Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Akış Sitometrisi ile Kalite Kontrollü Balgam Analizi

Published: August 9, 2021 doi: 10.3791/62785
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1bioAffinity Technologies, 2Department of Cell Systems & Anatomy, The University of Texas Health Science Center at San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna dağıtmak ve standart akış sitometrik platformlarındaki hücresel alt kümelerin daha sonra karakterizasyonu için etkili bir yöntemi açıklar.

Abstract

Akciğerin sağlığını anlamak için hücresel içeriği ve diğer mikroçevronmental özellikleri incelemek için yaygın olarak kullanılan balgam, geleneksel olarak sitoloji tabanlı metodolojiler kullanılarak analiz edilir. Slaytları okumak zaman alıcı olduğundan ve son derece uzmanlaşmış personel gerektirdiğinden, yardımcı programı sınırlıdır. Ayrıca, geniş döküntüler ve çok fazla skuamöz epitel hücresinin (SEC) veya yanak hücrelerinin varlığı, genellikle bir örneği tanı için yetersiz hale getirir. Buna karşılık, akış sitometrisi, hücresel popülasyonların yüksek verimli fenotiplemesine izin verirken aynı zamanda döküntüleri ve DC'leri hariç tutmaktadır.

Burada sunulan protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna, antikor lekesine ve hücresel popülasyonları düzeltmeye ve akış sitometrik platformunda örnekler almaya yönelik etkili bir yöntemi açıklar. Enkaz, ölü hücreler (SEC'ler dahil) ve hücre çiftlerinin hariç tutulmasını açıklayan bir gating stratejisi burada sunulmaktadır. Ayrıca, bu çalışma, hematopoetik ve epitel soy alt kümelerini karakterize etmek için bir farklılaşma kümesine (CD)45 pozitif ve negatif popülasyona dayanarak uygulanabilir, tek balgam hücrelerinin nasıl analiz edilip edilecektir. Akciğere özgü makrofajların akciğerden örnek elde edildiğinin ve tükürük olmadığının kanıtı olarak tanımlanmasıyla da bir kalite kontrol önlemi sağlanır. Son olarak, bu yöntemin üç akış sitometresinde analiz edilen aynı hastadan balgam profilleri sağlanarak farklı sitometrik platformlara uygulanabileceği gösterilmiştir; Navios EX, LSR II ve Lirik. Ayrıca, bu protokol ek hücresel ilgi işaretlerini içerecek şekilde değiştirilebilir. Bir akış sitometrik platformunda tüm balgam örneğini analiz etmek için bir yöntem burada sunulmaktadır, bu da balgamını akciğer hastalığının yüksek verimli tanısını geliştirmek için uygun hale getirir.

Introduction

Akış sitometrelerinin donanım ve yazılımındaki teknik gelişmeler, birçok farklı hücre popülasyonunun aynı anda tanımlanmasını mümkün kıldı1,2,3,4. Örneğin, hematopoetik hücre araştırmalarında akış sitometresinin kullanılması, bağışıklık sisteminin çok daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır2 ve hematopoetik sistemin hücresel hiyerarşisi5, ayrıca çok sayıda farklı kan kanserinin tanısal ayrımı6,7,8. Balgam hücrelerinin çoğu hematopoetik kökenli olmasına rağmen9,10,11, akış sitometrisi tanı amaçlı balgam analizine yaygın olarak uygulanmamıştır. Bununla birlikte, çeşitli çalışmalar balgamdaki bağışıklık hücresi popülasyonlarının değerlendirilmesinin (hücrelerin en önemli alt kümesi) astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) gibi hastalıkların teşhis ve / veya izlenmesinde büyük yardımcı olabileceğini göstermektedir 12,13,14,15. Ayrıca, akış sitometrisinde kullanılabilecek epitel spesifik belirteçlerin varlığı, balgam, akciğer epitel hücrelerindeki aşağıdaki en önemli hücre alt kümesinin sorgulanmasını sağlar.

Farklı doku kökenli birçok farklı hücre popülasyonunun analiz yeteneğine ek olarak, bir akış sitometresi çok sayıda hücreyi nispeten kısa bir sürede değerlendirebilir. Buna karşılık, slayt tabanlı, sitolojik analiz türleri genellikle son derece uzmanlaşmış personel ve / veya ekipman gerektirir. Bu analizler emek yoğun olabilir, bu da balgam örneğinin sadece bir kısmının analiz edilmesine neden olur16.

Üç kritik konu, akış sitometrisinde balgam kullanımının yaygın kullanımını sınırlar. İlk sayı balgam koleksiyonu ile ilgilidir. Balgam, mukusu akciğerlerden ağız boşluğuna dışarı atarak daha sonra bir toplama kabına tüküren bir huff öksürüğü ile toplanır. Mukus ağız boşluğundan geçtiği için SEC kontaminasyonu olasılığı yüksektir. Bu kontaminasyon numune analizini zorlaştırır, ancak sorun bu çalışmada gösterildiği gibi bir akış sitometrik platformunda kolayca düzeltilir.

Herkes kendiliğinden balgam üretemez; bu nedenle, balgam koleksiyonuna invaziv olmayan bir şekilde yardımcı olmak için çeşitli cihazlar geliştirilmiştir17. Nebülizör böyle bir cihazdır ve güvenilir balgam örnekleri ürettiği gösterilmiştir18,19,20. Nebülizör, balgamını invaziv olmayan bir şekilde toplamanın çok etkili bir yolu olmasına rağmen, kullanımı hala uzman personele sahip bir tıbbi tesiste bir ayar gerektirir21. Buna karşılık, akciğer flütü22,23,24 ve acapella16,25 gibi el cihazları çok kullanıcı dostu oldukları için evde kullanılabilir. Bu yardımcı cihazlar hem güvenli hem de uygun maliyetlidir.

Bizim için, acapella akciğer flütü16'dan sürekli olarak daha iyi sonuçlar verdi ve bu nedenle, acapella cihazı balgam koleksiyonları için seçildi. Balgam kullanmanın birincil amacı akciğer kanseri tespit testi geliştirmek olduğu için 3 günlük toplama örneğine karar verildi16. 3 günlük bir örneğin akciğer kanseri tespit olasılığını 1 veya 2 günlük bir örneğe kıyasla artırdığı gösterilmiştir26,27,28. Bununla birlikte, balgam toplamanın diğer yöntemleri farklı amaçlar için tercih edilebilir. Burada açıklanandan farklı bir balgam toplama yöntemi kullanılıyorsa, akış sitometrik analizi için kullanılan her antikor veya boyanın dikkatlice titratlanmasınız önerilir; farklı balgam toplama yöntemlerinin akış sitometrisi için hedeflenen proteinleri nasıl etkilediği hakkında çok az veri mevcuttur.

Öncelikle akış sitometrisi ile ilgili tanılama için balgam kullanma hevesini sönümleyen ikinci konu hücre numarasıdır. Sorun, güvenilir bir analiz için yeterli uygulanabilir hücrelerin toplanmasıdır. İki çalışma, invaziv olmayan yöntemlerle toplanan balgam örneklerinin, bir yardımcı cihaz yardımıyla, klinik tanı veya araştırma çalışmalarında kullanılabilecek yeterli uygulanabilir hücre içerdiğini göstermiştir16,24. Bununla birlikte, bu çalışmaların hiçbiri akış sitometrisi ile ilgili hücre sayıları sorununu ele almamıştır.

Bu protokolün temelini oluşturan çalışmalar için, her çalışma alanı için onaylanmış kurumsal kılavuzları izleyerek akciğer kanserine yakalanma riski yüksek katılımcılardan balgam örnekleri toplanarak alındı. Yüksek riskli katılımcılar 55-75 yaşları arasında, 30 paket yıl sigara içmiş ve son 15 yıl içinde sigarayı bırakmamış olarak tanımlanmıştır. Hastalara acapella cihazının üreticinin talimatlarına göre nasıl kullanılacağı gösterildi29 ve evde art arda üç gün boyunca balgam toplandı. Numune son koleksiyona kadar buzdolabında muhafaza edildi. Son toplama gününde, numune donmuş bir soğuk paketle bir gecede laboratuvara gönderildi. Numuneler alındıkları gün tek bir hücre süspansiyonuna işlendi. Bu balgam toplama yöntemi ile güvenilir bir akış sitometrik analizi için fazlasıyla uygulanabilir hücre elde edilir.

