tres ángulos de recolección controlados por software para optimizar la dispersión de la luz del ángulo delantero para lograr la sensibilidad adecuada para el tamaño de partícula a analizar. La compuerta poligonal para el citómetro Navios EX deberá ajustarse a un ángulo ligeramente inferior al de la compuerta singlete para el LSRII. La puerta de singlete para el Lyric se puede optimizar para obtener un perfil similar al visto con el LSR II. Usando la muestra de esputo, el factor de escala de área tendría que optimizarse para cada láser en el Lyric para lograr una puerta singlete similar a la LSR II.

Todos los perfiles mostrados en la Figura 4 a la Figura 7 fueron analizados con el software FlowJo, versión 10.6. Los archivos .fcs se pueden encontrar en FlowRepository (https://flowrepository.org), bajo los ID FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ y FR-FCM-Z3MM y se pueden usar para practicar el análisis de esputo como se ilustra en estas figuras.

Figure 1
Figura 1: Pesos de esputo y rendimiento celular. (A) Se representa la relación entre el peso del esputo, determinado antes del procesamiento, y el rendimiento celular total, determinado después del procesamiento utilizando un hemocitómetro. Cada bala representa una muestra individual, 126 en total. (B) Las muestras de esputo se estratificaron en cuatro categorías en función de su peso: pequeñas para muestras de hasta 3 g, medianas para muestras de más de 3 g hasta 8 g, grandes para muestras de más de 8 g hasta 16 g y muestras extragrandes para aquellas que pesan más de 16 g. (C) Se muestra la distribución del rendimiento celular para las muestras en cada categoría. Las barras rojas en (B) y (C) representan los valores medios en cada categoría. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Titulación de anticuerpos para CD45-PE antihumano. (A) La curva de titulación de CD45-PE (IgG1) con la intensidad media de fluorescencia (IMF) de la población positiva trazada frente a la concentración de las mesetas de anticuerpos CD45-PE a 1 μg/mL. (B) La curva de valoración que representa el índice de tinción frente a la concentración de anticuerpos muestra que el índice de tinción más alto es de 1 μg/ml. El índice de tinción se calculó como: [CD45 MFI población positiva - CD45 MFI población negativa] / [2 * Desviación estándar]. Sobre la base de la Figura 2A y la Figura 2B, se eligió 1 μg/ml como la concentración óptima para el anticuerpo CD45-PE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La proporción de SEC y células muertas en muestras de esputo es consistente entre las cuatro categorías de peso. (A) La proporción de SECs en muestras de esputo se clasifica de acuerdo con su categoría de peso. El porcentaje de contaminación sec se determinó mediante hemocitómetro como parte del recuento total de células. (B) Viabilidad celular de muestras de esputo excluyendo SECS, determinada por hemocitómetro y el método de exclusión de azul de tripano. Para cada gráfico, las líneas rojas representan los valores medios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Estrategia de gating para excluir escombros, células muertas y dobletes en una muestra de esputo. (A) Se utilizaron perlas NIST de tamaños 5 μm, 20 μm y 30 μm para fijar la compuerta indicada por la caja roja para excluir los desechos menores de 5 μm y los escombros más grandes por encima de 30 μm y cerca del eje. (B) Se adquirió una muestra de esputo utilizando los mismos voltajes para la dispersión delantera y lateral que la de las perlas NIST. La puerta creada en (A) se aplicó para excluir escombros. (C) Se excluyeron los escombros pequeños cerca del eje en esta gráfica de ancho de dispersión. (D) Se utilizó una muestra de esputo no teñido para establecer el corte (línea roja) para la población negativa y no teñida para el tinte de viabilidad. (E) El corte creado en D se aplicó a la muestra de esputo teñido para formar una puerta (caja roja) para incluir células vivas y viables. (F) La compuerta singlete indicada por