Summary
En forbigående skoldningsskade (65 °C ± 0,5 °C, 3 s) på den ene bagpote nedsætter tærsklen (g) til von Frey-filamentstimulering af den ipsilaterale side og ændrer gangmønsteret. Desuden inducerer forbrændingsskade depressionslignende adfærd i den tvungne svømmetest.
Abstract
Skoldning af vand er den mest almindelige årsag til forbrændingsskader hos både ældre og unge befolkninger. Det er en af de store kliniske udfordringer på grund af den høje dødelighed og følgevirkninger i lav- og mellemindkomstlande. Forbrændinger fremkalder ofte intens spontan smerte og vedvarende allodyni samt livstruende problem. Endnu vigtigere er overdreven smerte ofte ledsaget af depression, hvilket kan reducere livskvaliteten betydeligt. Denne artikel viser, hvordan man udvikler en dyremodel til undersøgelse af forbrændingsinduceret smerte og depressionslignende adfærd. Efter anæstesi blev forbrændingsskade induceret ved at dyppe musens bagpote i varmt vand (65 ° C ± 0,5 ° C) i 3 s. von Frey-testen og den automatiserede ganganalyse blev udført hver anden dag efter forbrændingsskade. Derudover blev depressionslignende adfærd undersøgt ved hjælp af den tvungne svømmetest, og rota-stangtesten blev udført for at differentiere den unormale motoriske funktion efter forbrændingsskade. Hovedformålet med denne undersøgelse er at beskrive udviklingen af en dyremodel til undersøgelse af forbrændingsskade-induceret smerte og depressionslignende adfærd hos mus.
Introduction
Vævsskade, såsom forbrænding og traumer, er generelt forbundet med samtidig forekomst af akut smerte. Brandskader og traumerelaterede symptomer anslås, at 1.80.000 dødsfald hvert år skyldes forbrændinger - langt de fleste forekommer i lav- og mellemindkomstlande fra forskellige typer forbrændinger1. Ifølge en verdensomspændende rapport er forbrændinger almindelige hos børn og tegner sig for ca. 40% -60% af de indlagte patienter 2,3. Disse specifikke skader er endnu mere alvorlige, da de kan forekomme i hverdagen, såsom koge- eller badevand 4,5. Selvom akutte smerter i de fleste tilfælde kan løses spontant efter genopretning fra vævsskade, kan det være muligt at blive kronisk på grund af unormale ændringer i nervesystemet 6,7.
For nylig er det blevet foreslået, at akut smerte kan fremkalde et deprimeret humør, og kronisk smerte kan forårsage angst og depression 8,9,10,11. Sameksistensen af smerte og depression gør det vanskeligere at behandle patienten. Depression har også en tendens til at øge smertefølsomheden, hvilket sandsynligvis vil fremkalde mere intens depression og smerte12. Komplikationer af smerte og depression er vist i dyremodeller af perifer inflammation 13,14,15,16. De detaljerede mekanismer, der ligger til grund for smerteinduceret depression, er ikke velkendte indtil nu17. Det er således nødvendigt at udvikle mere effektive behandlinger for forbrændinger for at lindre bivirkninger og symptomer.
Således blev den foreliggende undersøgelse designet til at udvikle en dyremodel til at studere forbrændingsskade-induceret akut smerte og depressionslignende adfærd hos mus. Til dette blev forbrændingsskaderelateret unormal taktil følsomhed, ændret gangmønster og depressionslignende adfærd målt. Derudover forsøger denne undersøgelse at validere modellen ved hjælp af NSAID'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Chungnam National University i Sydkorea og derefter udført på grundlag af de etiske retningslinjer fra International Association for the Study of Pain18.
1. Induktion af skoldningsforbrændingsskade på bagpoten
- Hus de mandlige ICR-mus, der vejer 20-25 g, i et lyst og temperaturkontrolleret rum (12/12 timer lys-mørk cyklus, 22,5 ° C ± 2,5 ° C) med en fugtighed på 40% -60%.
BEMÆRK: Både han- og hunmus kan bruges til denne protokol. - Giv dyret fri adgang til mad og vand, og akklimatiser i mindst 1 uge, før forsøget påbegyndes.
BEMÆRK: Alle dyrene blev gruppeopholdt for at udelukke variabler som isolationsstress. - Tildel musene tilfældigt til forsøgs- eller kontrolgruppen, og udfør blinde forsøg ved hjælp af dyrenumre som koder.
- På dagen for forbrændingsinduktion anæstesieres musen ved intraperitoneal (i.p.) injektion af 300 μL alfaxalone i en dosis på 100 mg/kg. Brug en kirurgisk kjole, handsker og maske, mens du udfører forbrændingsinduktionen.
