Summary
Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att dissociera sputum i en enda cell suspension och efterföljande karakterisering av cellulära delmängder på standard flöde cytometriska plattformar.
Abstract
Sputum, som ofta används för att studera cellulärt innehåll och andra mikromiljöfunktioner för att förstå lungans hälsa, analyseras traditionellt med hjälp av cytologibaserade metoder. Dess användbarhet är begränsad eftersom läsning av bilderna är tidskrävande och kräver högspecialiserad personal. Dessutom gör omfattande skräp och förekomsten av alltför många skivepitelceller (SECs), eller kindceller, ofta ett prov otillräckligt för diagnos. Däremot möjliggör flödescytometri fenotypning med hög genomströmning av cellulära populationer samtidigt som skräp och SEC exkluderas.
Protokollet som presenteras här beskriver en effektiv metod för att dissociera sputum i en enda cell suspension, antikroppsfläck och fixa cellulära populationer, och förvärva prover på en flöde cytometrisk plattform. En gating strategi som beskriver uteslutandet av skräp, döda celler (inklusive SECs) och celldubbel presenteras här. Vidare förklarar detta arbete också hur man analyserar livskraftiga, enstaka sputumceller baserat på ett kluster av differentiering (CD)45 positiva och negativa populationer för att karakterisera hematopoetiska och epitelial härstamning undergrupper. En kvalitetskontrollåtgärd tillhandahålls också genom att identifiera lungspecifika makrofager som bevis för att ett prov härrör från lungan och inte är saliv. Slutligen har det visats att denna metod kan tillämpas på olika cytometriska plattformar genom att tillhandahålla sputum profiler från samma patient analyseras på tre flöde cytometer. Navios EX, LSR II och Lyric. Dessutom kan detta protokoll ändras för att inkludera ytterligare cellulära markörer av intresse. En metod för att analysera ett helt sputumprov på en flöde cytometrisk plattform presenteras här som gör sputum mottaglig för att utveckla hög genomströmning diagnostik av lungsjukdom.
Introduction
Tekniska framsteg inom hårdvara och programvara för flödescytometrar har gjort det möjligt att identifiera många distinkta cellpopulationer samtidigt1,2,3,4. Användningen av flödescytometern i hematopoetisk cellforskning har till exempel lett till en mycket bättre förståelse för immunsystemet2 och den cellulära hierarkin i det hematopoetiska systemet5, liksom den diagnostiska skillnaden mellan en mängd olika blodcancer6,7,8. Även om de flesta sputumceller är av hematopoietic ursprung9,10,11, flöde cytometri har inte använts i stor utsträckning på sputum analys för diagnostiska ändamål. Flera studier tyder dock på att utvärderingen av immuncellpopulationer i sputum (den viktigaste delmängden av celler) kan vara till stor hjälp vid diagnos och/eller övervakning av sjukdomar som astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL)12,13,14,15. Dessutom tillåter förekomsten av epitelspecifika markörer som kan användas i flödescytometri förhör av följande viktigaste delmängd av celler i sputum, lungepitetelceller.
Förutom förmågan att analysera många distinkta cellpopulationer av olika vävnadsursprung kan en flödescytometer utvärdera ett stort antal celler på relativt kort tid. I jämförelse kräver glidbaserade, cytologiska typer av analyser ofta högspecialiserad personal och/eller utrustning. Dessa analyser kan vara arbetsintensiva, vilket leder till att endast en del av sputumprovet analyseras16.
Tre kritiska frågor begränsar den utbredda användningen av sputum i flöde cytometri. Det första numret gäller insamlingen av sputum. Sputum samlas in genom en huff hosta som utvisar slem från lungorna i munhålan och därefter spottar i en samlingskopp. Eftersom slem färdas genom munhålan finns det en stor risk för SEC-förorening. Denna förorening komplicerar provanalysen, men problemet åtgärdas enkelt på en flödescytometrisk plattform, vilket visas i denna studie.
Inte alla kan producera sputum spontant; Därför har flera enheter utvecklats för att hjälpa till med sputum insamling på ett icke-invasivt sätt17. Nebulisatorn är en sådan anordning och har visat sig producera tillförlitliga sputumprover18,19,20. Även om nebulisatorn är ett mycket effektivt sätt att icke-invasivt samla sputum, kräver dess användning fortfarande en inställning på en medicinsk anläggning med specialiserad personal21. Handhållna enheter som lungflöjt22,23,24 och acapella16,25 kan däremot användas hemma eftersom de är mycket användarvänliga. Dessa hjälpenheter är både säkra och kostnadseffektiva.
För oss gav acapella konsekvent bättre resultat än lungflöjt16, och därför har acapella-enheten valts för sputumsamlingar. Ett 3-dagars insamlingsprov bestämdes eftersom det primära syftet med att använda sputum är att utveckla ett test för lungcancerdetektering16. Det har visat sig att ett 3-dagars prov ökar sannolikheten för upptäckt av lungcancer jämfört med ett 1- eller 2-dagars prov26,27,28. Andra metoder för sputumsamling kan dock vara att föredra för olika ändamål. Om en annan sputumuppsamlingsmetod används än den som beskrivs här, rekommenderas att noggrant titrera varje antikropp eller färgämne som används för flödescytometrisk analys. det finns mycket lite data om hur olika sputum insamlingsmetoder påverkar de riktade proteinerna för flödescytometri.
Den andra frågan som dämpar entusiasmen för att använda sputum för diagnostik, främst relaterad till flödescytometri, är cellnummer. Problemet är insamlingen av tillräckligt livskraftiga celler för en tillförlitlig analys. Två studier visade att sputumprover som samlats in med icke-invasiva metoder, med hjälp av en hjälpanordning, innehåller tillräckligt med livskraftiga celler som kan användas i kliniska diagnos- eller forskningsstudier16,24. Ingen av dessa studier tog dock upp frågan om cellnummer avseende flödescytometri.
För de studier som ligger till grund för detta protokoll samlades sputumprover in från deltagare med hög risk för att utveckla lungcancer enligt godkända institutionella riktlinjer för varje studieplats. Högriskdeltagare definierades som mellan 55-75 år, efter att ha rökt 30 packår och inte slutat röka under de senaste 15 åren. Patienterna visades hur man använder acapella-enheten enligt tillverkarens instruktioner29 och samlade sputum under tre dagar i följd hemma. Provet förvarades i kylskåp fram till den sista samlingen. På den sista insamlingsdagen skickades provet till laboratoriet över natten med en frusen kall förpackning. Proverna bearbetades till en enda cell suspension samma dag som de togs emot. Med denna metod för sputum insamling erhålls mer än tillräckligt livskraftiga celler för en tillförlitlig flöde cytometrisk analys.
