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Biochemistry

जेयूएमपीएन: प्रोटिओमिक्स में प्रोटीन सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग और नेटवर्क विश्लेषण के लिए एक सुव्यवस्थित अनुप्रयोग

Published: October 19, 2021 doi: 10.3791/62796
Automatic Translation
1, 1,2, 2, 2, 2,3, 2, 2, 1,2, 1,2
1Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children’s Research Hospital, 2Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children’s Research Hospital, 3Department of Computational Biology, St. Jude Children’s Research Hospital

Summary

हम डेटा प्री-प्रोसेसिंग, सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग, मार्ग संवर्धन और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन नेटवर्क विश्लेषण सहित एक विस्तृत प्रोटोकॉल के साथ मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स डेटा के लिए नेटवर्क विश्लेषण करने और कल्पना करने के लिए एक सिस्टम जीव विज्ञान उपकरण जेयूएमपीएन प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स प्रौद्योगिकियों में हालिया प्रगति के साथ, सैकड़ों प्रोटिओम की गहरी प्रोफाइलिंग तेजी से संभव हो गई है। हालांकि, इस तरह के मूल्यवान डेटासेट से जैविक अंतर्दृष्टि प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण है। यहां हम मॉड्यूल (जैसे, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स) द्वारा जुड़े नमूनों और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) नेटवर्क में प्रोटीन सह-अभिव्यक्ति समूहों में प्रोटीन सह-अभिव्यक्ति समूहों में प्रोटिओम को व्यवस्थित करने के लिए एक सिस्टम जीव विज्ञान-आधारित सॉफ़्टवेयर जेयूपीएन और इसके संबंधित प्रोटोकॉल का परिचय देते हैं। चमकदार मंच का उपयोग करते हुए, जेयूएमपीएन सॉफ्टवेयर एकीकृत डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफ़ेस के साथ सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग, मार्ग संवर्धन और पीपीआई मॉड्यूल का पता लगाने के विश्लेषण को सुव्यवस्थित करता है। प्रोटोकॉल के मुख्य चरणों में जेयूएमपीएन सॉफ्टवेयर की स्थापना, अलग-अलग व्यक्त प्रोटीन या (डिस) विनियमित प्रोटिओम की परिभाषा, सार्थक सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर और पीपीआई मॉड्यूल का निर्धारण और परिणाम विज़ुअलाइज़ेशन शामिल हैं। जबकि प्रोटोकॉल को आइसोबेरिक लेबलिंग-आधारित प्रोटिओम प्रोफाइल का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है, जेयूएमपीएन आमतौर पर मात्रात्मक डेटासेट (जैसे, लेबल-मुक्त प्रोटिओमिक्स) की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होता है। इस प्रकार जेयूएमपीएन सॉफ्टवेयर और प्रोटोकॉल मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स में जैविक व्याख्या की सुविधा के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं।

Introduction

मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित शॉटगन प्रोटिओमिक्स जटिल नमूनों की प्रोटिओम विविधता का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण दृष्टिकोण बन गयाहै 1. मास स्पेक्ट्रोमेट्री इंस्ट्रूमेंटेशन2,3, क्रोमैटोग्राफी 4,5, आयन गतिशीलता का पता लगाने6, अधिग्रहण विधियों (डेटा-स्वतंत्र7 और डेटा-निर्भर अधिग्रहण8), मात्रा का ठहराव दृष्टिकोण (मल्टी-प्लेक्स आइसोबेरिक पेप्टाइड लेबलिंग विधि, जैसे, टीएमटी 9,10, और लेबल-मुक्त मात्रा का ठहराव11,12) और डेटा विश्लेषण रणनीतियों में हालिया प्रगति के साथ / सॉफ्टवेयर विकास 13,14,15,16,17,18, पूरे प्रोटिओम (जैसे, 10,000 से अधिक प्रोटीन) की मात्रा का ठहराव अब नियमितरूप से 19,20,21 है। हालांकि, इस तरह के गहरे मात्रात्मक डेटासेट से यंत्रवत अंतर्दृष्टि कैसे प्राप्त करें अभी भी चुनौतीपूर्ण है22. इन डेटासेट की जांच के लिए प्रारंभिक प्रयास मुख्य रूप से डेटा के व्यक्तिगत तत्वों के एनोटेशन पर निर्भर थे, प्रत्येक घटक (प्रोटीन) को स्वतंत्र रूप से इलाज करते थे। हालांकि, जैविक प्रणालियों और उनके व्यवहार को केवल व्यक्तिगत घटकों की जांच करके समझाया नहीं जा सकताहै 23. इसलिए, एक सिस्टम दृष्टिकोण जो इंटरैक्शन नेटवर्क के संदर्भ में मात्रात्मक बायोमोलेक्यूल्स को रखता है, जटिल प्रणालियों और संबंधित प्रक्रियाओं जैसे भ्रूणजनन, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और मानव रोगों के रोगजनन की समझ के लिए आवश्यक है।

नेटवर्क-आधारित सिस्टम जीव विज्ञान बड़े पैमाने पर मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स डेटा 25,26,27,28,29,30,31,32,33 का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली प्रतिमान के रूप में उभरा है। संकल्पनात्मक रूप से, स्तनधारी कोशिकाओं जैसे जटिल प्रणालियों को पदानुक्रमित नेटवर्क34,35 के रूप में मॉडलिंग किया जा सकता है, जिसमें पूरी प्रणाली को स्तरों में दर्शाया जाता है: पहले कई बड़े घटकों द्वारा, जिनमें से प्रत्येक तब छोटे उपप्रणालियों द्वारा पुनरावृत्त रूप से मॉडलिंग की जाती है। तकनीकी रूप से, प्रोटिओम गतिशीलता की संरचना को सह-व्यक्त प्रोटीन समूहों के परस्पर जुड़े नेटवर्क द्वारा प्रस्तुत किया जा सकता है (क्योंकि सह-व्यक्त जीन / प्रोटीन अक्सर समान जैविक कार्यों या विनियमन36 के तंत्र को साझा करते हैं) और शारीरिक रूप से बातचीत पीपीआई मॉड्यूल37। हाल के उदाहरण के रूप में, हमने टी सेल सक्रियण के दौरान पूरे प्रोटिओम और फॉस्फोप्रोटिओम के अस्थायी प्रोफाइल उत्पन्न किए और कार्यात्मक मॉड्यूल की पहचान करने के लिए पीपीआई के साथ एकीकृत सह-अभिव्यक्ति नेटवर्क का उपयोग किया जो टी-सेल क्विसेंस निकास की मध्यस्थता करते हैं। कई बायोएनर्जेटिक-संबंधित मॉड्यूल को हाइलाइट किया गया और प्रयोगात्मक रूप से मान्य किया गया (उदाहरण के लिए, माइटोरिबोसोम और जटिल चतुर्थ मॉड्यूल25, और एक-कार्बन मॉड्यूल38)। एक अन्य उदाहरण26 में, हमने अल्जाइमर रोग के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए अपने दृष्टिकोण को आगे बढ़ाया, और सफलतापूर्वक रोग प्रगति से जुड़े प्रोटीन मॉड्यूल और अणुओं को प्राथमिकता दी। महत्वपूर्ण बात यह है कि हमारी कई निष्पक्ष खोजों को स्वतंत्र रोगीसमूहों 26,29 और / या रोग माउस मॉडल 26 द्वारा मान्य किया गया था। इन उदाहरणों ने मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स और अन्य ओमिक्स एकीकरण के साथ आणविक तंत्र को विच्छेदन करने के लिए सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण की शक्ति को चित्रित किया।

यहां हम जेयूएमपीएन पेश करते हैं, एक सुव्यवस्थित सॉफ्टवेयर जो नेटवर्क-आधारित सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण का उपयोग करके मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स डेटा की पड़ताल करता है। जेयूएमपीएन स्थापित जंप प्रोटिओमिक्स सॉफ्टवेयर सूट13,14,39 के डाउनस्ट्रीम घटक के रूप में कार्य करता है, और इसका उद्देश्य सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण का उपयोग करके व्यक्तिगत प्रोटीन परिमाणीकरण से जैविक रूप से सार्थक मार्गों और प्रोटीन मॉड्यूल तक की खाई को भरना है। इनपुट के रूप में अलग-अलग व्यक्त (या सबसे चर) प्रोटीन के परिमाणीकरण मैट्रिक्स को लेकर, जेयूएमपीएन का उद्देश्य नमूनों और घने रूप से जुड़े पीपीआई मॉड्यूल (जैसे, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स) में सह-व्यक्त प्रोटीन क्लस्टर के एक स्तरीय पदानुक्रम में प्रोटिओम को व्यवस्थित करना है, जो आगे ओवर-प्रतिनिधित्व (या संवर्धन) विश्लेषण (चित्रा 1) द्वारा सार्वजनिक मार्ग डेटाबेस के साथ एनोटेट किए जाते हैं। चमकदार प्लेटफ़ॉर्म40 के साथ उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफ़ेस के लिए विकसित किया गया है और तीन प्रमुख कार्यात्मक मॉड्यूल को एकीकृत करता है: सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग विश्लेषण, मार्ग संवर्धन विश्लेषण और पीपीआई नेटवर्क विश्लेषण (चित्रा 1)। प्रत्येक विश्लेषण के बाद, परिणाम स्वचालित रूप से विज़ुअलाइज़ किए जाते हैं और आर / चमकदार विजेट फ़ंक्शंस के माध्यम से समायोज्य होते हैं और माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल प्रारूप में प्रकाशन तालिकाओं के रूप में आसानी से डाउनलोड करने योग्य होते हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम एक उदाहरण के रूप में मात्रात्मक पूरे प्रोटिओम डेटा का उपयोग करते हैं और जेयूएमपीएन का उपयोग करने के प्रमुख चरणों का वर्णन करते हैं, जिसमें जेयूएमपीएन सॉफ्टवेयर की स्थापना, अलग-अलग व्यक्त प्रोटीन की परिभाषा या (डिस) विनियमित प्रोटिओम, सह-अभिव्यक्ति नेटवर्क विश्लेषण, और पीपीआई मॉड्यूल विश्लेषण, परिणाम दृश्य और व्याख्या, और परेशानी की शूटिंग शामिल है। जेयूएमपीएन सॉफ्टवेयर गिटहब41 पर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में, जेयूएमपीएन का उपयोग टीएमटी आइसोबेरिक लेबल अभिकर्मक27 द्वारा निर्धारित बी सेल भेदभाव के दौरान पूरे प्रोटिओम प्रोफाइलिंग के प्रकाशित डेटासेट का उपयोग करके सचित्र है।