el polígono rojo excluye las celdas que no caen en diagonal, eliminando dobletes y/o grumos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Estrategia de gating de las células de esputo en compartimentos sanguíneos y no sanguíneos. (A) Las células de esputo no teñidas derivadas de la puerta singlete se utilizan para establecer el corte (línea roja) en la población negativa para CD45 (arriba). El corte del perfil superior se aplica a la muestra de esputo teñido (abajo) para diferenciar las poblaciones CD45 positivas (CD45+) y negativas (CD45-). (B) Las células de esputo CD45+ teñidas con anticuerpos isotipo para FITC/AF488 se utilizan para establecer las puertas en la población negativa (arriba). Las mismas puertas se aplican a las células de esputo CD45 + teñidas con marcadores de células sanguíneas CD3, CD19, CD66b y CD206 (abajo). (C) Las compuertas cuadrantes se colocan en las células de esputo CD45 teñidas con controles de isotipo (arriba) y se aplican a las células CD45- de la muestra de esputo teñida con los marcadores epiteliales pancitoqueratina (panCK) y EpCAM (abajo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Estrategia de gating para excluir escombros, grumos y células muertas de células de esputo teñidas en tres plataformas citométricas de flujo. Dos grandes muestras de esputo fueron procesadas, agrupadas, etiquetadas y divididas en tres porciones iguales para su adquisición en los citómetros de flujo Navios EX (A), LSR II (B) y Lyric (C). Fila superior: Las muestras de esputo fueron cerradas (caja roja) para excluir escombros muy pequeños y grandes. Segunda fila: El cuadro rojo grande en la gráfica Navios EX representa una puerta de inclusión que incluye las celdas pero excluye los escombros. La pequeña caja roja discontinua que se ve en la gráfica LSR II representa una puerta de exclusión para eliminar los escombros de un análisis posterior. Se necesita una mayor optimización con el Lyric para determinar dónde se necesita la cerración de exclusión de escombros. Por lo tanto, no hay ninguna puerta presente en esa parcela. Tercera fila: las puertas rectangulares rojas incluyen células vivas para un análisis posterior. Fila inferior: la puerta poligonal tiene celdas individuales al excluir los dobletes que caen fuera de la diagonal de la puerta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Estrategia de gating para esputo teñido para sangre y marcadores epiteliales en tres plataformas citométricas de flujo. El análisis que se muestra en la Figura 6 continúa en la Figura 7; todas las células individuales viables (fila inferior, Figura 6) se dividieron en poblaciones CD45+ y CD45- (primera fila, Figura 7), de modo que los marcadores específicos de células sanguíneas y los marcadores específicos de células epiteliales pudieran delinear aún más estas poblaciones. Segunda fila: perfil de los marcadores de células sanguíneas CD3/CD19/CD66b y CD206 de células CD45+ . Tercera fila: marcadores de células epiteliales panCK y EpCAM de células CD45. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Anticuerpo/tinción Propósito
FVS510 Mancha de viabilidad
Anti-humano CD45 – PE Marcador panleucocitario;  Compensación de PE
Anti-humano CD66b – FITC Marcador de granulocitos
CD3 antihumano – Alexa488 Marcador de células T
Cd19 antihumano – Alexa488 Marcador de células B; Compensación FITC/Alexa488
Anti-humano CD206 – PE-CF594 Marcador de macrófagos pulmonares;  Compensación PE-CF594
EpCAM antihumano – PE-CF594 Marcador de células epiteliales;  Compensación PE-CF594
Pancitoqueratina antihumana (panCK) – Alexa488 Marcador de células epiteliales
IgG1κ – Alexa488 Control de isotipo CD3/CD19/panCK
IgG1κ – FITC Control de isotipo CD66b
IgG1κ – PE-CF594 Control de isotipo CD206/EpCAM
Anti-humano CD45 – BV510 Compensación FVS510

Tabla 1: Anticuerpos y tinciones de viabilidad utilizadas. Lista de anticuerpos y colorantes de viabilidad utilizados en este protocolo. Se indican los subconjuntos celulares que cada uno de ellos identifica.

