Summary
我们提出了一套标准化的单脉冲和成对脉冲经颅磁刺激（TMS）记录方案，并提供常规幅度测量和阈值跟踪选项。该程序可以控制三种不同类型的磁刺激器，旨在使所有测试都由单个操作员方便地执行。
Abstract
大多数单脉冲经颅磁刺激 （TMS） 参数（例如，运动阈值、刺激反应功能、皮质静音期）用于检查皮质脊柱兴奋性。成对脉冲 TMS 范例（例如，短间隔和长间隔皮质内抑制 （SICI/LICI）、短间隔皮质内促进 （SICF） 以及短潜伏期和长潜伏期传入抑制 （SAI/LAI））提供有关皮质内抑制和促进网络的信息。长期以来，这一直是通过传统的TMS方法完成的，该方法测量运动诱发电位（MEPs）的大小变化，以响应恒定强度的刺激。最近引入了另一种阈值跟踪方法，通过这种方法可以跟踪目标振幅的刺激强度。阈值跟踪SICI在肌萎缩性侧索硬化症（ALS）中的诊断效用已在先前的研究中得到证实。然而，阈值跟踪TMS仅在少数几个中心使用，部分原因是缺乏现成的软件，但也可能是由于它与传统的单脉冲和成对TMS测量的关系存在不确定性。
已经开发了一套菜单驱动的半自动程序，以促进阈值跟踪TMS技术的更广泛使用，并能够与传统的幅度测量进行直接比较。这些设计用于控制三种类型的磁刺激器，并允许由单个操作员记录常见的单脉冲和成对脉冲TMS协议。
本文展示了如何在健康受试者上记录许多单脉冲和成对脉冲TMS方案并分析记录。这些TMS方案快速且易于执行，可以在不同的神经系统疾病中提供有用的生物标志物，特别是ALS等神经退行性疾病。
Introduction
运动皮层的经颅磁刺激（TMS）是一种非侵入性方法，用于检查皮质生理学和许多神经系统疾病（包括神经退行性疾病）的病理生理学1。使用超阈值TMS脉冲刺激初级运动皮层，以在目标肌肉中产生运动反应。这种反应称为运动诱发电位（MEP）。TMS 是询问皮质和潜在皮质下运动网络的有用工具2。单脉冲 TMS 可评估皮质反应性、静息运动阈值 （RMT）、MEP 振幅和皮质静默期 （CSP）2。可以使用配对脉冲TMS以2-3 ms（SICI）或~100 ms（LICI）的间刺激间隔（ISI）探测皮质抑制3，4，5。
SICI由γ-氨基丁酸（GABA）A介导，LICI由GABAB受体介导，如其药理学所示4，5。SICF的电路部分由谷氨酸能N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体介导6，7。如果TMS之前对周围感觉神经进行电刺激，则MEP振幅减小。这种效应称为传入抑制，当ISI约为20-25 ms时称为SAI，并且在周围神经的电刺激和TMS8，9，10的单脉冲之间的200-1000 ms的较长ISI时LAI。SAI由胆碱能活性调节11;然而，LAI的研究明显不足，并且这种现象背后的神经回路尚不清楚10。
MEP幅度是可变的，传统TMS（cTMS）方法中的终点估计通常使用10至20个响应的算术平均值，这些响应以固定的刺激强度引起。另一种方法是阈值跟踪TMS，在20多年前首次描述12，13。在这种情况下，连续刺激的强度变化以达到固定的目标振幅响应。传统和阈值跟踪技术都可以与不同的ISI一起使用。在应用于SICI的这种方法的第一个版本中，即"串行"阈值跟踪（T-SICIs），使用了与神经兴奋性测试中使用的跟踪方法类似的跟踪方法："阈值"首先在一个互刺激间隔（ISI）上估计，然后在连续的ISI上连续跟踪。该方法已被一个小组广泛使用，并因其高诊断效用而被提倡为ALS的潜在生物标志物14，15，16，17。然而，他们的发现尚未得到任何其他研究小组的证实14，15，16，17。
当参考阈值稳定时，连续方法有效，例如在周围神经中。然而，当阈值波动很大时，如皮质脊柱兴奋性的情况，已经发现串行跟踪具有严重扭曲SICI18的ISI依赖性的缺点。因此，另一种"并行"阈值跟踪范式可能更适合SICI（T-SICIp）18，19 和其他配对脉冲协议，其中阈值是独立并行估计的，用于不同的ISI。
尽管它们有希望，但现有的TMS方法尚未在临床试验中被接受为可靠的诊断测试或生物标志物。这可能是由于现有TMS方法的几个限制，例如时间消耗，手动操作的需求和较差的再现性。为了帮助克服这些限制，本文介绍了一套最近开发的自动化、快速、单脉冲和成对脉冲TMS协议，这些协议专为单手操作而设计，并能够比较传统、串行和并行阈值跟踪方法。