1. जेयूपीएन सॉफ्टवेयर की स्थापना

नोट: जेयूएमपीएन सॉफ़्टवेयर स्थापित करने के लिए दो विकल्प प्रदान किए जाते हैं: (i) व्यक्तिगत उपयोग के लिए स्थानीय कंप्यूटर पर स्थापना; और (ii) एकाधिक उपयोगकर्ताओं के लिए दूरस्थ शाइनी सर्वर पर JUMPn की तैनाती। स्थानीय स्थापना के लिए, इंटरनेट एक्सेस और ≥4 जीबी रैम वाला एक व्यक्तिगत कंप्यूटर एक छोटे नमूना आकार (एन < 30) के साथ डेटासेट के लिए जेयूएमपीएन विश्लेषण चलाने के लिए पर्याप्त है; बड़े-पलटन विश्लेषण (जैसे, एन = 200 नमूने) के लिए बड़ी रैम (जैसे, 16 जीबी) की आवश्यकता होती है।

  1. सॉफ़्टवेयर को स्थानीय कंप्यूटर पर स्थापित करें। स्थापना के बाद, वेब ब्राउज़र को JUMPn लॉन्च करने की अनुमति दें और विश्लेषण को स्थानीय कंप्यूटर पर चलने दें।
    1. ऑनलाइन निर्देशों का पालन करते हुए एनाकोंडा42 या मिनीकोंडा43 स्थापित करें।
    2. जेयूएमपीएन स्रोत कोड41 डाउनलोड करें। डाउनलोड की गई फ़ाइल को अनज़िप करने के लिए डबल क्लिक करें JUMPn_v_1.0.0.zip; JUMPn_v_1.0.0 नामका एक नया फ़ोल्डर बनाया जाएगा।
    3. कमांड लाइन टर्मिनल खोलें। विंडोज पर, एनाकोंडा प्रॉम्प्ट का उपयोग करें। मैकओएस पर, अंतर्निहित टर्मिनल एप्लिकेशन का उपयोग करें।
    4. JUMPn कोंडा वातावरण बनाएँ: JUMPn_v_1.0.0 फ़ोल्डर का पूर्ण पथ प्राप्त करें (उदाहरण JUMPn_v_1 के लिए, / पथ / बनाने और एक खाली कोंडा वातावरण को सक्रिय करने के लिए टर्मिनल पर निम्न आदेश टाइप करें
      कोंडा बनाएँ -पी/पथ/करने के लिए/JUMPn_v_1.0.0/जेयूएमपीएन -वाई
      कोंडा सक्रिय /पथ/करने के लिए/JUMPn_v_1.0.0/जेयूएमपीएन
    5. JUMPn निर्भरताएँ स्थापित करें: R स्थापित करें (टर्मिनल पर, प्रकार कोंडा स्थापित करें -c कोंडा-फोर्ज r = 4.0.0 -y), वर्तमान निर्देशिका को JUMPn_v_1.0.0 फ़ोल्डर में परिवर्तित करें (टर्मिनल पर, cd पथ/करने/JUMPn_v_1.0.0 टाइप करें), और निर्भरता पैकेज (टर्मिनल पर, Rscript बूटस्ट्रैप टाइप करें) स्थापित करें। R)
    6. वेब ब्राउज़र पर जेयूएमपीएन लॉन्च करें: वर्तमान निर्देशिका को निष्पादन फ़ोल्डर में बदलें (टर्मिनल पर, सीडी निष्पादन टाइप करें) और जेयूएमपीएन लॉन्च करें (टर्मिनल पर, टाइप आर -ई "चमकदार:: रनऐप ()")
    7. एक बार उपरोक्त निष्पादित होने के बाद, टर्मिनल स्क्रीन http://127.0.0.1: XXXX (यहां XXXX 4 यादृच्छिक संख्याओं को इंगित करता है) पर सुनना दिखाएगा। वेब ब्राउज़र पर http:///127.0.0.1:XXXX को कॉपी और पेस्ट करें, जिस पर JUMPn स्वागत पृष्ठ दिखाई देगा (चित्रा 2)।
  2. शाइनी सर्वर पर परिनियोजन. शाइनी सर्वर के उदाहरणों में वाणिज्यिक shinyapps.io सर्वर या कोई संस्थागत रूप से समर्थित शाइनी सर्वर शामिल हैं।
    1. डाउनलोड करें और निर्देश44 का पालन RStudio स्थापित करें।
    2. शाइनी सर्वर के लिए परिनियोजन अनुमति प्राप्त करें। shinyapps.io सर्वर के लिए, निर्देश45 का पालन करके उपयोगकर्ता खाता सेट करें। संस्थागत शाइनी सर्वर के लिए, अनुमतियों का अनुरोध करने के लिए सर्वर व्यवस्थापक से संपर्क करें।
    3. स्थानीय मशीन के लिए जेयूएमपीएन स्रोत कोड41 डाउनलोड करें; स्थापना आवश्यक नहीं है। या तो सर्वर खोलें। आर या यूआई। आरस्टूडियो में फ़ाइलें और आरस्टूडियो आईडीई के ऊपरी दाईं ओर सर्वर पर प्रकाशित करें ड्रॉप-डाउन मेनू पर क्लिक करें।
    4. खाता पैनल में प्रकाशित करें, सर्वर पता टाइप करें। प्रकाशित करें बटन दबाएँ। सफल परिनियोजन RStudio से RShiny सर्वर जहाँ अनुप्रयोग परिनियोजित किया गया था करने के लिए स्वचालित रीडायरेक्ट पर मान्य है।

2. एक उदाहरण डेटासेट का उपयोग करके डेमो चलाएं

नोट: जेयूएमपीएन प्रकाशित बी सेल प्रोटिओमिक्स डेटासेट का उपयोग करके एक डेमो रन प्रदान करता है। डेमो रन एक सुव्यवस्थित वर्कफ़्लो को दर्शाता है जो इनपुट के रूप में अलग-अलग व्यक्त प्रोटीन के परिमाणीकरण मैट्रिक्स को लेता है और क्रमिक रूप से सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग, मार्ग संवर्धन और पीपीआई नेटवर्क विश्लेषण करता है।