Slutligen, och relaterad till föregående cellnummer fråga, är frågan om hur man släpper sputumcellerna från dess mucinous miljö. Hur kan cellerna hållas livskraftiga och skapa en enda cellfjädring som inte täpper till flödescytometern? Baserat på det inledande arbetet av Pizzichini et al.30 och Miller et al.31 beskriver detta protokoll en enkel och pålitlig metod för sputumbehandling till en enda cellfjädring som är lämplig för flödescytometrisk analys. Denna metod har använt väletablerade riktlinjer i flödescytometri32,33,34 för att utveckla en effektiv antikroppsmärkningsstrategi för att identifiera hematopoetiska och epitelceller i sputum och tillhandahålla instrumentinställningar, kvalitetskontrollåtgärder och analysriktlinjer som standardiserar sputumanalys på en flödescytometrisk plattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla steg i sputumbehandlingen utförs i ett biologiskt säkerhetsskåp med lämplig personlig skyddsutrustning.
1. Reagensberedning innan sputumdissociation påbörjas
- Tina 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml per prov på is och håll dig kall tills den används.
VARNING: PFA är giftigt vid inandning och hudkontakt. Förbered fixativet enligt tillverkarens instruktioner och frys vid -20 °C i 25 ml alikvoter tills de används. - Approximera provets vikt och tina tillräckligt med 0,1% Dithiothreitol (DTT) för steg 2.2 och föra det till 37 °C. (Alikvoter av DTT bör förvaras vid -20 °C före användning.)
- Ta med tillräckligt med 0,5% N-acetyl- L-cystein (NAC) upp till 37 °C för steg 2,2. (NAC bör göras färskt varje vecka och förvaras vid 4 °C före användning.)
2. Sputum dissociation
- Väg sputumprovet för att bestämma volymerna av dissociationreagenser.
OBS: Ett prov anses vara litet om den ursprungliga vikten är ≤3 g, medium om >3 g men ≤8 g, stort om >8 men ≤16 g, och extra stort om ett prov väger >16 g. Indikationerna små, medelstora, stora och extra stora kommer att användas i hela protokollet. Den mängd reagenser som krävs för dissociation och märkning varierar beroende på sputumprovets storlek. - Överför ett litet prov till ett rent koniskt rör på 50 ml, ett medium prov till en ren engångsflaska av plast på 250 ml eller ett stort och extra stort prov till en ren engångsflaska av plast på 500 ml. Tillsätt 1 ml/g provvikt på 0,5 % NAC och 4 ml/g provvikt på 0,1 % DTT.
- Virvel vid maximal hastighet (i 15 s) och sedan vagga vid rumstemperatur (vid maximal hastighet) i 15 min.
- Späd ut provet med fyra volymer av Hanks balanserade saltlösning (HBSS) (baserat på den totala volymen prov + reagenser) för att neutralisera NAC och DTT; virvel snabbt vid maximal hastighet och sten vid rumstemperatur i 5 min vid maximal hastighet.
- Filtrera cellupphängningen genom 100 μm nylonnätcellsil i ett eller flera 50 ml koniska centrifugrör för att skapa en encellsfjädring.
- Centrifugera cellerna vid 800 x g i 10 min vid 4 °C. Aspirera supernatanten, kombinera alla pellets i ett koniskt rör på 15 ml och tvätta sedan pelletsen med HBSS med samma förutsättningar.
- Återutnyttja cellpelleten i en buffertvolym som bestäms av sputumprovets ursprungliga vikt.
OBS: Ett litet prov återanvänds i 250 μL HBSS. Ett mediumprov återanvänds i 760 μL HBSS. Stora och extra stora prover återanvänds i 1460 μL HBSS. - Ta en alikvot av cellupphängningen för ett levande/ dött cellantal med Trypan Blue.
OBS: För ett litet prov, använd 5 μL. För ett medium, stort eller extra stort prov, använd 10 μL. Späd 1:10 med HBSS.- Blanda 10 μL av sputumutspädningen med 30 μL trypanblå för att uppnå en slutlig provutspädning på 1:40. Ladda i räkningskamrarna i en hemocytometer för ett cellantal.
OBS: Det kan vara nödvändigt att justera den slutliga utspädningen om cellnumren är för låga eller för höga för att uppnå ett korrekt antal. Samråd med Guiot et al.20 för korrekt särskiljande sputumceller från SECs och skräp rekommenderas starkt här. Detta är viktigt för ett korrekt antal celler.
- Blanda 10 μL av sputumutspädningen med 30 μL trypanblå för att uppnå en slutlig provutspädning på 1:40. Ladda i räkningskamrarna i en hemocytometer för ett cellantal.
- Från det extra stora provet tar du bort 50 x 106 celler från totalen och lägger till ett nytt rör med tillräckligt med tillsatt HBSS för att skapa en total volym på 1700 μL.
Obs: Betrakta detta som ett stort exempel för resten av protokollet. Överblivna prover kan kasseras eller användas för andra ändamål.
3. Färgfärgning av antikropp och livskraft
- Val av antikropp och färgning av färgämne
OBS: Tabell 1 visar de antikroppar och livskraftsfärgämnen som används i detta protokoll och de cellpopulationer de identifierar.- Märk rören som innehåller sputumcellerna (se tabell 2 för etiketter).
- Använd 5 ml-flödescytometrirör (kompatibla med den flödescytometer som används) för provröret med de oförstådda cellerna och röret med isotypkontrollen. Använd koniska rör på 15 ml för blod- och epitelrörsprover.
OBS: Dessa prover kommer att överföras till flödescytometrirör efter antikroppsfärgning och fixering.
- Märk kompensationsrören (tabell 3).
OBS: Använd 5 ml flöde cytometri rör som är kompatibla med det flöde cytometer som används. - Tillsätt mängden HBSS, antikropp och/eller färgämne till vart och ett av sputumcellsrören och kompensationsrören enligt tabell 2 respektive tabell 3.
OBS: Tillsätt buffert (HBBS), antikroppar och färga till alla rör innan du lägger till celler eller kompensationspärlor för att säkerställa att alla rörens färgningstid är konsekvent. - Lägg till de mängder sputumcellvolym som anges i tabell 2 i analysrören.
- Lägg till kompensationspärlor till kompensationsrören enligt tabell 3.
- Inkubera alla rör (analys- och kompensationsrör) på is, skyddade mot ljus, i 35 minuter. Fyll sedan rören med iskall HBSS och centrifugera vid 4 °C i 10 min vid 800 x g.
- För kompensationsrören, aspirera supernatanten så nära pelletsen som möjligt och snärta pelletsen för att lossa.
- Tillsätt 0,5 ml kall HBSS i kompensationsrören, förvara dem på isen vid 4 °C och skydda dem mot ljus tills det behövs för flödescytometrianalys.
- Aspirera supernatanten från de oförstörda isotyp-, blod- och epitelrören efter centrifugering (steg 3.6 från antikroppsfärgningssektionen) och lossa pelletsen genom att snärta rören.