Son olarak ve önceki hücre sayısı sorunu ile ilgili olarak, balgam hücrelerinin mucinous ortamından nasıl serbest bırakılacağı sorusudur. Hücreler nasıl canlı tutulabilir ve akış sitometresini tıkamayan tek bir hücre süspansiyonu oluşturabilir? Pizzichini ve ark.30 ve Miller ve ark.31'in ilk çalışmalarına dayanarak, bu protokol balgam işleme için akış sitometrik analizi için uygun olan tek bir hücre süspansiyonuna kolay ve güvenilir bir yöntem açıklar. Bu yöntem, balgamdaki hematopoetik ve epitel hücrelerini tanımlamak ve bir akış sitometrik platformunda balgam analizini standartlaştıran cihaz ayarları, kalite kontrol önlemleri ve analiz kılavuzları sağlamak için verimli bir antikor etiketleme stratejisi geliştirmek için akış sitometrisinde iyi belirlenmiş kılavuzlar kullanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Balgam işlemenin tüm adımları, uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilir.

1. Balgam ayrışmaya başlamadan önce reaktif hazırlama

  1. %1 Paraformaldehit (PFA), buzda numune başına 25 mL çözün ve kullanıma kadar soğuk tutun.
    DİkKAT: PFA inhalasyon ve cilt teması ile toksiktir. Düzelticiyi üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve kullanıma kadar 25 mL aliquots içinde -20 °C'de dondurun.
  2. Numunenin ağırlığını yaklaşık olarak kavr ve 2.2. adım için yeterli miktarda% 0.1 Dithiothreitol (DTT) çözün ve 37 ° C'ye getirin. (DTT'nin aliquotları kullanılmadan önce -20 °C'de saklanmalıdır.)
  3. Adım 2.2 için 37 °C'ye kadar yeterli %0,5 N-asetil-L-sistein (NAC) getirin. (NAC haftalık taze hale getirilmeli ve kullanılmadan önce 4 °C'de saklanmalıdır.)

2. Balgam ayrışması

  1. Ayrışma reaktiflerinin hacimlerini belirlemek için balgam örneğini tartın.
    NOT: başlangıç ağırlığı ≤3 g ise küçük, >3 g ama ≤8 g ise orta, >8 ise büyük ancak ≤16 g ve bir örnek >16 g ağırlığındaysa ekstra büyük olarak kabul edilir. Protokol boyunca küçük, orta, büyük ve ekstra büyük endikasyonlar kullanılacaktır. Ayrışma ve etiketleme için gereken reaktif miktarı balgam örneğinin boyutuna göre farklılık gösterir.
  2. Küçük bir numuneyi temiz bir 50 mL konik tüpe, orta bir numuneyi temiz 250 mL plastik tek kullanımlık şişeye veya büyük ve ekstra büyük bir numuneyi temiz bir 500 mL plastik tek kullanımlık şişeye aktarın. %0,5 NAC 1 mL/g örnek ağırlığı ve %0,1 DTT 4 mL/g numune ağırlığı ekleyin.
  3. Maksimum hızda (15 s için) girdap ve ardından 15 dakika boyunca oda sıcaklığında (maksimum hızda) kayan.
  4. NAC ve DTT'yi nötralize etmek için numuneyi dört cilt Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (numune + reaktiflerin toplam hacmine göre) ile seyreltin; Vorteks maksimum hızda hızlı bir şekilde ve maksimum hızda 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kayar.
  5. Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için hücre süspansiyonunu 100 μm naylon ağ hücresi süzgeçlerinden bir veya daha fazla 50 mL konik santrifüj tüpüne filtreleyin.
  6. Hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 800 x g'da santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin, tüm peletleri bir 15 mL konik tüpte birleştirin ve ardından aynı koşulları kullanarak peletleri HBSS ile yıkayın.
  7. Hücre peletini balgam örneğinin ilk ağırlığına göre belirlenen bir arabellek hacminde yeniden kullanın.
    NOT: Küçük bir numune 250 μL HBSS'de yeniden sınıflanır. Orta boy bir numune 760 μL HBSS'de yeniden kullanılabilir. Büyük ve ekstra büyük numuneler 1460 μL HBSS'de yeniden sınıflanır.
  8. Trypan Blue kullanarak canlı/ölü hücre sayısı için hücre süspansiyonunun bir aliquot'ını alın.
    NOT: Küçük bir numune için 5 μL kullanın. Orta, büyük veya ekstra büyük bir numune için 10 μL kullanın.
    1. 1:40'lık son bir numune seyreltme elde etmek için balgam seyreltmenin 10 μL'sini% 0,4 Trypan Blue'nun 30 μL'si ile karıştırın. Hücre sayısı için hemositometrenin sayım odalarına yükleyin.
      NOT: Hücre sayıları doğru bir sayı elde etmek için çok düşük veya çok yüksekse son seyreltmeyi ayarlamak gerekebilir. Balgam hücrelerini SEC'lerden ve döküntülerden doğru bir şekilde ayırt etmek için Guiot ve ark.20'ye danışmak burada şiddetle tavsiye edilir. Bu, doğru bir hücre sayısı için gereklidir.
  9. Ekstra büyük numuneden, toplamdan 50 x 106 hücre çıkarın ve toplam 1700 μL hacim oluşturmak için yeterli HBSS ile yeni bir tüp ekleyin.
    NOT: Bunu protokolün geri kalanı için büyük bir örnek olarak düşünün. Arta kalan örnekler atılabilir veya başka amaçlar için kullanılabilir.

3. Antikor ve canlılık boyası boyama

  1. Antikor ve boyama boyası seçimi
    NOT: Tablo 1 , bu protokolde kullanılan antikorları ve canlılık boyasını ve tanımladıkları hücre popülasyonlarını gösterir.
    1. Balgam hücrelerini içeren tüpleri etiketleyin (etiketler için Tablo 2'ye bakın).
    2. Tespit edilmemiş hücrelere sahip numune tüpü ve izotip kontrolüne sahip tüp için 5 mL akış sitomemetri tüpleri (kullanılan akış sitometresi ile uyumlu) kullanın. Kan ve epitel tüp örnekleri için 15 mL konik tüp kullanın.
      NOT: Bu numuneler antikor boyama ve fiksasyonu takiben akış sitometri tüplerine aktarılacaktır.
  2. Kompanzasyon tüplerini etiketle (Tablo 3).
    NOT: Kullanılan akış sitometresi ile uyumlu 5 mL akış sitomemetri tüpleri kullanın.
  3. Sırasıyla Tablo 2 ve Tablo 3'te belirtildiği gibi balgam hücresi tüplerinin ve kompanzasyon tüplerinin her birine HBSS, antikor ve/veya boya miktarını ekleyin.
    NOT: Tüm tüplerin boyama süresinin tutarlı olduğundan emin olmak için hücre veya kompanzasyon boncukları eklemeden önce tüm tüplere tampon (HBBS), antikorlar ve boya ekleyin.
  4. Tablo 2'de listelenen balgam hücresi hacmi miktarlarını test tüplerine ekleyin.
  5. Tablo 3'te listelendiği gibi kompanzasyon tüplerine kompanzasyon boncukları ekleyin.
  6. Işıktan korunan tüm tüpleri (tahlil ve kompanzasyon tüpleri) 35 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Ardından, tüpleri 4 °C'de 800 x g'da 10 dakika boyunca buz gibi HBSS ve santrifüj ile doldurun.
  7. Kompanzasyon tüpleri için, süpernatantı peletlere mümkün olduğunca yakın aspire edin ve gevşetmek için peletleri hafifçe vurun.
  8. Kompanzasyon tüplerine 0,5 mL soğuk HBSS ekleyin, 4 °C'de buzda saklayın ve akış sitometri analizi için gerekli olana kadar ışıktan koruyun.
  9. Santrifüjlemeden sonra (antikor boyama bölümünden 3.6. adım) sonra, yersiz izotip, kan ve epitel tüplerden süpernatantı aspire edin ve tüpleri sallayarak peletleri gevşetin.