  1. जेयूएमपीएन होम पेज (चित्रा 2) पर, जेयूएमपीएन विश्लेषण शुरू करने के लिए विश्लेषण शुरू करें बटन पर क्लिक करें।
  2. प्रारंभ विश्लेषण पृष्ठ (चित्रा 3) के निचले बाएं कोने में, अपलोड डेमो बी सेल प्रोटिओमिक डेटा बटन पर क्लिक करें; डेटा अपलोड की सफलता को सूचित करने वाला एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा।
  3. पृष्ठ के निचले दाएं कोने में, डिफ़ॉल्ट पैरामीटर का उपयोग करके डेमो रन शुरू करने के लिए सबमिट जेयूएमपीएन विश्लेषण बटन पर क्लिक करें; एक प्रगति पट्टी दिखाई देगी जो विश्लेषण के पाठ्यक्रम को दर्शाती है। प्रगति पट्टी पूरी होने तक प्रतीक्षा करें (3 मिनट अपेक्षित)।
  4. एक बार डेमो रन समाप्त हो जाने के बाद, सफलता रन संदेश और परिणाम फ़ोल्डर के पूर्ण पथ के साथ एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा। जारी रखने के लिए जारी रखें परिणाम पर क्लिक करें।
  5. वेबपेज पहले उपयोगकर्ता को डब्ल्यूजीसीएनए द्वारा सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर परिणामों के लिए मार्गदर्शन करेगा। जारी रखने के लिए संवाद विंडो पर परिणाम देखें पर क्लिक करें।
  6. परिणाम पृष्ठ 1: डब्ल्यूजीसीएनए आउटपुट पृष्ठ के बाईं ओर प्रोटीन सह-अभिव्यक्ति पैटर्न ढूंढें। दो आकृति स्वरूपों के बीच नेविगेट करने के लिए अभिव्यक्ति स्वरूप का चयन करें ड्रॉप-डाउन बॉक्स पर क्लिक करें:
    1. रुझान साजिश प्रदर्शित करने के लिए रुझानों का चयन करें, प्रत्येक पंक्ति नमूनों में व्यक्तिगत प्रोटीन बहुतायत का प्रतिनिधित्व करती है। प्रत्येक पंक्ति का रंग दर्शाता है कि अभिव्यक्ति पैटर्न सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर सर्वसम्मति के कितने करीब है (यानी, डब्ल्यूजीसीएनए एल्गोरिथ्म द्वारा परिभाषित "ईजेनजेन")।
    2. प्रत्येक नमूने के लिए बॉक्सप्लॉट प्रारूप में सह-अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शित करने के लिए बॉक्सप्लॉट का चयन करें।
  7. डब्ल्यूजीसीएनए आउटपुट पेज के दाईं ओर मार्ग /ऑन्कोलॉजी संवर्धन हीटमैप देखें। प्रत्येक क्लस्टर के लिए सबसे अधिक समृद्ध मार्ग एक हीटमैप में एक साथ प्रदर्शित होते हैं, जिसमें रंग की तीव्रता बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजित पी-वैल्यू को दर्शाती है।
  8. व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए अभिव्यक्ति पैटर्न देखने के लिए वेबपेज को नीचे स्क्रॉल करें।
    1. ड्रॉप-डाउन बॉक्स का उपयोग करें प्रत्येक क्लस्टर से प्रोटीन देखने के लिए सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर का चयन करें (डिफ़ॉल्ट क्लस्टर 1 है)। तालिका में एक विशिष्ट प्रोटीन का चयन करें, जिस पर तालिका के नीचे बार प्लॉट स्वचालित रूप से इसकी प्रोटीन बहुतायत को प्रतिबिंबित करने के लिए अपडेट किया जाएगा।
    2. एक विशिष्ट प्रोटीन के लिए तालिका के दाईं ओर खोज बॉक्स का उपयोग करके विशिष्ट प्रोटीन नाम खोजें।
  9. पीपीआई परिणाम देखने के लिए, शीर्ष पर परिणाम पृष्ठ 2: पीपीआई आउटपुट पर क्लिक करें।
  10. किसी विशिष्ट सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर (डिफ़ॉल्ट क्लस्टर 1 है) के लिए परिणाम देखने के लिए सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर का चयन करें पर क्लिक करें। इस पृष्ठ पर सभी आकृति पैनलों के डिस्प्ले को नए चयनित क्लस्टर के लिए अपडेट किया जाएगा।
  11. बाएं आकृति पैनल पर चयनित सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर के लिए पीपीआई नेटवर्क देखें:
    1. नेटवर्क के भीतर अलग-अलग पीपीआई मॉड्यूल हाइलाइट करने के लिए समूह द्वारा चयन करें ड्रॉप-डाउन बॉक्स क्लिक करें। नेटवर्क लेआउट परिवर्तित करने के लिए नेटवर्क लेआउट स्वरूप का चयन करें ड्रॉप-डाउन बॉक्स पर क्लिक करें (डिफ़ॉल्ट फ्रुचरमैन रेनगोल्ड द्वारा है).
    2. चरण 2.11.3-2.11.5 करने के लिए माउस और ट्रैकपैड का उपयोग करें।
    3. आवश्यकतानुसार पीपीआई नेटवर्क को ज़ूम इन या ज़ूम आउट करें। पर्याप्त रूप से ज़ूम इन करने पर नेटवर्क में प्रत्येक नोड के जीन नाम दिखाए जाएंगे।
    4. ज़ूम इन करने पर, उस प्रोटीन और उसके नेटवर्क पड़ोसियों को हाइलाइट करने के लिए एक निश्चित प्रोटीन का चयन करें और क्लिक करें।
    5. लेआउट में अपनी स्थिति बदलने के लिए नेटवर्क में एक निश्चित नोड (प्रोटीन) खींचें; जिससे नेटवर्क लेआउट को उपयोगकर्ता द्वारा फिर से व्यवस्थित किया जा सकता है।
  12. पीपीआई परिणाम पृष्ठ के दाएँ पैनल पर, सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर-स्तर की जानकारी देखें जो पीपीआई परिणामों की व्याख्या में सहायता करती है:
    1. चयनित क्लस्टर के सह-अभिव्यक्ति प्रतिमान को डिफ़ॉल्ट रूप से बॉक्सप्लॉट के रूप में देखें.
    2. अधिक जानकारी के लिए अभिव्यक्ति स्वरूप का चयन करें ड्रॉप-डाउन बॉक्स पर क्लिक करें या चरण 2.12.3-2.12.5 में वर्णित के रूप में प्रदर्शित करता है।
    3. सह-अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए रुझान प्लॉट दिखाने के लिए रुझानों का चयन करें।
    4. सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर के लिए काफी समृद्ध मार्ग दिखाने के लिए पाथवे बारप्लॉट का चयन करें।
    5. सर्कल प्लॉट प्रारूप में सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर के लिए काफी समृद्ध मार्ग दिखाने के लिए पाथवे सर्कल प्लॉट का चयन करें।
  13. व्यक्तिगत पीपीआई मॉड्यूल स्तर पर परिणाम देखने के लिए परिणाम पृष्ठ 2: पीपीआई आउटपुट वेबपेज को नीचे स्क्रॉल करें। प्रदर्शन के लिए एक विशिष्ट पीपीआई मॉड्यूल का चयन करने के लिए मॉड्यूल ड्रॉप-डाउन बॉक्स पर क्लिक करें (क्लस्टर 1: मॉड्यूल 1 डिफ़ॉल्ट रूप से दिखाया गया है)।
  14. बाएं पैनल पर पीपीआई मॉड्यूल देखें। नेटवर्क प्रदर्शन में हेरफेर करने के लिए, चरण 2.11.2-2.11.5 का पालन करें।
  15. सही पैनल पर मार्ग /ऑन्कोलॉजी संवर्धन परिणाम देखें। अधिक जानकारी और प्रदर्शन के लिए पाथवे एनोटेशन शैली ड्रॉप-डाउन का चयन करें बॉक्स पर क्लिक करें:
    1. चयनित पीपीआई मॉड्यूल के लिए काफी समृद्ध मार्ग दिखाने के लिए बारप्लॉट का चयन करें।
    2. सर्कल प्लॉट के प्रारूप में चयनित पीपीआई मॉड्यूल के लिए काफी समृद्ध मार्ग दिखाने के लिए सर्कल प्लॉट का चयन करें।
    3. चयनित पीपीआई मॉड्यूल से काफी समृद्ध मार्ग और संबंधित जीन नाम दिखाने के लिए हीटमैप का चयन करें।
    4. विस्तृत मार्ग संवर्धन परिणाम दिखाने के लिए तालिका का चयन करें, जिसमें मार्ग /ऑन्कोलॉजी शब्दों, जीन नामों और फिशर के सटीक परीक्षण द्वारा पी-मान का नाम शामिल है।
  16. प्रकाशन तालिका को स्प्रेडशीट प्रारूप में देखें: पूर्ण पथ का पालन करें (दोनों परिणाम पृष्ठों के शीर्ष पर मुद्रित) और व्यापक सारांश.xlsx नामक प्रकाशन स्प्रेडशीट तालिका ढूंढें।

3. इनपुट फ़ाइल तैयार करना और जेयूएमपीएन पर अपलोड करना

नोट: जेयूएमपीएन इनपुट के रूप में या तो अलग-अलग व्यक्त प्रोटीन (पर्यवेक्षित विधि) या सबसे चर प्रोटीन (असुरक्षित विधि) के परिमाणीकरण मैट्रिक्स के रूप में लेता है। यदि परियोजना का लक्ष्य कई स्थितियों (जैसे, विभिन्न रोग समूहों, या जैविक प्रक्रिया के समय-श्रृंखला विश्लेषण) में बदले गए प्रोटीन को समझना है, तो डीई विश्लेषण करने की पर्यवेक्षित विधि को प्राथमिकता दी जाती है; अन्यथा, सबसे चर प्रोटीन का चयन करने का एक असुरक्षित दृष्टिकोण खोजपूर्ण उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. पंक्तियों के रूप में प्रत्येक प्रोटीन और स्तंभों के रूप में प्रत्येक नमूने के साथ प्रोटीन परिमाणीकरण तालिका उत्पन्न करें। आधुनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स सॉफ्टवेयर सूट (जैसे, जंप सूट 13,14,39, प्रोटिओम डिस्कवरर, मैक्सक्वांट15,46) के माध्यम से इसे प्राप्त करें।
  2. चर प्रोटिओम को परिभाषित करें।
    1. विभेदक रूप से व्यक्त (डीई) प्रोटीन को परिभाषित करने के लिए प्रोटिओमिक्स सॉफ़्टवेयर सूट द्वारा प्रदान किए गए सांख्यिकीय विश्लेषण परिणामों का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, समायोजित पी-मान < 0.05 के साथ)।
    2. वैकल्पिक रूप से, उपयोगकर्ता डीई या अधिकांश चर प्रोटीन को परिभाषित करने के लिए उदाहरण आर कोड47 का पालन कर सकते हैं।
  3. परिभाषित चर प्रोटिओम का उपयोग करके इनपुट फ़ाइल को स्वरूपित करें।
    नोट: आवश्यक इनपुट फ़ाइल प्रारूप (चित्रा 4) में एक शीर्ष लेख पंक्ति शामिल है; स्तंभों में प्रोटीन परिग्रहण (या कोई अद्वितीय आईडी), जीएन (आधिकारिक जीन प्रतीक), प्रोटीन विवरण (या कोई उपयोगकर्ता द्वारा प्रदान की गई जानकारी) शामिल हैं, इसके बाद व्यक्तिगत नमूनों का प्रोटीन परिमाणीकरण होता है।
    1. चरण 3.1 में निर्दिष्ट स्तंभों के क्रम का पालन करें, लेकिन शीर्ष लेख के स्तंभ नाम उपयोगकर्ता के लिए लचीले हैं।
    2. टीएमटी (या इसी तरह) मात्रात्मक प्रोटिओम के लिए, इनपुट परिमाणीकरण मूल्यों के रूप में सारांशित टीएमटी रिपोर्टर तीव्रता का उपयोग करें। लेबल मुक्त डेटा के लिए, या तो सामान्यीकृत वर्णक्रमीय गणना (जैसे, एनएसएएफ48) या तीव्रता-आधारित विधि (जैसे, मैक्सक्वांट46 द्वारा रिपोर्ट की गई एलएफक्यू तीव्रता या आईबीएक्यू प्रोटीन तीव्रता) का उपयोग करें।
    3. लापता मान JUMPn विश्लेषण के लिए अनुमति दी जाती है। परिमाणीकरण मैट्रिक्स में एनए के रूप में इन्हें लेबल करना सुनिश्चित करें। हालांकि, केवल 50% से अधिक नमूनों में मात्रा का ठहराव के साथ प्रोटीन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    4. परिणामी इनपुट फ़ाइल को .txt, .xlsx, या .csv स्वरूप के रूप में सहेजें (तीनों JUMPn द्वारा समर्थित हैं)।
  4. इनपुट फ़ाइल अपलोड करें:
    1. ब्राउज़र बटन पर क्लिक करें और इनपुट फ़ाइल (चित्रा 3, बाएं पैनल) का चयन करें; फ़ाइल प्रारूप (एक्सएलएसएक्स, सीएसवी, और टीएक्सटी समर्थित हैं) स्वचालित रूप से पता लगाया जाएगा।
    2. यदि इनपुट फ़ाइल में तीव्रता जैसी मात्रा का ठहराव मान (उदाहरण के लिए, जंप सूट39 द्वारा उत्पन्न) या अनुपात-जैसे (जैसे, प्रोटिओम डिस्कवरर से) शामिल हैं, तो डेटा विकल्प के निष्पादन लॉग 2-ट्रांसफ़ॉर्मेशन के लिए हाँ का चयन करें; अन्यथा, डेटा पहले से ही लॉग-ट्रांसफ़ॉर्म किया गया हो सकता है, इसलिए इस विकल्प के लिए नहीं का चयन करें।

4. सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग विश्लेषण

नोट: हमारे समूह 25,26,27 और अन्य 28,29,31 ने डब्ल्यूजीसीएनए49 को मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग विश्लेषण के लिए एक प्रभावी तरीका साबित किया है। जेयूएमपीएन डब्ल्यूजीसीएनए विश्लेषण25,50 के लिए 3-चरणीय प्रक्रिया का अनुसरण करता है: (i) टोपोलॉजिकल ओवरलैप मैट्रिक्स (टीओएम; जीन / प्रोटीन के बीच मात्रा का ठहराव समानता द्वारा निर्धारित) के आधार पर गतिशील पेड़ काटने51 द्वारा सह-अभिव्यक्ति जीन / प्रोटीन क्लस्टर की प्रारंभिक परिभाषा; (ii) अतिरेक को कम करने के लिए समान समूहों का विलय (ईजेन्जीन समानता के डेंड्रोग्राम के आधार पर); और (iii) प्रत्येक क्लस्टर के लिए जीन / प्रोटीन का अंतिम असाइनमेंट जो न्यूनतम पियर्सन सहसंबंध कटऑफ से अधिक है।

  1. डब्ल्यूजीसीएनए पैरामीटर (चित्रा 3, मध्य पैनल) कॉन्फ़िगर करें। निम्नलिखित तीन पैरामीटर क्रमशः तीन चरणों को नियंत्रित करते हैं:
    1. 30 के रूप में न्यूनतम क्लस्टर आकार सेट करें। यह पैरामीटर टीओएम-आधारित हाइब्रिड गतिशील पेड़ काटने के प्रारंभिक चरण (i) में प्रत्येक सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर के लिए आवश्यक प्रोटीन की न्यूनतम संख्या को परिभाषित करता है। मान जितना बड़ा होगा, एल्गोरिथ्म द्वारा लौटाए गए क्लस्टर की संख्या उतनी ही कम होगी।
    2. 0.2 के रूप में न्यूनतम क्लस्टर दूरी सेट करें। इस मान को बढ़ाना (उदाहरण के लिए, 0.2-0.3 से) चरण (ii) के दौरान अधिक क्लस्टर विलय का कारण बन सकता है, जिसके परिणामस्वरूप क्लस्टर की संख्या कम हो सकती है।
    3. 0.7 के रूप में न्यूनतम केएमई सेट करें। प्रोटीन को चरण (ii) में परिभाषित सबसे सहसंबद्ध क्लस्टर को सौंपा जाएगा, लेकिन इस सीमा को पार करने वाले पियर्सन सहसंबंध वाले केवल प्रोटीन को बनाए रखा जाएगा। इस चरण में विफल होने वाले प्रोटीन को किसी भी क्लस्टर (अंतिम रिपोर्ट में विफल प्रोटीन के लिए 'एनए' क्लस्टर) को असाइन नहीं किया जाएगा।
  2. विश्लेषण शुरू करें। सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग विश्लेषण सबमिट करने के दो तरीके हैं:
    1. पीपीआई नेटवर्क विश्लेषण के बाद स्वचालित रूप से डब्ल्यूजीसीएनए के व्यापक विश्लेषण को शुरू करने के लिए नीचे दाएं कोने में जेयूएमपीएन विश्लेषण सबमिट करें बटन पर क्लिक करें।
    2. वैकल्पिक रूप से, केवल डब्ल्यूजीसीएनए चरण को निष्पादित करने के लिए चुनें (विशेष रूप से पैरामीटर ट्यूनिंग के उद्देश्य से; चरण 4.2.3-4.2.4 देखें):
    3. विश्लेषण प्रारंभ करें पृष्ठ के निचले भाग में उन्नत पैरामीटर बटन पर क्लिक करें; एक नई पैरामीटर विंडो पॉप अप होगी। नीचे विजेट में, विश्लेषण के मोड का चयन करें, केवल डब्ल्यूजीसीएनए का चयन करें, फिर जारी रखने के लिए बर्खास्तगी पर क्लिक करें।
    4. विश्लेषण प्रारंभ करें पृष्ठ पर, सबमिट जेयूएमपीएन विश्लेषण बटन पर क्लिक करें।
    5. उपरोक्त किसी भी मामले में, विश्लेषण प्रस्तुत करने पर एक प्रगति पट्टी दिखाई देगी।
      नोट: एक बार विश्लेषण समाप्त हो जाने के बाद (आमतौर पर WGCNA केवल विश्लेषण के लिए 1 मिनट < और व्यापक विश्लेषण के लिए <3 मिनट), एक संवाद बॉक्स एक सफलता रन संदेश और परिणाम फ़ोल्डर के लिए पूर्ण पथ के साथ दिखाई देगा।
  3. चरण 2.4-2.8 (चित्रा 5) में सचित्र के रूप में डब्ल्यूजीसीएनए परिणामों की जांच करें। ध्यान दें कि फ़ाइल co_exp_clusters_3colums.txt का निरपेक्ष पथ परिणाम पृष्ठ के शीर्ष पर हाइलाइट किया गया है: प्रत्येक प्रोटीन की क्लस्टर सदस्यता रिकॉर्ड करने और इसे पीपीआई केवल विश्लेषण के लिए इनपुट के रूप में उपयोग करने के लिए WGCNA आउटपुट।
  4. समस्या निवारण। निम्नलिखित तीन सामान्य मामलों पर चर्चा की जाती है। एक बार पैरामीटर नीचे चर्चा के रूप में अद्यतन कर रहे हैं, नए WGCNA परिणाम उत्पन्न करने के लिए चरण 4.2.2-4.2.4 का पालन करें।
    1. यदि डेटा से एक महत्वपूर्ण सह-अभिव्यक्ति पैटर्न अपेक्षित है, लेकिन एल्गोरिथ्म द्वारा याद किया गया है, तो चरण 4.4.2-4.4.4 का पालन करें
    2. एक लापता क्लस्टर विशेष रूप से छोटे सह-अभिव्यक्ति समूहों के लिए संभावना है, अर्थात, इस पैटर्न को प्रदर्शित करने वाले प्रोटीन की केवल एक सीमित संख्या (जैसे, <30)। पुन: विश्लेषण से पहले, प्रोटीन परिमाणीकरण मैट्रिक्स की इनपुट फ़ाइल की फिर से जांच करें और कई सकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन का पता लगाएं जो उस महत्वपूर्ण सह-अभिव्यक्ति पैटर्न का पालन करते हैं।
    3. छोटे क्लस्टर को बचाने के लिए, न्यूनतम क्लस्टर आकार को कम करें (उदाहरण के लिए, 10 से कम क्लस्टर आकार मजबूत नहीं हो सकता है, इस प्रकार अनुशंसित नहीं हो सकता है), और न्यूनतम क्लस्टर दूरी को कम करें (उदाहरण के लिए, 0.1; यहां 0 के रूप में सेटिंग की भी अनुमति है, जिसका अर्थ है कि स्वचालित क्लस्टर विलय छोड़ दिया जाएगा)।
    4. अद्यतन मापदंडों के साथ सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग चरण को निष्पादित करने के बाद, सबसे पहले, जांचें कि क्लस्टर को सह-अभिव्यक्ति पैटर्न प्लॉट्स से बचाया गया है, फिर विस्तृत प्रोटीन परिमाणीकरण से अपने प्रोटीन परिग्रहण की खोज करके सकारात्मक नियंत्रण की जांच करें (खोज से पहले बाईं ओर ड्रॉप-डाउन विजेट से उपयुक्त सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर का चयन करना सुनिश्चित करें)।
      नोट: बचाव के लिए पैरामीटर ट्यूनिंग और पुन: चलाना के एकाधिक पुनरावृत्तियों की आवश्यकता हो सकती है।
    5. यदि किसी भी क्लस्टर को असाइन नहीं किए जा सकते हैं जो बहुत अधिक प्रोटीन हैं, तो चरण 4.4.6-4.4.7 का पालन करें।
      नोट: आमतौर पर, प्रोटीन का एक छोटा प्रतिशत (आमतौर पर <10%) किसी भी क्लस्टर को सौंपा नहीं जा सकता है क्योंकि वे बाहरी प्रोटीन हो सकते हैं जो डेटासेट के किसी भी सामान्य अभिव्यक्ति पैटर्न का पालन नहीं करते हैं। हालांकि, यदि ऐसा प्रतिशत महत्वपूर्ण है (उदाहरण के लिए, >30%), तो यह सुझाव देता है कि अतिरिक्त सह-अभिव्यक्ति पैटर्न मौजूद हैं जिन्हें अनदेखा नहीं किया जा सकता है।
    6. 'नए' सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर का पता लगाकर इस स्थिति को कम करने के लिए न्यूनतम क्लस्टर आकार और न्यूनतम क्लस्टर दूरी पैरामीटर दोनों घटाएँ।
    7. इसके अलावा, इन 'एनए क्लस्टर' प्रोटीन को सिकोड़ने के लिए न्यूनतम पियर्सन सहसंबंध (केएमई) पैरामीटर को कम करें।
      नोट: इस पैरामीटर ट्यूनिंग नए क्लस्टर उत्पन्न नहीं होगा, लेकिन इसके बजाय कम थ्रेशोल्ड के साथ अधिक पहले विफल प्रोटीन स्वीकार करके 'मौजूदा' क्लस्टर के आकार में वृद्धि होगी; हालाँकि, यह प्रत्येक क्लस्टर की विषमता को भी बढ़ाएगा, क्योंकि अब अधिक शोर प्रोटीन की अनुमति है।
    8. दो समूहों में पैटर्न का बहुत मामूली अंतर होता है; 4.4.9-4.4.11 चरणों के बाद उन्हें एक क्लस्टर में मर्ज करें।
    9. समस्या को हल करने के लिए न्यूनतम क्लस्टर दूरी पैरामीटर बढ़ाएँ।
    10. हालांकि, कुछ स्थितियों में, एल्गोरिथ्म वांछित पैटर्न को कभी वापस नहीं कर सकता है; ऐसे क्षण में, मैन्युअल रूप से समायोजित करें या फ़ाइल में क्लस्टर सदस्यता संपादित करें co_exp_clusters_3colums.txt (चरण 4.3 से फ़ाइल) मर्ज करने के लिए।
    11. डाउनस्ट्रीम पीपीआई नेटवर्क विश्लेषण के लिए इनपुट के रूप में पोस्ट-संपादित फ़ाइल लें। मैन्युअल संपादन के मामले में, क्लस्टर असाइनमेंट के मानदंडों को सही ठहराएं, और मैन्युअल संपादन की प्रक्रिया रिकॉर्ड करें।