4. Fixering med 1% paraformaldehyd (PFA)
- Tillsätt kalla 1% PFA (som bör tinas vid det här laget) till de oförstätliga, isotyp,blod och epiteliella rör; 2 ml till de ouppfyllda rören och isotyprören och 10 ml till blodet och epitelrören.
- Inkubera rören på is, skyddade mot ljus i 1 h. Virvel snabbt vid maxhastighet efter 30 min.
- Fyll rören med iskall HBSS. Centrifugrör vid 4 °C i 10 min vid 1600 x g.
- Aspirera så mycket supernatant som möjligt utan att störa cellpelleten och snärta röret med fingrarna för att lossa cellerna.
- Tillsätt 200 μL kall HBSS till de ouppnåeliga rören och isotyprören.
- Beräkna volymen hbss för återupplivning av blod och epitelrör enligt det totala antalet celler.
OBS: Resuspension volym = 0,15 x [totalt antal celler (steg 8 i sputumdissociation) / 106]. Använd 50 x 106 som cellantal för ett extra stort prov. - Förvara alla prov- och kompensationsrör, skyddade mot ljus på isen vid 4 °C tills flödescytometrianalys utförs.
OBS: Detta protokoll har inte testats för lagring i mer än 24 timmar.
5. Datainsamling på flödescytometern
- Tillämpa lämpliga startprocedurer för den flödescytometer som används.
OBS: Detta avsnitt av protokollet förutsätter att den person som använder flödescytometern är utbildad i användningen av det instrument som är tillgängligt för dem, särskilt när det gäller dagliga förfaranden, inklusive kontroll av stabiliteten hos optik- och fluidiksystemen, tekniker för standardisering av ljusspridning och fluorescensintensitet samt beräkning och tillämpning av rätt kompensationsmatris. - Använd blandningen av National Institute of Standards and Technology (NIST) pärlor för att säkerställa att framåt spridning och sidospridning spänningar är inställda för att placera NIST pärlor för att spänna över hela tomten utan att placera pärlor för nära axlarna.
OBS: Detta steg är avgörande för att säkerställa att skräp mindre än 5 μm kan elimineras genom gating efter förvärvet analys. Beroende på vilken flödescytometer som används, tänk på att de minsta pärlorna inte utesluts med tröskelvärdet (när du använder LSR II eller Lyric) eller med hög diskriminering (med hjälp av Navios EX-flödescytometer). För Navios EX användes en vinst på 2 för fram- och sidospridning, en spänning på 236 för framåtspridning och 250 för sidospridning. För LSR II användes en främre spridningsspänning på 165 och en sidospridningsspänning på 190. - Ställ in flödeshastigheten på medium (LSR II) eller hög (Navios EX).
OBS: Det medelstora eller höga flödet för de flesta instrument kan användas för att förvärva sputumrören. Det är viktigt att notera att användning av för långsamt flöde eller för utspädd av provet kan leda till att cellerna sätter sig, vilket resulterar i ökad virvel vilket inte önskas. Därför bör det leda till cellulär densitet som kan förvärvas snabbt men inte täppa till maskinen om du följer den beräknade resuspensionsvolymen i steg 4.6. - Justera spänningarna för varje parameter som används för spridnings- och fluorescerande parametrar för att placera cellpopulationerna på skalan. Använd siffrorna med gatingstrategin som vägledning om hur du justerar spänningarna i enlighet därmed.
Observera: Kontrollera att alla parametrar som behövs är markerade i parametervalsfönstret före förvärvet eller att data inte kommer att förvärvas. - Skaffa data för det oförstätliga sputumprovet först, följt av det isotypfärgade provet, och sedan blodröret och epitelröret.
OBS: Om cellupphängningen är för koncentrerad för att flödescytometern ska kunna köra proverna utan igensättning, kan proverna spädas ut ytterligare med HBSS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll utvecklades med en klinisk laboratorium inställning i åtanke. Fokus under utvecklingen av protokollet låg på enkelhet, effektivitet och reproducerbarhet. Det konstaterades att det mest tidskrävande steget i bearbetningen av sputum var att räkna cellerna. Därför är protokollet konfigurerat på ett sådant sätt att sputumbearbetning och cellmärkning kan utföras oberoende av cellräkning utan tidsförlust. Ett korrekt cellantal, som fortfarande är nödvändigt för att späda ut provet på lämpligt sätt för en fri körning, kan sedan erhållas under inkubationsperioden för antikroppsmärkning.
Detta protokoll använder ett sputumviktmått istället för ett cellantal som en indikation på hur mycket antikropp/färg som ska användas för optimal cellmärkning. Det finns dock en stor variation i sputumprovernas vikt. av de 126 prover som analyserades varierade vikten från 0,57 g till 38,30 g. Figur 1A visar att korrelationen mellan sputumvikt och cellutbyte inte är stark. Därför delades proverna in i fyra kategorier. Provernas medianvikter var 2,1 g för små prov, 5,0 g för medelstora prover, 11,2 g för stora prover och 22,0 g för extra stora prover (figur 1B). Det fanns dock fortfarande prover som gav mycket fler celler än förväntat baserat på deras vikt (figur 1C), majoriteten av proverna grupperade fint. För små prover var mediancellutbytet 8,0 x 106 celler, för medelstora prover 13,0 x 106, för stora prover 35,4 x 106 och extra stora prover 93,0 x 106.
Varje antikropp som användes i detta protokoll titrerades. En koncentration på platåfasen (figur 2A) med det högsta färgningsindexet (figur 2B) i titreringskurvan valdes som arbetskoncentration. Variationer i celltal kommer inte dramatiskt att ändra färgningsintensiteten. Denna antikroppstitrering och testning är nödvändig och bör installeras med försiktighet för varje ny antikropp eller färgämne som används i detta protokoll34,35. När en antikropp titreras med försiktighet ska den färga 10 till 50 gånger fler celler än antalet celler på vilka antikroppen titrerades34,35. Ett exempel på denna princip finns i tabell 4. Anti-human CD45-PE antikroppen titrerades på 1 x 106 celler i en total volym av 400 μL. Om denna antikropp mot färgningsvolymen extrapoleras till protokollet (se tabell 2, som visar CD45-PE-kvantitets- och färgningsvolymerna för varje provstorlek), för ett litet prov, kommer 0,625 x 106 celler att färgas, 1,25 x 106 celler färgas för ett mediumprov och 2,5 x 106 celler för ett stort prov (kolumn A i tabell 4). Ett 50-faldigt överskott i cellnummer för varje kategori beräknas vara 31,25 x 106, 62,5 x 106 respektive 125 x 106 celler (kolumn B). Som visas i kolumnerna C och D ligger mediancellnumret för varje storlekskategori och det största exemplet i varje kategori väl inom det 50-faldiga intervallet.