4. %1 Paraformaldehit (PFA) ile fiksasyon

  1. Lekesiz, izotip, kan ve epitel tüplere soğuk% 1 PFA (şimdiye kadar çözülmesi gereken) ekleyin; Lekesiz ve izotip tüplere 2 mL, kan ve epitel tüplerine 10 mL.
  2. Tüpleri 1 saat boyunca ışıktan korunan buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Vortex 30 dakika sonra maksimum hızda hızlı bir şekilde.
  3. Tüpleri buz gibi HBSS ile doldurun. Daha sonra, 4 °C'de santrifüj tüpleri 1600 x g'da 10 dakika boyunca.
  4. Hücre peletini bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatant emiş ve hücreleri gevşetmek için tüpü parmaklarla hareket ettirin.
  5. Lekesiz ve izotip tüplere 200 μL soğuk HBSS ekleyin.
  6. Kanın ve epitel tüpünün yeniden canlandırılması için HBSS hacmini toplam hücre sayısına göre hesaplayın.
    NOT: Resüsyon hacmi = 0,15 x [toplam hücre sayısı (balgam ayrışması adım 8) / 106]. Ekstra büyük bir örnek için hücre sayısı olarak 50 x 106 kullanın.
  7. Akış sitometrisi analizi yapılana kadar buz üzerinde ışıktan korunan tüm numune ve kompanzasyon tüplerini 4 °C'de saklayın.
    NOT: Bu iletişim kuralı 24 saatten fazla depolama için sınanmamıştır.

5. Akış sitometresinde veri toplama

  1. Kullanılan akış sitometresi için uygun başlangıç yordamlarını uygulayın.
    NOT: Protokolün bu bölümünde, akış sitometresini işleten kişinin, özellikle optik ve akışkan sistemlerin stabilitesini kontrol etmek, ışık saçılımı ve floresan yoğunluğunu standartlaştırma teknikleri ve doğru kompanzasyon matrisini hesaplamak ve uygulamak da dahil olmak üzere günlük prosedürler ile ilgili olarak mevcut cihazın kullanımı konusunda eğitilmeleri varsaymaktadır.
  2. İleri saçılma ve yan dağılım voltajlarının, boncukları eksenlere çok yakın yerleştirmeden tüm arsayı kapsayacak şekilde yerleştirecek şekilde ayarlandığından emin olmak için Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü (NIST) boncuklarının karışımını kullanın.
    NOT: Bu adım, 5 μm'den küçük kalıntıların alım sonrası analizler ile ortadan kaldırılabilmesini sağlamak için çok önemlidir. Kullanılan akış sitometresine bağlı olarak, en küçük boncukların eşikle (LSR II veya Lirik kullanılırken) veya yüksek ayırıcıyla (Navios EX akış sitometresini kullanarak) dışlanmadığını unutmayın. Navios EX için, ileri ve yan dağılım için 2, ileri saçılma için 236 ve yan dağılım için 250 voltaj için 2 kazanç kullanılmıştır. LSR II için 165 ileri saçılma gerilimi ve 190 yan dağılım gerilimi kullanılmıştır.
  3. Akış hızını orta (LSR II) veya yüksek (Navios EX) olarak ayarlayın.
    NOT: Balgam tüplerini elde etmek için çoğu enstrüman için orta veya yüksek akış hızı kullanılabilir. Bir akış hızının çok yavaş kullanılması veya numunenin çok seyreltilmiş olmasının hücrelerin yerleşmesine neden olabileceğini ve bunun da istenmeyen vortekslerin artmasına neden olabileceğini belirtmek önemlidir. Bu nedenle, 4.6 adımında hesaplanan resüspensyon hacmine bağlı kalmak, hızlı bir şekilde elde edilebilen ancak makineyi tıkamayan hücresel yoğunluğa neden olmalıdır.
  4. Hücre popülasyonlarını ölçeğe yerleştirmek için dağılım ve floresan parametreleri için kullanılan her parametre için voltajları ayarlayın. Gerilimlerin buna göre nasıl ayarlanacağına rehberlik etmek için gating stratejisine sahip rakamları kullanın.
    NOT: Alma işleminden önce parametre seçim penceresinde gereken tüm parametrelerin seçildiğinden veya verilerin alınmayacağından emin olun.
  5. Önce lekesiz balgam örneği, ardından izotip lekeli örnek, sonra da kan tüpü ve epitel tüpü için veri alın.
    NOT: Hücre süspansiyonu, akış sitometresinin numuneleri tıkanmadan çalıştırmasına izin vermeyecek kadar konsantreyse, numuneler HBSS ile daha da seyreltilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol klinik laboratuvar ayarı göz önünde bulundurularak geliştirilmiştir. Protokolün geliştirilmesi sırasında odak noktası basitlik, verimlilik ve tekrarlanabilirlikti. Balgamının işlenmesinde en çok zaman alan adımın hücreleri saymak olduğu bulunmuştur. Bu nedenle protokol, balgam işleme ve hücre etiketlemesi zaman kaybı olmadan hücre sayımından bağımsız olarak gerçekleştirilebilecek şekilde ayarlanır. Numuneyi engelsiz bir çalışma için uygun şekilde seyreltmek için hala gerekli olan doğru bir hücre sayısı, daha sonra antikor etiketleme inkübasyon döneminde elde edilebilir.

Bu protokol, optimal hücre etiketlemesi için ne kadar antikor/boya kullanılacağının bir göstergesi olarak hücre sayısı yerine balgam ağırlığı ölçüsü kullanır. Bununla birlikte, balgam örneklerinin ağırlığında büyük bir çeşitlilik vardır; analiz edilen 126 numuneden ağırlığı 0,57 g ile 38,30 g arasında değişmektedir. Şekil 1A , balgam ağırlığı ile hücre verimi arasındaki korelasyonun güçlü olmadığını göstermektedir. Bu nedenle, örnekler dört kategoriye ayrılmıştır; örneklerin ortanca ağırlıkları küçük numuneler için 2,1 g, orta numuneler için 5,0 g, büyük numuneler için 11,2 g ve ekstra büyük numuneler için 22,0 g olarak belirlendi (Şekil 1B). Bununla birlikte, ağırlıklarına göre beklenenden çok daha fazla hücre veren örnekler vardı (Şekil 1C), örneklerin çoğu güzelce kümelendi. Küçük numuneler için ortanca hücre verimi 8.0 x 106 hücre, orta sınıf numuneler için 13.0 x 106, büyük numuneler için 35.4 x 106 ve ekstra büyük numuneler 93.0 x 106 idi.

Bu protokolde kullanılan her antikor titrize edildi. Çalışma konsantrasyonu olarak titrasyon eğrisinin en yüksek boyama indeksi (Şekil 2B) olan plato fazında (Şekil 2A) bir konsantrasyon seçilmiştir. Hücre sayılarındaki değişimler boyama yoğunluğunu önemli ölçüde değiştirmeyecektir. Bu antikor titrasyonu ve testi esastır ve bu protokolde kullanılan her yeni antikor veya boya için özenle ayarlanmalıdır34,35. Bir antikor özenle titratlandığında, antikorun titrated edildiği hücre sayısından 10 ila 50 kat daha fazla hücreyi lekelemelidir34,35. Bu ilkenin bir örneği Tablo 4'te verilmiştir. Anti-insan CD45-PE antikoru 1 x 106 hücre üzerinde toplam 400 μL hacimde titratlandı. Boyama hacmine karşı bu antikor protokole göre tahmin edilirse (bkz. Tablo 2, her örnek boyutu için CD45-PE miktarını ve boyama hacimlerini gösterir), küçük bir örnek için 0.625 x 106 hücre lekelenir, orta örnek için 1.25 x 106 hücre lekelenir ve büyük bir örnek için 2.5 x 106 hücre (Tablo 4'teki sütun A). Her kategori için hücre sayısındaki 50 kat fazlalık sırasıyla 31,25 x 106, 62,5 x 106 ve 125 x 106 hücre (B sütunu) olarak hesaplanır. C ve D sütunlarında gösterildiği gibi, her boyut kategorisinin ortanca hücre numarası ve her kategorideki en büyük örnek 50 kat aralığındadır.