5. प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन नेटवर्क विश्लेषण

नोट: पीपीआई नेटवर्क पर सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर को सुपरइम्पोज करके, प्रत्येक सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर को आगे छोटे पीपीआई मॉड्यूल में स्तरीकृत किया जाता है। विश्लेषण प्रत्येक सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर के लिए किया जाता है और इसमें दो चरण शामिल होते हैं: पहले चरण में, जेयूएमपीएन पीपीआई नेटवर्क पर सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर से प्रोटीन को सुपरइम्पोज करता है और सभी जुड़े घटकों को ढूंढता है (यानी, जुड़े नोड्स / प्रोटीन के कई क्लस्टर; उदाहरण के लिए, चित्रा 6 ए देखें); फिर, टोपोलॉजिकल ओवरलैप मैट्रिक्स (टीओएम) विधि52 का उपयोग करके प्रत्येक जुड़े घटक के लिए समुदायों या मॉड्यूल (घने जुड़े नोड्स के) का पता लगाया जाएगा।

  1. पीपीआई नेटवर्क विश्लेषण (चित्रा 3, सही पैनल) के लिए पैरामीटर कॉन्फ़िगर करें।
    1. 2 के रूप में न्यूनतम पीपीआई मॉड्यूल आकार सेट करें। यह पैरामीटर पहले चरण विश्लेषण से डिस्कनेक्ट किए गए घटकों के न्यूनतम आकार को परिभाषित करता है। निर्दिष्ट पैरामीटर से छोटा कोई भी घटक अंतिम परिणामों से हटा दिया जाएगा।
    2. अधिकतम पीपीआई मॉड्यूल आकार 40 के रूप में सेट करें। इस थ्रेशोल्ड को पास करने वाले बड़े, डिस्कनेक्ट किए गए घटक दूसरे चरण के टीओएम-आधारित विश्लेषण से गुजरेंगे। दूसरे चरण का विश्लेषण प्रत्येक बड़े घटक को छोटे मॉड्यूल में विभाजित करेगा: प्रत्येक मॉड्यूल में संभवतः प्रोटीन होते हैं जो पूरे मूल घटक की तुलना में अधिक घने रूप से जुड़े होते हैं।
  2. विश्लेषण शुरू करें। पीपीआई नेटवर्क विश्लेषण प्रस्तुत करने के दो तरीके हैं:
    1. डिफ़ॉल्ट रूप से डब्ल्यूजीसीएनए विश्लेषण के बाद स्वचालित रूप से पीपीआई विश्लेषण करने के लिए सबमिट जेयूपीएन विश्लेषण बटन दबाएं।
    2. वैकल्पिक रूप से, अनुकूलित सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर परिणाम अपलोड करें और चरण 5.2.3-5.2.5 के बाद केवल पीपीआई विश्लेषण करें।
    3. फ़ाइल co_exp_clusters_3colums.txt के स्वरूप का पालन करके इनपुट फ़ाइल तैयार करें (उपधारा 4.4 देखें)।
    4. विश्लेषण प्रारंभ करें पृष्ठ के निचले भाग में उन्नत पैरामीटर बटन पर क्लिक करें; एक नई पैरामीटर विंडो पॉप अप होगी। ऊपरी सत्र में 'केवल पीपीआई' विश्लेषण के लिए सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर परिणाम अपलोड करें, चरण 5.2.3 द्वारा तैयार इनपुट फ़ाइल अपलोड करने के लिए ब्राउज़र पर क्लिक करें।
    5. नीचे विजेट में, विश्लेषण के मोड का चयन करें, केवल पीपीआई का चयन करें, फिर जारी रखने के लिए बर्खास्तगी पर क्लिक करें। विश्लेषण प्रारंभ करें पृष्ठ पर, सबमिट जेयूएमपीएन विश्लेषण बटन पर क्लिक करें।
  3. एक बार विश्लेषण समाप्त हो जाने के बाद (आमतौर पर <3 मिनट), चरण 2.10-2.15 (चित्रा 6) में सचित्र के रूप में पीपीआई परिणामों की जांच करें।
  4. वैकल्पिक उन्नत चरण) ट्यूनिंग मापदंडों द्वारा पीपीआई मॉड्यूलराइजेशन समायोजित करें:
    1. पीपीआई परिणामों में शामिल अधिक प्रोटीन की अनुमति देने के लिए अधिकतम मॉड्यूल आकार पैरामीटर बढ़ाएं। 5.4.2-5.4.3 चरणों का पालन करते हुए, अनिर्दिष्ट इंटरैक्शन को कवर करने के लिए अनुकूलित पीपीआई नेटवर्क अपलोड करें।
    2. विश्लेषण प्रारंभ करें पृष्ठ के निचले भाग में उन्नत पैरामीटर बटन पर क्लिक करें; एक नई पैरामीटर विंडो पॉप अप होगी। अनुकूलित पीपीआई फ़ाइल तैयार करें, जिसमें , सी ऑननेक्शन और के प्रारूप में तीन कॉलम शामिल हैं; यहां प्रत्येक प्रोटीन के आधिकारिक जीन नामों द्वारा प्रस्तुत किए जाते हैं।
    3. एक पीपीआई डेटाबेस अपलोड करें में, अनुकूलित पीपीआई फ़ाइल अपलोड करने के लिए ब्राउज़ बटन पर क्लिक करें।

6. मार्ग संवर्धन विश्लेषण

नोट: सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर और पीपीआई मॉड्यूल दोनों के जेयूएमपीएन-व्युत्पन्न पदानुक्रमित संरचनाएं फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करके अति-प्रतिनिधित्व वाले मार्गों के साथ स्वचालित रूप से एनोटेट की जाती हैं। उपयोग किए जाने वाले मार्ग / टोपोलॉजी डेटाबेस में जीन ओन्टोलॉजी (जीओ), केईजीजी, हॉलमार्क और रिएक्टोम शामिल हैं। उपयोगकर्ता विश्लेषण के लिए अनुकूलित डेटाबेस अपलोड करने के लिए उन्नत विकल्पों का उपयोग कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, गैर-मानव प्रजातियों से डेटा का विश्लेषण करने के मामले में)।

  1. डिफ़ॉल्ट रूप से, मार्ग संवर्धन विश्लेषण सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग और पीपीआई नेटवर्क विश्लेषण के साथ स्वचालित रूप से शुरू किया जाता है।
  2. मार्ग संवर्धन परिणाम देखें:
    1. परिणाम पृष्ठों पर विभिन्न स्वरूपों की कल्पना करने के लिए चरण 2.7, 2.12 और 2.15 का पालन करें। व्यापक सारांश.xlsx फ़ाइल (चरण 2.16) में स्प्रेडशीट प्रकाशन तालिका में विस्तृत परिणाम देखें।
  3. (वैकल्पिक उन्नत चरण) मार्ग संवर्धन विश्लेषण के लिए अनुकूलित डेटाबेस अपलोड करें:
    1. जीन पृष्ठभूमि फ़ाइल तैयार करें, जिसमें आमतौर पर एक प्रजाति के सभी जीनों के आधिकारिक जीन नाम होते हैं।
    2. 6.3.3-6.3.4 चरणों का पालन करते हुए ऑन्कोलॉजी लाइब्रेरी फ़ाइल तैयार करें।
    3. एनरिचआर 53, और एमएसआईडीबी54 सहित सार्वजनिक वेबसाइटों से ऑन्कोलॉजी लाइब्रेरीफ़ाइलों को डाउनलोड करें। उदाहरण के लिए, एनरिचआर वेबसाइट55 से ड्रोसोफिला से ऑन्कोलॉजी डाउनलोड करें।
    4. दो कॉलम के साथ आवश्यक प्रारूप के लिए डाउनलोड की गई फ़ाइल को संपादित करें: पहले कॉलम के रूप में मार्ग नाम, और फिर आधिकारिक जीन प्रतीक ("/" द्वारा अलग) दूसरे कॉलम के रूप में। विस्तृत फ़ाइल स्वरूप JUMPn R चमकदार सॉफ़्टवेयर के सहायता पृष्ठ में वर्णित है।
      नोट: जेयूएमपीएन गिटहब साइट56 में जीन पृष्ठभूमि और ऑन्कोलॉजी लाइब्रेरी (एक उदाहरण के रूप में ड्रोसोफिला का उपयोग करके) की उदाहरण फ़ाइलें ढूंढें।
    5. विश्लेषण प्रारंभ करें पृष्ठ के निचले भाग में उन्नत पैरामीटर बटन पर क्लिक करें; एक नई पैरामीटर विंडो पॉप अप होगी।
    6. पाथवे संवर्धन विश्लेषण आइटम के लिए एक पृष्ठभूमि फ़ाइल अपलोड करें और चरण 6.3.1 पर तैयार पृष्ठभूमि फ़ाइल अपलोड करने के लिए ब्राउज़र पर क्लिक करें। फिर सत्र में, पाथवे संवर्धन विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली पृष्ठभूमि का चयन करें, उपयोगकर्ता-आपूर्ति की गई पृष्ठभूमि पर क्लिक करें।
    7. पाथवे संवर्धन विश्लेषण आइटम के लिए एक ऑन्कोलॉजी लाइब्रेरी फ़ाइल अपलोड करें और चरण 6.3.2-6.3.4 पर तैयार ऑन्कोलॉजी लाइब्रेरी फ़ाइल को अपलोड करने के लिए ब्राउज़र पर क्लिक करें। फिर सत्र में, पाथवे संवर्धन विश्लेषण के लिए डेटाबेस का चयन करें, .xlsx प्रारूप में उपयोगकर्ता-आपूर्ति डेटाबेस पर क्लिक करें।
  4. अनुकूलित डेटाबेस का उपयोग करके विश्लेषण शुरू करने के लिए निचले दाएं कोने में सबमिट जेयूपीएन विश्लेषण बटन पर क्लिक करें।