Tubo (Etiqueta) Tamaño de la muestra* HBSS (μL) FVS510 (μL) CD45 (μL) Otros anticuerpos (μL) Células § (μL)
Sin manchas pequeño 80 20
Medio 50 50
grande 50 50
IgG1κ - Alexa488 IgG1κ- FITC IgG1κ - PE-CF594
Control de isotipos pequeño 60.65 0.6 10 2 6 0.75 20
Medio 30.65 0.6 10 2 6 0.75 50
grande 30.25 1 10 2 6 0.75 50
CD206 CD3 CD19 CD66b
Sangre pequeño 92.875 1.5 25 1.875 5 1.25 7.5 115
Medio 65.75 3 50 3.75 10 2.5 15 350
grande 102.5 10 100 7.5 20 5 30 725
EpCAM PanCK
Epitelial pequeño 96.5 1.5 25 10 2 115
Medio 73 3 50 20 4 350
grande 117 10 100 40 8 725
* Las muestras se consideran pequeñas, medianas o grandes en función del peso determinado en el paso 1 de la sección de disociación de esputo del protocolo.
§ Las celdas deben agregarse después de que se hayan distribuido todos los reactivos, incluidos los de los tubos de compensación (Tabla 3).

Tabla 2: Contenido de tubos con células de esputo. Utilice esta tabla como se hace referencia en el protocolo para agregar los volúmenes especificados de anticuerpos y la tinción de viabilidad para el tamaño de muestra apropiado.

Tubo (Etiqueta) Reactivos añadidos (μL) Reactivos añadidos (gota)
HBSS CD45-PE CD206-PE-CF594 EpCAM-PE-CF594 CD19-Alexa488 CD45-BV510 CompBead (+) CompBead * (-)
PE comp. 76 4 x x x x 1 1
PE-CF594 comp. 72 x 4 4 x x 1 1
Alexa488/FITC comp. 60 x x x 20 x 1 1
BV510 comp. 60 x x x x 20 1 1
* Las perlas positivas (+) y negativas (-) deben añadirse después de que se hayan distribuido todos los reactivos y se hayan preparado los tubos de la Tabla 2.
comp. = compensación

Tabla 3: Contenido de los tubos de compensación. Utilice esta tabla como se hace referencia en el protocolo para agregar los volúmenes especificados de anticuerpos a las cuentas de compensación.

Número de celda (x 106)
Un B C D
Tamaño de la muestra En volumen de tinción * Acceso de 50 veces Muestra mediana (acceso plegable) # Muestra más grande (acceso plegable) #
Pequeño 0.625 31.25 8.0 (12.8) 24.77 (39.6)
Medio 1.25 62.5 13.0 (10.4) 48.87 (39.1)
Grande 2.5 125 35.4 (14.2) 113.5 (45.4)
* Volúmenes de tinción utilizados en el protocolo (Tabla 2).  El número de células se extrapola de cómo se realizó la curva de titulación; 1 μg/ml de CD45-PE y 1 x 106 células por 200 μL.
Acceso 50 veces mayor de números de celda en la columna A.
# fold el acceso en las columnas C y D se calcula dividiendo el número presentado en las celdas de las columnas C o D por el número en la celda correspondiente en la columna A.

Tabla 4: Concentración antihumana de CD45-PE para todas las muestras en cada categoría de tamaño de muestra.

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Discussion

El contenido celular del esputo incluye una gran variedad de células de gran alcance, a menudo acompañadas de una gran cantidad de escombros37. Además, el análisis del esputo requiere un control de calidad que confirme que la muestra se recoge del pulmón en lugar de de la cavidad oral38. Por lo tanto, no es tan sencillo analizar el esputo por citometría de flujo como lo es para la sangre, por ejemplo, que libera una suspensión celular mucho más limpia y homogénea. Este protocolo ha abordado todos estos problemas: proporcionar configuraciones de instrumentos utilizando perlas de tamaño específico para garantizar que se puedan detectar las poblaciones de células más pequeñas y más grandes, una estrategia de cierre para eliminar escombros, grupos celulares, SEC contaminantes y otras células muertas y, por último, una medida de control de calidad para garantizar que una muestra de esputo provenga del pulmón en lugar de ser principalmente saliva.