Balgam örneklerinin çeşitli boyutları arasındaki boyut ve hücre veriminde belirgin farklılıklara rağmen, her kategorideki ortanca yüzde SEC kontaminasyonu çok benzerdir. Şekil 3A , balgam ağırlığı kategorilerine göre tabakalanmış, tek tek örneklerde bulunan CE'lerin yüzdesini göstermektedir. Bu hücreler akciğer dokusunu değil ağız boşluğunu temsil eden SEC'ler ile ilgiliydi. Bununla birlikte, ortalama SEC kontaminasyonu tüm kategoriler için% 20'den azdır. Şekil 3B , bu örneklerde bulunan canlı hücrelerin yüzdesini göstermektedir. SEC'ler hariç, küçük, orta ve büyük örnek boyutu kategorileri için ortalama canlılık yaklaşık% 72 idi. Ekstra büyük kategori için biraz daha yüksekti (%79).

Şekil 4, ilgi çekici balgam hücrelerini enkazdan, ölü hücrelerden (kontamine SECs36'yı da içerir) ve hücre kümelerinden ayırmak için tipik bir gating stratejisi göstermektedir. Şekil 4A, 5 μm'den küçük veya 30 μm'den büyük kalıntıları ortadan kaldırmak için kapıları ayarlamak için NIST boncuklarının kullanımını gösterirken, Şekil 4B bu kapıyı balgam hücrelerine uygular. Şekil 4C, ileri saçılma genişliğine (FSC-W), genişlik kapısına karşı yan dağılım genişliği (SSC-W) olarak bakıldığında tipik bir balgam profili gösterir. Bu profil, SSC-W ve FSC-W eksenleri boyunca kendini gösteren küçük kalıntıları ortadan kaldırmak için kullanılır. Ölü hücrelerin ortadan kaldırılması Şekil 4D ve Şekil 4E'de gösterilmiştir. FVS510 pozitifliği için kesmeyi belirlemek için el değmemiş kontrol (Şekil 4D) kullanılır; negatif kontrolün üzerinde FVS510 için pozitif lekeleyen hücreler ölü kabul edilir ve balgam hücresi analizinde kullanılmaz (Şekil 4E). Son olarak, şekil 4F'de gösterilen hücre çiftlerini analizden çıkarmak için tek bir kapı uygulanır. Böylece Şekil 4B, Şekil 4C, Şekil 4E ve Şekil 4F'de gösterilen seçim kapılarından geçen hücreler, bu protokolde kullanılan antikorlarla sonraki analizlere hazır canlı, tek balgam hücrelerini temsil eder.

Bu etiketleme protokolünde anti-CD45 antikorunun kullanılması, canlı, tek balgam hücrelerinin bir kan (CD45+) hücre bölmesine ve kan dışı (CD45-) hücre bölmesine ayrılmasını sağlar. İkinci kategori epitel hücrelerini ve diğer kan dışı hücreleri içerir. Şekil 5A'daki üst profil, CD45 pozitifliği için kesmeyi ayarlamak için yersiz bir balgam örneğinin kullanımını gösterir ve kapıları CD45+ hücrelerini ve CD45 hücrelerini yakalamak için işler. Şekil 5A'nın alt profili, anti-CD45 antikor ile boyanmış bir balgam örneğine uygulanan bu kapıları göstermektedir. Daha sonra EK antikorlarla boyama, CD45+ kapısındaki kan hücresine özgü popülasyonları (Şekil 5B) ve CD45 kapısındaki epitel popülasyonları da dahil olmak üzere diğer kan hücresi dışı popülasyonları tanımlamak için kullanılır (Şekil 5C). Her iki şekilde de, üst profiller izotip lekeli balganın çift negatif popülasyonları ayarlamak için nasıl kullanıldığını gösterirken, alt profiller antikor lekeli balgam hücrelerini göstermektedir. Şekil 5B (altta), floresan (FL) 1 kanalında (anti-CD66b, CD3, CD19 antikorları) ve FL3 kanalında tespit edilebilen anti-CD206 antikorlarının kokteyli ile oluşturulan altı farklı CD45+ hücre popülasyonu göstermektedir. Tasnif deneyleri, akciğere özgü makrofajların M ile tanımlanan kapılarda bulunduğunu ortaya çıkardı. Bu nedenle bu kapılarda hücrelerin varlığı, balgam örneğinin akciğerden elde edildiğini ve tükürük olmadığını gösterir (Bederka ve ark., hazırlık aşamasında el yazması). Şekil 5C (altta), FL1 kanalında tespit edilebilen anti-pan-sitokeratin (panCK) ile oluşturulan gating kadranlarını ve CD45-balgam hücreleri arasında FL3 kanalında tespit edilebilen anti-epitel hücre yapışma molekülü (EpCAM) antikorlarını göstermektedir.

Bu etiketleme protokolü Navios EX ve LSR II üzerinde kapsamlı bir şekilde test edilmiştir. Lirik üzerinde bazı ön deneyler yapıldı, ancak diğer iki makine için yapılan kapsamlı enstrüman optimizasyonu olmadan. Bu nedenle, Malzemeler sayfasında Navios EX ve LSR II için ayrıntılı cihaz ayarları sağlanır, ancak Lirik için sağlanmamıştır. Balgam hücrelerini analiz etmek için kullanılabilecek bu üç akış sitometrik platformu arasındaki benzerlikleri ve varyasyonları anlamak için, çeşitli makinelerden elde edilen profiller Şekil 6 ve Şekil 7'de karşılaştırılabilir. İki büyük balgam örneği işlendi, havuza alındı, etiketlendi, üç eşit bölüme ayrıldı ve daha sonra yukarıda belirtilen her akış sitometresinde elde edildi. Şekil 4'e benzeyen Şekil 6, enkaz, ölü hücreler ve hücre kümelerini ortadan kaldırmak için gating stratejisini karşılaştırır. Şekil 5 ile aynı olan Şekil 7, çeşitli akış sitometrelerinde elde edilen verilerden elde edilen kan ve kan dışı profilleri karşılaştırır.

Üç farklı akış sitometresinden elde edilen çeşitli profillerin karşılaştırılması, her bir aletle aynı temel profillerin gözlemlenebileceğini göstermektedir. Dikkat etmesi gereken farklar SSC-W/FSC-W (genişlik kapısı) çizimleri (Şekil 6, ikinci satır) ve dağılım çizimlerinin doğrusal ölçekleridir (Şekil 6 ve 7). Navios EX'te oluşturulan dağılım genişliği grafiği bir ekleme kapısı (kırmızı kutu) gösterir, yani kapıya dahil edilen tüm hücreler daha fazla analiz edilir; sol-alt köşedeki eksenler boyunca olaylar hariç tutulur. LSR II ve Lirik üzerindeki dağılım genişliği çizimleri, aynı eksenler boyunca benzer bir olay biriktirme göstermez. Bu tutarsızlık, Navios EX'te kullanılan çok hassas eşikten kaynaklanmaktadır ve önceki boyut dışlama kapısında ( Şekil 6'nın üst satırı) bazı küçük döküntülere yol açmaktadır. Bazen, enkaz LSRII'de oluşturulan dağılım genişliği profilinde eksenler boyunca görülür, ancak sağ alt köşededir. Bu gibi durumlarda, bu olayları daha fazla analizden ortadan kaldırmak için bir dışlama kapısı ( Şekil 6'nın 2. satırındaki orta profildeki kesikli kırmızı kutuda belirtildiği gibi) kullanılır.

