Summary
Dette arbeidet dokumenterer en enkel metode for å lage syntetiske antigenkontroller for immunhistokjemi. Teknikken kan tilpasses en rekke antigener i et bredt spekter av konsentrasjoner. Prøvene gir en referanse for å vurdere intra- og interanalyseytelse og reproduserbarhet.
Abstract
Immunhistokjemi (IHC) analyser gir verdifull innsikt i proteinuttrykksmønstre, hvis pålitelige tolkning krever godt karakteriserte positive og negative kontrollprøver. Fordi passende vevs- eller cellelinjekontroller ikke alltid er tilgjengelige, kan en enkel metode for å lage syntetiske IHC-kontroller være gunstig. En slik metode er beskrevet her. Det kan tilpasses forskjellige antigentyper, inkludert proteiner, peptider eller oligonukleotider, i et bredt spekter av konsentrasjoner. Denne protokollen forklarer trinnene som er nødvendige for å lage syntetiske antigenkontroller, ved å bruke som eksempel et peptid fra det humane erytroblastiske onkogenet B2 (ERBB2 / HER2) intracellulære domenet (ICD) anerkjent av en rekke diagnostisk relevante antistoffer. Serielle fortynninger av HER2 ICD-peptidet i bovint serumalbumin (BSA)-oppløsning blandes med formaldehyd og varmes opp i 10 minutter ved 85 °C for å størkne og kryssbinde peptidet/BSA-blandingen. Den resulterende gelen kan behandles, seksjoneres og farges som et vev, noe som gir en rekke prøver av kjente antigenkonsentrasjoner som spenner over et bredt spekter av fargeintensiteter.
Denne enkle protokollen er i samsvar med rutinemessige histologiske laboratorieprosedyrer. Metoden krever bare at brukeren har en tilstrekkelig mengde av ønsket antigen. Rekombinante proteiner, proteindomener eller lineære peptider som koder for relevante epitoper kan syntetiseres lokalt eller kommersielt. Laboratorier som genererer interne antistoffer kan reservere aliquots av immuniseringsantigenet som det syntetiske kontrollmålet. Muligheten til å lage veldefinerte positive kontroller over et bredt spekter av konsentrasjoner gjør det mulig for brukere å vurdere intra- og interlaboratorieanalyseytelse, få innsikt i det dynamiske området og lineariteten til analysene og optimalisere analyseforholdene for deres spesielle eksperimentelle mål.
Introduction
Immunhistokjemi (IHC) tillater sensitiv og spesifikk, romlig presis påvisning av målantigener i formalinfaste, paraffininnstøpte (FFPE) vevsseksjoner. Resultatene av IHC-farging kan imidlertid påvirkes av flere variabler, inkludert varm og kald iskemitid, vevsfiksering, vevsforbehandling, antistoffreaktivitet og konsentrasjon, analysedeteksjonskjemi og reaksjonstider1. Følgelig krever reproduserbar ytelse og tolkning av IHC-reaksjoner streng kontroll av disse variablene og bruk av godt karakteriserte positive og negative kontrollprøver. Ofte brukte kontroller inkluderer paraffininnstøpt vev eller dyrkede cellelinjer kjent fra uavhengige analyser for å uttrykke antigenet av interesse, men slike prøver er ikke alltid tilgjengelige1. Videre forstås ekspresjonsnivåene av målantigenene i vev og cellelinjekontroller generelt bare kvalitativt og kan være variable. Kontroller som inneholder reproduserbare, nøyaktig kjente konsentrasjoner av målantigen kan hjelpe til med optimalisering av IHC-reaksjonsbetingelser. En generell metode, som kan tilpasses en rekke antigentyper i et fysiologisk relevant konsentrasjonsområde for å lage syntetiske IHC-kontrollprøver, er beskrevet av forfatterne2. En detaljert protokoll er gitt her for opprettelse og bruk av denne typen standard.
Hensiktsmessige kontroller er avgjørende for gyldig tolkning av IHC-analyser 1,3,4. Vev, dyrkede celler og peptidbelagte substrater har blitt brukt som IHC-kontroller i henhold til etterforskernes spesifikke behov. Fordelene og begrensningene som ligger i bruk av vev som IHC-kontroller har blitt grundig diskutert 1,4. For mange antistoffer kan passende kontroller velges fra utvalgte normale vev som inneholder cellepopulasjoner som uttrykker målantigenet over et bredt dynamisk område. Vevskontroller er mindre egnet når målantigenet ikke er godt karakterisert med hensyn til ekspresjonssted eller overflod, eller når potensielt kryssreagerende antigener uttrykkes samtidig i de samme cellene eller vevsstedene. I disse sammenhengene kan blokker av dyrkede cellelinjer som uttrykker antigenet av interesse være nyttige. For å gi ytterligere bevis på målspesifisitet, kan cellelinjer konstrueres for å over- eller underuttrykke målantigener. For eksempel ble en slik tilnærming nylig brukt til å evaluere en rekke anti-PD-L1-analyser ved hjelp av en vevsmikromatrise av isogene cellelinjer som uttrykker en rekke PD-L1-antigen5. Praktiske begrensninger for rutinemessig bruk av cellelinjeblokker inkluderer kostnaden og tiden som trengs for å produsere tilstrekkelige celletall, og det faktum at uttrykket av noen antigener kanskje ikke er pålitelig konsistent, selv innenfor klonale cellelinjer6. Syntetiske peptider er et tredje alternativ for IHC-kontroller for antistoffer som gjenkjenner korte lineære epitoper. Steven Bogen og kolleger har publisert mye om bruk av peptider koblet til overflaten av glassglass 7,8 og glassperler9. En studie av denne gruppen viste at kvantitativ analyse av peptidbaserte IHC-kontroller kunne oppdage fargeprosessvariasjon savnet ved kvalitativ evaluering av vevskontroller analysert parallelt10. Mens standarder som bruker perlebaserte antigener kan være allment anvendelige, er mange detaljer proprietære for forfatterne, noe som begrenser utbredt adopsjon.
En annen tilnærming til IHC-standarder inkorporerer målantigener i kunstig opprettede proteingeler. Dette konseptet ble først demonstrert av Per Brandtzaeg i 1972 i en studie der normalt kaninserum ble polymerisert ved bruk av glutaraldehyd11. Små blokker av den resulterende gelen ble deretter gjennomvåt i 1-4 uker i løsninger som inneholder immunoglobulinantigenene av interesse ved forskjellige konsentrasjoner. Etter alkoholfiksering og parafininnbygging ble deler av de resulterende kontrollene vist å flekke med intensiteter som tilsvarer logaritmen til antigenløsningene der de hadde blitt gjennomvåt. Senere fremstilte etterforskere glutaraldehydkonjugater av spesifikke aminosyrer i fortynnede BSA- eller hjernehomogenatløsninger som positive kontroller i immunelektronmikroskopistudier12,13. Nyere arbeid undersøkte bruken av geler laget av formaldehydfaste proteinløsninger som surrogater for FFPE-vev i massespektrometrianalyse14. Et annet nylig arbeid undersøkte strukturen og egenskapene til geler dannet ved oppvarming av humane eller bovine serumalbuminløsninger i forskjellige konsentrasjoner og pH15. Disse forfatterne fant at serumalbumin danner tre typer geler som er forskjellige i mekanisk elastisitet, sekundær strukturbevaring og fettsyrebindende evne avhengig av eksperimentelle forhold. Sammen demonstrerer disse papirene den generelle gjennomførbarheten av tilnærmingen som brukes her. Proteinløsninger med definert sammensetning skaper vevslignende geler som kan viderebehandles, seksjoneres og farges ved hjelp av rutinemessige histologiske metoder.
Denne protokollen beskriver dannelsen av en syntetisk IHC-kontroll laget av bovint serumalbumin (BSA) polymerisert med varme og formaldehyd. Gelene kan inkorporere et bredt utvalg av antigener, inkludert proteiner i full lengde, proteindomener og lineære peptider, samt ikke-proteinantigener inkludert oligonukleotider2. Denne demonstrasjonen bruker et eksempelantigen et lineært peptid som koder for de C-terminale 16 aminosyrene i det humane ERBB2 (HER2/ neu) proteinet TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (se materialtabell). Denne sekvensen inkluderer epitoper anerkjent av tre kommersielt tilgjengelige, diagnostisk relevante antistoffer, inkludert Herceptest polyklonale reagens (ENPEYLGLDVP) og de monoklonale antistoffene CB11 (AENPEYL) og 4B5 (TAENPEYLGL) (se materialtabell)16.
Metoden demonstrert her benytter lett tilgjengelige reagenser ved hjelp av prosesser og teknikker som er kjent for ethvert praktiserende histologisk laboratorium. Den viktigste begrensningen er behovet for å identifisere og kjøpe målantigenene, som i mange tilfeller kan oppnås til en relativt beskjeden kostnad. Fordi disse syntetiske kontrollene er av helt definert sammensetning og laget med enkle metoder, kan de implementeres i mange laboratorier med reproduserbare resultater. Bruken av dem kan lette den objektive, kvantifiserbare evalueringen av IHC-fargeresultater og tillate større intra- og interlaboratorisk reproduserbarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjøring av stamløsning og verktøy
- Klargjør 20 ml av en 25 % w/v BSA-oppløsning ved å blande 5 g BSA pulver i 14 ml PBS, pH 7,2 i en 50 ml konisk slange til den er jevnt fordelt. Vortex etter behov for å dispergere BSA pulveret.
- Oppbevar oppløsningen over natten ved 4 °C for å tillate fullstendig oppløsning. Juster det endelige volumet til 20 ml med PBS for å lage en 25 % w/v lagerløsning.
- Klargjør 20 ml av en 31,3 % w/v BSA-oppløsning ved å blande 6,26 g BSA pulver i 13 ml PBS, pH 7,2 i en 50 ml konisk slange til den er jevnt fordelt. Oppbevar oppløsningen over natten ved 4 °C for å tillate fullstendig oppløsning. Juster det endelige volumet til 20 ml med PBS for å lage en 31,3 % w/v lagerløsning.
- Forvarm en varmeblokk til 85 °C.
MERK: Protokollen nedenfor lager peptid / BSA-geler med volumer på 1,26-1,4 ml dannet i 1,5 ml mikrosentrifugerrør. For å bruke mindre volumer, for eksempel når antigenlagrene begrenser, klargjør du gelene i PCR-rør og bruker en termosykler satt til 85 °C som varmeblokk. - Test at BSA / formaldehydblandingen danner en gel som forventet ved å blande 700 μL 25% BSA-løsning med 700 μL 37% formaldehyd. Bland godt ved å pipettere opp og ned 5 ganger innen 5-10 s. Unngå å lage luftbobler.
FORSIKTIG: Konsentrert formaldehyd er giftig; brukes med passende sikkerhetsforanstaltninger. - Umiddelbart etter blanding av BSA- og formaldehydløsninger, plasser det lukkede mikrosentrifugerøret i en varmeblokk ved 85 °C i 10 minutter. Fjern røret fra varmeblokken og la det avkjøles. Bekreft at gelen har dannet seg som forventet.
2. Fremstilling og fortynning av peptider
- Oppnå 5-20 mg lyofilisert peptid av ønsket sekvens.
MERK: De C-terminale 16 aminosyrene i det humane ERBB2 intracellulære domenet anerkjent av 4B5 er TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.- Tilsett 4 aminosyrer til N-terminalen, acetyl-YGSG og C-terminalen, GSGC-amid for å lette kryssbinding av peptidet til BSA og gi avstand mellom BSA-molekylet og peptidepitopen.
MERK: Den komplette sekvensen er: acetyl-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-amid. - Hvis ønskelig, bruk andre N- og C-terminale aminosyresekvenser for å utvide kjernepeptidpitopen.
MERK: Virkningen av forskjellige sekvenser varierer med forskjellige antistoff / epitopkombinasjoner. Tilsetningen av det C-terminale peptidet reduserer bindingen av noen antistoffer mot C-terminale epitoper. I slike tilfeller utelater du denne sekvensen. - Bekreft at peptider fra kommersielle kilder leveres ved >95% renhet, hvis sammensetning er bekreftet ved HPLC og massespektrometrianalyse.
- Tilsett 4 aminosyrer til N-terminalen, acetyl-YGSG og C-terminalen, GSGC-amid for å lette kryssbinding av peptidet til BSA og gi avstand mellom BSA-molekylet og peptidepitopen.
- Beregn nødvendige volumer for 5x (1,25 E-2 M) peptidmasseløsninger. Med henvisning til tabell 1, kolonne C-E, legges inn verdier for antigenmolekylvekten (g/mol), prosent antigenrenhet (0-100) og antigenmasse (mg).
MERK: Volumet av løsningsmiddel (i μL) som skal resuspendere prøven for å oppnå en stamløsning på 1,25 E-2 M er 800 x antigenmolekylvekt x prosent antigenrenhet/antigenmasse.- Forbered og merk tydelig åtte 1,5 ml mikrosentrifugerrør.
MERK: Rørene vil inneholde 5x peptidlager i et løsningsmiddel, 1x peptidlager i et løsningsmiddel, fem 10x serielle fortynninger på 2,5 E-4 M til 2,5 E-8 M peptid / BSA / formaldehydgel og en negativ kontrollgel som inneholder BSA / formaldehyd som mangler tilsatt antigen. Alle gelprøver ser identiske ut. Når du forbereder flere sett med peptidfortynninger på en gang, må du passe på å merke og identifisere alle rør og behandlingskassetter riktig. Bruk fargekodede mikrosentrifugerør og behandlingskassetter der det er mulig for å minimere feilidentifisering.
- Forbered og merk tydelig åtte 1,5 ml mikrosentrifugerrør.
- Klargjør en 5x peptidløsning ved 1,25 E-2 M ved å gjenopplive hele massen av lyofilisert peptid (20 mg for ERBB2 peptider) i 60 μL av passende løsningsmiddel.
MERK: I dette eksemplet ble dimetylformamid (DMF) lagt direkte til leverandørens beholder.- Inspiser løsningen for å sikre at peptidet er helt oppløst. Tilsett om nødvendig ytterligere løsningsmiddel og/eller soniker prøven til peptidet er fullstendig oppløst, og pass på at volumet beregnet i tabell 1 overskrides for 5x peptidstammen.
FORSIKTIG: DMF er giftig; brukes med passende forholdsregler.
MERK: Avhengig av aminosyresekvensen, og den tilsvarende hydrofobisiteten og ladningen, kan peptider være oppløselige i DMF, dimetylsulfoksid (DMSO), rent vann eller fortynnede løsninger av eddiksyre, maursyre eller ammoniumbikarbonat. Peptidegenskaper kan beregnes ved hjelp av en rekke elektroniske verktøy17. Noen peptidleverandører kan foreslå løsemidler som passer for spesifikke sekvenser. - Tilsett oppløsningsmiddel etter behov for å bringe volumet av 5x peptidmassen til det endelige volumet beregnet i tabell 1. Vortex for 5 s og sentrifuge ved romtemperatur ved 5000 x g i 5 s. Peptidløsninger kan lagres ved -80 °C.
- Inspiser løsningen for å sikre at peptidet er helt oppløst. Tilsett om nødvendig ytterligere løsningsmiddel og/eller soniker prøven til peptidet er fullstendig oppløst, og pass på at volumet beregnet i tabell 1 overskrides for 5x peptidstammen.
- Med henvisning til tabell 2, kolonne C, klargjør 150 μL 1x peptidmasseoppløsning (2,5 E-3 M) ved å fortynne 30 μL av 5x peptidmassen til 120 μL løsningsmiddel (DMF dette eksemplet). Vortex for 5 s og sentrifuge ved romtemperatur ved 5000 x g i 5 s.
- Med henvisning til tabell 2, kolonne D, klargjør 700 μL 5 E-4 M peptid/ BSA-løsning (fortynning 1) ved å fortynne 140 μL 1x peptidmasse til 560 μL på 31,3% BSA / PBS, pH 7,2. Vortex for 5 s og sentrifuge ved romtemperatur ved 5000 x g i 5 s.
MERK: Den endelige BSA-konsentrasjonen av denne oppløsningen er 25 % (w/v). - Med henvisning til tabell 2, kolonne E-H, klargjør fire påfølgende 10x serielle fortynninger av 5 E-4 M peptid / BSA-lageret ved å tilsette 70 μL peptid / BSA-løsning til 630 μL på 25% BSA / PBS, pH 7,2. Vortex for 5 s og sentrifuge ved romtemperatur ved 5000 x g i 5 s.
MERK: Etter dette trinnet vil det være fem 10 ganger serielle fortynninger av peptid (5 E-4 M til 5 E-8 M) i 25% BSA / PBS, pH 7,2. De fire første prøvene vil inneholde 630 μL. Den siste prøven vil inneholde 700 μL. - Med henvisning til tabell 2, kolonne I, lag en negativ kontroll BSA-prøve som inneholder 700 μL av 25% BSA / PBS, pH 7,2 (figur 1A).
3. Fremstilling av BSA-peptidgeler
- Bekreft at varmeblokken eller termosykleren er stabil ved 85 °C.
- Se tabell 3, kolonne B-E. Arbeid en prøve om gangen, legg til den første 25% BSA / peptidprøven (fortynning 1) 630 μL 37% formaldehyd. Bland godt ved å pipettere opp og ned 5 ganger innen 5-10 s. Unngå å lage luftbobler.
FORSIKTIG: Konsentrert formaldehyd er giftig; brukes med passende sikkerhetsforanstaltninger.- Etter blanding av peptid/BSA- og formaldehydløsninger, plasser det lukkede mikrosentrifugerøret i en varmeblokk ved 85 °C i 10 minutter.
MERK: Bland BSA-peptidløsningen og formaldehyd grundig, men ikke bruk mer enn 10 s på å pipettere blandingen før prøven settes på varme. Siden formaldehyd-kryssbinding begynner umiddelbart, kan gelen dannes annerledes hvis prosedyren er variert for forskjellige prøver. Den endelige BSA-konsentrasjonen i disse gelene er 12,5 % (w/v). Endelige BSA-konsentrasjoner mindre enn 10% kan gi geler som ikke størkner; endelige BSA-konsentrasjoner større enn 16 % kan gi geler som er sprøere og vanskeligere å seksjonere etter behandling. - Gjenta trinn 3.2 og 3.2.1 for hver av fortynningene 2-4.
- Gjenta trinn 3.2 og 3.2.1 for fortynning 5, men tilsett 700 μL 37 % formaldehyd, et volum tilsvarende 700 μL BSA-antigenoppløsning.
- Se tabell 3 kolonne G; gjenta trinn 3.2 og 3.2.1 for den negative kontrollprøven, og tilsett 700 μL 37 % formaldehyd, et volum som tilsvarer 700 μL negativ kontroll BSA-løsning.
- Etter blanding av peptid/BSA- og formaldehydløsninger, plasser det lukkede mikrosentrifugerøret i en varmeblokk ved 85 °C i 10 minutter.
- Fjern rørene fra varmeblokken etter 10-12 minutter. Oppvarmingstiden skal være så konsistent som mulig for hver prøve. La gelene avkjøles på benken i 5-10 minutter (figur 1B).
- Bruk en ren, fleksibel laboratoriespatel til engangsbruk, fjern gelprøven i ett stykke fra mikrosentrifugerøret, og legg den i en forseglet beholder som inneholder minst 15 ml nøytral bufret formalin (NBF), ved hjelp av en separat beholder med NBF for hver prøve.
- Alternativt kan du kutte av bunnen av mikrosentrifugerøret med et nytt enkeltkantet barberblad, og skyve gelen ut fra bunnen med luft eller en passende sonde (Figur 1C-G).
MERK: De størknede formaldehyd/ BSA-gelene kan forbli i mikrosentrifugerørene ved romtemperatur i opptil 24 timer. Å forlate gelene i mikrosentrifugerøret i mer enn 24 timer kan føre til at de blir sprø og vanskeligere å behandle og seksjonere.
- Alternativt kan du kutte av bunnen av mikrosentrifugerøret med et nytt enkeltkantet barberblad, og skyve gelen ut fra bunnen med luft eller en passende sonde (Figur 1C-G).
4. Trimming, behandling og innebygging av BSA-geler
- Trim gelkeglen i sylindriske skiver som er ca. 5 mm tykke ved hjelp av en ren barberhøvel med én kant (figur 1H,I). Pakk platene inn i en biopsifolie, plasser en større gelskive i en kassett (som skal brukes i pilotstudien i trinn 5), og de resterende gelskivene sammen til en annen kassett (figur 2A, E) for bruk i konstruksjon av vevsmikromatrise (TMA) i trinn 6. Plasser de innpakkede gelskivene i tydelig merkede vevsbehandlingskassetter.
- Plasser kassettgelene i minst 15 ml 10% NBF per gelprøve før behandling, ved hjelp av en separat beholder med NBF for hver prøve. Geler kan forbli i 10% NBF i 6-48 timer.
- Behandle gelene i en automatisert histologisk vevsprosessor, etter en stor vevsplan med trykk og vakuum. Hvert trinn tar 1 time: 10% NBF, 70% etanol, 95% etanol (gjenta to ganger), 100% etanol (gjenta to ganger), xylener (gjenta tre ganger), parafin ved 60 ° C (gjenta tre ganger).
MERK: For etterforskere som velger å behandle prøver manuelt, følg samme sekvens av reagenser og tider. - Når prøvebehandlingen er fullført, fjerner du kassettene fra vevsprosessoren og flytter dem til parafininnbyggingssenteret.
- Pakk ut geler fra biopsifolien og legg gelene i paraffin. For hver prøve, legg inn en skive gel i en liten 15 mm x 15 mm form (Figur 2B-D), og de resterende gelskivene sammen i en annen større form (Figur 2F-H). Den første blokken med en prøve vil bli brukt til å teste peptidgelen i en pilotstudie. Den andre blokken kan brukes til TMA-konstruksjon.
5. Pilotevaluering av peptidfortynningsserien
- For hver peptidfortynningsserie planlegger du å lage to glassglass som inneholder totalt 6 separate seksjoner: en seksjon fra hver av de fem fortynningsserieprøvene, pluss en seksjon fra BSA-eneste negative kontrollprøven.
- På det første glassglasset skjærer du en 4 μm tykk seksjon fra hver av de mindre blokkene som inneholder en gelskive med de tre høyeste peptidkonsentrasjonene (2,5 E-4 M til 2,5 E-6 M).
- På et annet lysbilde, kutt en 4 μm tykk seksjon fra hver blokk med de to laveste peptidkonsentrasjonene (2,5 E-7 M og 2,5 E-8 M) og en seksjon fra BSA-eneste kontrollblokk. Registrer rekkefølgen på prøvene på lysbildene.
MERK: Forvent at de parafininnstøpte gelene skal kutte jevnt og produsere ensartede seksjoner uten fragmentering, rive eller skravlende artefakt. Hvis spesielle parafininnstøpte gelprøver er vanskelige å seksjonere, bløtlegg blokkflaten kort i iskaldt destillert vann før snitting. Eksperimenter om nødvendig med forskjellige bløtleggingstider eller med forskjellige løsninger (f.eks. ammoniakkvann). - Tørk lysbildene ved romtemperatur (ca. 23 °C) i 24 timer etterfulgt av 60 °C i 30 minutter.
- Beis de to lysbildene forberedt for hvert peptid med ønsket antistoff i henhold til standard IHC-protokoller.
MERK: Den primære antistoffkonsentrasjonen på lysbilde brukt for monoklonal 4B5 kanin i denne demonstrasjonen var 1,5 ug/ ml.- Forvent å se et relativt jevnt signal innenfor hver gelseksjon, med de forskjellige gelprøvene som viser et spekter av signalintensitet som tilsvarer peptidfortynningene.
- Hvis resultatene for pilotstudien er tilfredsstillende, konstruer en TMA fra geldonorblokkene som inneholder forskjellige konsentrasjoner av peptidantigen, som beskrevet i de neste trinnene i protokollen.
6. BSA gel TMA konstruksjon
- Konstruer en vevsmikromatrise som inneholder dupliserte kjerner med en diameter på 1 mm fra donorblokker som inneholder BSA-gel alene og BSA-geler som inneholder alle fem fortynningene av ERBB2-peptid.
MERK: Hvis ønskelig, ta med BSA-geler som inneholder de samme fem fortynningene av et ikke-målpeptid som ytterligere negative kontroller. Hvis ønskelig, inkluder kjerner av representative ERBB2-uttrykkende cellelinjer som positive kontroller. - Skjær 4 μm tykke seksjoner av TMA og beis med 1,5 ug / ml anti-ERBB2 / HER2 / neu kanin monoklonal 4B5 (se Materialtabell) i henhold til laboratoriestandardprotokoller.
- Vurder den resulterende flekkintensiteten kvalitativt ved inspeksjon eller kvantitativt ved digital bildeskanning og analyse (figur 3A, B).
MERK: Siden digital bildeanalyse ikke er fokus for denne protokollen, er disse trinnene igjen for leseren å utføre i henhold til deres preferanser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Peptider skal oppløses helt i et egnet oppløsningsmiddel ved romtemperatur for å danne en optisk klar oppløsning. Hvis det fortsatt er synlig partikkelformet materiale etter 30-60 minutter, kan det være nyttig å tilsette ytterligere volumer av det opprinnelige oppløsningsvæsken eller et alternativt løsningsmiddel som ikke overstiger det tiltenkte volumet av 5x peptidløsningen beregnet i tabell 1. På samme måte bør den kombinerte peptid/BSA-oppløsningen forbli gjennomskinnelig (figur 1A).
Peptid/BSA gelprøver skal danne en ugjennomsiktig gummiaktig masse etter oppvarming med 37 % formaldehyd (figur 1B-I). Mindre oppsprekking av gelprøvene kan forekomme under fjerning fra mikrosentrifugerørene (figur 3A). Disse skal ikke forstyrre påfølgende trinn. Parafininnstøpte gelprøver skal seksjoneres jevnt uten å rive eller skravle. Geler som viser uregelmessige utrivninger (figur 3B) kan ha nytte av mindre aggressive blokkvendte og/eller korte bløtlegging i isvann eller ammoniakkvann. Områder med variabelt redusert signal i et vannmerkemønster kan oppstå når fordelingen av ett eller flere fargereagenser er ujevn (figur 3C). Det fokalt økte makroskopiske signalet kan ses hvis det er reagensfangst under gelseksjonene på et hvilket som helst stadium av fargeprosessen (figur 3C). Bruk av positivt ladede glassglass og forsiktig tørking av lysbilder etter seksjonering kan redusere denne gjenstanden. Mikroskopiske områder av det reduserte signalet kan oppstå hvis det er en ujevn fordeling av antigen i gelmatrisen eller hvis variasjon i den lokale gelstrukturen begrenser antistoff-antigen-interaksjon (figur 3D). Ufullstendig peptidoppløsning kan resultere i spredte områder med fokalt intenst signal i en lavintensitetsbakgrunn (figur 3E).
Etter å ha reagert med et passende antistoff, bør gelprøver med bare negativ kontroll vise minimalt signal (figur 4A), optimalt mindre enn 2% -3% av det dynamiske analyseområdet. I svært sjeldne tilfeller kan det være signifikant antistoffinteraksjon med BSA gelmateriale som mangler noe antigen som ikke kan elimineres ved endrede reaksjonsbetingelser. Signalintensiteten i en individuell gelprøve bør være relativt jevn, med økende signal i prøver med økende antigenkonsentrasjoner (figur 4A, B). Den absolutte signalintensiteten vil variere avhengig av antigen-antistoffkombinasjonen og forholdene som brukes til IHC-flekken. Avhengig av fargeforholdene kan det være en terskelantigenkonsentrasjon under hvilken signalet vil være i bakgrunnen og en antigenkonsentrasjon over hvilken signalet vil bli mettet. I noen analyser kan signalet over bakgrunnen være synlig i prøver med så lite som 2,5 E-8 M peptid2. I replikerende fargeløp skal signalintensiteten for seksjoner kuttet fra hver gelprøve være reproduserbar fra løp til løp. I denne anvendelsen av anti-HER2 antistoff ble de mye brukte MDA-175 og SK-BR-3 cellelinjekontrollene farget i samme eksperiment for å sammenligne med peptidkontrollene. Cellelinjene viser forventet fordeling og intensitet av signalet: >10 % av MDA-175-cellene (HER2 1+) viser svak (figur 4C,D), ufullstendig omkretsmembranøs farging, og >10 % av SK-BR-3-cellene (HER2 3+) (figur 4E,F) viser intens fullstendig omkretsmembranøs farging.
Mulige årsaker til fravær av signal inkluderer: (1) peptidsekvensen er ikke et funksjonelt mål for antistoffet; (2) fargeprotokollen er ikke optimalisert for å oppdage antigenkonsentrasjonene som er tilstede i gelene; (3) feil peptidprøve ble farget; (4) reagens- eller instrumentfeil. Mulige årsaker til signal i prøver der det ikke forventes inkluderer ikke-spesifikk reaktivitet av primært antistoff eller deteksjonsreagenser med BSA-gel- eller peptidprøver som ble feilmerket under tilberedning.
Figur 1: Peptid-BSA gelpreparat. (A) 25 % (w/v) BSA (uten tilsatt peptid) i PBS, pH 7,2. (B) Gel dannet ved å blande like store mengder 25% BSA og 37% formaldehydoppløsning og oppvarming til 85 ° C i 10 minutter (C-G) Etter avkjøling ved romtemperatur i 5-10 minutter, kan BSA-gelen fjernes fra mikroscentrifugerøret ved hjelp av en fleksibel engangsspatel. (H-I) Den intakte gelen skjæres i skiver ~ 5 mm tykk som forberedelse til behandling og innebygging. Vektstenger er 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fremstilling av BSA gelprøver for behandling og innebygging. (AD) Fremstilling av en parafinblokk som inneholder en enkelt plate av BSA gel. (A) BSA-antigengelen pakkes inn i biopsivev før behandling. (B) Etter parafininfiltrasjon plasseres den nå gjennomsiktige gelskiven på det innebygde senterets oppvarmede scene og pakkes ut. (C) Den ene gelskiven plasseres i en 15 mm x 15 mm innebygd form som inneholder flytende parafin. (D) Den ferdige parafinblokken er klar for seksjonering. (E-H) Fremstilling av en parafinblokk som inneholder flere plater av BSA gel. Når det gjelder figur A-D ovenfor, blir de resterende gelprøvene behandlet og innebygd i en blokk for å gi materiale til TMA-konstruksjon. Vektstenger er 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Gelpreparering og farging av artefakter. (A) Kjerner kan vise mindre oppsprekking introdusert under behandling og / eller innebyggingstrinn; fokal mørkere kan gjenspeile reagensfangst under seksjonen. (B) Riving av gelmateriale (sett i fargede seksjoner som uregelmessige hulrom) kan skyldes over- eller under bløtlegging av blokken før snitting. (C) Uregelmessige mønstre for vannmerkefarging kan skyldes ujevn reagensfordeling ved ett eller flere fargetrinn. (D) Mikroskopisk mønster av BSA-peptidstrukturen kan ses, spesielt ved høyere peptidkonsentrasjoner. (E) Ufullstendig peptidoppløsning kan produsere et stjernehimmelmønster med et fokalsignal i en lavintensitetsbakgrunn. Skalastenger er 200 μm (A-C) eller 20 μm (D, E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Farget ERBB2/HER2 peptid TMA med ERBB2/HER2 1+ og 3+ cellelinjer. (A) Replikere TMA-kjerner (øverste og nederste rader) som ikke inneholder peptid (venstre kolonne) eller ERBB2-peptid i konsentrasjoner fra 2,5 E-8 M til 2,5 E-4 M ble farget med anti-HER2 / neu klon 4B5 i henhold til produsentens anbefalinger. Kjerner med økende peptidkonsentrasjoner viser en gradert økning i signalet. (B) TMA-kjernene som vises i panel A, ble skannet digitalt, og den gjennomsnittlige pikselintensiteten [0,01 x (100 – % transmittans) x 255] er plottet kontra peptidkonsentrasjon. (C-F) Cellelinjepositive kontroller som inneholdt ERBB2/HER2-uttrykkende cellelinjer MDA-175 (HER2 1+, C,D) og SK-BR-3 (HER2 3+, E,F) ble inkludert i TMA som inneholdt BSA-peptidgelene slik at intensiteten av signal i cellelinjene og BSA-peptidgeler kunne sammenlignes på samme lysbilde. Skalastenger er 500 μm (A), 250 μm (C, E) og 20 μm (D, F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| En | B | C | D | E | F | G | H | |||
| Peptid navn | Peptid sekvens | MW (Da) | Peptid renhet (%) | Oppgitt peptidmasse (mg) | Føflekker av peptid i prøven (inkluderer korreksjon for renhet) | Volum (mikroliter) av løsningsmiddel for å resuspendere peptidet for å få 1,25 e-2 M lager | Løsemiddel | |||
| ERBB2 / HER2 | Ac YGSGTPTAENP EYLGLDVPVGSGC-amid |
2424.6 | 95.0 | 20.0 | 7.84E-06 | 626.9 | DMF | |||
Tabell 1: Beregninger for fremstilling av peptidstamme.
| En | B | C | D | E | F | G | H | Jeg |
| Rør | 5x Peptid lager | 1x Peptid lager | Fortynning 1 | Fortynning 2 | Fortynning 3 | Fortynning 4 | Fortynning 5 | Negativ control |
| [Peptid] lager (M) | 1.25*10-2 | 2.5*10-3 | 5*10-4 | 5*10-5 | 5*10-6 | 5*10-7 | 5*10-8 | Ingen |
| Peptid løsning (i løsemiddel) |
>30 uL | 30 uL fra 5x (1.25E-2 M) peptid lager |
140 uL fra 1x (2,5E-3 M) peptid lager |
70 uL fra Fortynning 1 |
70 uL fra Fortynning 2 |
70 uL fra Fortynning 3 |
70 uL fra Fortynning 4 |
Ingen |
| Løsemiddel volum | 120 uL | |||||||
| Endelig peptid lager volum |
150 uL | |||||||
| 31,3% BSA / PBS volum |
560 uL 31,3% BSA |
|||||||
| 25% BSA / PBS volum |
630 uL 25% BSA |
630 uL 25% BSA |
630 uL 25% BSA |
630 uL 25% BSA |
700 uL 25% BSA |
|||
| Volum av fortynnet peptid i BSA | 700 uL | 700 uL | 700 uL | 700 uL | 700 uL | 700 uL |
Tabell 2: Beregninger for fremstilling av BSA-peptidfortynninger.
| En | B | C | D | E | F | G |
| Rør | Fortynning 1 | Fortynning 2 | Fortynning 3 | Fortynning 4 | Fortynning 5 | Negativ kontroll |
| Gjenværende volum av peptid i fortynnet BSA | 630 uL | 630 uL | 630 uL | 630 uL | 700 uL | 700 uL |
| [Peptid] (M) i fortynnet BSA | 5*10-4 | 5*10-5 | 5*10-6 | 5*10-7 | 5*10-8 | Ingen |
| Volum på 37% Formaldehyd for å legge til | 630 uL | 630 uL | 630 uL | 630 uL | 700 uL | 700 uL |
| Endelig [Peptid] (M) i gel |
2.5*10-4 | 2.5*10-5 | 2.5*10-6 | 2.5*10-7 | 2.5*10-8 | Ingen |
Tabell 3: Beregninger for fremstilling av BSA-formaldehydgeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden gjør det mulig for brukeren å lage ensartede prøver av kjent sammensetning og antigenkonsentrasjon som standarder i IHC-reaksjoner, ved hjelp av materialer og teknikker som er kjent for de fleste histologiske laboratorier. Det mest avgjørende trinnet er å identifisere epitopen som antistoffet av interesse binder seg til. Denne protokollen beskriver bruk av et lineært peptidantigen fra ERBB2/HER2 ICD. Den samme protokollen kan brukes til å danne BSA-geler som inneholder oligonukleotider, fluorescerende etiketter, proteindomener eller proteiner i full lengde. Denne sistnevnte tilnærmingen kan være nyttig for antistoffer som binder seg til konformasjonelle epitoper som ikke gjenskapes av en enkelt lineær peptidsekvens. For eksempel kan BSA-gelstandarder som inneholder 0,1 mg/ml naiv IgG fra mus, rotter og kaniner brukes som prosesskontroller for å bekrefte at sekundære deteksjons- og fargetrinn har fungert som forventet.
Antigen-BSA-gelmetoden beskrevet her utfyller andre teknikker for å kontrollere og standardisere IHC-reaksjoner. Cellelinjer og vevsprøver med godt karakteriserte ekspresjonsnivåer av målantigener har vært avgjørende for godt kontrollerte IHC-protokoller 1,3,4. Peptider koblet til overflaten av glassglass og glassperler har blitt foreslått som kvantitative kontroller 7,8,9. Hver av de potensielle metodene har overlappende fordeler og begrensninger. BSA-antigengelene har flere fordeler. De er enkle å lage og tilpasningsdyktige til forskjellige antigensammensetninger og konsentrasjoner. De reproduserer noe av den tredimensjonale arkitekturen til vevsprøver mens de kontrollerer for den iboende heterogeniteten som finnes i biologiske prøver. Fordi de syntetiske antigengelene kan fremstilles med brukervalgbare antigenkonsentrasjoner som strekker seg fra under deteksjonsgrensen til de høyeste konsentrasjonene som finnes i biologiske prøver (~ 10-4 M)2, gir de muligheter til å kalibrere og standardisere analyser utført med moderne teknikker, for eksempel AQUA18 og imaging massespektrometri19 , hvis dynamiske område langt overstiger tradisjonell kromogen IHC. I tillegg tillater metoden kontroller som inneholder mer enn ett antigen, som kan brukes i multipleksanalyseutvikling og standardisering.
Mens metoden krever at brukeren kjenner epitopene for antistoffene av interesse, binder mange antistoffer seg til veldokumenterte lineære epitoper. Epitopkartleggingsteknikker 20,21,22 kan ofte identifisere udefinerte lineære epitoper, og syntetiske peptider inkludert kjente lineære epitoper kan kjøpes til en beskjeden pris. Andre antistoffer binder seg til konformasjonsepitoper som ikke reproduseres av lineære peptider, men er bevart i hele proteiner eller proteindomener. For noen av disse antistoffene er rekombinante former av målantigenene kommersielt tilgjengelige.
For å lage kontrollprøver med optimal ensartethet og reproduserbarhet, må peptidet eller annet målantigen være fullstendig oppløst og forsiktig fortynnet i BSA-oppløsninger. Det er også viktig at effektiv, rask blanding av BSA/peptidløsningen med 37 % formaldehyd skjer før prøven starter å gelere, og at den blandede prøven deretter plasseres umiddelbart ved 85 °C i 10 minutter. For å unngå overfiksering og behandling av artefakter, bør geler tas gjennom behandling og parafininnbygging i henhold til anbefalt tidsplan.
Variasjoner på metoden beskrevet her kan være nyttig i bestemte sammenhenger. For eksempel kan alternative N- og C-terminale peptidsekvenser brukes til å optimalisere påvisning av peptider bundet til BSA2. Det bør forventes at antistoffer som gjenkjenner epitoper fra den ekstreme C-termini av proteiner, kan være variabelt følsomme for C-terminale modifikasjoner av den opprinnelige sekvensen. Peptid-BSA gelprøvene kan også dannes ved oppvarming ved 85 °C i 10 minutter uten fikseringsmiddel, og deretter fremstilles som frosne blokker eller etterfast med en rekke kjemikalier2. I tillegg kan peptidkonjugering oppnås med maleimidkjemi eller andre metoder enn beskrevet her.
Biologiske prøver som cellelinjer og vev har fordelen som kontroller for å representere kompleksiteten til de mange variablene som bare finnes i livet. På den annen side, fordi vevs- og cellestandarder både er internt heterogene og variable fra prøve til prøve, er tolkningen av variabel farging fra løp til løp forvirret. I tillegg er antigenkonsentrasjonene i vev og celler ofte bare kjent kvalitativt, men med den økende bruken av kvantitativ massespektrometri rapporteres absolutte proteinkonsentrasjoner hyppigere23. BSA-antigenkontrollene beskrevet her eliminerer med vilje den romlige og biologiske konteksten til proteiner i celler og vev. Av denne grunn kan korrelasjonen mellom IHC-signalintensitet og antigenkonsentrasjon funnet i disse kontrollene ufullkommen reprodusere det som ses i vev. De syntetiske kontrollene som er beskrevet her, kan være nyttige for å optimalisere og standardisere noen aspekter ved IHC-analyseytelsen. Likevel hindrer de ikke behovet for riktig bruk av andre kontrollprøver. For eksempel kan potensiell ikke-spesifikk farging i et målvev bare evalueres ved parallell bruk av en negativ vevskontrollprøve. I tillegg reproduserer ikke BSA-antigengelkontroller vevsspesifikke preanalytiske variabler, inkludert varm og kald iskemitid, proteolyse eller fikserings- og behandlingsforhold som kan påvirke IHC-ytelsen. Følgelig, og som det har blitt diskutert andre steder mer detaljert 1,3,4, bør etterforskere gjøre gjennomtenkt bruk av celle- og vevsstandarder for å nøyaktig karakterisere ytelsen til IHC-systemet.
BSA-antigenkontroller kan brukes til å utvikle eller optimalisere fargeprotokoller og tjene som intra- og interlaboratorie referanseprøver når man vurderer reproduserbarheten av etablerte protokoller. Tilgang til veldefinerte standardprøver bør tillate brukere å karakterisere IHC-reaksjonsatferd strengere, identifisere variasjon i fargeytelse og optimalisere reaksjonsforhold for å oppnå spesifikke mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Charles A. Havnar, Kathy J. Hötzel, Charles A. Jones, Carmina M. Espiritu, Linda K. Rangell og Franklin V. Peale er ansatte og aksjonærer i Genentech og Roche. Deres tilknyttede selskaper produserer reagenser og instrumenter som brukes i denne studien.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner takknemlig sine kolleger Jeffrey Tom og Aimin Song for peptidsyntese, Nianfeng Ge for TMA-konstruksjon, Shari Lau for IHC-farging, Melissa Edick for digital mikroskopisk skanning og Hai Ngu for digital bildekvantifisering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HER2/neu clone 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
| Biopsy Wraps | Leica | 3801090 | |
| Bovine Serum Albumin, ultra pure | Cell Signaling Technology | BSA #9998 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| Disposable base mold (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
| Disposable base mold (24 mm x 24 mm) |
Fisher | 22-363-554 | |
| Disposable spatula | VWR | 80081-188 | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
| 37% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | |
| ERBB2 / HER2 peptide | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
| Magnetic Stir Bar | |||
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL | |||
| Paraplast paraffin | Leica | 39601006 | |
| Peptide parameter calculator | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
| Peptide suppliers | ABclonal Science | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | |
| Anaspec Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| CPC Scientific | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| New England Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| Phosphate Buffered Saline pH 7.2 | |||
| Reagent Alcohol | Thermo Scientific | 9111 | |
| Single Edge Razor | VWR | 55411-050 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).
- Hötzel, K. J., et al. Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).
- Martinez-Morilla, S., et al. Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray. Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Sompuram, S. R., et al. Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets. Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).
- Sompuram, S. R., et al. A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).
- Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).
- Vani, K., et al. Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).
- Brandtzaeg, P. Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity. Immunology. 22, 177-183 (1972).
- Matute, C., Streit, P. Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity. Histochemistry. 86, 147-157 (1986).
- Ottersen, O. P. Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing. Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).
- Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. 'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).
- Arabi, S. H., et al. Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties. Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).
- Schrohl, A. -S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Brünner, N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies. Histopathology. 59, 975-983 (2011).
- Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).
- Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Forsström, B., et al. Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).
- Forsström, B., et al. Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes. PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).
- Prasad, B., et al. Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).