- Efter dyb bedømning af musen desinficeres omkring højre bagpote med 70% ethanol.
BEMÆRK: Kontroller manglen på respons på knivspidsstimulering påført bagtæerne eller halen for at bekræfte tilstanden af dyb anæstesi. - Påfør en oftalmisk salve på øjnene for at forhindre hornhindetørring efter induktion af anæstesi.
- Nedsænk højre bagpote på den dybt bedømrede mus i varmt vand ved 65 °C ± 0,5 °C i 3 s. Lav et mærke på anklen på hver mus, inden du nedsænker bagpoten i varmt vand for at opretholde konsistensen i det brændte område.
- Efter induktion af forbrændinger skal du bringe musene i et rent hjemmebur og placere dem på en varmepude, indtil dyrene kommer sig efter anæstesi.
BEMÆRK: Det smertestillende middel, acetaminophen (200 mg/kg), blev administreret intraperitonealt en gang dagligt i 7 dage fra dagen for forbrændingsskaden (Only Burn + Acetaminophen-gruppen). Burn-gruppen blev behandlet med saltvand som køretøjskontrol. Forsøget blev udført efter den metode, der er beskrevet i en tidligere undersøgelse4.
2. Måling af mekanisk allodyni
- Bring musene til adfærdstestrummet og lad dem akklimatisere mindst i 30 minutter før testen. Brug en kirurgisk kjole, handsker og maske, mens du udfører testen.
- Læg musene i en firkantet kasse (diameter: 13 cm, højde: 12 cm) på et metalnetgulv (maskestørrelse: 0,7 cm x 0,7 cm) og lad dem akklimatisere sig i mindst 30 minutter.
- Vurder den mekaniske tærskel for bagpoten ved hjælp af den stigende stimulusmetode19,20.
- Stik forsigtigt en række von Frey-filamenter med 5-8 s intervaller for at stimulere bagplanten. Få basisværdierne dagen før forbrændingsinduktion.
BEMÆRK: 0,16-1,2 g von Frey-filamenterne blev brugt i testen til at måle poteudtagningstærsklen hos henholdsvis alle dyr. Pote tilbagetrækning respons test blev startet med den laveste bøjningskraft af von Frey filament (0,16 g i denne protokol). Hvis der ikke var noget svar, blev der påført et filament med den næste bøjningskraft. - Udfør fem forsøg for at evaluere mekaniske tærskler for hver ipsilateral (skadet) bagpote.
BEMÆRK: Bøjningskraften af von Frey-filament, der producerer respons mere end tre gange af de fem forsøg i hvert dyr, blev udtrykt som poteabstinenstærskel (PWT, g). Mekaniske tærskler blev målt en dag før og ved 1, 3, 5 og 7 dage efter forbrændingsskade. Analgetisk virkning blev vurderet 1 time efter administration af acetaminophen i dyret.
3. Automatiseret ganganalyse
- Akklimatisere musene i ganganalysesystemet en gang dagligt i 10-15 min fra 5 dage før forbrændingsskaden. Brug en kirurgisk kjole, handsker og maske, mens du udfører ganganalyse.
- På testdagen skal musene bringes til adfærdstestrummet og akklimatiseres i mindst 30 minutter før testen.
BEMÆRK: Udfør akklimatiserings- og ganganalysetest i et mørkt miljø. Indstil betingelserne i programmenuen som følger.- Når du har kørt programmet, skal du klikke på menuen Opret nyt eksperiment for at udpege den mappe, der skal gemmes dataene.
- Efter udpegelsen skal du indstille den maksimale køretid til 5 s og maksimalt tilladte hastighedsvariationer til 50%.
- Vælg et registreret kamera, og indstil gangbroens længde til 30 cm under fanen Opsætning i programmet.
- På fanen Erhverv i programmenuen skal du vælge Åbn erhvervelse.
- Baseret på statusmeddelelserne skal du klikke på knappen Snap baggrund for at få et baggrundsbillede af en tom gangbro.
- Klik på knappen Start erhvervelse , og placer derefter musen ved indgangen til den venstre-højre krydsbare gangbro. Optagelsen starter automatisk efter musens frie bevægelighed.
BEMÆRK: Hvis dyrets gang er blevet registreret med succes, og alle fodspor er blevet registreret, markeres det som Kompatibel kørsel med et grønt ikon. Hvis softwaren ikke registrerer nogen fodspor, vises et rødt ikon, i hvilket tilfælde det anbefales at udføre optagelsen igen. Forfatterne anbefaler at indsamle og analysere mindst fem vellykkede kompatible kørsler udført med lignende kørehastigheder. - På fanen Erhverv i programmenuen skal du vælge Klassificer kørsler.