Günlük ölçekleri Navios EX ile Lirik ve LSR II sitometreleri arasındaki çizimlerde biraz farklı görünse de, Navios EX daha fazla on yıl kullanarak veri alma seçeneğine sahiptir. Daha fazla on yıl uygulamak, deneyin bağlamı ve ilgi alanlarını görselleştirmek için istenen hassasiyete bağlıdır.

Navios EX ve LSR II ve Lirik sitometreler arasındaki ek bir fark, singlet kapısının profilinin ortaya çıkmasıdır. Navios EX sitometresi, LSR II'den farklı bir toplama açısına sahip dikdörtgen bir akış hücresi ile donatılmıştır. Navios EX, parçacık boyutunun analiz etmesi için uygun hassasiyeti elde etmek için ileri açılı ışık saçılımını optimize etmek için yazılım kontrollü üç toplama açısı içerir. Navios EX sitometresinin çokgen kapısının LSRII için singlet kapısından biraz daha düşük bir açıya ayarlanması gerekir. Lirik için singlet kapısı, LSR II ile görülene benzer bir profil elde etmek için optimize edilebilir. Balgam örneğini kullanarak, LSR II'ye benzer bir tek kapı elde etmek için Lirik üzerindeki her lazer için alan ölçekleme faktörünün optimize edilmesi gerekir.

Şekil 4'te Şekil 7'ye kadar gösterilen tüm profiller FlowJo yazılımı, sürüm 10.6 ile analiz edilmiştir. .fcs dosyaları FlowRepository (https://flowrepository.org), FR-FCM-Z3LX, FR-FCM-Z3MJ ve FR-FCM-Z3MM kimlikleri altında bulunabilir ve bu rakamlarda gösterildiği gibi balgam analizi uygulamak için kullanılabilir.

Figure 1
Şekil 1: Balgam ağırlıkları ve hücre verimi. (A) Tasvir edilen, işlenmeden önce belirlenen balgam ağırlığı ile hemositometre kullanılarak işlendikten sonra belirlenen toplam hücre verimi arasındaki ilişkidir. Her madde işareti, toplamda 126 olmak üzere tek bir örneği temsil eder. (B) Balgam örnekleri ağırlıklarına göre dört kategoriye ayrıştırıldı: 3 g'a kadar olan numuneler için küçük, 8 g'dan 8 g'a kadar olan numuneler için orta, 16 g'dan daha ağır numuneler için büyük ve 16 g'dan (C) daha ağır olanlar için ekstra büyük numuneler Gösterilen, her kategorideki numuneler için hücre veriminin dağılımıdır. (B) ve (C) öğelerindeki kırmızı çubuklar her kategorideki ortanca değerleri temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Anti-insan CD45-PE için antikor titrasyonu. (A) 1 μg/mL'deki CD45-PE antikor platolarının konsantrasyonuna kıyasla çizilen pozitif popülasyonun ortalama floresan yoğunluğuna (MFI) sahip CD45-PE (IgG1) titrasyon eğrisi. (B) Antikor konsantrasyonuna karşı boyama indeksini gösteren titrasyon eğrisi, en yüksek boyama indeksinin 1 μg/mL'de olduğunu gösterir. Boyama indeksi şu şekilde hesaplandı: [CD45 MFI pozitif popülasyon - CD45 MFI negatif popülasyon] / [2 * Standart Sapma]. Şekil 2A ve Şekil 2B'ye dayanarak, CD45-PE antikoru için en uygun konsantrasyon olarak 1 μg/mL seçilmiştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Balgam örneklerindeki SEC'lerin ve ölü hücrelerin oranı dört ağırlık kategorisi arasında tutarlıdır. (A) Balgam örneklerindeki SEC'lerin oranı ağırlık kategorilerine göre sınıflandırılır. Sec kontaminasyonunun yüzdesi, toplam hücre sayımının bir parçası olarak hemositometre ile belirlendi. (B) Hemositometre ve trippan mavi dışlama yöntemi ile belirlenen SECS hariç balgam örneklerinin hücre canlılığı. Her grafik için kırmızı çizgiler ortanca değerleri temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Balgam örneğindeki döküntüleri, ölü hücreleri ve çiftleri dışlamak için gating stratejisi. (A) 5 μm, 20 μm ve 30 μm boyutlarındaki NIST boncukları, kırmızı kutunun gösterdiği kapıyı 5 μm'den küçük ve 30 μm'nin üzerindeki ve eksene yakın daha büyük kalıntıları dışlayacak şekilde ayarlamak için kullanıldı. (B) NIST boncuklarınınkiyle ileri ve yan dağılım için aynı gerilimler kullanılarak bir balgam örneği elde edildi. (A) içinde oluşturulan kapı, enkazı dışlamak için uygulanmıştır. (C) Bu dağılım genişliği grafiğinde eksene yakın küçük döküntüler hariç tutulmuştır. (D) Uygulanabilirlik boyası için negatif, lekesiz popülasyon için kesme (kırmızı çizgi) ayarlamak için tespit edilmemiş bir balgam örneği kullanılmıştır. (E) D'de oluşturulan kesme, canlı, uygulanabilir hücreleri içerecek bir kapı (kırmızı kutu) oluşturmak için lekeli balgam örneğine uygulandı. (F) Kırmızı çokgen tarafından belirtilen tek kapı, diyagonal üzerine düşmeyen hücreleri dışlar, çiftleri ve/ veya kümeleri ortadan kaldırır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Balgam hücrelerinin kan ve kan dışı hücre bölmelerine gating stratejisi. (A) Tekli kapıdan elde edilen lekesiz balgam hücreleri, CD45 (üst) için negatif popülasyondaki kesmeyi (kırmızı çizgi) ayarlamak için kullanılır. Cd45 pozitif (CD45+) ve negatif popülasyonları (CD45-) ayırt etmek için üst profilden kesme lekeli balgam örneğine (altta) uygulanır. (B) FITC/AF488 için izotip antikorlarla boyanmış CD45+ balgam hücreleri negatif popülasyondaki (üstteki) kapıları ayarlamak için kullanılır. Aynı kapılar CD3, CD19, CD66b ve CD206 (altta) kan hücresi belirteçleri ile boyanmış CD45+ balgam hücrelerine uygulanır. (C) Kadran kapıları, izotip kontrolleri (üstte) ile boyanmış CD45- balgam hücrelerine yerleştirilir ve epitel belirteçleri pan-sitokeratin (panCK) ve EpCAM (altta) ile boyanmış balgam örneğinden hücrelere uygulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Üç akış sitometrik platformundaki lekeli balgam hücrelerinin kalıntılarını, kümelerini ve ölü hücrelerini dışlamak için gating stratejisi. Navios EX (A), LSR II (B) ve Lirik (C) akış sitometrelerinde elde edilmesi için iki büyük balgam örneği işlendi, birikti, etiketlendi ve üç eşit bölüme ayrıldı. Üst satır: Balgam örnekleri çok küçük ve büyük döküntüleri dışlamak için kapılı (kırmızı kutu) edildi. İkinci satır: Navios EX çizimindeki büyük kırmızı kutu, hücreleri içeren ancak enkazı dışlayan bir ekleme kapısını temsil eder. LSR II çiziminde görülen kesikli küçük kırmızı kutu, daha fazla analizden kaynaklanan kalıntıları ortadan kaldırmak için bir dışlama kapısını temsil eder. Enkaz dışlama gatinginin nerede gerekli olduğunu belirlemek için Lirik ile daha fazla optimizasyona ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bu arsada hiçbir kapı yoktur. Üçüncü sıra: kırmızı dikdörtgen kapılar daha fazla analiz için canlı hücreler içerir. Alt satır: çokgen kapı, kapının diyagonal dışına düşen çiftleri hariç tutarak tek hücreye sahiptir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Üç akış sitometrik platformunda kan ve epitel belirteçleri için lekeli balgam için gating stratejisi. Şekil 6'da gösterilen analiz Şekil 7'de devam edilir; tüm uygulanabilir, tek hücreli (alt sıra, Şekil 6) CD45+ ve CD45 popülasyonlarına ayrılmıştır (ilk satır, Şekil 7), böylece kan hücresine özgü belirteçler ve epitel hücreye özgü belirteçler bu popülasyonları daha da açıklayabilir. İkinci sıra: CD45+ hücrelerinden CD3/CD19/CD66b ve CD206 kan hücresi belirteçlerinin profili. Üçüncü sıra: CD45 hücrelerinden epitel hücre belirteçleri panCK ve EpCAM. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Antikor/leke Amaç
FVS510 Canlılık lekesi
anti-insan CD45 – PE Pan-lökosit işaretleyici;  PE telafisi
Anti-insan CD66b – FITC Granülosit işaretleyici
anti-insan CD3 – Alexa488 T hücre işaretçisi
İnsan karşıtı CD19 – Alexa488 B hücre işaretçisi; FITC/Alexa488 tazminatı
anti-insan CD206 – PE-CF594 Akciğer makrofaj işaretçisi;  PE-CF594 tazminatı
İnsan karşıtı EpCAM – PE-CF594 Epitel hücre işaretleyicisi;  PE-CF594 tazminatı
Anti-insan pan-sitokeratin (panCK) – Alexa488 Epitel hücre işaretçisi
IgG1φ – Alexa488 CD3/CD19/panCK izotip kontrolü
IgG1φ – FITC CD66b izotip kontrolü
IgG1φ – PE-CF594 CD206/EpCAM izotip kontrolü
anti-insan CD45 – BV510 FVS510 tazminatı