7. बड़े नमूना आकार के साथ डेटासेट का विश्लेषण

नोट: जेयूएमपीएन बड़े नमूना आकार (परीक्षण किए गए 200 नमूनों तक) के साथ डेटासेट के विश्लेषण का समर्थन करता है। एक बड़े नमूना आकार के विज़ुअलाइज़ेशन को सुविधाजनक बनाने के लिए, सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग परिणामों के प्रदर्शन को सुविधाजनक बनाने के लिए नमूना समूह निर्दिष्ट करने वाली एक अतिरिक्त फ़ाइल ("मेटा फ़ाइल" नामक) की आवश्यकता होती है।

  1. मेटा फ़ाइल तैयार करें और अपलोड करें।
    1. 7.1.2-7.1.3 चरणों के बाद प्रत्येक नमूने के लिए समूह जानकारी (जैसे, नियंत्रण और रोग समूह) निर्दिष्ट करता है जो मेटा फ़ाइल तैयार करें।
    2. सुनिश्चित करें कि मेटा फ़ाइल में कम से कम दो कॉलम हैं: कॉलम 1 में प्रोटीन परिमाणीकरण मैट्रिक्स फ़ाइल से कॉलम नाम और ऑर्डर के समान नमूना नाम होने चाहिए (जैसा कि चरण 3.3 में तैयार किया गया है); कॉलम 2 का उपयोग उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित सुविधाओं की किसी भी संख्या के लिए समूह असाइनमेंट के लिए किया जाएगा। स्तंभों की संख्या लचीली है।
    3. सुनिश्चित करें कि मेटा फ़ाइल की पहली पंक्ति में प्रत्येक स्तंभ के लिए स्तंभ नाम हैं; दूसरी पंक्ति के बाद से, समूहों या अन्य विशेषताओं (जैसे, लिंग, आयु, उपचार, आदि) की व्यक्तिगत नमूना जानकारी सूचीबद्ध की जानी चाहिए।
    4. प्रारंभ विश्लेषण पृष्ठ के निचले भाग में उन्नत पैरामीटर बटन पर क्लिक करके मेटा फ़ाइल अपलोड करें; एक नई पैरामीटर विंडो पॉप अप होगी। चरण 7.1.5 पर आगे बढ़ें
    5. मेटा फ़ाइल आइटम अपलोड करें और पृष्ठभूमि फ़ाइल अपलोड करने के लिए ब्राउज़र पर क्लिक करें। यदि अनपेक्षित स्वरूप या बेजोड़ नमूना नाम JUMPn द्वारा पाए जाते हैं, तो मेटा फ़ाइल (चरण 7.1.1-7.1.3) के आगे स्वरूपण के लिए एक त्रुटि संदेश पॉप अप होगा।
  2. सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग विश्लेषण के लिए मापदंडों को समायोजित करें: न्यूनतम पियर्सन सहसंबंध 0.2 के रूप में सेट करें। बड़े नमूना आकार के कारण इस पैरामीटर को आराम देने की आवश्यकता है।
  3. विश्लेषण सबमिट करने के लिए नीचे दाएं कोने में सबमिट जेयूपीएन विश्लेषण बटन पर क्लिक करें।
  4. विश्लेषण परिणाम देखें: सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर पैटर्न प्रदर्शित करने के अलावा सभी डेटा आउटपुट समान हैं।
    1. परिणाम पृष्ठ 1: WGCNA आउटपुट पृष्ठ में, सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर को उपयोगकर्ता-परिभाषित नमूना समूहों या सुविधाओं द्वारा स्तरीकृत नमूनों के साथ बॉक्सप्लॉट के रूप में विज़ुअलाइज़ करें। प्लॉट में प्रत्येक डॉट डब्ल्यूजीसीएनए एल्गोरिथ्म द्वारा गणना की गई ईजेन्जीन (यानी, क्लस्टर का सर्वसम्मति पैटर्न) का प्रतिनिधित्व करता है।
    2. यदि उपयोगकर्ता ने नमूनों को समूहीकृत करने के लिए कई सुविधाएँ (जैसे, आयु, लिंग, उपचार, आदि) प्रदान की हैं, तो नमूनों को समूहीकृत करने के लिए एक और सुविधा का चयन करने के लिए अभिव्यक्ति प्रारूप ड्रॉप-डाउन बॉक्स पर क्लिक करें।

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Representative Results

हमने जेयूएमपीएनप्रदर्शन को अनुकूलित और मूल्यांकन करने के लिए हमारे प्रकाशित गहरे प्रोटिओमिक्स डेटासेट 25,26,27,30 (आंकड़े 5 और चित्रा 6) के साथ-साथ डेटा सिमुलेशन57 (तालिका 1) का उपयोग किया। डब्ल्यूजीसीएनए के माध्यम से सह-अभिव्यक्ति प्रोटीन क्लस्टरिंग विश्लेषण के लिए, हम इनपुट के रूप में नमूनों में काफी बदल गए प्रोटीन का उपयोग करने की सलाह देते हैं (उदाहरण के लिए, सांख्यिकीय विश्लेषण द्वारा पता लगाए गए अलग-अलग व्यक्त (डीई) प्रोटीन)। विश्लेषण के लिए गैर-डीई प्रोटीन को शामिल करने के परिणामस्वरूप कार्यक्रम द्वारा लौटाए गए अधिक सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर हो सकते हैं (बड़े इनपुट आकार के कारण), हम परिकल्पना करते हैं कि सिस्टम-स्तरीय विश्लेषण के लिए पृष्ठभूमि (शेष गैर-डीई) के साथ वास्तविक सिग्नल (जैसे, डीई प्रोटीन) को मिलाकर सिग्नल को पतला कर सकता है और अंतर्निहित नेटवर्क संरचना को मुखौटा कर सकता है। इसका परीक्षण करने के लिए, सिमुलेशन विश्लेषण दो अलग-अलग स्थितियों के तहत किया गया था: i) अत्यधिक गतिशील प्रोटिओम (उदाहरण के लिए, टी सेल सक्रियण25 में 50% परिवर्तित) और ii) अपेक्षाकृत स्थिर प्रोटिओम (उदाहरण के लिए, 2% प्रोटिओम26 ईस्वी में बदल गया)। अत्यधिक गतिशील प्रोटिओम के लिए, हमारे प्रकाशित परिणामों के समान क्लस्टर आकार और अभिव्यक्ति पैटर्न (यानी, आइजेन) के बाद 50% प्रोटिओम से छह सह-अभिव्यक्ति समूहों का अनुकरणकिया गया था। इसी तरह, अपेक्षाकृत स्थिर प्रोटिओम के लिए, हमने अपने हालिया एडी प्रोटिओमिक्स अध्ययन26 के बाद 2% प्रोटिओम से तीन समूहों का अनुकरण किया। जैसा कि अपेक्षित था, प्रोटीन की इनपुट संख्या बढ़ने से पता लगाए गए समूहों की संख्या बढ़ जाती है (तालिका 1)। अत्यधिक गतिशील प्रोटिओम के लिए, इनपुट के रूप में सभी प्रोटीनों का उपयोग करने से 63% परिशुद्धता के साथ अधिकांश सच्चे क्लस्टर (6 नकली बोनाफाइड क्लस्टर में से 5; 83% रिकॉल) को कैप्चर किया जा सकता है (8 लौटे क्लस्टर में से 5 सच्चे सकारात्मक हैं; यानी, शेष 3 क्लस्टर झूठी सकारात्मक हैं)। हालांकि, अपेक्षाकृत स्थिर प्रोटिओम के लिए, गैर-डीई प्रोटीन के साथ इनपुट आकार बढ़ाने से नाटकीय रूप से परिशुद्धता कम हो जाती है (तालिका 1)। उदाहरण के लिए, इनपुट के रूप में पूरे प्रोटिओम का उपयोग करते हुए, 169 मॉड्यूल का पता लगाया जाता है, जिनमें से केवल 2 सही हैं (1.2% परिशुद्धता; शेष 98.8% पता लगाए गए मॉड्यूल झूठी सकारात्मक हैं)। इन परिणामों से इस प्रकार संकेत मिलता है कि इनपुट के रूप में केवल परिवर्तित प्रोटिओम चुनने से सह-अभिव्यक्ति विश्लेषण की सटीकता में वृद्धि होगी, खासकर अपेक्षाकृत स्थिर प्रोटिओम के लिए।

सह-अभिव्यक्ति प्रोटीन समूहों का पता लगाने के बाद, प्रत्येक क्लस्टर को मार्ग संवर्धन विश्लेषण (चित्रा 1) का उपयोग करके जेयूएमपीएन द्वारा एनोटेट किया जाएगा। वर्तमान संस्करण में जीन ओन्टोलॉजी (जीओ), केईजीजी, हॉलमार्क और रिएक्टोम सहित चार आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले मार्ग डेटाबेस शामिल हैं। उपयोगकर्ता जीएमटी प्रारूप54 में अपने स्वयं के डेटाबेस को संकलित कर सकते हैं, जिसे जेयूएमपीएन में अपलोड किया जा सकता है। मार्ग संवर्धन विश्लेषण के लिए कई डेटाबेस को एकीकृत करना अधिक व्यापक विचार प्रदान कर सकता है; हालाँकि, विभिन्न मार्ग डेटाबेस के आकार काफी भिन्न होते हैं, जो कुछ (विशेष रूप से बड़े) डेटाबेस के लिए अवांछित पूर्वाग्रह को प्रेरित कर सकते हैं। जेयूएमपीएन के भीतर दो समाधान प्रदान किए जाते हैं। सबसे पहले, एक सांख्यिकीय दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, नाममात्र पी मानों को बेंजामिनी-होचबर्ग विधि58 द्वारा बहु-परिकल्पना परीक्षण के लिए समायोजित (या दंडित) किया जाता है, जिसमें एक बड़े डेटाबेस के साथ एक छोटे डेटाबेस की तुलना में एक ही समायोजित पी स्तर तक पहुंचने के लिए अधिक महत्वपूर्ण नाममात्र पी-मान की आवश्यकता होती है। दूसरा, जेयूएमपीएन प्रत्येक डेटाबेस के लिए शीर्ष महत्वपूर्ण रूप से समृद्ध मार्ग को अलग से हाइलाइट करता है, इस प्रकार डेटाबेस-विशिष्ट शीर्ष समृद्ध मार्ग हमेशा प्रदर्शित होते हैं।