BEMÆRK: Når du har valgt de data, der er opnået fra den vellykkede overholdelseskørsel ovenfor, skal du gå til videoanalyseskærmen, hvor musenes gangmønstre blev registreret. - Vælg det løb, der skal analyseres, og klik på knappen Autoklassificer .
- Når du har udført automatisk klassificering, skal du fjerne næse, genital genkendelse og forkert anerkendelse af poter til junk data i hver kørsel og derefter analysere dataene.
BEMÆRK: Alle statistiske parametre analyseres og gemmes automatisk i programmet, og rå dataværdier kan findes i eksperimentatorens analysemenu. Automatisk ganganalyse blev udført før og ved 1, 3, 5 og 7 dage efter forbrændingsskade. Evalueringen blev udført 30 minutter efter administration af acetaminophen i Burn + Acetaminophen-gruppen og 30 minutter efter saltvandsbehandling i Burn-gruppen. Dette eksperiment blev udført efter den metode, der er beskrevet i de tidligere undersøgelser 4,21,22.
4. Måling af depressionslignende adfærd
BEMÆRK: Fortvivlelsesbaseret adfærd, immobilitetstid i vandet blev målt ved den tvungne svømmetest.
- Bring musene til adfærdstestrummet og akklimatiser dem i mindst 30 minutter før testen. Brug en kirurgisk kjole, handsker og maske, mens du udfører den tvungne svømmetest.
- Musen sættes i en klar plexiglascylinder (10 cm x 25 cm) indeholdende 15 cm vand (25 °C ± 0,5 °C) i 15 minutter.
- Efter 24 timer sættes musen i cylinderen under de samme forhold og måles immobilitetstiden.
BEMÆRK: Immobilitetstiden blev målt i 5 minutters testtid, og det tidspunkt, hvor mus stoppede med at klatre eller svømme og bare flød for at holde hovedet over vandoverfladen, blev registreret. Den tvungne svømmeprøve blev udført på dag 7 efter brandskaden. Evalueringen blev udført 1 time efter administration af acetaminophen i Burn + Acetaminophen-gruppen og 1 time efter saltvandsbehandling i Burn-gruppen. Forsøget blev udført efter den metode, der er beskrevet i tidligere undersøgelser23,24.
5. Måling af normal motorisk funktion
BEMÆRK: Rota-stang-testen blev udført for at differentiere den unormale motoriske funktion efter forbrændingsskade.
- Bring musene til adfærdstestrummet og akklimatiser dem i mindst 30 minutter før testen. Brug en kirurgisk kjole, handsker og maske, mens du udfører den tvungne svømmetest.
- Anbring dyrene på en rullende cylindrisk platform (5,7 cm bred; 3 cm diameter) ophængt 16 cm over bunden af apparatet.
- Lad hvert dyr træne en gang om dagen på en rota-stang i mindst 5 dage før induktion af forbrændingsskade.
- Udfør rota-stangtesten hvert 20. minut i 2 timer efter lægemiddeladministration. Indstil skæringstiden til 2 min.
- Mål varigheden af den tid, musen kører på en roterende stang med en konstant hastighed på 15 omdrejninger pr. Minut uden at falde.
BEMÆRK: Rota-stangtesten blev udført 7 dage efter induktion af forbrændingsskade. Evalueringen blev udført umiddelbart efter administration af acetaminophen i Burn + Acetaminophen-gruppen og efter saltvandsbehandling i Burn-gruppen. Alfaxalone blev anvendt som en positiv kontrol for eksperimentelt behandlede lægemidler i denne test. Under rotarod-testen måles varigheden af den tid, musen kører på den roterende stang uden at falde. Forsøget blev udført efter den metode, der er beskrevet i tidligere undersøgelser22,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at minimere dyrenes lidelser og reducere antallet af dyr, der anvendes i henhold til retningslinjerne for tre R'er (udskiftning, reduktion og forfining), blev denne undersøgelse designet med det mindste antal dyr til indsamling af væsentlige data, der blev etableret gennem indledende forsøg. I denne undersøgelse blev adfærdsmæssige eksperimenter uafhængigt udført to gange som følger. Ganganalysen, mekanisk allodyni og depressionslignende adfærdstest blev udført med Control (n = 5), Burn (n = 7; køretøjskontrol; saltvand) og Burn + Acetaminophen (n = 7) grupper. I rota-stangtesten, Kontrol (n = 3), Forbrænding (n = 4; køretøjskontrol; saltvand), Forbrænding + Acetaminophen (n = 4), Positiv kontrol (n = 4; Alfaxalone) grupper blev designet. Alfaxalone er en type neuroaktiv steroid og bedøvelsesmiddel, der i øjeblikket anvendes i veterinærmedicin som en injicerbar generel bedøvelsesinducer. I denne undersøgelse blev alfaxalone anvendt i dyreanæstesi til forbrændingsinduktion og anvendt som et positivt kontrollægemiddel til motoriske svækkelser i rota-stangtesten.