Hay pasos críticos en el protocolo para trabajar con esputo que vale la pena señalar. En primer lugar, el rendimiento celular puede verse drásticamente afectado por el número de coladores de células de nylon utilizados en el paso 2.5 de la parte de disociación del esputo del protocolo. Es posible que se requieran múltiples coladores para evitar perder demasiadas células debido a la obstrucción del colador. Cuando el flujo a través de los coladores se ha ralentizado notablemente, se debe usar un nuevo colador. En segundo lugar, el pellet celular de muestras de esputo puede estar muy suelto, especialmente si hay una alta contaminación de las SEC. Por lo tanto, es esencial no aspirar demasiado cerca del pellet al retirar el sobrenadante después de centrifugar las muestras. Aspirar demasiado cerca del pellet puede resultar en pérdida de células, si no pérdida de todo el pellet. En tercer lugar, este protocolo requiere un paso de fijación. Esto preserva las células y su perfil de tinción y sirve como una medida de seguridad para proteger al operador del citómetro de flujo. El funcionamiento de muestras en ciertos citómetros de flujo puede presentar mayores riesgos biológicos debido al potencial de producción de aerosoles39. La fijación de PFA ayuda a proteger al operador de posibles patógenos en la muestra de esputo. Cuarto, y quizás el aspecto más desafiante de la preparación de muestras de esputo para el análisis citométrico de flujo, es el conteo celular. El conteo celular es complicado debido a la gran variedad de tipos de células presentes en el esputo. Las máquinas de contar a menudo están limitadas por el rango de tamaño de celda que pueden capturar y, por lo tanto, son menos confiables que un hemocitómetro. Sin embargo, el conteo celular de muestras de esputo por hemocitómetro, que es excelentemente descrito por Guiot et al.20, es tedioso y requiere práctica para llegar a ser competente. Un número de células preciso es vital para determinar el volumen de resuspensión final de la muestra para permitir un caudal razonable y evitar obstrucciones en el citómetro de flujo. La presencia de las SEC muy grandes en el esputo y los muchos grupos celulares más pequeños que no se rompen por el tampón de disociación, ni son atrapados por los filtros, aumentan la probabilidad de obstruir el citómetro de flujo. Por lo tanto, se recomienda dedicar algún tiempo a determinar la mejor concentración / caudal celular para la adquisición de datos utilizando el citómetro de flujo disponible. Además, asegúrese de que el citómetro de flujo tenga el tamaño apropiado de célula de flujo y boquilla (o sonda) capaz de medir las poblaciones de células más grandes presentes en el esputo.

Incluso cuando se ha logrado la competencia en el conteo celular, sigue siendo un proceso que consume mucho tiempo. Por lo tanto, la determinación de los reactivos para el etiquetado celular en este protocolo se basa en el tamaño de la muestra (según lo juzgado por el peso) en lugar del número de células. Esto permite un uso más eficiente del tiempo, ya que el recuento manual de células se puede completar durante el tiempo necesario para la tinción de anticuerpos y colorantes de viabilidad. Sin embargo, hay tres excepciones notables a esto. Si una muestra es de >16 g (las llamadas muestras extra grandes), el recuento manual de células debe ocurrir antes de la tinción para que se puedan conservar reactivos costosos tincionando solo 25 x 106 células cada una para la sangre y los tubos epiteliales. Este número de celda proporciona perfiles muy confiables en la configuración descrita en este protocolo. Otra posible excepción es el caso de una muestra muy pequeña. La estimación es que se necesita un mínimo de 1-2 x 106 células para que el análisis de citometría de flujo tal como se presenta en este protocolo genere perfiles confiables (datos no mostrados). Por lo tanto, si una muestra contiene menos de 1-2 x 106 células, puede que no valga la pena continuar con el procedimiento, ya que el resultado final probablemente será inaceptable.

Los reactivos de etiquetado específicos que funcionan bien en las células de sangre periférica o líneas celulares pueden funcionar de manera muy diferente en las células sanguíneas contenidas en el esputo (observaciones no publicadas). Por lo tanto, se recomienda valorar cada anticuerpo u otros reactivos de etiquetado de acuerdo con protocolos bien establecidos34,35 antes de que se utilicen en experimentos de citometría de flujo. La mayoría de las valoraciones de anticuerpos deben dar resultados comparables cuando se tiñen de 10 a 50 veces; sin embargo, se aconseja realizar titulaciones adicionales con números celulares superiores a ese rango34. Cuando se ha determinado una concentración de reactivo, es esencial mantener el tiempo de incubación de ese reactivo igual que en el experimento real. Por esa razón, el protocolo enfatiza la adición de todos los tampones y reactivos a los tubos antes de que se agreguen las células o las perlas de compensación. Este orden de adición de reactivos y células / cuentas juntas permite una mayor consistencia en los tiempos de etiquetado. Si, por alguna razón, el tiempo de incubación experimental no puede mantenerse similar al utilizado para la titulación de anticuerpos/colorantes, este último debe repetirse con un tiempo de incubación que sea factible durante los experimentos.