मार्ग संवर्धन विश्लेषण के समान, स्ट्रिंग59,60, बायोप्लेक्स 61,62 और InWeb_IM63 डेटाबेस के संयोजन से एक समग्र पीपीआई नेटवर्क संकलित किया गया था। बायोप्लेक्स डेटाबेस मानव कोशिका लाइनों में मास स्पेक्ट्रोमेट्री के बाद आत्मीयता शुद्धि का उपयोग करके बनाया गया था, जबकि स्ट्रिंग और इनवेब में विभिन्न स्रोतों से जानकारी होती है। इसलिए स्ट्रिंग और इनवेब डेटाबेस को उच्च गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए किनारे के स्कोर द्वारा फ़िल्टर किया गया था, कटऑफ के साथ स्केल-फ्री मानदंड24 को सर्वोत्तम फिटिंग द्वारा निर्धारित किया गया था। अंतिम विलय पीपीआई नेटवर्क ~ 1,100,000 किनारों (तालिका 2) के साथ 20,000 से अधिक मानव जीन को कवर करता है। यह व्यापक इंटरैक्टोम संवेदनशील पीपीआई विश्लेषण के लिए हमारे जेयूएमपीएन सॉफ्टवेयर के साथ एक बंडल में शामिल और प्रकाशित किया गया है।

विश्लेषण समाप्त होने के बाद, जेयूएमपीएन प्रकाशन तालिका स्प्रेडशीट फ़ाइल व्यापक सारांश.xlsx उत्पन्न करता है, जिसमें तीन अलग-अलग शीट शामिल हैं। पहली शीट में सह-अभिव्यक्ति प्रोटीन क्लस्टर के परिणाम होते हैंप्रति पंक्ति एक प्रोटीन के साथ: पहला कॉलम प्रत्येक इनपुट प्रोटीन की क्लस्टर सदस्यता को इंगित करता है, और शेष कॉलम उपयोगकर्ता-इनपुट फ़ाइल से कॉपी किए जाते हैं, जिसमें प्रोटीन परिग्रहण, जीन नाम, प्रोटीन विवरण और व्यक्तिगत नमूनों का परिमाणीकरण होता है। दूसरी शीट में मार्ग संवर्धन विश्लेषण के परिणाम होते हैं, जो प्रत्येक सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर में समृद्ध महत्वपूर्ण मार्गों को प्रदर्शित करते हैं। यह तालिका पहले विभिन्न मार्ग डेटाबेस द्वारा व्यवस्थित की जाती है, फिर सह-अभिव्यक्ति समूहों, कार्यात्मक मार्गों, मार्ग जीनों की कुल संख्या, व्यक्तिगत क्लस्टर में जीन की कुल संख्या, ओवरलैप जीन संख्या और नाम, संवर्धन गुना, फिशर सटीक परीक्षण व्युत्पन्न पी-मान और बेंजामिनी-होचबर्ग झूठी खोज दर द्वारा क्रमबद्ध की जाती है। तीसरी शीट में प्रति पंक्ति एक पीपीआई मॉड्यूल के साथ पीपीआई मॉड्यूल विश्लेषण के परिणाम शामिल हैं; इसके स्तंभों में मॉड्यूल नाम (इसकी सह-अभिव्यक्ति सदस्यता और मॉड्यूल आईडी द्वारा परिभाषित, उदाहरण के लिए, Cluster1_Module1), मैप किए गए प्रोटीन और संख्याएं, साथ ही कार्यात्मक मार्ग शामिल हैं जो मार्ग डेटाबेस के खिलाफ मॉड्यूल प्रोटीन की खोज करके परिभाषित किए गए हैं।

Figure 1
चित्र 1: जेयूएमपीएन का वर्कफ़्लो। विभेदक रूप से व्यक्त (डीई) प्रोटीन के शीर्ष चर के परिमाणीकरण मैट्रिक्स को इनपुट के रूप में लिया जाता है, और प्रोटीन को डब्ल्यूजीसीएनए एल्गोरिथ्म द्वारा सह-अभिव्यक्ति समूहों में वर्गीकृत किया जाता है। प्रत्येक सह-अभिव्यक्ति को तब मार्ग संवर्धन विश्लेषण द्वारा एनोटेट किया जाता है और घनीभूत रूप से जुड़े प्रोटीन मॉड्यूल पहचान के लिए प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) नेटवर्क पर आगे बढ़ाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: JUMPn स्वागत पृष्ठ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: जेयूएमपीएन का इनपुट पृष्ठ। पृष्ठ में क्रमशः सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग और पीपीआई नेटवर्क विश्लेषण के लिए इनपुट फ़ाइल अपलोड पैनल और पैरामीटर कॉन्फ़िगरेशन पैनल शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: मात्रा का ठहराव मैट्रिक्स का उदाहरण इनपुट फ़ाइल। कॉलम में प्रोटीन परिग्रहण (या कोई अद्वितीय आईडी), जीएन (आधिकारिक जीन प्रतीक), प्रोटीन विवरण (या कोई उपयोगकर्ता द्वारा प्रदान की गई जानकारी) शामिल हैं, इसके बाद व्यक्तिगत नमूनों का प्रोटीन परिमाणीकरण होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर परिणाम जेयूएमपीएन द्वारा रिपोर्ट किए गए। सह-अभिव्यक्ति क्लस्टरिंग पैटर्न (ए), क्लस्टर (बी) में शीर्ष समृद्ध मार्ग हीटमैप, और प्रत्येक क्लस्टर के लिए विस्तृत प्रोटीन बहुतायत दिखाया गया है (सी)। उपयोगकर्ता विभिन्न प्रदर्शन विकल्पों का चयन कर सकते हैं और चयन बॉक्स के माध्यम से विभिन्न समूहों के बीच नेविगेट कर सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: पीपीआई नेटवर्क विश्लेषण परिणाम जेयूएमपीएन द्वारा रिपोर्ट किए गए। वैश्विक अंतर-मॉड्यूल नेटवर्क दिखाया गया है (ए), इसके बाद व्यक्तिगत मॉड्यूल (बी) और इसके काफी समृद्ध मार्गों (सी) का एक उपनेटवर्क है। उपयोगकर्ता विभिन्न प्रदर्शन विकल्पों का चयन कर सकते हैं और चयन बॉक्स के माध्यम से विभिन्न समूहों और मॉड्यूल के बीच नेविगेट कर सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

विश्लेषण के लिए % शीर्ष प्रोटीन # नकली मॉड्यूल # मॉड्यूल का पता लगाया # पुनः प्राप्त मॉड्यूल1 परिशुद्धता2 3 याद करें
अत्यधिक गतिशील प्रोटिओम (उदाहरण के लिए, टी सेल सक्रियण के दौरान): 50% प्रोटिओम से 6 नकली मॉड्यूल
2 6 2 2 1 0.33
5 6 2 2 1 0.33
10 6 3 3 1 0.5
20 6 4 4 1 0.67
50 6 6 6 1 1
100 6 8 5 0.63 0.83
अपेक्षाकृत स्थिर प्रोटिओम (उदाहरण के लिए, एडी के रोगजनन के दौरान): 2% प्रोटिओम से 3 नकली मॉड्यूल
1 3 1 1 1 0.33
2 3 3 3 1 1
5 3 8 3 0.38 1
10 3 13 3 0.23 1
20 3 19 3 0.16 1
50 3 71 2 0.03 0.67
100 3 169 2 0.01 0.67
1. एक रिकैप्चर मॉड्यूल एक पता लगाया गया मॉड्यूल है जिसका आइजेनजीन अत्यधिक सहसंबंधित है (पियर्सन आर > 0.95) नकली आइजेन्स में से एक के साथ।
2परिशुद्धता = # पुनः प्राप्त मॉड्यूल / # पता चला मॉड्यूल
3रिकॉल = # रिकैप्ड मॉड्यूल / # सिम्युलेटेड मॉड्यूल

तालिका 1: सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर का पता लगाने के सिमुलेशन अध्ययन।

पीपीआई नेटवर्क नहीं। नोड्स की नहीं। किनारों की
बायोप्लेक्स 3.0 संयुक्त (293 टी + एचसीटी 116) 14,551 1,67,399
InBio_Map_core_2016_09_12 17,429 6,08,166
स्ट्रिंग (v11.0) 18,954 5,87,482
समग्र पीपीआई नेटवर्क 20,485 11,52,607

तालिका 2: मानव प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) नेटवर्क के सांख्यिकी। पीपीआई नेटवर्क को उच्च गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए एज स्कोर द्वारा फ़िल्टर किया जाता है, स्कोर कटऑफ स्केल-फ्री मानदंडों को सर्वोत्तम रूप से फिट करके निर्धारित किया जाता है।

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Discussion

यहां हमने अपने जेयूएमपीएन सॉफ्टवेयर और इसके प्रोटोकॉल को पेश किया, जिसे गहरी मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स डेटा 25,26,27,30,64 का उपयोग करके आणविक तंत्र को विच्छेदन करने के लिए कई परियोजनाओं में लागू किया गया है। जेयूएमपीएन सॉफ्टवेयर और प्रोटोकॉल को पूरी तरह से अनुकूलित किया गया है, जिसमें सह-अभिव्यक्ति नेटवर्क विश्लेषण के लिए डीई प्रोटीन पर विचार, व्यापक और उच्च गुणवत्ता वाले पीपीआई नेटवर्क का संकलन, कड़े सांख्यिकीय विश्लेषण (उदाहरण के लिए, कई परिकल्पना परीक्षण पर विचार करके) एक सुव्यवस्थित और उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफ़ेस के साथ शामिल है। जेयूएमपीएन द्वारा पहचाने गए कई प्रोटीन मॉड्यूल को कार्यात्मक प्रयोग अध्ययन25,27 या स्वतंत्र रोगी सहकर्मियों26 द्वारा मान्य किया गया है, जो विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में अंतर्निहित प्रमुख अणुओं और मार्गों की पहचान करने के लिए एक प्रभावी उपकरण के रूप में जेयूएमपीएन का उदाहरण देते हैं।