Data blev udtrykt som middelværdi ± S.E.M. Derudover blev eksperimentelle data opnået på forskellige tidspunkter analyseret uafhængigt. Smerteadfærdsreaktioner blev beregnet som arealet under kurven (AUC). Tovejs gentagne målinger ANOVA blev udført for at bestemme forskelle i dataene fra mekanisk allodynitest, ganganalyse og rota-stangtest over tid. Dunnetts test blev brugt til post-hoc analyse for at bestemme P-værdien blandt de eksperimentelle grupper. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante. GraphPad Prism 6.0-software blev brugt til at analysere denne statistiske validitet. Alle statistiske analyseprocedurer blev udført blindt i forhold til forsøgsbetingelserne. En figur, der illustrerer den forbrændingsskade-inducerede vævsskade, er vist i supplerende figur 1.
Tidsforløbsændringer i poteudtagningstærsklen (PWT, g) efter forbrændingsskade er vist i figur 1. PWT (g) af forbrændingsskadeinducerede mus blev reduceret 1 dag efter forbrændingsinduktion og opretholdt i 7 dage sammenlignet med kontrolgruppens. Administration af acetaminophen (200 mg/kg, dvs. en gang dagligt i 7 dage fra dagen for induktion af forbrænding) reducerede signifikant det forbrændingsinducerede fald i PWT (figur 1A, ** p < 0,01 versus Burn-gruppen). Derudover viste AUC-analysen (i 7 dage), at acetaminophen-administration signifikant reducerede den forbrændingsskadeinducerede mekaniske allodyni (figur 1B, *** p < 0,001 versus kontrolgruppe, ** p < 0,01 versus Burn-gruppe).
Ændringer i bagpoteaftryksområdet efter forbrændingsskade over tid er vist i figur 2. Forbrændingsskade reducerede signifikant det ipsilaterale bagpoteaftryksområde fra dagen efter induktion og vedvarede i 7 dage. Bagpoteaftryksområdet blev signifikant forbedret ved administration af acetaminophen (200 mg/kg, i.p., en gang dagligt i 7 dage fra dagen for induktion) sammenlignet med den køretøjsbehandlede gruppe (figur 2A,B, * p < 0,05 og ** p < 0,01 versus Burn-gruppen).
Tidsforløbsændringer i en enkelt stilling efter brandskade er vist i figur 3. Forbrændingsskade reducerede den enkelte holdning (%) af den ipsilaterale bagpote 1 dag efter forbrændingsinduktion, og denne reduktion blev opretholdt i 7 dage. Bagpotens enkeltstilling blev forbedret ved administration af acetaminophen (200 mg/kg, dvs. en gang dagligt i 7 dage fra dagen for induktion af forbrænding) sammenlignet med den køretøjsbehandlede gruppe (figur 3A,B, * p < 0,05 versus Burn-gruppen).
Ændringer i immobilitetstiden opnået ved den tvungne svømmeprøve er vist i figur 4. Immobilitetstiden for de forbrændingsskadeinducerede mus blev øget 7 dage efter forbrændingsinduktion sammenlignet med kontrolgruppens. I forbrændingsskadeinducerede mus reducerede acetaminophenadministration (200 mg / kg, i.p., en gang dagligt i 7 dage fra dagen for forbrændingsinduktion) signifikant den forbrændingsskadeinducerede stigning i immobilitetstid (** p < 0,01 og *** p < 0,001 versus Burn-gruppe).
Den normale motoriske funktion blev vurderet ud fra ændringerne i køretiden på rota-stangen, som vist i figur 5. Driftstiden for de forbrændingsskadeinducerede mus ændrede sig ikke 7 dage efter forbrændingsinduktion sammenlignet med kontrolgruppens. I modsætning hertil blev køretiden for alfaxalonebehandlede mus (positiv kontrol) signifikant reduceret i løbet af ca. 60 minutter. Dette resultat indikerer, at en forbrændingsskade, der anvendes i denne undersøgelse, ikke forårsager motorisk svækkelse (*** p < 0,001 versus Burn-gruppen).
Figur 1: Mekanisk allodyni vurderet ved von Frey-test i forbrændingsskadeinducerede mus. (A) Poteudtagningstærsklen (PWT, g) i musens ipsilaterale bagpote blev reduceret 1 dag efter forbrændingsskade og opretholdt i 7 dage sammenlignet med kontrolgruppen. Administration af acetaminophen (200 mg/kg, dvs. en gang dagligt i 7 dage fra dagen for induktion af forbrænding) reducerede signifikant den forbrændingsskadeinducerede mekaniske allodyni. (B) PWT blev analyseret som arealet under kurven (AUC). Pile angiver dagen for lægemiddeladministration. p < 0,001 versus kontrolgruppe, ** p < 0,01 versus Burn-gruppe. Tovejs gentagne målinger ANOVA blev udført for at bestemme de samlede effekter i løbet af von Frey-testen. Post-hoc analyse blev udført ved hjælp af Dunnetts test for at bestemme P-værdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Poteaftryksområde opnået ved automatiseret ganganalyse i forbrændingsskadeinducerede mus. (A) Repræsentative billeder af både musens ipsilaterale og kontralaterale bagpoter blev fanget af ganganalysesoftwaren. Potens kontaktstørrelse reduceres efter forbrændingsskade sammenlignet med kontrolgruppens. Denne reduktion blev delvist genvundet ved administration af acetaminophen (200 mg/kg, dvs. en gang dagligt i 7 dage fra dagen for induktion af forbrænding). Hvide rektangler angiver de bagpoter, der analyseres af softwaren, (B) en graf viser tidsforløbsændringerne i poteaftryksområdet (%). Data beregnes som procentdelen af ændringer i udskriftsområdet mellem de ipsilaterale (højre) og kontralaterale (venstre) bagpoter (f.eks. Angiver værdien på 50% de samme poteaftryksområder i højre og venstre bagpote). Pile angiver dagen for lægemiddeladministration. * p < 0,05 og ** p < 0,01 versus Burn-gruppen. Tovejs gentagne målinger ANOVA blev udført for at bestemme de samlede effekter i udskriftsområdets tidsforløb ved ganganalyse. Post-hoc analyse blev udført ved hjælp af Dunnetts test for at bestemme P-værdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Enkelt holdning opnået ved automatiseret ganganalyse i forbrændingsskadeinducerede mus. (A) Repræsentative billeder af en enkelt holdning blev taget af ganganalysesoftwaren. Forskellige farver angav holdningen af hver pote: blå, højre forpote; lyserød, højre bagpote; gul, venstre forpote; grøn, venstre bagpote. Den enkelte holdning af den ipsilaterale bagpote blev forkortet efter forbrændingsskade. Denne ændring blev delvist genvundet ved administration af acetaminophen (200 mg/kg, dvs. en gang dagligt i 7 dage fra dagen for induktion af forbrænding). (B) En graf viser tidsforløbsændringer i den enkelte holdning (%). Data opsummeres som en linjegraf efter beregning af procentdelen af ændringer i enkelt holdning mellem de ipsilaterale (højre) og kontralaterale (venstre) bagpoter (f.eks. Værdien på 50% angiver den samme enkelt holdning i højre og venstre bagpote). Pile angiver dagen for lægemiddeladministration. * p < 0,05 mod Burn-gruppen. Tovejs gentagne målinger ANOVA blev udført for at bestemme de samlede effekter i tidsforløbet af en enkelt holdning til ganganalyse. Post-hoc analyse blev udført ved hjælp af Dunnetts test for at bestemme P-værdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Immobilitetstiden for den tvungne svømmetest i forbrændingsskadeinducerede mus. Immobilitetstiden for de forbrændingsskadeinducerede mus blev øget 7 dage efter forbrændingsinduktion sammenlignet med kontrolgruppens. I forbrændingsskadeinducerede mus lindrede acetaminophen-administration (200 mg / kg, dvs. en gang dagligt i 7 dage fra dagen for forbrændingsinduktion) signifikant forbrændingsskadeinduceret forbedret immobilitetstid. p < 0,001 versus kontrolgruppe, ** p < 0,01 versus Burn-gruppe. Envejs gentagne målinger ANOVA blev udført for at bestemme de samlede effekter i løbet af den tvungne svømmetest. Post-hoc analyse blev udført ved hjælp af Dunnetts test for at bestemme P-værdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Den normale motoriske funktionsvurdering baseret på ændringer i køretiden for rota-stangstesten i forbrændingsskadeinducerede mus. Der var ingen ændring i driftstiden for de forbrændingsskadeinducerede mus 7 dage efter forbrændingsinduktion sammenlignet med dem fra kontrol- og acetaminophen-behandlede forbrændingsskadegrupper. Køretiden for alfaxalonebehandlede