Las muestras de esputo se han utilizado ampliamente como muestra de diagnóstico para estudiar la fisiopatología de diversas enfermedades que afectan al pulmón. La tuberculosis40,41, la EPOC13,42, el asma43, la fibrosis quística44,45, el cáncer de pulmón46,47,48 y la artritis reumatoide49 se encuentran entre las muchas enfermedades en las que se ha estudiado el esputo debido a la ventaja de que es una muestra obtenida de forma no invasiva. Más recientemente, durante la pandemia de coronavirus, el esputo se ha utilizado para detectar la diseminación viral prolongada en pacientes hospitalizados con la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19)50.

Se han utilizado varias tecnologías, incluida la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), el análisis de proteínas, la microscopía y la citometría de flujo, para identificar marcadores específicos de la enfermedad en el esputo. El uso de una plataforma citométrica de flujo para analizar muestras de esputo no es ampliamente utilizado, pero su uso aumenta. Con los recientes avances en la tecnología de citómetros de flujo3,51,52, así como los avances en la química de los fluoróforos, la generación de nuevos clones de anticuerpos y el desarrollo de diversos colorantes para identificar poblaciones de células muertas51,53,54, la posibilidad de diseñar paneles de anticuerpos destinados a diagnosticar enfermedades humanas ha aumentado dramáticamente. Además, el reciente impulso para automatizar el análisis de datos citométricos de flujo55,56 eliminará el sesgo potencial en la lectura e interpretación manual de datos de flujo. Estos nuevos desarrollos en citometría de flujo facilitarán significativamente la exploración del esputo como diagnóstico clínico.

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Disclosures

Todos los autores son empleados pasados o actuales de bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

Queremos agradecer a David Rodríguez por su ayuda con la preparación de la figura. Las muestras de esputo se ejecutaron en el BD LSR II en el UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, con el apoyo de UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC en UT Health) y UL1 TR001120 (subvención de CTSA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix Polysciences 25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 Fisher Scientific 08-771-19
3 M NaOH EMD SX0593-1
50 mL conical falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
Alexa488 anti-human CD19 BioLegend 302219
Alexa488 anti-human CD3 BioLegend 300415
Alexa488 anti-human cytokeratin BioLegend 628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype BioLegend 400129
BV510 anti-human CD45 BioLegend 304036
CD66b FITC isotype BD Biosciences 555748
CompBead Plus Compensation Beads BD Biosciences 560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL Fisher Scientific 09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL Fisher Scientific 09-761-10
CS&T beads BD Biosciences 655051
DTT Fisher Scientific BP172-5
FITC anti-human CD66b GeneTex GTX75907
Fixable Viability Stain BD Biosciences 564406
FlowCheck Beckman Coulter A69183
FlowSet Beckman Coulter A69184
HBSS Fisher Scientific 14-175-095
NAC Sigma-Aldrich A9165
NIST Beads, 05 μM Polysciences 64080
NIST Beads, 20 μM Polysciences 64160
NIST Beads, 30 μM Polysciences 64170
PE anti-human CD45 BioLegend 304039
PE-CF594 anti-human EpCAM BD Biosciences 565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype BD Biosciences 562292
PE-CR594 anti-human CD206 BD Biosciences 564063
Sodium citrate dihydrate EMD SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Medicina Número 174
Análisis de esputo de calidad controlada por citometría de flujo
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Grayson, M., Lai, S. C., Bederka, L. … More

Grayson, M., Lai, S. C., Bederka, L. H., Araujo, P., Sanchez, J., Reveles, X. T., Rebel, V. I., Rebeles, J. Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (174), e62785, doi:10.3791/62785 (2021).

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