Tablo 1: Kullanılan antikorlar ve canlılık lekeleri. Bu protokolde kullanılan antikorların ve canlılık boyasının listesi. Her birinin tanımladığı hücresel alt kümeler gösterilir.

Tüp (Etiket) Örnek boyutu* HBSS (μL) FVS510 (μL) CD45 (μL) Diğer antikorlar (μL) Hücreler § (μL)
Yersiz küçük 80 20
Orta 50 50
büyük 50 50
IgG1φ - Alexa488 IgG1φ- FITC IgG1φ - PE-CF594
İzotip kontrolü küçük 60.65 0.6 10 2 6 0.75 20
Orta 30.65 0.6 10 2 6 0.75 50
büyük 30.25 1 10 2 6 0.75 50
CD206 CD3 CD19 CD66b
Kan küçük 92.875 1.5 25 1.875 5 1.25 7.5 115
Orta 65.75 3 50 3.75 10 2.5 15 350
büyük 102.5 10 100 7.5 20 5 30 725
EpCAM PanCK
Epitel küçük 96.5 1.5 25 10 2 115
Orta 73 3 50 20 4 350
büyük 117 10 100 40 8 725
* Numuneler, protokolün balgam ayrıştırma bölümünün 1.
§ Kompanzasyon tüplerindekiler de dahil olmak üzere tüm reaktifler dağıtıldıktan sonra hücreler eklenmelidir (Tablo 3).

Tablo 2: Balgam hücreli tüplerin içeriği. Uygun örnek boyutu için belirtilen antikor hacimlerini ve canlılık lekesini eklemek için protokolde belirtildiği gibi bu tabloyu kullanın.

Tüp (Etiket) Reaktifler eklendi (μL) Reaktifler eklendi (bırak)
HBSS CD45-PE CD206-PE-CF594 EpCAM-PE-CF594 CD19-Alexa488 CD45-BV510 CompBead (+) CompBead * (-)
PE kompozisyonu. 76 4 x x x x 1 1
PE-CF594 kompozisyon. 72 x 4 4 x x 1 1
Alexa488/FITC kompozisyon. 60 x x x 20 x 1 1
BV510 kompozisyon. 60 x x x x 20 1 1
* Pozitif (+) ve negatif (-) boncuklar tüm reaktifler dağıtıldıktan ve Tablo 2'deki tüpler hazırlandıktan sonra eklenmelidir.
comp. = tazminat

Tablo 3: Kompanzasyon tüplerinin içeriği. Belirtilen antikor hacimlerini kompanzasyon boncuklarına eklemek için protokolde başvurulmuş olarak bu tabloyu kullanın.

Hücre numarası (x 106)
A B C D
Örnek boyutu Boyama hacminde * 50 kat erişim Ortanca örnek (katlama erişimi) # En büyük örnek (katlama erişimi) #
Küçük 0.625 31.25 8.0 (12.8) 24.77 (39.6)
Orta 1.25 62.5 13.0 (10.4) 48.87 (39.1)
Büyük 2.5 125 35.4 (14.2) 113.5 (45.4)
* Protokolde kullanılan boyama hacimleri (Tablo 2).  Hücre numarası, titrasyon eğrisinin nasıl gerçekleştirildiğinin tahmin edildiği gibi; 200 μL başına 1 μg/mL CD45-PE ve 1 x 106 hücre.
Sütun A'daki hücre numaralarına 50 kat erişim
# C ve D sütunlarındaki katlama erişimi, C veya D sütunlarının hücrelerinde sunulan sayının A sütunundaki karşılık gelen hücredeki sayıya bölünmesiyle hesaplanır.

Tablo 4: Her örnek boyutu kategorisindeki tüm numuneler için anti-insan CD45-PE konsantrasyonu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Balganın hücresel içeriği, genellikle çok fazla enkazla birlikte çok çeşitli hücreler içerir37. Ek olarak, balgam analizi, numunenin ağız boşluğu yerine akciğerden toplandığını doğrulayan bir kalite kontrolü gerektirir38. Bu nedenle, balgamumu akış sitometrisi ile analiz etmek, örneğin çok daha temiz ve homojen bir hücre süspansiyonu serbest bırakan kan için olduğu kadar basit değildir. Bu protokol tüm bu sorunları ele almıştır: hem en küçük hem de en büyük hücre popülasyonlarının tespit edilebilmesini sağlamak için belirli boyut boncuklarını kullanarak cihaz ayarları sağlamak, enkazı, hücre kümelerini, kontamine SEC'leri ve diğer ölü hücreleri ortadan kaldırmak için bir gating stratejisi ve son olarak, balgam örneğinin çoğunlukla tükürük olmak yerine akciğerden olmasını sağlamak için bir kalite kontrol önlemi.

Protokolde balgamla çalışma konusunda işaret etmeye değer kritik adımlar vardır. İlk olarak, hücre verimi, protokolün balgam ayrışma kısmının 2,5. Süzgecin tıkanması nedeniyle çok fazla hücrenin kaybedilmesini önlemek için birden fazla süzgeç gerekebilir. Süzgeçlerden geçen akış belirgin bir şekilde yavaşladığında, yeni bir süzgeç kullanılmalıdır. İkincisi, balgam örneklerinin hücre peleti, özellikle SEC'lerin yüksek kirlenmesi varsa, çok gevşek olabilir. Bu nedenle, numuneleri santrifüj ettikten sonra süpernatantı çıkarırken pelekaya çok yakın aspire etmemek önemlidir. Pelete çok yakın aspirasyon, tüm peletin kaybı değilse, hücre kaybına neden olabilir. Üçüncü olarak, bu protokol bir sabitleme adımı gerektirir. Bu, hücreleri ve lekeleme profillerini korur ve akış sitometresi operatörini korumak için bir güvenlik önlemi görevi görür. Numunelerin belirli akış sitometrelerinde çalıştırması, aerosol üretimi potansiyeli nedeniyle artan biyolojik tehlikelere neden olabilir39. PFA fiksasyonu, operatörü balgam numuneslerindeki potansiyel patojenlerden korumaya yardımcı olur. Dördüncüsü ve belki de balgam örneklerini akış sitometrik analizi için hazırlamanın en zorlu yönü hücre sayımıdır. Balgamda bulunan çok çeşitli hücre türleri nedeniyle hücre sayımı karmaşıktır. Sayım makineleri genellikle yakalayabilecekleri hücre boyutu aralığı ile sınırlıdır ve bu nedenle hemositometreden daha az güvenilirdir. Bununla birlikte, Guiot ve ark.20 tarafından mükemmel bir şekilde tanımlanan balgam örneklerinin hemositometre ile hücre sayımı sıkıcıdır ve pratik yapmanın yeterli olmasını gerektirir. Makul bir akış hızı sağlamak ve akış sitometresinde tıkanıklıkları önlemek için numunenin son resüspensiyon hacminin belirlenmesinde doğru bir hücre numarası çok önemlidir. Balgamdaki çok büyük SEC'lerin varlığı ve ayrışma arabelleği tarafından parçalanmamış veya filtreler tarafından yakalanmayan birçok küçük hücre kümeleri, akış sitometresini tıkama olasılığını arttırır. Bu nedenle, kullanılabilir akış sitometresini kullanarak veri toplama için en iyi hücre konsantrasyonu / akış hızını belirlemek için biraz zaman harcamanız önerilir. Ayrıca, akış sitometresinin balgamda bulunan daha büyük hücre popülasyonlarını ölçebilen uygun akış hücresine ve nozul boyutuna (veya prob) sahip olduğundan emin olun.