Trots de uppenbara skillnaderna i storlek och cellutbyte mellan de olika storlekarna på sputumproverna är medianprocenten SEC-förorening i varje kategori mycket lik. Figur 3A visar andelen sec som finns i enskilda prover, stratifierade efter deras sputumviktskategori. Det största bekymret var med SECs eftersom dessa celler inte är representativa för lungvävnad utan av munhålan. Den genomsnittliga SEC-föroreningen är dock mindre än 20% för alla kategorier. Figur 3B visar andelen livskraftiga celler som finns i dessa prover. Exklusive sec var den genomsnittliga lönsamheten cirka 72 % för kategorierna små, medelstora och stora urvalsstorlekar. Den var något högre (79%) för den extra stora kategorin.
Figur 4 visar en typisk gatingstrategi för att separera sputumcellerna av intresse från skräp, döda celler (som också inkluderar de kontaminerande SECs36) och cellklumpar. Figur 4A visar användningen av NIST-pärlor för att sätta grindar för att eliminera skräp mindre än 5 μm eller större än 30 μm, medan figur 4B applicerar denna port på sputumceller. Bild 4C visar en typisk sputumprofil när den ses som sidospridningsbredd (SSC-W) mot framåtriktad spridningsbredd (FSC-W), breddporten. Denna profil används för att eliminera små skräp som presenterar sig längs SSC-W och FSC-W axlar. Eliminering av döda celler visas i figurerna 4D och figur 4E. Den oförstätliga kontrollen (figur 4D) används för att bestämma brytet för FVS510-positivitet. celler som färgar positivt för FVS510 ovanför den negativa kontrollen anses vara döda och kommer inte att användas i sputumcellanalysen (figur 4E). Slutligen appliceras en singlet gate för att ta bort celldubbel från analysen, vilket visas i figur 4F. De celler som har tagit sig igenom urvalsportarna som visas i figurerna 4B, figur 4C, figur 4E och figur 4F representerar alltså levande, enstaka sputumceller som är redo för efterföljande analys med de antikroppar som används i detta protokoll.
Användningen av anti-CD45-antikroppen i detta märkningsprotokoll gör det möjligt att separera levande, enstaka sputumceller i ett blod (CD45+) cellfack och ett cellfack utan blod (CD45). Den senare kategorin omfattar epitelceller och andra icke-blodkroppar. Den översta profilen i figur 5A visar användningen av ett oförberömt sputumprov för att ställa in brytet för CD45-positivitet, vilket gör att portarna fångas CD45+ celler och CD45-celler. Den nedre profilen för figur 5A visar båda dessa portar applicerade på ett sputumprov färgat med anti-CD45-antikroppen. Färgning med ytterligare antikroppar används sedan för att identifiera blodcellsspecifika populationer inom CD45+ porten (figur 5B) och andra icke-blodcellspopulationer, inklusive epitelpopulationer i CD45- gate (figur 5C). I båda siffrorna visar de översta profilerna hur isotypfärgat sputum används för att ställa in de dubbla negativa populationerna, medan bottenprofilerna visar de antikroppsfärgade sputumcellerna. Figur 5B (nederkant) visar sex olika CD45+ cellpopulationer som skapats med cocktail av antikroppar som kan detekteras i fluorescenskanalen (FL) 1 (anti-CD66b, CD3, CD19-antikroppar) och anti-CD206 som kan detekteras i FL3-kanalen. Sorteringsexperiment har visat att lungspecifika makrofager finns i de portar som identifierats med M. Förekomsten av celler i dessa portar indikerar således att sputumprovet härleddes från lungan och inte var saliv (Bederka et al., manuskript som förberedelse). Figur 5C (nederkant) visar de gatingkvadranter som skapats med anti-pan-cytokeratin (panCK) detekterbar i FL1-kanalen och antiepitetelcells vidhäftningsmolekylen (EpCAM) som kan detekteras i FL3-kanalen bland CD45- sputumcellerna.
Detta märkningsprotokoll har testats utförligt på Navios EX och LSR II. Några preliminära experiment utfördes på Lyrisk dikt, men utan den omfattande instrumentoptimeringen som gjordes för de andra två maskinerna. Därför tillhandahålls detaljerade instrumentinställningar för Navios EX och LSR II i materialbladet, men inte för texten. För att förstå likheter och variationer mellan dessa tre flödescytometriska plattformar som kan användas för att analysera sputumceller kan profiler som erhållits från de olika maskinerna jämföras i figur 6 och figur 7. Två stora sputum prover bearbetades, poolades, märkts, separerades i tre lika delar och därefter förvärvas på varje flöde cytometer som nämns ovan. Figur 6, som liknar figur 4, jämför gatingstrategin för att eliminera skräp, döda celler och cellklumpar. Figur 7, som är identisk med figur 5, jämför blod- och icke-blodprofilerna från de data som erhållits på de olika flödescytometrarna.
Att jämföra de olika profilerna från de tre olika flödescytometrarna visar att samma grundläggande profiler kan observeras med varje instrument. Skillnaderna att vara uppmärksam på är SSC-W/FSC-W (breddport) (figur 6, andra raden) och de linjära skalorna för spridningsområdena (figurerna 6 och 7). Spridningsbreddsdiagrammet som genereras på Navios EX visar en inkluderingsport (röd låda), vilket innebär att alla celler som ingår i porten analyseras ytterligare. händelserna längs axlarna i det vänstra nedre hörnet är uteslutna. Spridningsbredden ritar på LSR II, och Lyric visar inte en liknande insättning av händelser längs samma axlar. Denna diskrepans beror sannolikt på det mycket känsliga tröskelvärde som används på Navios EX, vilket leder till en del litet skräp i den tidigare storleksuteslutningsgrinden (översta raden i figur 6). Ibland ses skräp längs axlarna i spridningsbreddsprofilen som genereras på LSRII, men det är i det högra nedre hörnet. I dessa fall används en uteslutningsgrind (som indikeras av den streckade röda rutan i mittenprofilen i rad 2 i figur 6) för att eliminera dessa händelser från ytterligare analys.
Medan loggskalorna verkar något olika på tomterna mellan Navios EX och lyriska och LSR II-cytometrar, har Navios EX möjlighet att hämta data med fler årtionden. Genomförandet av fler årtionden beror på experimentets sammanhang och den önskade känsligheten för att visualisera de intressanta befolkningarna.
En annan anmärkningsvärd skillnad mellan Navios EX och LSR II och Lyric cytometers är utseendet på profilen på singlet gate. Navios EX-cytometern är utrustad med en rektangulär flödescell med en annan uppsamlingsvinkel än LSR II. Navios EX innehåller tre programvarustyrda insamlingsvinklar för att optimera ljusspridningen framåt vinkel för att uppnå den känslighet som är lämplig för partikelstorlek att analysera. Polygonporten för Navios EX-cytometern måste justeras till en något lägre vinkel än singletporten för LSRII. Singletporten för Lyric kan optimeras för att få en profil som liknar den som ses med LSR II. Med hjälp av sputum-exemplet måste områdesskalningsfaktorn optimeras för varje laser på texten för att uppnå en singlet-grind som liknar LSR II.
Alla profiler som visas i figur 4 till figur 7 analyserades med FlowJo-programvaran, version 10.6. FCS-filerna finns i FlowRepository (https://flowrepository.org), under IDS FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ och FR-FCM-Z3MM och kan användas för att öva sputumanalysen som illustreras i dessa siffror.
Bild 1: Sputumvikter och cellutbyte. (A) Avbildat är förhållandet mellan sputumvikt, bestämd före bearbetning, och det totala cellutbytet, fastställt efter bearbetning med hjälp av en hemocytometer. Varje punkt representerar ett enskilt prov, totalt 126. B) Sputumproverna har stratifierats i fyra kategorier baserat på deras vikt: små för prover som väger upp till 3 g, medium för prover som väger mer än 3 g upp till 8 g, stora för prover som väger mer än 8 g upp till 16 g och extra stora prover för dem som väger mer än 16 g. (C) Visas är fördelningen av cellutbytet för proverna i varje kategori. De röda staplarna i (B) och C representerar medianvärdena i varje kategori. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Antikroppstitrering för anti-human CD45-PE. A) CD45-PE-titreringskurvan (IgG1) med den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) för den positiva populationen plottad jämfört med koncentrationen av CD45-PE-antikroppsplatåerna vid 1 μg/ml. (B) Titreringskurvan som visar färgningsindexet jämfört med antikroppskoncentrationen visar att det högsta färgningsindexet ligger på 1 μg/ml. Färgning index beräknades som: [CD45 MFI positiv befolkning - CD45 MFI negativ population] / [2 * Standard avvikelse]. Baserat på figur 2A och figur 2B valdes 1 μg/ml som den optimala koncentrationen för CD45-PE-antikroppen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Andelen SEC och döda celler i sputumprover är konsekvent bland de fyra viktkategorierna. A) Andelen SEC i sputumprover klassificeras efter deras viktkategori. Den procentuella SEC-föroreningen fastställdes av hemocytometer som en del av det totala antalet celler. B) Cellviabilitet för sputumprover med undantag av SECS, som bestäms av hemocytometern och trypan blå uteslutningsmetoden. För varje diagram representerar de röda linjerna medianvärdena. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: Gating-strategi för att utesluta skräp, döda celler och dubbletter i ett sputumprov. A) NIST-pärlor i storlekarna 5 μm, 20 μm och 30 μm användes för att ställa in den grind som anges av den röda lådan för att utesluta skräp mindre än 5 μm och större skräp över 30 μm och nära axeln. B) Ett sputumprov införskaffades med samma spänning för fram- och sidospridningen som nistpärlornas. Porten som skapades i (A) tillämpades för att utesluta skräp. C) Små skräp nära axeln uteslöts i denna spridningsbredd. D) Ett osainedt sputumprov användes för att ställa in avskärningen (röd linje) för den negativa, oförstuderade populationen för livskraftsfärgämnet. (E) Den bryt som skapades i D applicerades på det färgade sputumprovet för att bilda en grind (röd låda) för att inkludera levande, livskraftiga celler. F) Den singletport som indikeras av den röda polygonen utesluter celler som inte faller på diagonalen, vilket eliminerar dubbningar och/eller klumpar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Sputumcellers gatingstrategi i blod och icke-blodkroppar. (A) Ostained sputumceller som härrör från singletporten används för att ställa in cut-off (röd linje) på den negativa populationen för CD45 (överst). Brytpunkten från den översta profilen appliceras på det färgade sputumprovet (botten) för att skilja CD45-positiva (CD45+) och negativa populationer (CD45-). (B) CD45+ sputumceller färgade med isotypantikroppar för FITC/AF488 används för att ställa in portarna på den negativa populationen (överst). Samma portar appliceras på CD45+ sputumceller färgade med blodcellsmarkörer CD3, CD19, CD66b och CD206 (botten). C) Kvadrantportar placeras på CD45- sputumcellerna färgade med isotypkontroller (överst) och appliceras på CD45- cellerna från sputumprovet färgade med epitelmarkörerna pancyt cytokeratin (panCK) och EpCAM (botten). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Gating-strategi för att utesluta skräp, klumpar och döda celler i färgade sputumceller på tre flödescytometriska plattformar. Två stora sputumprover bearbetades, poolades, märktes och delades in i tre lika stora portioner för förvärv på Navios EX (A), LSR II (B) och Lyriska (C) flöde cytometrar. Översta raden: Sputumprover var gated (röd låda) för att utesluta mycket små och stora skräp. Andra raden: Den stora röda rutan i Navios EX-tomten representerar en inkluderingsport som innehåller cellerna men utesluter skräp. Den streckade lilla röda lådan som ses i LSR II-tomten representerar en uteslutningsgrind för att eliminera skräp från ytterligare analys. Ytterligare optimering med texten behövs för att avgöra var skräputeslutning behövs. Därför finns det ingen port i den tomten. Tredje raden: röda rektangulära grindar inkluderar levande celler för vidare analys. Nedre raden: polygonporten har enstaka celler genom att utesluta dubbletter som faller utanför portens diagonal. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Gatingstrategi för sputum färgat för blod och epitelmarkörer på tre flödescytometriska plattformar. Analysen i figur 6 fortsätter i figur 7. alla livskraftiga, enstaka celler (nedre raden, figur 6) delades in i CD45 + och CD45- populationer (första raden, figur 7), så att blodcellsspecifika markörer och epitelial cellspecifika markörer ytterligare kunde avgränsa dessa populationer. Andra raden: profil av blodcellsmarkörer CD3/CD19/CD66b och CD206 från CD45+ celler. Tredje raden: epitelcellmarkörer panCK och EpCAM från CD45- celler. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Antikropp/fläck | Avsikt |
| FVS510 | Livskraft fläck |
| Anti-human CD45 – PE | Pan-leukocytmarkör; PE-kompensation |
| Anti-human CD66b – FITC | Granulocytmarkör |
| Anti-mänsklig CD3 – Alexa488 | T-cellmarkör |
| Anti-mänsklig CD19 – Alexa488 | B-cellmarkör; FITC/Alexa488 ersättning |
| Anti-mänsklig CD206 – PE-CF594 | Lung makrofag markör; PE-CF594 ersättning |
| Anti-human EpCAM – PE-CF594 | Epitelcellmarkör; PE-CF594 ersättning |
| Anti-human pan-cytokeratin (panCK) – Alexa488 | Epitelcellmarkör |
| IgG1κ – Alexa488 | ISOTYPKONTROLL CD3/CD19/panCK |
| IgG1κ – FITC | CD66b isotypkontroll |
| IgG1κ – PE-CF594 | ISOtypkontroll CD206/EpCAM |
| Anti-human CD45 – BV510 | FVS510 ersättning |
Tabell 1: Använda antikroppar och livskraftsfläckar. Förteckning över antikroppar och livskraftsfärg som används i detta protokoll. Anges är de cellulära delmängder som de var och en identifierar.
| Rör (Etikett) | Provstorlek* | HBSS (μL) | FVS510 (μL) | CD45 (μL) | Andra antikroppar (μL) | Celler § (μL) | |||
| Oförstörd | liten | 80 | 20 | ||||||
| Medium | 50 | 50 | |||||||
| stor | 50 | 50 | |||||||
| IgG1κ - Alexa488 | IgG1κ- FITC | IgG1κ - PE-CF594 | |||||||
| Isotypkontroll | liten | 60.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 20 | |
| Medium | 30.65 | 0.6 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| stor | 30.25 | 1 | 10 | 2 | 6 | 0.75 | 50 | ||
| CD206 | CD3 | CD19 | CD66b | ||||||
| Blod | liten | 92.875 | 1.5 | 25 | 1.875 | 5 | 1.25 | 7.5 | 115 |
| Medium | 65.75 | 3 | 50 | 3.75 | 10 | 2.5 | 15 | 350 | |
| stor | 102.5 | 10 | 100 | 7.5 | 20 | 5 | 30 | 725 | |
| EpCAM | PanCK | ||||||||
| Epitelceller | liten | 96.5 | 1.5 | 25 | 10 | 2 | 115 | ||
| Medium | 73 | 3 | 50 | 20 | 4 | 350 | |||
| stor | 117 | 10 | 100 | 40 | 8 | 725 | |||
| * Prover anses vara små, medelstora eller stora baserat på vikt som bestäms i steg 1 i sputumdissociationsavsnittet i protokollet. | |||||||||
| § Celler bör tillsättas efter det att alla reagenser har distribuerats, även i kompensationsrören (tabell 3). | |||||||||
Tabell 2: Innehåll i rör med sputumceller. Använd den här tabellen enligt protokollet för att lägga till de angivna volymerna antikroppar och livskraftsfläckar för lämplig provstorlek.
| Rör (Etikett) | Reagenser tillsatta (μL) | Reagenser tillsatta (släpp) | ||||||
| HBSS | CD45-PE | CD206-PE-CF594 | Epcam-PE-CF594 | CD19-Alexa488 | CD45-BV510 | CompBead (+) | CompBead * (-) | |
| PE-komp. | 76 | 4 | x | x | x | x | 1 | 1 |
| PE-CF594 comp. | 72 | x | 4 | 4 | x | x | 1 | 1 |
| Alexa488/FITC-komp. | 60 | x | x | x | 20 | x | 1 | 1 |
| BV510 comp. | 60 | x | x | x | x | 20 | 1 | 1 |
| * De positiva (+) och negativa (-) pärlorna ska tillsättas efter att alla reagenser har distribuerats och rören i tabell 2 har beretts. | ||||||||
| comp. = kompensation | ||||||||
Tabell 3: Innehållet i kompensationsrören. Använd den här tabellen som den refereras i protokollet för att lägga till de angivna volymerna av antikroppar till kompensationspärlorna.
| Cellnummer (x 106) | ||||
| A | B | C | D | |
| Provstorlek | I färgning volym * | 50-faldig åtkomst ¶ | Medianprov (vikåtkomst) # | Största exemplet (vikåtkomst) # |
| Liten | 0.625 | 31.25 | 8.0 (12.8) | 24.77 (39.6) |
| Medium | 1.25 | 62.5 | 13.0 (10.4) | 48.87 (39.1) |
| Stor | 2.5 | 125 | 35.4 (14.2) | 113.5 (45.4) |
| * Färgningsvolymer som används i protokollet (tabell 2). Cellnumret extrapoleras från hur titreringskurvan utfördes. 1 μg/ml CD45-PE och 1 x 106 celler per 200 μL. | ||||
| ¶ 50-faldig åtkomst till cellnummer i kolumn A. | ||||
| # vikåtkomst i kolumnerna C och D beräknas genom att dividera talet som visas i cellerna i kolumnerna C eller D med talet i motsvarande cell i kolumn A. | ||||
Tabell 4: Anti-human CD45-PE-koncentration för alla prover i varje provstorlekskategori.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det cellulära innehållet i sputum innehåller ett stort antal omfattande celler, ofta åtföljda av mycket skräp37. Dessutom kräver sputumanalys en kvalitetskontroll som bekräftar att provet samlas in från lungan istället för munhålan38. Därför är det inte lika enkelt att analysera sputum efter flödescytometri som det är för blod, till exempel, vilket frigör en mycket renare och homogen cellupphängning. Detta protokoll har tagit itu med alla dessa problem: tillhandahålla instrumentinställningar med hjälp av specifika storlek pärlor för att säkerställa att både de minsta och största cellpopulationerna kan upptäckas, en gating strategi för att eliminera skräp, cellklumpar, förorenande SECs och andra döda celler, och slutligen, en kvalitetskontroll åtgärd för att säkerställa att ett sputumprov kommer från lungan istället för att vara mestadels saliv.
Det finns kritiska steg i protokollet i arbetet med sputum som är värt att påpeka. För det första kan cellutbytet påverkas drastiskt av antalet nyloncellsiler som används i steg 2,5 i sputumdissociationsdelen av protokollet. Flera silar kan behövas för att undvika att förlora för många celler på grund av igensättning av silen. När flödet genom silarna har saktat ner märkbart bör en ny sil användas. För det andra kan cellpelleten av sputumprover vara mycket lös, särskilt om det finns hög förorening av SEC. Därför är det viktigt att inte aspirera för nära pelleten när du tar bort supernatanten efter centrifugering av proverna. Inandning för nära pelleten kan leda till cellförlust, om inte förlust av hela pelleten. För det tredje kräver detta protokoll ett fixeringssteg. Detta bevarar cellerna och deras färgningsprofil och fungerar som en säkerhetsåtgärd för att skydda flödescytometeroperatören. Löpprover på vissa flödescytometrar kan innebära ökade biologiska faror på grund av potentialen för aerosolproduktion39. PFA-fixeringen hjälper till att skydda operatören från potentiella patogener i sputumprovet. För det fjärde, och kanske den mest utmanande aspekten av att förbereda sputumprover för flödescytometrisk analys, är cellräkning. Cellräkning är komplicerat på grund av den stora variationen av celltyper som finns i sputum. Räknemaskiner begränsas ofta av det cellstorleksområde de kan fånga upp och är därför mindre tillförlitliga än en hemocytometer. Cellräkning av sputumprover med hemocytometer, som beskrivs utmärkt av Guiot et al.20, är dock tråkigt och kräver övning för att bli skicklig. Ett korrekt cellnummer är avgörande för att bestämma provets slutliga resuspensionsvolym för att möjliggöra en rimlig flödeshastighet och förhindra träskor i flödescytometern. Närvaron av de mycket stora SECs i sputum och de många mindre cellklumparna som inte bryts upp av dissociationsbufferten eller fångas av filtren ökar sannolikheten för igensättning av flödescytometern. Därför rekommenderas att spendera lite tid på att bestämma den bästa cellkoncentrationen/flödeshastigheten för datainsamling med hjälp av den tillgängliga flödescytometern. Se dessutom till att flödescytometern har lämplig flödescell och munstyckesstorlek (eller sond) som kan mäta de större cellpopulationerna i sputum.
Även när kunskaper i cellräkning har uppnåtts är det fortfarande en tidskrävande process. Därför baseras reagensernas bestämning för cellmärkning i detta protokoll på provstorleken (enligt vikt) snarare än cellnummer. Detta möjliggör en effektivare tidsanvändning eftersom det manuella cellantalet kan slutföras under den tid som krävs för färgfärgning av antikroppen och livskraften. Det finns dock tre anmärkningsvärda undantag från detta. Om ett prov är >16 g (de så kallade extra stora proverna) bör det manuella cellantalet ske före färgning så att dyra reagenser kan bevaras genom att endast färga 25 x 106 celler vardera för blodet och epitelrören. Det här cellnumret ger mycket tillförlitliga profiler i de inställningar som beskrivs i det här protokollet. Ett annat potentiellt undantag är ett mycket litet urval. Uppskattningen är att minst 1-2 x 106 celler behövs för flödescytometrianalysen som presenteras i detta protokoll för att generera tillförlitliga profiler (data visas inte). Därför, om ett prov innehåller färre än 1-2 x 106 celler, kanske det inte är värt att fortsätta med proceduren eftersom slutresultatet sannolikt kommer att vara oacceptabelt.
Specifika märkningsreagenser som fungerar bra på perifera blodkroppar eller cellinjer kan fungera mycket annorlunda på blodkroppar som finns i sputum (opublicerade observationer). Därför rekommenderas att titrera varje antikropp eller andra märkningsreagenser enligt väletablerade protokoll34,35 innan de används i flödescytometriexperiment. De flesta antikroppstitreringar bör ge jämförbara resultat vid färgning upp till 10 till 50 gånger; Det rekommenderas dock att göra ytterligare titreringar med celltal som är högre än det intervallet34. När en reagenskoncentration har fastställts är det viktigt att hålla inkubationstiden för reagensen densamma som i det faktiska experimentet. Därför betonar protokollet att lägga till alla buffert- och reagenser i rören innan cellerna eller kompensationspärlorna läggs till. Denna ordning att lägga till reagenser och celler / pärlor tillsammans möjliggör högre konsistens i märkningstider. Om den experimentella inkubationstiden av någon anledning inte kan hållas liknande den som används för antikropps-/färgtitrering, bör den senare upprepas med en inkubationstid som är möjlig under experiment.
Sputumprover har använts i stor utsträckning som ett diagnostiskt prov för att studera patofysiologi av olika sjukdomar som påverkar lungan. Tuberkulos40,41, KOL13,42, astma43, cystisk fibros44,45, lungcancer46,47,48 och reumatoid artrit49 är bland de många sjukdomar där sputum har studerats på grund av fördelen att det är ett icke-invasivt erfaret prov. På senare tid, under coronapandemin, har sputum använts för att upptäcka långvarig virusutgjutning hos patienter som lagts in på sjukhus med coronavirussjukdom 2019 (COVID-19)50.
Olika tekniker, inklusive omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR), proteinanalys, mikroskopi och flödescytometri, har använts för att identifiera sjukdomsspecifika markörer i sputum. Att använda en flödescytometrisk plattform för att analysera sputumprover används inte i stor utsträckning, men dess användning ökar. Med de senaste framstegen inom tekniken för flödescytometrar3,51,52, liksom framsteg inom kemierna för fluoroforer, generering av nya antikroppskloner och utveckling av olika färgämnen för att identifiera döda cellpopulationer51,53,54, har möjligheten att utforma antikroppspaneler som syftar till att diagnostisera mänskliga sjukdomar ökat dramatiskt. Dessutom kommer den senaste pushen för att automatisera analysen av flödescytometriska data55,56 att eliminera den potentiella partiskheten vid manuell läsning och tolkning av flödesdata. Dessa nya utvecklingar inom flöde cytometri kommer avsevärt att underlätta utforskning av sputum som en klinisk diagnostik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare är tidigare eller nuvarande anställda på bioAffinity Technologies.
Acknowledgments
Vi vill tacka David Rodriguez för hans hjälp med figurförberedelserna. Sputumprover kördes på BD LSR II vid UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, med stöd av UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) och UL1 TR001120 (CTSA-bidrag).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Paraformaldehyde Flow-Fix | Polysciences | 25037 | |
| 100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
| 50 mL conical falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Alexa488 anti-human CD19 | BioLegend | 302219 | |
| Alexa488 anti-human CD3 | BioLegend | 300415 | |
| Alexa488 anti-human cytokeratin | BioLegend | 628608 | |
| Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype | BioLegend | 400129 | |
| BV510 anti-human CD45 | BioLegend | 304036 | |
| CD66b FITC isotype | BD Biosciences | 555748 | |
| CompBead Plus Compensation Beads | BD Biosciences | 560497 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
| Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
| CS&T beads | BD Biosciences | 655051 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| FITC anti-human CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 564406 | |
| FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
| FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| NAC | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NIST Beads, 05 μM | Polysciences | 64080 | |
| NIST Beads, 20 μM | Polysciences | 64160 | |
| NIST Beads, 30 μM | Polysciences | 64170 | |
| PE anti-human CD45 | BioLegend | 304039 | |
| PE-CF594 anti-human EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
| PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype | BD Biosciences | 562292 | |
| PE-CR594 anti-human CD206 | BD Biosciences | 564063 | |
| Sodium citrate dihydrate | EMD | SX0445-1 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 |
References
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews. Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), San Diego, Calif. 251-258 (2012).
- Robinson, J. P., Roederer, M. History of science. Flow cytometry strikes gold. Science. 350 (6262), New York, N.Y. 739-740 (2015).
- Orfao, A., et al. Immunophenotypic dissection of normal hematopoiesis. Journal of Immunological Methods. 475, 112684 (2019).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Bento, L. C., et al. The use of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: A review. Frontiers in Oncology. 7, 270 (2017).
- Della Porta, M. G., Picone, C. Diagnostic utility of flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases. 9 (1), 2017017 (2017).
- Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2), Pt 1 475-478 (2000).
- Spanevello, A., et al. Induced sputum cellularity. Reference values and distribution in normal volunteers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 162 (3), Pt 1 1172-1174 (2000).
- Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
- Hastie, A. T., et al. Mixed sputum granulocyte longitudinal impact on lung function in the severe asthma research program. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (7), 882-892 (2021).
- Hastie, A. T., et al. Association of sputum and blood eosinophil concentrations with clinical measures of COPD severity: an analysis of the SPIROMICS cohort. The Lancet. Respiratory Medicine. 5 (12), 956-967 (2017).
- Kim, J., et al. Innate immune crosstalk in asthmatic airways: Innate lymphoid cells coordinate polarization of lung macrophages. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (5), 1769-1782 (2019).
- Bai, Y., Zhou, Q., Fang, Q., Song, L., Chen, K. Inflammatory cytokines and T-Lymphocyte subsets in serum and sputum in patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 25, 2206-2210 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-Carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Hristara-Papadopoulou, A., Tsanakas, J., Diomou, G., Papadopoulou, O. Current devices of respiratory physiotherapy. Hippokratia. 12 (4), 211-220 (2008).
- Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and biochemical analysis of induced sputum from asthmatic and from healthy subjects. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
- Alexis, N., Soukup, J., Ghio, A., Becker, S. Sputum phagocytes from healthy individuals are functional and activated: a flow cytometric comparison with cells in bronchoalveolar lavage and peripheral blood. Clinical Immunology. 97 (1), 21-32 (2000).
- Guiot, J., et al. Methodology for sputum induction and laboratory processing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56612 (2017).
- Paggiaro, P. L., et al. Sputum induction. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 3-8 (2002).
- Anjuman, N., Li, N., Guarnera, M., Stass, S. A., Jiang, F. Evaluation of lung flute in sputum samples for molecular analysis of lung cancer. Clinical and Translational Medicine. 2, 15 (2013).
- Sethi, S., Yin, J., Anderson, P. K. Lung flute improves symptoms and health status in COPD with chronic bronchitis: A 26 week randomized controlled trial. Clinical and Translational Medicine. 3, 29 (2014).
- Su, J., et al. Analysis of lung flute-collected sputum for lung cancer diagnosis. Biomarker Insights. 10, 55-61 (2015).
- Naraparaju, S., Vaishali, K., Venkatesan, P., Acharya, V. A comparison of the Acapella and a threshold inspiratory muscle trainer for sputum clearance in bronchiectasis-A pilot study. Physiotherapy Theory and Practice. 26 (6), 353-357 (2010).
- Hinson, K. F., Kuper, S. W. The diagnosis of lung cancer by examination of sputum. Thorax. 18, 350-353 (1963).
- Johnston, W. W., Bossen, E. H. Ten years of respiratory cytopathology at Duke University Medical Center. I. The cytopathologic diagnosis of lung cancer during the years 1970 to 1974, noting the significance of specimen number and type. Acta Cytologica. 25 (2), 103-107 (1981).
- Ng, A. B., Horak, G. C. Factors significant in the diagnostic accuracy of lung cytology in bronchial washing and sputum samples. II. Sputum samples. Acta Cytologica. 27 (4), 397-402 (1983).
- Smiths Medical Videos. , Available from: https://videos.smiths-medical.com/search?q=acapella&page=1 (2021).
- Pizzichini, E., et al. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154 (2), 308-317 (1996).
- Miller, H. R., Phipps, P. H., Rossier, E. Reduction of nonspecific fluorescence in respiratory specimens by pretreatment with N-acetylcysteine. Journal of Clinical Microbiology. 24 (3), 470-471 (1986).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 4, Unit 4.1 (2001).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Kini, S. R. Color Atlas of Pulmonary Cytopathology. , Springer-Verlag New York, Inc. (2002).
- Papanicolaou Society of Cytopathology Task Force on Standards of Practice. Guidelines of the Papanicolaou Society of Cytopathology for the examination of cytologic specimens obtained from the respiratory tract. Diagnostic Cytopathology. 21 (1), 61-69 (1999).
- Holmes, K. L., et al. International Society for the Advancement of Cytometry cell sorter biosafety standards. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 85 (5), 434-453 (2014).
- Datta, S., Shah, L., Gilman, R. H., Evans, C. A. Comparison of sputum collection methods for tuberculosis diagnosis: a systematic review and pairwise and network meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (8), 760-771 (2017).
- Armstrong-Hough, M., et al. "Something so hard": a mixed-methods study of home sputum collection for tuberculosis contact investigation in Uganda. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease: The Official Journal of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. 22 (10), 1152-1159 (2018).
- Freeman, C. M., et al. Design of a multi-center immunophenotyping analysis of peripheral blood, sputum and bronchoalveolar lavage fluid in the Subpopulations and Intermediate Outcome Measures in COPD Study (SPIROMICS). Journal of Translational Medicine. 13, 19 (2015).
- Petsky, H. L., Li, A., Chang, A. B. Tailored interventions based on sputum eosinophils versus clinical symptoms for asthma in children and adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 8, 005603 (2017).
- Hisert, K. B., Liles, W. C., Manicone, A. M. A flow cytometric method for isolating cystic fibrosis airway macrophages from expectorated sputum. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (1), 42-50 (2019).
- Duncan, G. A., et al. Microstructural alterations of sputum in cystic fibrosis lung disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (18), 88198 (2016).
- Kemp, R. A., Reinders, D. M., Turic, B. Detection of lung cancer by automated sputum cytometry. Journal of Thoracic Oncology: Official Publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2 (11), 993-1000 (2007).
- Blandin Knight, S., et al. Progress and prospects of early detection in lung cancer. Open Biology. 7 (9), (2017).
- Gomperts, B. N., Spira, A., Elashoff, D. E., Dubinett, S. M. Lung cancer biomarkers: FISHing in the sputum for risk assessment and early detection. Cancer Prevention Research. 3 (4), Philadelphia, Pa. 420-423 (2010).
- Demoruelle, M. K., et al. Antibody responses to citrullinated and noncitrullinated antigens in the sputum of subjects with rheumatoid arthritis and subjects at risk for development of rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (4), Hoboken, N.J. 516-527 (2018).
- Wang, K., et al. Differences of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 shedding duration in sputum and nasopharyngeal swab specimens among adult inpatients with coronavirus disease 2019. Chest. 158 (5), 1876-1884 (2020).
- Chattopadhyay, P. K., Hogerkorp, C. -M., Roederer, M. A chromatic explosion: the development and future of multiparameter flow cytometry. Immunology. 125 (4), 441-449 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nature Immunology. 15 (2), 128-135 (2014).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit 9.34 (2010).
- Chattopadhyay, P. K., et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine. 12 (8), 972-977 (2006).
- Duetz, C., Bachas, C., Westers, T. M., Avan de Loosdrecht, A. A. Computational analysis of flow cytometry data in hematological malignancies: future clinical practice. Current Opinion in Oncology. 32 (2), 162-169 (2020).
- Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews. Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).