这里使用的设备包括TMS机器，隔离式线性双极恒流刺激器，用于消除50-60 Hz电干扰的噪声消除器，肌电图放大器和数据采集系统。该软件用途广泛，可与其他放大器、刺激器和录制条件配合使用。
Protocol
注意：所有受试者必须在考试前给予书面同意，并且协议必须得到适当的当地伦理审查委员会的批准。此处描述的所有方法均已获得区域科学伦理委员会和丹麦数据保护局的批准。
TMS方法涉及三个阶段：1）受试者的制备，2）记录TMS，3）分析结果。
1. 主题的准备
- 评估受试者的病史，并询问受试者体内是否有癫痫，起搏器或任何类型的金属装置/植入物，对于女性受试者，她是否怀孕。
- 详细指导受试者有关考试的信息，并邀请他们给予书面同意。
- 告知受试者对头皮应用磁刺激，每次检查大约需要10分钟。
- 解释刺激将作为咔哒声听到，旨在唤起肌肉抽搐，并且某些刺激可能会感到轻微的不愉快。
- 解释如果受试者发出信号，可以随时关闭刺激。
- 要求受试者戴上泳帽。
- 清洁受试者与所研究半球对侧的手。
- 将活动记录电极放在第一背骨间（FDI）肌上，并将参比电极放在第二 掌指关节上。
- 将接地电极放在手背上。
- 将录音和接地电极连接到放大器。
- 指示受试者在检查期间保持警觉但放松。
2. TMS记录
注：以下说明适用于所使用的特定软件和仪器（见 材料表）;这些将需要适应其他硬件。
- 打开 TMS 设备。
- 使用TMS录音协议启动半自动录音软件。
- 从菜单中选择增益和门控选项（表1）。单击 "确定" 继续。
- 从主要选项中选择协议 CSP 。
- 将线圈放置在距顶点的双耳线左侧约 4 cm 处，手柄指向矢状旁平面 45°，以便进行后前电流感应。
- 通过单击 插入 键手动增加刺激强度，直到获得 MEP。
- 在监视 MEP 以查找热点的同时，稍微移动线圈的位置。
- 找到热点后，在游泳帽上绘制线圈的轮廓，以实现恒定的线圈定位。
- 单击 "确定" 以启动自动刺激协议。
注：记录自动继续，从确定200 μV时的RMT开始。 - 指导受试者保持FDI肌肉的舒适激活，以测量200μV响应的主动运动阈值（AMT）。
- 单击 "确定" 以测量3组10个上下刺激周期之间有或没有停顿的沉默期。
注意：对于每组10，刺激从0.8增加到1.6×RMT200，间隔为0.2，然后以相反的顺序重复。 - 告诉拍摄对象在最后一次刺激后放松，然后单击 "确定 "返回主 菜单。
- 从主要选项中选择协议 SICI 。
- 从菜单中选择要研究的计划 ISI，从菜单中选择要研究的 ISI ，并从菜单中选择每个 ISI 的刺激次数（ 如果未使用默认值）。
- 从菜单中选择 ASICI。
注：记录自动继续，从确定200 μV的RMT开始，然后在1000 μV下开始。SICI记录在确定RMT后自动开始，并持续约10分钟。测试刺激固定在RMT1000，条件刺激固定在RMT200的70%。以下 ISI 按伪随机顺序选择：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5 和 7 毫秒。在每三个成对的刺激之后给予单独测试的刺激。因此，每个成对的刺激被传递10次，总共产生120个刺激。 - 通过观察泳帽上的轮廓，屏幕上的MEP以及记录过程中肌肉的收缩，确保线圈位置稳定。
- 当协议完成后，屏幕自动返回主菜单选项时，从菜单中选择TSICIp。
注：记录自动继续，从确定200 μV下的RMT开始，然后SICI记录约10分钟。如果响应大于250 μV，则通过最大刺激器输出（MSO）降低1%来连续跟踪RMT200，如果响应小于160 μV，则将其增加1%。单独测试的刺激与成对的刺激交替出现，成对的刺激与伪随机ISI一起传递：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5和7毫秒。因此，总共传递了120个刺激，每个9个成对刺激10次，每个三个成对刺激后单独测试刺激。 - 在协议完成后，屏幕自动返回主菜单选项后，单击" 完成 "，除非将运行其他协议。
- 通过单击" 关闭文件并保存数据 "按钮完成录制。
3. TMS分析
- 启动分析软件程序以离线进行分析。
- 选择要分析的录制文件，然后单击" 确定 "按钮。