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर और पीपीआई मॉड्यूल के इष्टतम परिणामों की पीढ़ी शामिल है, जिसके लिए पैरामीटर ट्यूनिंग के कई पुनरावृत्तियों की आवश्यकता हो सकती है, साथ ही अनुकूलित पीपीआई नेटवर्क को अपलोड करना भी हो सकता है। हमारे प्रोटोकॉल में, हमने सामान्य व्यावहारिक परिदृश्यों पर चर्चा की, जिसमें महत्वपूर्ण समूहों के लापता होने को कैसे संभालना है, अनिर्दिष्ट प्रोटीन का एक उच्च प्रतिशत, दो अनावश्यक समूहों का विलय, और पीपीआई मॉड्यूल के भीतर महत्वपूर्ण प्रोटीन का लापता होना शामिल है। हम उपयोगकर्ता को कई सकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन तैयार करने और अंतिम सह-अभिव्यक्ति समूहों में उनकी उपस्थिति की पुष्टि करने की सलाह देते हैं। कभी-कभी एक अपूर्ण पीपीआई नेटवर्क डेटाबेस के कारण अंतिम पीपीआई मॉड्यूल में एक सकारात्मक नियंत्रण कभी शामिल नहीं किया जाएगा। आंशिक रूप से इसे कम करने के लिए, हमने अपने पीपीआई नेटवर्क को बायोप्लेक्स वी 362 और स्ट्रिंग वी 1160 के नवीनतम संस्करणों के साथ अपडेट किया है। इसके अलावा, जेयूएमपीएन उपयोगकर्ताओं को अनुकूलित पीपीआई नेटवर्क अपलोड करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, चारा के रूप में एक महत्वपूर्ण सकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन का उपयोग करके आत्मीयता शुद्धि-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एपी-एमएस) प्रयोगों से प्राप्त उपन्यास इंटरैक्शन को अधिक अनुकूलित विश्लेषण के लिए वर्तमान समग्र पीपीआई नेटवर्क के साथ एकीकृत किया जा सकता है।

प्रत्येक सह-अभिव्यक्ति प्रोटीन क्लस्टर के लिए मार्ग संवर्धन विश्लेषण के ढांचे का उपयोग करके, जेयूएमपीएन को प्रतिलेखन कारक (टीएफ) गतिविधि का अनुमान लगाने के लिए बढ़ाया जा सकता है। धारणा यह है कि यदि सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर में एक विशिष्ट टीएफ के लक्ष्य जीन का अधिक प्रतिनिधित्व मौजूद है (यानी, इन लक्ष्यों को अलग-अलग व्यक्त किया जाता है और एक ही अभिव्यक्ति पैटर्न का पालन किया जाता है), तो उस टीएफ की गतिविधि संभावित रूप से प्रयोगात्मक स्थितियों में बदल जाती है क्योंकि इसका लक्ष्य प्रोटीन बहुतायत लगातार बदल जाता है। तकनीकी रूप से, यह टीएफ-लक्ष्य डेटाबेस (जैसे, एनकोड प्रोजेक्ट65 से) के साथ वर्तमान मार्ग डेटाबेस को बदलकर जेयूएमपीएन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। इसी तरह, किनेज-सब्सट्रेट डेटाबेस का लाभ उठाकर किनेज गतिविधि का भी अनुमान लगाया जा सकता है, इनपुट के रूप में गहरे फॉस्फोप्रोटिओमिक्स को लेते हुए। एक उदाहरण के रूप में, हमने मस्तिष्क ट्यूमर रोगजनन64 अंतर्निहित अनियमित टीएफ और किनेसेस की सफलतापूर्वक पहचान की। दरअसल, गतिविधि अनुमान के लिए नेटवर्क दृष्टिकोण का उपयोग मानव रोगों66,67 के लिए विनियमित ड्राइवरों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में उभरा है।

JUMPn सॉफ़्टवेयर आसानी से डेटा प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होता है। भले ही आइसोबेरिक लेबलिंग मात्रात्मक प्रोटिओम का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया गया था, वही प्रोटोकॉल लेबल-मुक्त मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स डेटा के साथ-साथ जीनोम-वाइड अभिव्यक्ति प्रोफाइल के लिए भी लागू होता है (उदाहरण के लिए, आरएनए-सेक या माइक्रोएरे द्वारा मात्रा निर्धारित; जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल27 दोनों के लिए जेयूएमपीएन को लागू करने का हमारा हालिया उदाहरण देखें)। सह-व्यक्त फॉस्फोसाइट्स की पहचान करने के लिए जेयूएमपीएन द्वारा फॉस्फोप्रोटिओमिक्स डेटा भी लिया जा सकता है, इसके बाद किनेज गतिविधि अनुमान25। इसके अलावा, एपी-एमएस दृष्टिकोण द्वारा उत्पन्न इंटरैक्टोम डेटा भी उपयुक्त होगा, जिसके द्वारा शिकार प्रोटीन जो समान चारा इंटरैक्शन ताकत और स्टोइकोमेट्री का पालन करते हैं, सह-अभिव्यक्ति क्लस्टर बनाएंगे और डेटा व्याख्या68 के लिए ज्ञात पीपीआई के साथ ओवरलैप होंगे।

जेयूएमपीएन के वर्तमान संस्करण के लिए सीमाएं मौजूद हैं। सबसे पहले, स्थापना प्रक्रिया कमांड लाइन-आधारित है और कंप्यूटर विज्ञान के बुनियादी ज्ञान की आवश्यकता होती है। यह जेयूएमपीएन के व्यापक उपयोग में बाधा डालता है, विशेष रूप से कम्प्यूटेशनल पृष्ठभूमि के बिना जीवविज्ञानियों से। एक अधिक आदर्श कार्यान्वयन एक ऑनलाइन सर्वर पर JUMPn प्रकाशित करने के लिए है। दूसरा, मानव रोग अध्ययन पर हमारे ध्यान के कारण वर्तमान डेटाबेस मानव-केंद्रित हैं। ध्यान दें कि चूहों द्वारा उत्पन्न प्रोटिओमिक्स डेटा का विश्लेषण जेयूएमपीएन द्वारा ऐसे मानव-केंद्रित डेटाबेस25,27 का उपयोग करके भी किया गया है, यह मानते हुए कि अधिकांश पीपीआई दोनों प्रजातियों69,70 में संरक्षित हैं। माउस-विशिष्ट सिग्नलिंग को इस दृष्टिकोण से कैप्चर नहीं किया जाएगा, लेकिन उन मानव अध्ययनों में रुचि नहीं है। हालांकि, गैर-स्तनधारी मॉडल सिस्टम (जैसे, ज़ेब्राफिश, फ्लाई, या खमीर) के लिए, प्रजाति-विशिष्ट डेटाबेस तैयार किया जाना चाहिए और उन्नत विकल्पों का उपयोग करके जेयूएमपीएन में अपलोड किया जाना चाहिए। अतिरिक्त प्रजातियों के संसाधन भविष्य के जेयूएमपीएन रिलीज के माध्यम से प्रदान किए जा सकते हैं। तीसरा, ऑन्कोलॉजी /पाथवे विश्लेषण के वर्तमान चरण में महत्वपूर्ण समय लगता है, जिसे समानांतर कंप्यूटिंग द्वारा आगे अनुकूलित किया जा सकता है।

अंत में, हम सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण द्वारा सह-व्यक्त और संभावित रूप से शारीरिक रूप से बातचीत करने वाले प्रोटीन मॉड्यूल की पहचान और कल्पना करने के लिए मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स डेटा की खोज के लिए जेयूएमपीएन सॉफ्टवेयर और प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। जेयूएमपीएन को अन्य 53,71,72 से अलग करने वाली प्रमुख विशेषताओं में शामिल हैं: (i) जेयूएमपीएन मार्ग और नेटवर्क विश्लेषण (चित्रा 1) के चार प्रमुख घटकों को एकीकृत और सुव्यवस्थित करता है; (ii) अधिकांश मार्ग विश्लेषण सॉफ्टवेयर से अलग जो इनपुट के रूप में एक साधारण जीन सूची लेता है, जेयूएमपीएन परिमाणीकरण मैट्रिक्स से शुरू होता है, जिसके द्वारा मात्रात्मक जानकारी को साहित्य प्रलेखित मार्गों और नेटवर्क के साथ मूल रूप से एकीकृत किया जा सकता है; (iii) सह-अभिव्यक्ति प्रोटीन क्लस्टर और इंटरैक्शन मॉड्यूल दोनों स्वचालित रूप से ज्ञात मार्गों द्वारा एनोटेट किए जाते हैं, और उपयोगकर्ता के अनुकूल वेब ब्राउज़र का उपयोग करके आर / चमकदार इंटरैक्टिंग प्लेटफॉर्म के माध्यम से कल्पना की जाती है; (iv) अंतिम परिणाम तीन तालिकाओं में व्यवस्थित किए जाते हैं जो एक्सेल प्रारूप में आसानी से प्रकाशित करने योग्य होते हैं। इस प्रकार, हम उम्मीद करते हैं कि जेयूएमपीएन और यह प्रोटोकॉल मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स डेटा का उपयोग करके विदारक तंत्र के लिए कई अध्ययनों पर व्यापक रूप से लागू होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) (आर 01 एजी 047928, आर 01 एजी 053987, आरएफ 1 एजी 064909, आरएफ 1 एजी 068581, और यू 54 एनएस 110435) और एएलएसएसी (अमेरिकन लेबनानी सीरियाई एसोसिएटेड चैरिटीज) द्वारा वित्त पोषण सहायता प्रदान की गई थी। एमएस विश्लेषण सेंट जूड चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल के सेंटर ऑफ प्रोटिओमिक्स एंड मेटाबोलॉमिक्स में किया गया था, जिसे आंशिक रूप से एनआईएच कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट (पी 30 सीए 021765) द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MacBook Pro with a 2.3 GHz Quad-Core Processor running OS 10.15.7. Apple Inc. MacBook Pro 13'' Hardware used for software development and testing
Anoconda Anaconda, Inc. version 4.9.2 https://docs.anaconda.com/anaconda/install/
miniconda Anaconda, Inc. version 4.9.2 https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
RStudio RStudio Public-benefit corporation version 4.0.3 https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Shiny Server RStudio Public-benefit corporation https://shiny.rstudio.com/articles/shinyapps.html

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Vanderwall, D., Suresh, P., Fu, Y.,… More

Vanderwall, D., Suresh, P., Fu, Y., Cho, J. H., Shaw, T. I., Mishra, A., High, A. A., Peng, J., Li, Y. JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics. J. Vis. Exp. (176), e62796, doi:10.3791/62796 (2021).

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