mus (Positiv kontrol) blev imidlertid signifikant reduceret til ~ 60 s. Dette resultat indikerer, at en forbrændingsskade, der anvendes i denne undersøgelse, ikke forårsager motorisk svækkelse. p < 0,001 versus Burn-gruppen. Tovejs gentagne målinger ANOVA blev udført for at bestemme de samlede effekter i løbet af rota-stangtesten. Post-hoc analyse blev udført ved hjælp af Dunnetts test for at bestemme P-værdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Ændringer i vævsskade over tid efter induktion af forbrændinger. Efter den skoldende forbrændingsinduktion blev der observeret betydelig vævsskade, som steg gradvist over tid. I denne undersøgelse har Acetaminophen, der anvendes som et positivt kontrollægemiddel, vist en beskyttende virkning på vævsskader. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den skoldningsforbrænding er en slags termisk forbrænding, der er forårsaget af opvarmede væsker. Det er blevet foreslået, at første- eller andengradsforbrændinger forekommer i de fleste tilfælde, men langvarig kontakt med varmekilder kan forårsage tredjegradsforbrændinger26. I den foreliggende undersøgelse blev forbrændingsskader induceret ved at udsætte musens højre bagpote i varmt vand ved 65 °C i 3 s 4,26. Vævsskade blev påvist i den brandskadede pote, som viser almindelige symptomer på forbrændinger som rødme, afskalning af huden og hævelse (supplerende figur 1)4.
Mekanisk allodynimåling er en almindeligt anvendt metode til identifikation af smerterespons i dyresmertemodeller og blev målt ved hjælp af von-Frey-filamenter i denne undersøgelse. Den stigende stimulusmetode med von Frey-filamenterne bruges til at bestemme den mekaniske tærskel, der kræves for at fremkalde et dyrs poteudtagningsrespons19,20. Eksperimentet startede med glødetråden med mindst mulig stimulus. Filamentets bøjningskraft, der reagerer på et bestemt tal (tre gange i denne protokol), blev opnået som en poteudtagningstærskelværdi.
Ganganalyse af gnavere under fri gang bruges til at studere Parkinsons sygdom eller lemmer bevægelser og positionsændringer i sensorisk-motoriske svækkelsesmodeller, herunder rygmarvsskade og slagtilfælde27,28. Ganganalysesystemet analyserer automatisk forskellige gangparametre, herunder poteintensitet, poteaftryk, holdningsfase osv. Ændringer af parametre, som ganganalysesystemet kan analysere, kan bruges som smerterelaterede indikatorer i ganganalysen af smertedyrsmodeller. Derfor kan ganganalyse anvendes som en eksperimentel metode til ikke-invasivt at kvantificere spontan smerte i dyremodel 4,21,22. Baseret på tidligere resultater om, at gangparametre blev reduceret på den smerteinducerede side i dyremodeller af smerte21,22, kvantificerede denne præsenterede protokol hver gangparameter som forholdet mellem den forbrændingsinducerede ipsilaterale og kontralaterale side. I denne protokol blev poteaftryksområde og enkeltstillingsdata konverteret til ændringshastigheden mellem ipsilaterale (skadede) og kontralaterale (ikke-skadede) bagpoter. Værdien på 50% betyder, at poteaftrykstørrelsen og tiden til at nå gulvet er den samme i både den ipsilaterale og kontralaterale, mens værdien mindre end 50% indikerer, at disse parametre reduceres i den forbrændingsinducerede ipsilaterale bagpote. De procentvise ændringer mellem de ipsilaterale og kontralaterale bagpoter blev brugt til at opnå alle data (dvs. normale mus viste ~ 50%, hvilket betyder, at det ipsilaterale: kontralaterale forhold var 50:50). Hos normale dyr forekommer parametrene relateret til hvert bagben de samme på begge sider, når de går frit. Analysen af denne protokol er imidlertid fokuseret på, at parametrene på den ipsilaterale side falder efter smerteinduktion. Derudover er der individuel variation i hvert dyr; nøjagtige data opnås muligvis ikke, når rådataene analyseres, som de er. Derfor blev hver gangparameterværdi konverteret til et forhold for at opnå mere nøjagtige resultater under analysen. Den foreliggende undersøgelse har vist, at udskriftsområdets størrelse og den enkelte holdningstid for den ipsilaterale bagpote blev reduceret efter forbrændingsskade, og denne reduktion blev genoprettet ved gentagen intraperitoneal acetaminophenadministration. Disse ændringer faldt sammen med et lignende mønster af tidsforløbsændringer i smerteadfærd efter forbrændingsskade og lægemiddeladministration.