- 从 TMS 菜单中选择创建 TMS MEM 文件选项进行分析。
- 单击 "确定" 保存 MEM 文件。
- 单击TMS菜单中的绘图TMS MEM / MEF选项，以将单个受试者的录音与一组健康对照进行比较。
- 单击 MEF 文件名菜单上的第 1 个选项。然后，单击MEF文件，将使用MEF文件列表进行比较。
- 单击 MEM 文件名菜单上的第 1 个选项。然后，单击MEM文件，将使用MEM文件列表进行比较。
- 使用 95% 置信区间、标准差或标准误差的不同选项叠加 MEM 和 MEF 文件。
Representative Results
在一个健康受试者中获得了以下结果。通过"4→2→1"跟踪规则和对数回归（如前所述）检测到200 μV（RMT200）或1000 μV（RMT1000）峰峰值响应的RMT18。RMT200为52.1%MSO，RMT1000为59.8%MSO。
所有配对脉冲TMS选项都可以在幅度、并行阈值跟踪和串行阈值跟踪模式下确定。这里，仅总结了幅度和并行阈值跟踪模式。因此，可以从菜单中选择ISI，每个ISI的刺激数量以及条件刺激的刺激强度水平。在这里，我们只描述这些选项的默认选项。
图1显示了设置，包括使用8字形线圈进行刺激，使用表面电极进行记录，安装有软件的计算机，TMS机器，用于消除50-60 Hz电气干扰的噪声消除器，隔离的线性双极恒流刺激器，肌电图放大器和数据采集系统。
图2显示SICI为A-SICI（图2A）和T-SICI并行（图2B），如协议部分所述。 图3 显示LICI为A-LICI（图3A）和T-LICI并行（图3B）。对于A-LICI，在找到热点后，程序确定RMT1000并将测试和调节刺激设置为该振幅。单独测试刺激以每 4 次 刺激的形式传递，并且以 50、100、150、200、250 和 300 ms 的间隔进行条件反射+测试刺激以伪随机方式传递。每个ISI提供十个刺激。同样，对于 T-LICI，在 50 至 300 ms 的时间内，在与 A-LICI 相同的 6 个 ISI 下提供 10 个成对脉冲，并且跟踪 RMT200 的阈值，同时将条件刺激设置为跟踪 RMT200 的 120%。
图4显示SICF为A-SICF（图4A）和T-SICF并行（图4B）。对于 A-SICF，找到热点后，程序将确定 RMT50 和 RMT1000。然后将测试刺激设置为RMT1000，并将条件刺激设置为RMT50的90%。ISI 的范围是从 1 到 4.9 x 0.3 毫秒。单独测试刺激作为每 4 个 或第 5 个 刺激传递，并且 14 个条件反射+ 测试刺激按伪随机顺序传递。至于A-SICF，T-SICF在14个ISI下从1到4.9 ms测量，阈值在每个ISI处用10个成对脉冲跟踪。
图5显示SAI为A-SAI（图5A）和T-SAI并行（图5B）。SAI方案涉及刺激神经中的躯体感觉传入物，并在约20 ms后记录对MEP兴奋的影响。这种MEP潜伏期（'N20'）对于刺激的时间很重要。程序要求用户从某个范围（16-23 毫秒）中选择延迟，或者在超出此范围时指定延迟。为了确定N20潜伏期，可以进行传统的体感诱发电位，或者可以使用年龄和身高校正的实验室对照。
对于A-SAI，首先确定1mV复合肌肉动作电位的电刺激强度（EMT1000）。然后，找到用于磁刺激的热点，并确定RMT1000。然后，该程序将磁性和电刺激与从N20-2到N20 + 12 ms的ISI相结合。单独测试刺激按每4次 刺激给出，而条件反射+测试刺激按伪随机顺序给出。对于类似于A-SAI的T-SAI，首先确定EMT1000。然后，刺激切换到磁刺激，并以通常的方式确定热点。然后，程序以类似于其他跟踪协议的方式确定RMT200。此外，该程序直接进入跟踪SAI，电激励和磁性测试激励之间的ISI以1 ms的步长从N20-2增加到N20 + 12 ms。
图6显示LAI为A-LAI（图6A）和T-LAI并联（图6B）。用于记录长间隔传入抑制的LAI协议与SAI相同，只是由于间隔要长得多（200至1000 ms，以100 ms的步长），因此N20间隔被忽略并且不必输入。