Hücre sayımında yeterlilik sağlanmış olsa bile, yine de zaman alıcı bir süreçtir. Bu nedenle, reaktiflerin bu protokoldeki hücre etiketlemesi için belirlemesi, hücre numarası yerine örnek boyutuna (ağırlığa göre değerlendirilir) dayanır. Bu, manuel hücre sayısı antikor ve canlı boya boyası için gereken süre boyunca tamamlanabildiğinden zamanın daha verimli kullanılmasını sağlar. Ancak, bunun üç önemli istisnası vardır. Bir örnek >16 g ise (ekstra büyük örnekler olarak adlandırılır), manuel hücre sayısı lekelenmeden önce gerçekleşmelidir, böylece pahalı reaktifler kan ve epitel tüpleri için her biri sadece 25 x 106 hücre boyanarak korunabilir. Bu hücre numarası, bu iletişim kuralında açıklanan ayarlarda çok güvenilir profiller sağlar. Diğer bir olası istisna, çok küçük bir örnek durumudur. Tahmin, güvenilir profiller oluşturmak için bu protokolde sunulan akış sitometri analizi için en az 1-2 x 106 hücreye ihtiyaç duyulduğudur (veriler gösterilmez). Bu nedenle, bir örnek 1-2 x 106'dan az hücre içeriyorsa, nihai sonuç muhtemelen kabul edilemez olacağından prosedüre devam etmeye değmeyebilir.

Periferik kan hücreleri veya hücre hatları üzerinde iyi çalışan spesifik etiketleme reaktifleri balgamda bulunan kan hücreleri üzerinde çok farklı çalışabilir (yayınlanmamış gözlemler). Bu nedenle, akış sitometrisi deneylerinde kullanılmadan önce her antikorun veya diğer etiketleme reaktiflerinin iyi kurulmuş protokollere34,35 göre titrat yapılması önerilir. Antikor titrasyonlarının çoğu 10 ila 50 kata kadar lekeleme yaparken karşılaştırılabilir sonuçlar vermelidir; ancak, bu aralıktan daha yüksek hücre numaraları ile ek titrasyonlar yapılması önerilir34. Bir reaktif konsantrasyonu belirlendiğinde, bu reaktifin inkübasyon süresini gerçek deneydekiyle aynı tutmak önemlidir. Bu nedenle, protokol, hücreler veya kompanzasyon boncukları eklenmeden önce tüm tampon ve reaktifleri tüplere eklemeyi vurgular. Reaktifleri ve hücreleri/boncukları bir araya toplama sırası, etiketleme sürelerinde daha yüksek tutarlılık sağlar. Her nedense, deneysel kuluçka süresi antikor/ boya titrasyonu için kullanılana benzer tutulamazsa, ikincisi deneyler sırasında mümkün olan bir kuluçka süresi ile tekrarlanmalıdır.

Balgam örnekleri, akciğeri etkileyen çeşitli hastalıkların patofizyolojisini incelemek için tanısal bir örnek olarak yaygın olarak kullanılmıştır. Tüberküloz40,41, KOAH13,42, astım43, kistik fibrozis44,45, akciğer kanseri46,47,48 ve romatoid artrit49, invaziv olmayan bir örnek olmasının avantajı nedeniyle balgamının çalışıldığı birçok hastalık arasındadır. Daha yakın zamanda, koronavirüs pandemisi sırasında, koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19)50 ile hastaneye yatırılan hastalarda uzun süreli viral dökülmeyi tespit etmek için balgam kullanılmıştır.

Balgamdaki hastalığa özgü belirteçleri tanımlamak için ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), protein analizi, mikroskopi ve akış sitometrisi gibi çeşitli teknolojiler kullanılmıştır. Balgam örneklerini analiz etmek için akış sitometrik platformu kullanmak yaygın olarak kullanılmaz, ancak kullanımı artar. Akış sitometresi teknolojisindeki son gelişmeler3,51,52, ayrıca floroforların kimyalarındaki gelişmeler, yeni antikor klonlarının üretimi ve ölü hücre popülasyonlarını tanımlamak için çeşitli boyaların geliştirilmesi51,53,54, insan hastalıklarını teşhis etmeyi amaçlayan antikor panelleri tasarlama olasılığı önemli ölçüde artmıştır. Ayrıca, akış sitometrik verilerinin analizini otomatikleştirmek için son itme55,56, akış verilerini manuel olarak okuma ve yorumlamadaki potansiyel önyargıyı ortadan kaldıracaktır. Akış sitometristindeki bu yeni gelişmeler, balgamının klinik tanı olarak araştırılmasını önemli ölçüde kolaylaştıracaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tüm yazarlar bioAffinity Technologies'in geçmiş veya mevcut çalışanlarıdır.