Selvom det er kontroversielt, er den tvungne svømmetest den mest almindeligt anvendte metode til at studere deprimerede gnaveres adfærd. Dyrene forsøger at flygte fra beholderen fuld af vand, men bevæger sig til sidst ikke, hvilket fremkalder fortvivlelse29. Det hævdes imidlertid, at immobilitet er vanskeligt at evaluere som et mål for depression, fordi denne test er forbundet med udholdenhed såvel som følelser af fortvivlelse. For at understøtte resultaterne af det tvungne svømmeforsøg kan andre metoder til evaluering af depression, såsom halesuspensionstesten, nyhedsundertrykt fodringstest og saccharoseforbrugstest, betragtes som30,31. I den foreliggende undersøgelse blev immobiliseringstiden øget efter forbrændingsskade, og denne stigning blev genoprettet ved administration af acetaminophen.
Protokollerne i denne undersøgelse var designet til at etablere en model for akut smerte, der ledsager depressionslignende adfærd efter forbrændingsskade. Den depressionslignende adfærd i denne undersøgelse kan være de sekundære virkninger af fysisk svækkelse og ændringer i termisk følsomhed efter forbrændingsskade 15,32,33. Resultaterne kunne tyde på, at mus med induceret akut smerte efter forbrændingsskade udviste depressionslignende adfærd. Det har vist sig at forbedre smerterespons og deraf følgende depressionslignende adfærd ved eksperimentelt behandlede lægemidler.
Rota-stangtesten er en præstationstest baseret på en rotationsbelastning, der generelt anvendes med magt på gnavere med atletisk aktivitet. Testen måler parametre som køretid og udholdenhed. Nogle af testfunktionerne omfatter blandt andet virkningerne af et eksperimentelt lægemiddel eller balancen mellem forsøgspersoner i den neuropatiske smertemodel, grebsstyrke og motorisk koordinationsvurdering 22,25,34. Som det fremgår af resultaterne af denne undersøgelse, var der ingen ændring i rota-stangens køretid efter forbrændingsskade eller acetaminophenbehandling sammenlignet med kontrolgruppens.
Denne undersøgelse viser udviklingen af en dyremodel til undersøgelse af forbrændingsskade-induceret smerte og depression-lignende adfærd hos mus. I denne henseende har denne undersøgelse vist, at skoldning af forbrændingsskader inducerede mekanisk allodyni, ændringer af gangparametre og depressionslignende adfærd såsom immobilitetstid. Denne model er velegnet til forskning i de forskellige aspekter og resultater af forbrændingssmerter og dens behandling og forventes at bringe vigtig information til dette forskningsfelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Chungnam National University og National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud finansieret af Koreas regering (NRF-2019R1A6A3A01093963 og NRF-2021R1F1A1062509).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 307809 | |
| 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL tube | SPL | 50050 | |
| Acetaminophen BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | A7085-100G | This analgesic agent is used as a positive control. |
| Alfaxan multidose (Alfaxalone) | JUROX Pty.Limited | In this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test. | |
| CatWalk automated gait analysis system | Noldus | CatWalk XT | Gait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction |
| OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment) | Ashish Life Science | This material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia. | |
| Plexiglass cylinder | SCITECH KOREA | custom made products | Used in forced swimming test |
| Rota-rod system | SCITECH KOREA | Accelerating rota rod | Used in the measurement of Normal Motor Function |
| von Frey filaments | North Coast Medical | NC12775 | Used in the measurement of Mechanical Allodynia |
| Waterbath | CHANGSHIN SCIENCE | C-WBE | Used in the burn injury induction |
References
- Peck, M. D. Epidemiology of burns throughout the World. Part II: intentional burns in adults. Burns. 38 (5), 630-637 (2012).
- Tracy, L. M., Cleland, H. Pain assessment following burn injury in Australia and New Zealand: Variation in practice and its association on in-hospital outcomes. Australasian Emergency Care. 24 (1), 73-79 (2021).
- Montgomery, R. K.
- Kang, D. W., Choi, J. G. Bee venom reduces burn-induced pain via the suppression of peripheral and central substance P expression in mice. Journal of Veterinary Science. 22 (1), 9 (2021).
- Abdi, S., Zhou, Y.
- Ullrich, P. M., Askay, S. W. Pain, depression, and physical functioning following burn injury. Rehabilitation Psychology. 54 (2), 211-216 (2009).
- Patwa, S., Benson, C. A. Spinal cord motor neuron plasticity accompanies second-degree burn injury and chronic pain. Physiological Reports. 7 (23), 14288 (2019).
- Michaelides, A., Zis, P. Depression, anxiety and acute pain: links and management challenges. Postgraduate Medicine. 131 (7), 438-444 (2019).
- Doan, L., Manders, T., Wang, J. Neuroplasticity underlying the comorbidity of pain and depression. Neural Plasticity. 2015, 504691 (2015).
- Vachon-Presseau, E., Centeno, M. V. The emotional brain as a predictor and amplifier of chronic pain. Journal of Dental Research. 95 (6), 605-612 (2016).
- Apkarian, A. V., Baliki, M. N. Predicting transition to chronic pain. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 360-367 (2013).
- Yin, W., Mei, L. A Central amygdala-ventrolateral periaqueductal gray matter pathway for pain in a mouse model of depression-like behavior. Anesthesiology. 132 (5), 1175-1196 (2020).
- Deng, Y. T., Zhao, M. G., Xu, T. J. Gentiopicroside abrogates lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior in mice through tryptophan-degrading pathway. Metabolic Brain Disease. 33 (5), 1413-1420 (2018).
- Zhang, G. F., Wang, J. Acute single dose of ketamine relieves mechanical allodynia and consequent depression-like behaviors in a rat model. Neuroscience Letters. 631, 7-12 (2016).
- Edwards, R. R., Smith, M. T. Symptoms of depression and anxiety as unique predictors of pain-related outcomes following burn injury. Annals of Behavioral Medicine. 34 (3), 313-322 (2007).
- Pincus, T., Vlaeyen, J. W. Cognitive-behavioral therapy and psychosocial factors in low back pain: directions for the future. Spine. 27 (5), 133-138 (2002).
- Laumet, G., Edralin, J. D. CD3(+) T cells are critical for the resolution of comorbid inflammatory pain and depression-like behavior. Neurobiology of Pain. 7, 100043 (2020).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Scholz, J., Broom, D. C. Blocking caspase activity prevents transsynaptic neuronal apoptosis and the loss of inhibition in lamina II of the dorsal horn after peripheral nerve injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (32), 7317-7323 (2005).
- Kang, D. W., Choi, J. G. Automated gait analysis in mice with chronic constriction injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56402 (2017).
- Kang, D. W., Moon, J. Y. Antinociceptive profile of levo-tetrahydropalmatine in acute and chronic pain mice models: Role of spinal sigma-1 receptor. Scientific Reports. 6, 37850 (2016).
- Huang, W., Chen, Z. Piperine potentiates the antidepressant-like effect of trans-resveratrol: involvement of monoaminergic system. Metabolic Brain Disease. 28 (4), 585-595 (2013).
- Can, A., Dao, D. T. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3638 (2012).
- Choi, J. G., Kang, S. Y. Antinociceptive effect of Cyperi rhizoma and Corydalis tuber extracts on neuropathic pain in rats. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 16 (6), 387-392 (2012).
- Mosby's. Mosby's Dictionary of Medicine, Nursing & Health Professions - Seventh edition, Nursing Standard. 20 (22), RCN Publishing Company Ltd. 36 (2006).
- Vandeputte, C., Taymans, J. M. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Isvoranu, G., Manole, E. Gait analysis using animal models of peripheral nerve and spinal cord injuries. Biomedicines. 9 (8), 1050 (2021).
- Yankelevitch-Yahav, R., Franko, M. The forced swim test as a model of depressive-like behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52587 (2015).
- Yan, H. C., Cao, X.
- Papp, M., Willner, P. An animal model of anhedonia: attenuation of sucrose consumption and place preference conditioning by chronic unpredictable mild stress. Psychopharmacology. 104 (2), 255-259 (1991).
- Seminowicz, D. A., Laferriere, A. L. MRI structural brain changes associated with sensory and emotional function in a rat model of long-term neuropathic pain. Neuroimage. 47 (3), 1007-1014 (2009).
- Yalcin, I., Barthas, F. Emotional consequences of neuropathic pain: insight from preclinical studies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 47, 154-164 (2014).
- Choi, J. W., Kang, S. Y. Analgesic effect of electroacupuncture on paclitaxel-induced neuropathic pain via spinal opioidergic and adrenergic mechanisms in mice. American Journal of Chinese Medicine. 43 (1), 57-70 (2015).