图 1：设置。 设置包括使用八字线圈进行刺激，使用表面电极进行记录，安装有软件的计算机，TMS机器，用于消除50-60 Hz电气干扰的噪声消除器，隔离的线性双极恒流刺激器，肌电图放大器和数据采集系统。缩写：TMS = 经颅磁刺激。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：A-SICI和T-SICI绘制为1 ms至7 ms的互刺激间隔的函数 （A）A-SICI绘制为条件响应的幅度，占对照的百分比。（B）T-SICI绘制为阈值变化（抑制占对照的百分比）。缩写：A-SICI = 短间隔皮质内抑制的振幅;T-SICI = 短间隔皮质内抑制的阈值变化;MEP = 电机诱发电位;RMT = 静止运动阈值。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：A-LICI和T-LICI绘制为从1 ms到300 ms的互刺激间隔的函数， （A）A-LICI绘制为条件响应的幅度作为对照的百分比。（B）T-LICI绘制为阈值变化（抑制占对照的百分比）。缩写：A-SICI = 短间隔皮质内抑制的振幅;T-SICI = 短间隔皮质内抑制的阈值变化;MEP = 电机诱发电位;RMT = 静止运动阈值。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：A-SICF和T-SICF绘制为从1 ms到4.9 ms的互刺激间隔的函数 （A）A-SICF绘制为条件响应的幅度作为对照的百分比。（B）T-SICF绘制为阈值变化（抑制占对照的百分比）。缩写：A-SICF = 皮质内促进的短间隔振幅;T-SICF = 短间隔皮质内促进的阈值变化;MEP = 电机诱发电位;RMT = 静止运动阈值。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：A-SAI 和 T-SAI 绘制为 20 ms 至 35 ms 间刺激间隔的函数， （A） A-SAI 绘制为条件响应幅度作为对照的百分比。（B）T-SAI绘制为阈值变化（抑制占对照的百分比）。缩写：A-SAI = 短潜伏期传入抑制的幅度;T-SAI = 短潜伏期传入抑制的阈值变化;MEP = 电机诱发电位;RMT = 静止运动阈值。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 6：A-LAI 和 T-LAI 绘制为 200 ms 至 1000 ms 的互刺激间隔的函数， （A） A-LAI 绘制为条件响应幅度作为对照的百分比。（B）T-LAI绘制为阈值变化（抑制占对照的百分比）。缩写：A-LAI = 长潜伏期传入抑制的幅度;T-LAI = 长潜伏期传入抑制的阈值变化;MEP = 电机诱发电位;RMT = 静止运动阈值。 请点击此处查看此图的放大版本。
表 1： 软件中可用的 TMS 协议。缩写： TMS = 经颅磁刺激;SICI =皮质内抑制短间隔;SICF = 皮质内促进短间隔;LICI = 长间隔皮质内抑制;SAI = 短潜伏期传入抑制;LAI = 长潜伏期传入抑制;μV = 微伏。 请点击此处下载此表格。
Discussion
TMS测量在记录软件中编程，是一个高度自动化的过程。但是，需要特别注意获得可靠的结果。在记录阶段，重要的是要确保热点上具有一致的MEP响应，然后在整个记录过程中将线圈保持在相对于被摄体头骨的相同位置。由于警惕性对皮质兴奋性有显著影响20，因此需要特别注意保持受试者放松但警觉。
为了保持主题的警觉性，应定期提出简短的问题。此外，检查者应密切关注肌肉收缩，以确定目标肌肉是否受到刺激。此外，检查员除了检查泳帽上的轮廓外，还应监视屏幕以观察MEP振幅或阈值变化是否表明任何线圈位移。如果线圈已移位，用户应尝试使用图纸将其更换到位。如果此操作失败，则应重新启动录制。在这些协议中，通过ISI的伪随机顺序和在每组三对刺激之后给出单独测试的刺激，线圈位移的影响最小化。使TMS线圈的位置能够实时跟踪的另一种方法是通过神经导航系统。此类系统在商业上可用且有效;但是，高昂的成本限制了它们的使用。请注意，这里没有提供ALS或其他神经退行性疾病患者的数据。这些患者可能出现其他挑战，例如外周运动神经元缺失引起的低振幅、自发活动和不可兴奋。