Acknowledgments

David Rodriguez'e figür hazırlığındaki yardımı için teşekkür etmek istiyoruz. Balgam örnekleri UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) ve UL1 TR001120 (CTSA hibesi) tarafından desteklenen UT Health San Antonio Flow Cytometry Paylaşılan Kaynak Tesisi'ndeki BD LSR II'de çalıştırıldı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix Polysciences 25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 Fisher Scientific 08-771-19
3 M NaOH EMD SX0593-1
50 mL conical falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
Alexa488 anti-human CD19 BioLegend 302219
Alexa488 anti-human CD3 BioLegend 300415
Alexa488 anti-human cytokeratin BioLegend 628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype BioLegend 400129
BV510 anti-human CD45 BioLegend 304036
CD66b FITC isotype BD Biosciences 555748
CompBead Plus Compensation Beads BD Biosciences 560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL Fisher Scientific 09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL Fisher Scientific 09-761-10
CS&T beads BD Biosciences 655051
DTT Fisher Scientific BP172-5
FITC anti-human CD66b GeneTex GTX75907
Fixable Viability Stain BD Biosciences 564406
FlowCheck Beckman Coulter A69183
FlowSet Beckman Coulter A69184
HBSS Fisher Scientific 14-175-095
NAC Sigma-Aldrich A9165
NIST Beads, 05 μM Polysciences 64080
NIST Beads, 20 μM Polysciences 64160
NIST Beads, 30 μM Polysciences 64170
PE anti-human CD45 BioLegend 304039
PE-CF594 anti-human EpCAM BD Biosciences 565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype BD Biosciences 562292
PE-CR594 anti-human CD206 BD Biosciences 564063
Sodium citrate dihydrate EMD SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
  2. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews. Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
  3. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), San Diego, Calif. 251-258 (2012).
  4. Robinson, J. P., Roederer, M. History of science. Flow cytometry strikes gold. Science. 350 (6262), New York, N.Y. 739-740 (2015).
  5. Orfao, A., et al. Immunophenotypic dissection of normal hematopoiesis. Journal of Immunological Methods. 475, 112684 (2019).
  6. Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
  7. Bento, L. C., et al. The use of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: A review. Frontiers in Oncology. 7, 270 (2017).
  8. Della Porta, M. G., Picone, C. Diagnostic utility of flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases. 9 (1), 2017017 (2017).
  9. Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2), Pt 1 475-478 (2000).
  10. Spanevello, A., et al. Induced sputum cellularity. Reference values and distribution in normal volunteers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 162 (3), Pt 1 1172-1174 (2000).
  11. Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
  12. Hastie, A. T., et al. Mixed sputum granulocyte longitudinal impact on lung function in the severe asthma research program. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (7), 882-892 (2021).
  13. Hastie, A. T., et al. Association of sputum and blood eosinophil concentrations with clinical measures of COPD severity: an analysis of the SPIROMICS cohort. The Lancet. Respiratory Medicine. 5 (12), 956-967 (2017).
  14. Kim, J., et al. Innate immune crosstalk in asthmatic airways: Innate lymphoid cells coordinate polarization of lung macrophages. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (5), 1769-1782 (2019).
  15. Bai, Y., Zhou, Q., Fang, Q., Song, L., Chen, K. Inflammatory cytokines and T-Lymphocyte subsets in serum and sputum in patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 25, 2206-2210 (2019).
  16. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-Carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  17. Hristara-Papadopoulou, A., Tsanakas, J., Diomou, G., Papadopoulou, O. Current devices of respiratory physiotherapy. Hippokratia. 12 (4), 211-220 (2008).
  18. Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and biochemical analysis of induced sputum from asthmatic and from healthy subjects. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
  19. Alexis, N., Soukup, J., Ghio, A., Becker, S. Sputum phagocytes from healthy individuals are functional and activated: a flow cytometric comparison with cells in bronchoalveolar lavage and peripheral blood. Clinical Immunology. 97 (1), 21-32 (2000).
  20. Guiot, J., et al. Methodology for sputum induction and laboratory processing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56612 (2017).
  21. Paggiaro, P. L., et al. Sputum induction. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 3-8 (2002).
  22. Anjuman, N., Li, N., Guarnera, M., Stass, S. A., Jiang, F. Evaluation of lung flute in sputum samples for molecular analysis of lung cancer. Clinical and Translational Medicine. 2, 15 (2013).
  23. Sethi, S., Yin, J., Anderson, P. K. Lung flute improves symptoms and health status in COPD with chronic bronchitis: A 26 week randomized controlled trial. Clinical and Translational Medicine. 3, 29 (2014).
  24. Su, J., et al. Analysis of lung flute-collected sputum for lung cancer diagnosis. Biomarker Insights. 10, 55-61 (2015).
  25. Naraparaju, S., Vaishali, K., Venkatesan, P., Acharya, V. A comparison of the Acapella and a threshold inspiratory muscle trainer for sputum clearance in bronchiectasis-A pilot study. Physiotherapy Theory and Practice. 26 (6), 353-357 (2010).
  26. Hinson, K. F., Kuper, S. W. The diagnosis of lung cancer by examination of sputum. Thorax. 18, 350-353 (1963).
  27. Johnston, W. W., Bossen, E. H. Ten years of respiratory cytopathology at Duke University Medical Center. I. The cytopathologic diagnosis of lung cancer during the years 1970 to 1974, noting the significance of specimen number and type. Acta Cytologica. 25 (2), 103-107 (1981).
  28. Ng, A. B., Horak, G. C. Factors significant in the diagnostic accuracy of lung cytology in bronchial washing and sputum samples. II. Sputum samples. Acta Cytologica. 27 (4), 397-402 (1983).
  29. Smiths Medical Videos. , Available from: https://videos.smiths-medical.com/search?q=acapella&page=1 (2021).
  30. Pizzichini, E., et al. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154 (2), 308-317 (1996).
  31. Miller, H. R., Phipps, P. H., Rossier, E. Reduction of nonspecific fluorescence in respiratory specimens by pretreatment with N-acetylcysteine. Journal of Clinical Microbiology. 24 (3), 470-471 (1986).
  32. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  33. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  34. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
  35. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 4, Unit 4.1 (2001).
  36. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  37. Kini, S. R. Color Atlas of Pulmonary Cytopathology. , Springer-Verlag New York, Inc. (2002).
  38. Papanicolaou Society of Cytopathology Task Force on Standards of Practice. Guidelines of the Papanicolaou Society of Cytopathology for the examination of cytologic specimens obtained from the respiratory tract. Diagnostic Cytopathology. 21 (1), 61-69 (1999).
  39. Holmes, K. L., et al. International Society for the Advancement of Cytometry cell sorter biosafety standards. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 85 (5), 434-453 (2014).
  40. Datta, S., Shah, L., Gilman, R. H., Evans, C. A. Comparison of sputum collection methods for tuberculosis diagnosis: a systematic review and pairwise and network meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (8), 760-771 (2017).
  41. Armstrong-Hough, M., et al. "Something so hard": a mixed-methods study of home sputum collection for tuberculosis contact investigation in Uganda. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease: The Official Journal of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. 22 (10), 1152-1159 (2018).
  42. Freeman, C. M., et al. Design of a multi-center immunophenotyping analysis of peripheral blood, sputum and bronchoalveolar lavage fluid in the Subpopulations and Intermediate Outcome Measures in COPD Study (SPIROMICS). Journal of Translational Medicine. 13, 19 (2015).
  43. Petsky, H. L., Li, A., Chang, A. B. Tailored interventions based on sputum eosinophils versus clinical symptoms for asthma in children and adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 8, 005603 (2017).
  44. Hisert, K. B., Liles, W. C., Manicone, A. M. A flow cytometric method for isolating cystic fibrosis airway macrophages from expectorated sputum. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (1), 42-50 (2019).
  45. Duncan, G. A., et al. Microstructural alterations of sputum in cystic fibrosis lung disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (18), 88198 (2016).
  46. Kemp, R. A., Reinders, D. M., Turic, B. Detection of lung cancer by automated sputum cytometry. Journal of Thoracic Oncology: Official Publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2 (11), 993-1000 (2007).
  47. Blandin Knight, S., et al. Progress and prospects of early detection in lung cancer. Open Biology. 7 (9), (2017).
  48. Gomperts, B. N., Spira, A., Elashoff, D. E., Dubinett, S. M. Lung cancer biomarkers: FISHing in the sputum for risk assessment and early detection. Cancer Prevention Research. 3 (4), Philadelphia, Pa. 420-423 (2010).
  49. Demoruelle, M. K., et al. Antibody responses to citrullinated and noncitrullinated antigens in the sputum of subjects with rheumatoid arthritis and subjects at risk for development of rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (4), Hoboken, N.J. 516-527 (2018).
  50. Wang, K., et al. Differences of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 shedding duration in sputum and nasopharyngeal swab specimens among adult inpatients with coronavirus disease 2019. Chest. 158 (5), 1876-1884 (2020).
  51. Chattopadhyay, P. K., Hogerkorp, C. -M., Roederer, M. A chromatic explosion: the development and future of multiparameter flow cytometry. Immunology. 125 (4), 441-449 (2008).
  52. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nature Immunology. 15 (2), 128-135 (2014).
  53. Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit 9.34 (2010).
  54. Chattopadhyay, P. K., et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine. 12 (8), 972-977 (2006).
  55. Duetz, C., Bachas, C., Westers, T. M., Avan de Loosdrecht, A. A. Computational analysis of flow cytometry data in hematological malignancies: future clinical practice. Current Opinion in Oncology. 32 (2), 162-169 (2020).
  56. Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews. Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).

Tags

Tıp Sayı 174
Akış Sitometrisi ile Kalite Kontrollü Balgam Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grayson, M., Lai, S. C., Bederka, L. … More

Grayson, M., Lai, S. C., Bederka, L. H., Araujo, P., Sanchez, J., Reveles, X. T., Rebel, V. I., Rebeles, J. Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (174), e62785, doi:10.3791/62785 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter