Summary
Эта работа документирует простой метод создания синтетических антигенов для иммуногистохимии. Методика адаптируется к различным антигенам в широком диапазоне концентраций. Образцы служат ориентиром для оценки эффективности и воспроизводимости внутри- и межанализа.
Abstract
Анализы иммуногистохимии (IHC) дают ценную информацию о паттернах экспрессии белка, надежная интерпретация которых требует хорошо охарактеризованных положительных и отрицательных контрольных образцов. Поскольку соответствующие элементы управления тканями или клеточными линиями не всегда доступны, простой метод создания синтетических элементов контроля IHC может быть полезным. Такой способ описан здесь. Он адаптируется к различным типам антигенов, включая белки, пептиды или олигонуклеотиды, в широком диапазоне концентраций. Этот протокол объясняет шаги, необходимые для создания синтетического контроля антигена, используя в качестве примера пептид из эритробластного онкогена человека B2 (ERBB2 / HER2) внутриклеточного домена (ICD), распознаваемого различными диагностически значимыми антителами. Серийные разведения пептида HER2 ICD в растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA) смешивают с формальдегидом и нагревают в течение 10 мин при 85 °C для затвердевания и сшивки смеси пептид/BSA. Полученный гель может быть обработан, разделен и окрашен как ткань, что дает серию образцов известных концентраций антигенов, охватывающих широкий диапазон интенсивности окрашивания.
Этот простой протокол согласуется с обычными лабораторными процедурами гистологии. Метод требует только, чтобы у пользователя было достаточное количество желаемого антигена. Рекомбинантные белки, белковые домены или линейные пептиды, кодирующие соответствующие эпитопы, могут синтезироваться локально или коммерчески. Лаборатории, генерирующие собственные антитела, могут резервировать аликвоты иммунизирующего антигена в качестве синтетической контрольной мишени. Возможность создания четко определенных положительных элементов управления в широком диапазоне концентраций позволяет пользователям оценивать эффективность внутри- и межлабораторного анализа, получать представление о динамическом диапазоне и линейности своих анализов и оптимизировать условия анализа для своих конкретных экспериментальных целей.
Introduction
Иммуногистохимия (IHC) позволяет чувствительно и специфично, пространственно точно обнаруживать антигены-мишени в формалин-фиксированных, парафиновых (FFPE) участках тканей. Однако на результаты окрашивания IHC могут влиять несколько переменных, включая время теплой и холодной ишемии, фиксацию тканей, предварительную обработку тканей, реактивность и концентрацию антител, химию обнаружения анализа и время реакции1. Соответственно, воспроизводимые характеристики и интерпретация реакций МГК требуют строгого контроля этих переменных и использования хорошо охарактеризованных положительных и отрицательных контрольных образцов. Часто используемые контрольные элементы включают парафиновые внедренные ткани или культивируемые клеточные линии, известные из независимых анализов для экспрессии интересующего антигена, но такие образцы не всегда доступны1. Кроме того, уровни экспрессии целевых антигенов в тканях и контроле клеточных линий, как правило, понимаются только качественно и могут быть переменными. Контроль, содержащий воспроизводимые, точно известные концентрации целевого антигена, может помочь в оптимизации условий реакции IHC. Общий способ, адаптируемый к различным типам антигенов в физиологически значимом диапазоне концентраций для создания синтетических контрольных образцов IHC, был описан авторами2. Здесь представлен подробный протокол для создания и использования этого типа стандарта.
Соответствующие средства контроля необходимы для достоверной интерпретации анализов IHC 1,3,4. Ткани, культивируемые клетки и субстраты с пептидным покрытием использовались в качестве контроля IHC в соответствии с конкретными потребностями исследователей. Преимущества и ограничения, присущие использованию тканей в качестве средств контроля IHC, широко обсуждались 1,4. Для многих антител соответствующие элементы управления могут быть выбраны из выбранных нормальных тканей, содержащих клеточные популяции, экспрессирующие целевой антиген в широком динамическом диапазоне. Тканевые элементы контроля менее подходят, когда антиген-мишень недостаточно хорошо охарактеризован в отношении места экспрессии или изобилия, или когда потенциально перекрестно реагирующие антигены совместно экспрессируются в одних и тех же клетках или участках тканей. В этих контекстах блоки культивируемых клеточных линий, экспрессирующих интересующий антиген, могут быть полезны. Для предоставления дополнительных доказательств специфичности мишени клеточные линии могут быть спроектированы для чрезмерной или недостаточной экспрессии целевых антигенов. Например, такой подход недавно был использован для оценки различных анализов против PD-L1 с использованием тканевого микрочипа из изогенных клеточных линий, экспрессирующих диапазон антигена PD-L15. Практические ограничения на рутинное использование блоков клеточных линий включают стоимость и время, необходимые для получения достаточного количества клеток, а также тот факт, что экспрессия некоторых антигенов может быть ненадежно последовательной даже в пределах клональных клеточных линий6. Синтетические пептиды являются третьим вариантом контроля IHC для антител, которые распознают короткие линейные эпитопы. Стивен Боген и его коллеги опубликовали обширные публикации об использовании пептидов, соединенных с поверхностью стеклянных слайдов 7,8 и стеклянных бусин9. Одно исследование, проведенное этой группой, показало, что количественный анализ контроля IHC на основе пептидов может обнаружить вариации процесса окрашивания, пропущенные качественной оценкой контроля тканей, проанализированных параллельно10. В то время как стандарты, использующие антигены на основе бисера, могут быть широко применимы, многие детали являются собственностью авторов, ограничивая широкое распространение.