本研究中的所有协议（单脉冲和成对脉冲）都是使用连接到Bistim2 模块的八位数线圈（Magstim，D70远程线圈）进行的。这样做是为了保持协议之间磁场的可比强度，因为当通过Bistim模块时，刺激会衰减。系统被设置为独立Bistim触发模式，允许对两个Magstim 2002 装置进行单独的外部触发。对于单脉冲协议，其中一个单元的强度设置为0%MSO。录制是使用录制协议进行的，录制协议是软件程序的一部分。对于其他类型的磁刺激器，只需要一个单元。
TMS方法的一个局限性是可变性。先前的研究表明，同一受试者的个体间变异性高于日内或日间变异性19，21。应注意方法的标准化，并消除可能影响可靠性的技术错误。TMS不能用于某些疾病，例如起搏器或癫痫患者。应遵守国际安全规则22。此外，可能会出现轻微的不适，特别是如果使用圆形线圈23 。然而，这种不适通常是最小的，并且不需要导致检查的中断。
与现有方法相比，本手稿中描述的方法在记录和分析方面都是自动化的。这允许由单个操作员执行记录，并且操作员除了将线圈保持在同一位置外，不需要干扰任何其他操作。每个协议被设计为需要大约10分钟，这使得在一小时内运行多个协议成为可能，而使用现有的手动方法，一个协议可能需要花费的时间。在本研究中，磁刺激每4秒传递一次;然而，其他磁性设备允许更快的刺激，允许每个协议的记录持续时间减少到不到5分钟。这里描述的软件还允许选择不同的ISI，每个ISI的刺激数量以及条件刺激水平。这里描述的方法的一个主要进步是门控功能，当主体不放松时，它会自动删除痕迹。
总之，这里描述的方法可以为理解几种脑部疾病的潜在机制提供宝贵的信息，特别是神经退行性疾病，如ALS，并且可能具有诊断价值。对于不同的患者群体和更大的群体，需要进一步的研究来确定常规和阈值跟踪TMS测量的诊断价值，以及这些措施是否确实可以用作神经退行性疾病的生物标志物。记录不同肌肉以及上肢和下肢TMS的研究也是有道理的。
Disclosures
HB和JH从UCL获得本研究中使用的Qtrac软件销售版税。其他作者没有潜在的利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了Lundbeck基金会（资助编号R290-2018-751）和丹麦独立研究基金（资助编号：9039-00272B）的两笔赠款的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 Hz Noise Eliminator | Digitimer Ltd | Humbug | |
| Analogue-to-Digital Converter | National Instruments | NI-6221 | |
| Recording program | Digitimer Ltd (copyright University College London) | QtracS.EXE | |
| TMS recording protocol | Digitimer Ltd (copyright QTMS Science) | QTMSG-12 recording protocol | |
| Disposable surface recording electrodes | AMBU | Ambu® BlueSensor NF | |
| Figure-of-8 coil | Magstim Co. Ltd, Whiteland, Wales, UK | Magstim® D70 Remote Coil | |
| Isolated EMG amplifier | Digitimer Ltd | D440 | |
| Isolated linear bipolar constant-current stimulator | Digitimer Ltd | DS5 | |
| TMS device | Magstim Co. Ltd, Whiteland, Wales, UK | Magstim® 2002 stimulators (2 MagStim units are required ) | |
| Analysis and plotting program | Digitimer Ltd (copyright University College London) | QtracP.EXE |
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