Другой подход к стандартам IHC включает целевые антигены в искусственно созданные белковые гели. Эта концепция была впервые продемонстрирована Пером Брандцаегом в 1972 году в исследовании, в котором нормальная сыворотка кролика была полимеризована с использованием глутаральдегида11. Небольшие блоки полученного геля затем замачивали в течение 1-4 недель в растворах, содержащих интересующие иммуноглобулиновые антигены в различных концентрациях. После фиксации спирта и встраивания парафина было показано, что участки полученного контроля окрашиваются с интенсивностью, соответствующей логарифму растворов антигенов, в которых они были пропитаны. Позже исследователи подготовили глутаральдегидные конъюгаты специфических аминокислот в разбавленных растворах BSA или гомогенатов мозга в качестве положительных контрольных элементов в исследованиях иммуноэлектронной микроскопии12,13. Более поздняя работа исследовала использование гелей, изготовленных из формальдегид-фиксированных белковых растворов, в качестве суррогатов для ткани FFPE в масс-спектрометрическом анализе14. Другая недавняя работа исследовала структуру и свойства гелей, образующихся при нагревании растворов сывороточного альбумина человека или крупного рогатого скота при различных концентрациях и рН15. Эти авторы обнаружили, что сывороточный альбумин образует три типа гелей, отличающихся механической эластичностью, сохранением вторичной структуры и способностью связывать жирные кислоты в зависимости от условий эксперимента. Вместе эти документы демонстрируют общую осуществимость применяемого здесь подхода. Белковые растворы определенного состава создают тканеподобные гели, которые могут быть дополнительно обработаны, разделены и окрашены с использованием обычных гистологических методов.
Этот протокол описывает образование синтетического контроля IHC, изготовленного из бычьего сывороточного альбумина (BSA), полимеризованного теплом и формальдегидом. Гели могут включать широкий спектр антигенов, включая полноразмерные белки, белковые домены и линейные пептиды, а также небелковые антигены, включая олигонуклеотиды2. В этой демонстрации используется пример антигена линейного пептида, кодирующего С-концевые 16 аминокислот человеческого белка ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (см. Таблицу материалов). Эта последовательность включает эпитопы, признанные тремя коммерчески доступными диагностически значимыми антителами, включая поликлональный реагент Herceptest (ENPEYLGLDVP) и моноклональные антитела CB11 (AENPEYL) и 4B5 (TAENPEYLGL) (см. Таблицу материалов)16.
Метод, продемонстрированный здесь, использует легкодоступные реагенты с использованием процессов и методов, знакомых любой практикующей гистологической лаборатории. Наиболее существенным ограничением является необходимость выявления и приобретения целевых антигенов, что во многих случаях может быть достигнуто при относительно скромных затратах. Поскольку эти синтетические элементы управления имеют полностью определенный состав и изготовлены простыми методами, они могут быть реализованы во многих лабораториях с воспроизводимыми результатами. Их использование может способствовать объективной, поддающейся количественной оценке результатов окрашивания IHC и обеспечивать большую внутри- и межлабораторную воспроизводимость.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка складского раствора и инструментов
- Готовят 20 мл 25% мас./об.раствора BSA путем смешивания 5 г порошка BSA в 14 мл PBS, рН 7,2 в конической пробирке объемом 50 мл до равномерного диспергирования. Вихрь по мере необходимости диспергирует порошок BSA.
- Держите раствор в течение ночи при температуре 4 °C, чтобы обеспечить полное растворение. Отрегулируйте конечный объем до 20 мл с помощью PBS, чтобы получить 25% мас./v запасной раствор.
- Готовят 20 мл 31,3% мас./об.раствора BSA путем смешивания 6,26 г порошка BSA в 13 мл PBS, рН 7,2 в конической пробирке объемом 50 мл до равномерного диспергирования. Держите раствор в течение ночи при температуре 4 °C, чтобы обеспечить полное растворение. Отрегулируйте конечный объем до 20 мл с помощью PBS, чтобы получить 31,3% мас./v запасной раствор.
- Разогрейте тепловой блок до 85 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол создает пептидные/BSA гели объемом 1,26-1,4 мл, сформированные в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл. Чтобы использовать меньшие объемы, например, когда запасы антигена ограничены, приготовьте гели в пробирках ПЦР и используйте термоциклер, установленный на 85 ° C в качестве теплового блока. - Проверьте, что смесь BSA/формальдегид образует гель, как и ожидалось, путем смешивания 700 мкл 25% раствора BSA с 700 мкл 37% формальдегида. Хорошо перемешать, пипеткой вверх и вниз 5 раз в течение 5-10 с. Избегайте создания пузырьков воздуха.
ВНИМАНИЕ: Концентрированный формальдегид токсичен; использовать с соответствующими мерами предосторожности. - Сразу после смешивания растворов BSA и формальдегида поместите закрытую микроцентрифужную трубку в тепловой блок при 85 °C в течение 10 мин. Снимите трубку с теплового блока и дайте ей остыть. Подтвердите, что гель сформировался должным образом.
2. Получение и разведение пептидов
- Получают 5-20 мг лиофилизированного пептида нужной последовательности.
ПРИМЕЧАНИЕ: С-концевые 16 аминокислот внутриклеточного домена человека ERBB2, распознаваемого 4B5, являются TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.- Добавьте 4 аминокислоты к N-концу, ацетил-YGSG и C-концу, GSGC-амид, чтобы облегчить сшивание пептида с BSA и обеспечить расстояние между молекулой BSA и пептидным эпитопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная последовательность: ацетил-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-амид. - При желании используют другие N- и C-концевые аминокислотные последовательности для расширения эпитопа основного пептида.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие различных последовательностей варьируется при различных комбинациях антител/эпитопов. Добавление С-концевого пептида снижает связывание некоторых антител с С-концевыми эпитопами. В таких случаях опускайте эту последовательность. - Подтвердить, что пептиды из коммерческих источников поставляются в чистоте >95%, состав которой подтверждается ВЭЖХ и масс-спектрометрическим анализом.
- Добавьте 4 аминокислоты к N-концу, ацетил-YGSG и C-концу, GSGC-амид, чтобы облегчить сшивание пептида с BSA и обеспечить расстояние между молекулой BSA и пептидным эпитопом.
- Рассчитайте необходимые объемы для 5x (1,25 E-2 M) пептидного запаса растворов. Ссылаясь на таблицу 1, столбцы C-E, введите значения молекулярной массы антигена (г/моль), процента чистоты антигена (0-100) и массы антигена (мг).
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем растворителя (в мкл) для повторного суспендирования образца для получения запасного раствора 1,25 Е-2 М составляет 800 х молекулярной массы антигена х процентов чистоты антигена/массы антигена.- Подготовьте и четко маркируйте восемь микроцентрифужных трубок по 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирки будут содержать 5x пептидного материала в растворителе, 1x пептидного материала в растворителе, пять 10-кратных последовательных разведений от 2,5 E-4 M до 2,5 пептида E-8 M/формальдегидного геля и отрицательный контрольный гель, содержащий BSA/формальдегид без добавления антигена. Все образцы геля выглядят одинаково. При одновременном приготовлении нескольких наборов пептидных разведений позаботьтесь о том, чтобы правильно маркировать и идентифицировать все трубки и обрабатывать кассеты. По возможности используйте микроцентрифужные трубки с цветовой кодировкой и кассеты для обработки, чтобы свести к минимуму ошибочную идентификацию.
- Подготовьте и четко маркируйте восемь микроцентрифужных трубок по 1,5 мл.
- Готовят 5-кратный пептидный раствор при 1,25 E-2 M путем повторного использования всей массы лиофилизированного пептида (20 мг для пептидов ERBB2) в 60 мкл соответствующего растворителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере диметилформамид (DMF) был добавлен непосредственно в контейнер поставщика.- Осмотрите раствор, чтобы убедиться, что пептид полностью растворен. При необходимости добавляют дополнительный растворитель и/или обрабатывают образец ультразвуком до полного растворения пептида, следя за тем, чтобы объем, рассчитанный в таблице 1 для 5-кратного пептидного запаса.
ВНИМАНИЕ: ДМФ токсичен; использовать с соответствующими мерами предосторожности.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от аминокислотной последовательности и соответствующей гидрофобности и заряда пептиды могут быть растворимы в DMF, диметилсульфоксиде (DMSO), чистой воде или разбавленных растворах уксусной кислоты, муравьиной кислоты или бикарбоната аммония. Пептидные характеристики могут быть рассчитаны с использованием различных онлайн-инструментов17. Некоторые поставщики пептидов могут предлагать растворители, подходящие для определенных последовательностей. - Добавляют растворитель по мере необходимости, чтобы довести объем 5-кратного запаса пептидов до конечного объема, рассчитанного в таблице 1. Вихрь на 5 с и центрифуга при комнатной температуре при 5000 х г в течение 5 с. Пептидные растворы можно хранить при -80 °C.
- Осмотрите раствор, чтобы убедиться, что пептид полностью растворен. При необходимости добавляют дополнительный растворитель и/или обрабатывают образец ультразвуком до полного растворения пептида, следя за тем, чтобы объем, рассчитанный в таблице 1 для 5-кратного пептидного запаса.
- Ссылаясь на таблицу 2, колонка С, получают 150 мкл 1x пептидного раствора (2,5 E-3 M) путем разбавления 30 мкл 5x пептидного запаса в 120 мкл растворителя (DMF в этом примере). Вихрь на 5 с и центрифуга при комнатной температуре при 5000 х г в течение 5 с.
- Ссылаясь на таблицу 2, колонка D, получают 700 мкл 5 раствора пептида E-4 M/BSA (разбавление 1) путем разбавления 140 мкл 1x пептидного материала в 560 мкл 31,3% BSA/PBS, рН 7,2. Вихрь на 5 с и центрифуга при комнатной температуре при 5000 х г в течение 5 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация BSA этого раствора составляет 25% (мас./об.). - Ссылаясь на таблицу 2, колонки E-H, готовят четыре последовательных 10-кратных последовательных разведения 5 пептидов E-4 M/BSA путем добавления 70 мкл раствора пептида/BSA к 630 мкл 25% BSA/PBS, рН 7,2. Вихрь на 5 с и центрифуга при комнатной температуре при 5000 х г в течение 5 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого этапа будет пять 10-кратных последовательных разведений пептида (от 5 E-4 M до 5 E-8 M) в 25% BSA/PBS, pH 7,2. Первые четыре образца будут содержать 630 мкл. Последний образец будет содержать 700 мкл. - Ссылаясь на таблицу 2, колонка I, подготовьте отрицательный контрольный образец BSA, содержащий 700 мкл 25% BSA/PBS, рН 7,2 (рисунок 1A).
3. Приготовление BSA-пептидных гелей
- Убедитесь, что тепловой блок или термоциклер стабилен при температуре 85 °C.
- См. таблицу 3, столбцы B-E. Работая по одному образцу за раз, добавляют к первому 25% образцу BSA/пептида (разбавление 1) 630 мкл 37% формальдегида. Хорошо перемешать, пипеткой вверх и вниз 5 раз в течение 5-10 с. Избегайте создания пузырьков воздуха.
ВНИМАНИЕ: Концентрированный формальдегид токсичен; использовать с соответствующими мерами предосторожности.- После смешивания растворов пептида/BSA и формальдегида поместите закрытую микроцентрифужную трубку в тепловой блок при 85 °C в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно перемешайте раствор BSA-пептида и формальдегид, но не тратьте более 10 с на пипетирование смеси перед помещением образца на тепло. Поскольку сшивание формальдегида начинается немедленно, гель может образовываться по-разному, если процедура варьируется для разных образцов. Конечная концентрация BSA в этих гелях составляет 12,5% (мас./об.). Конечные концентрации BSA менее 10% могут давать гели, которые не затвердевают; конечные концентрации BSA, превышающие 16%, могут привести к образованию гелей, более хрупких и трудно поддающихся разделению после обработки. - Повторите шаги 3.2 и 3.2.1 для каждого из разведений 2-4.
- Повторите шаги 3.2 и 3.2.1 для разбавления 5, но добавьте 700 мкл 37% формальдегида, объем, равный 700 мкл раствора BSA-антигена.
- См. таблицу 3 колонки G; повторите шаги 3.2 и 3.2.1 для отрицательного контрольного образца, добавив 700 мкл 37% формальдегида, объем, равный 700 мкл отрицательного контрольного раствора BSA.
- После смешивания растворов пептида/BSA и формальдегида поместите закрытую микроцентрифужную трубку в тепловой блок при 85 °C в течение 10 мин.
- Снимите трубки с теплового блока через 10-12 мин. Время нагрева должно быть как можно более последовательным для каждого образца. Дайте гелям остыть на столешнице в течение 5-10 мин (рисунок 1B).
- Используя чистый, гибкий одноразовый лабораторный шпатель, извлеките образец геля в одном куске из микроцентрифужной трубки и поместите его в герметичный контейнер, содержащий, по меньшей мере, 15 мл нейтрального буферизованного формалина (NBF), используя отдельный контейнер NBF для каждого образца.
- В качестве альтернативы можно отрезать дно трубки микроцентрифуги новым лезвием бритвы с одним кромкой и вытолкнуть гель со дна воздухом или подходящим зондом (рисунок 1C-G).
ПРИМЕЧАНИЕ: Затвердевшие формальдегидные/BSA гели могут оставаться в микроцентрифужных трубках при комнатной температуре до 24 ч. Оставление гелей в микроцентрифужной трубке более чем на 24 ч может привести к тому, что они станут хрупкими и более трудными для обработки и секционирования.
- В качестве альтернативы можно отрезать дно трубки микроцентрифуги новым лезвием бритвы с одним кромкой и вытолкнуть гель со дна воздухом или подходящим зондом (рисунок 1C-G).
4. Обрезка, обработка и встраивание гелей BSA
- Обрежьте гелевой конус цилиндрическими дисками толщиной около 5 мм с помощью чистой бритвы с одним краем (рисунок 1H,I). Оберните диски в обертывание для биопсии, поместив один большой гель-диск в одну кассету (для использования в пилотном исследовании на этапе 5), а остальные гелевые диски вместе во вторую кассету (рисунок 2A, E) для использования в конструкции тканевого микрочипа (TMA) на этапе 6. Поместите обернутые гелевые диски в четко обозначенные кассеты для обработки тканей.
- Поместите кассетные гели по меньшей мере в 15 мл 10% NBF на образец геля перед обработкой, используя отдельный контейнер NBF для каждого образца. Гели могут оставаться в 10% НБФ в течение 6-48 ч.
- Обработайте гели в автоматизированном гистологическом тканевом процессоре, следуя большому тканевому графику с давлением и вакуумом. Каждый шаг занимает 1 ч: 10% NBF, 70% этанола, 95% этанола (повторите два раза), 100% этанола (повторите два раза), ксилолы (повторите три раза), парафин при 60 °C (повторите три раза).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследователей, решивших обрабатывать образцы вручную, следуйте той же последовательности реагентов и времени. - Когда обработка образца будет завершена, извлеките кассеты из тканевого процессора и переместите их в центр встраивания парафина.
- Распакуйте гели из обертывания для биопсии и вложите гели в парафин. Для каждого образца вставьте один диск геля в небольшую форму размером 15 мм х 15 мм (рисунок 2B-D), а остальные гелевые диски вместе во вторую более крупную форму (рисунок 2F-H). Первый блок с одним образцом будет использоваться для тестирования пептидного геля в пилотном исследовании. Второй блок может быть использован для строительства TMA.
5. Пилотная оценка серии разбавления пептидов
- Для каждой серии разбавления пептидов планируется создать два стеклянных слайда, содержащих в общей сложности 6 отдельных секций: по одной секции из каждого из пяти образцов серии разбавления плюс один участок из отрицательного контрольного образца, предназначенного только для BSA.
- На первом стеклянном слайде вырежьте один участок толщиной 4 мкм от каждого из меньших блоков, содержащих один гель-диск с тремя самыми высокими концентрациями пептидов (от 2,5 E-4 M до 2,5 E-6 M).
- На втором слайде вырежьте один участок толщиной 4 мкм из каждого блока с двумя самыми низкими концентрациями пептидов (2,5 E-7 M и 2,5 E-8 M) и один участок из блока управления, предназначенного только для BSA. Запишите порядок образцов на слайдах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте, что гели, встроенные в парафин, будут резаться плавно, создавая однородные участки без фрагментации, разрыва или болтовни артефакта. Если определенные образцы геля, содержащие парафин, трудно разделить, кратковременно замочите поверхность блока в ледяной дистиллированной воде перед секционированием. При необходимости экспериментируйте с различным временем замачивания или с различными растворами (например, аммиачной водой). - После секционирования высушите горки при комнатной температуре (около 23 °C) в течение 24 ч, а затем 60 °C в течение 30 мин.
- Окрасьте два слайда, подготовленные для каждого пептида, желаемым антителом в соответствии со стандартными протоколами IHC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичная концентрация антител на слайде, используемая для моноклонального 4B5 кролика в этой демонстрации, составляла 1,5 мкг/мл.- Ожидайте увидеть относительно однородный сигнал в каждой секции геля, при этом различные образцы геля показывают диапазон интенсивности сигнала, соответствующий пептидным разбавлениям.
- Если результаты пилотного исследования удовлетворительны, постройте ТМА из блоков донора геля, содержащих различные концентрации пептидного антигена, как описано в следующих шагах протокола.
6. BSA гель ТМА конструкция
- Построить тканевый микрочип, содержащий дубликаты сердечников диаметром 1 мм из донорских блоков, содержащих только гель BSA и гели BSA, содержащие все пять разведений пептида ERBB2.
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании включите гели BSA, содержащие те же пять разведений нецелевого пептида, что и дополнительные отрицательные контрольные элементы. При желании включите ядра репрезентативных ERBB2-экспрессирующих клеточных линий в качестве положительных контрольных элементов. - Вырежьте участки TMA толщиной 4 мкм и окрасьте 1,5 мкг/мл анти-ERBB2/HER2/neu кролика моноклонального 4B5 (см. Таблицу материалов) в соответствии со стандартными лабораторными протоколами.
- Оцените результирующую интенсивность пятна качественно путем контроля или количественно с помощью сканирования и анализа цифровых изображений (рисунок 3A,B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку анализ цифровых изображений не находится в центре внимания этого протокола, эти шаги оставлены на усмотрение читателя в соответствии с его предпочтениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пептиды должны полностью растворяться в соответствующем растворителе при комнатной температуре с образованием оптически прозрачного раствора. Если видимый твердый материал все еще присутствует через 30-60 мин, может быть полезно добавить дополнительные объемы исходного растворителя или альтернативного растворителя, не превышающие предполагаемый объем 5-кратного пептидного запаса, рассчитанный в таблице 1. Аналогичным образом, комбинированный раствор пептида/BSA должен оставаться полупрозрачным (рисунок 1A).
Образцы пептидного/BSA-геля должны образовывать непрозрачную резиновую массу после нагревания с 37% формальдегидом (рисунок 1B-I). Незначительный разрыв образцов геля может произойти при удалении из микроцентрифужных трубок (рисунок 3А). Они не должны мешать последующим шагам. Образцы геля, содержащие парафин, должны плавно секционироваться без разрывов или болтовни. Гели, которые показывают нерегулярные разрывы (рисунок 3B), могут извлечь выгоду из менее агрессивного облицовки блока и / или кратковременного замачивания в ледяной воде или аммиачной воде. Участки переменно сниженного сигнала в рисунке водяного знака могут возникать, когда распределение одного или нескольких окрашивающих реагентов неравномерно (рисунок 3C). Очагово повышенный макроскопический сигнал можно увидеть, если на любой стадии процесса окрашивания происходит улавливание реагентов под гелевыми срезами (рисунок 3С). Использование положительно заряженных стеклянных горок и тщательное высыхание горок после секционирования может уменьшить этот артефакт. Микроскопические участки пониженного сигнала могут возникать, если существует неравномерное распределение антигена в гелевой матрице или если изменение местной структуры геля ограничивает взаимодействие антитело-антиген (рисунок 3D). Неполное растворение пептидов может привести к рассеянию областей очагово интенсивного сигнала на фоне низкой интенсивности (рисунок 3E).
После реакции с соответствующим антителом отрицательные контрольные образцы геля, содержащие только BSA, должны показывать минимальный сигнал (рисунок 4A), оптимально менее 2%-3% от диапазона динамического анализа. Очень редко может наблюдаться значительное взаимодействие антител с материалом геля BSA, в котором отсутствует какой-либо антиген, который не может быть устранен путем изменения условий реакции. Интенсивность сигнала в отдельном образце геля должна быть относительно равномерной, с увеличением сигнала в образцах с увеличением концентрации антигена (рисунок 4A,B). Абсолютная интенсивность сигнала будет варьироваться в зависимости от комбинации антиген-антитело и условий, используемых для окрашивания IHC. В зависимости от условий окрашивания может быть пороговая концентрация антигена, ниже которой сигнал будет находиться на фоне, и концентрация антигена, выше которой сигнал будет насыщенным. В некоторых анализах сигнал выше фона может быть виден в образцах с пептидом 2,5 E-8 M2. При воспроизведении окрашивания интенсивность сигнала для участков, вырезанных из каждого образца геля, должна быть воспроизводимой от пробега к прогону. При этом применении антитела против HER2 широко используемые элементы управления клеточными линиями MDA-175 и SK-BR-3 были окрашены в том же эксперименте для сравнения с пептидными контрольными группами. Клеточные линии показывают ожидаемое распределение и интенсивность сигнала: >10% клеток MDA-175 (HER2 1+) показывают слабое (рисунок 4C,D), неполностью окружное мембранное окрашивание, а >10% клеток SK-BR-3 (HER2 3+) (Рисунок 4E,F) показывают интенсивное полностью окружное мембранное окрашивание.
Возможные причины отсутствия сигнала включают: (1) пептидная последовательность не является функциональной мишенью для антитела; (2) протокол окрашивания не оптимизирован для обнаружения концентраций антигенов, присутствующих в гелях; (3) был окрашен неправильный образец пептида; (4) ошибка реагента или прибора. Возможные причины сигнала в образцах, где он не ожидается, включают неспецифическую реактивность первичных антител или реагенты обнаружения с гелем BSA или пептидными образцами, которые были неправильно маркированы во время приготовления.
Рисунок 1: Пептид-BSA гель препарат. (A) 25% (мас./об.) BSA (без добавления пептида) в PBS, рН 7,2. (B) Гель образуется путем смешивания равных объемов 25% BSA и 37% раствора формальдегида и нагревания до 85 °C в течение 10 мин. (C-G) После охлаждения при комнатной температуре в течение 5-10 мин гель BSA можно удалить из микроцентрифужной трубки с помощью гибкого одноразового шпателя. (Н-И) Неповрежденный гель нарезается на диски толщиной ~5 мм при подготовке к обработке и встраиванию. Шкала 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Подготовка образцов геля BSA для обработки и встраивания. (А-Д) Приготовление парафинового блока, содержащего один диск Геля BSA. (A) Гель BSA-антигена заворачивается в биопсийную ткань перед обработкой. (B) После инфильтрации парафина полупрозрачный гель-диск помещается на нагретую сцену центра встраивания и разворачивается. (C) Один гелевый диск помещается во встраиваемую форму размером 15 мм x 15 мм, содержащую жидкий парафин. (D) Готовый парафиновый блок готов к секционированию. (Э-Н) Получение парафинового блока, содержащего несколько дисков Геля BSA. Что касается рисунков A-D выше, оставшиеся образцы геля обрабатываются и встраиваются в один блок, чтобы обеспечить материал для строительства TMA. Шкала 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Артефакты получения и окрашивания геля. (А) Керны могут иметь незначительный разрыв, введенный на этапах обработки и/или встраивания; очаговое затемнение может отражать улавливание реагентов под сечением. (B) Отрывение гелевого материала (видимого в окрашенных срезах в виде нерегулярных пустот) может быть результатом чрезмерного или недостаточного замачивания блока перед секционированием. (C) Нерегулярные рисунки окрашивания водяных знаков могут быть вызваны неравномерным распределением реагентов на одной или нескольких стадиях окрашивания. (D) Можно наблюдать микроскопическое формирование структуры BSA-пептида, особенно при более высоких концентрациях пептидов. (E) Неполное растворение пептидов может привести к образованию картины звездного неба с фокальным сигналом на фоне низкой интенсивности. Шкала стержней составляет 200 мкм (A-C) или 20 мкм (D,E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Окрашенный пептид ERBB2/HER2 TMA с клеточными линиями ERBB2/HER2 1+ и 3+. (A) Воспроизвести ядра ТМА (верхний и нижний ряды), не содержащие пептида (левая колонка) или пептида ERBB2 в концентрациях от 2,5 Е-8 М до 2,5 Е-4 М, окрашенные анти-HER2/neu клоном 4B5 в соответствии с рекомендациями производителя. Ядра с увеличением концентрации пептидов показывают градуированное увеличение сигнала. (B) Ядра TMA, показанные на панели A, были отсканированы в цифровом виде, и средняя интенсивность пикселей [0,01 x (100 - % пропускания) x 255] построена по сравнению с концентрацией пептида. (С-Ф) Положительные элементы управления клеточными линиями, содержащие ERBB2/HER2-экспрессирующие клеточные линии MDA-175 (HER2 1+, C,D) и SK-BR-3 (HER2 3+, E,F), были включены в TMA, содержащий BSA-пептидные гели, так что интенсивность сигнала в клеточных линиях и BSA-пептидных гелях можно было сравнить на одном слайде. Шкала стержней составляет 500 мкм (A), 250 мкм (C,E) и 20 мкм (D,F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| A | B | C | D | E | F | G | H | |||
| Название пептида | Пептидная последовательность | МВт (Да) | Чистота пептидов (%) | Предоставленная пептидная масса (мг) | Родинки пептида в образце (включает поправку на чистоту) | Объем (микролитры) растворителя, в котором необходимо повторно суспендировать пептид для получения запаса 1,25 е-2 М | Растворитель | |||
| ЭРББ2 / ХЕР2 | Ac YGSGTPTAENP EYLGLDVPVGSGC амид |
2424.6 | 95.0 | 20.0 | 7.84Е-06 | 626.9 | ДМФ | |||
Таблица 1: Расчеты по подготовке пептидного запаса.
| A | B | C | D | E | F | G | H | Я |
| Тюбик | 5x Пептидный запас | 1x Запас пептидов | Разбавление 1 | Разбавление 2 | Разбавление 3 | Разбавление 4 | Разбавление 5 | Отрицательный контраl |
| [Пептид] запас (M) | 1.25*10-2 | 2.5*10-3 | 5*10-4 | 5*10-5 | 5*10-6 | 5*10-7 | 5*10-8 | Никакой |
| Пептидный раствор (в растворителе) |
>30 ул | 30 ул из 5x (1,25Е-2 М) запас пептидов |
140 ул от 1x (2,5Е-3 М) запас пептидов |
70 uL от Разбавление 1 |
70 uL от Разбавление 2 |
70 uL от Разбавление 3 |
70 uL от Разбавление 4 |
Никакой |
| Объем растворителя | 120 ул | |||||||
| Конечный пептид объем склада |
150 ул | |||||||
| 31,3% BSA / PBS том |
560 ул 31,3% БСА |
|||||||
| 25% BSA / PBS том |
630 ул 25% БСА |
630 ул 25% БСА |
630 ул 25% БСА |
630 ул 25% БСА |
700 ул 25% БСА |
|||
| Объем разбавленного пептида в BSA | 700 ул | 700 ул | 700 ул | 700 ул | 700 ул | 700 ул |
Таблица 2: Расчеты по получению BSA-пептидных разведений.
| A | B | C | D | E | F | G |
| Тюбик | Разбавление 1 | Разбавление 2 | Разбавление 3 | Разбавление 4 | Разбавление 5 | Отрицательный контроль |
| Объем, оставшийся в пептиде в разбавленном BSA | 630 ул | 630 ул | 630 ул | 630 ул | 700 ул | 700 ул |
| [Пептид] (M) в разбавленном BSA | 5*10-4 | 5*10-5 | 5*10-6 | 5*10-7 | 5*10-8 | Никакой |
| Объем добавления 37% формальдегида | 630 ул | 630 ул | 630 ул | 630 ул | 700 ул | 700 ул |
| Конечный [Пептид] (M) в геле |
2.5*10-4 | 2.5*10-5 | 2.5*10-6 | 2.5*10-7 | 2.5*10-8 | Никакой |
Таблица 3: Расчеты по приготовлению BSA-формальдегидных гелей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод позволяет пользователю создавать однородные образцы известного состава и концентрации антигена в качестве стандартов в реакциях IHC, используя материалы и методы, знакомые большинству гистологических лабораторий. Наиболее важным шагом является идентификация эпитопа, с которым связывается интересующее антитело. Этот протокол описывает использование линейного пептидного антигена из ERBB2/HER2 ICD. Этот же протокол может быть использован для формирования гелей BSA, содержащих олигонуклеотиды, флуоресцентные метки, белковые домены или полноразмерные белки. Этот последний подход может быть полезен для связывания антител с конформационными эпитопами, которые не воссозданы одной линейной пептидной последовательностью. Например, стандарты Геля BSA, содержащие 0,1 мг/мл наивного IgG от мышей, крыс и кроликов, могут использоваться в качестве средств управления процессом для подтверждения того, что вторичные этапы обнаружения и окрашивания сработали должным образом.
Описанный здесь метод антиген-BSA геля дополняет другие методы контроля и стандартизации реакций IHC. Клеточные линии и образцы тканей с хорошо охарактеризованными уровнями экспрессии целевых антигенов имеют важное значение для хорошо контролируемых протоколов IHC 1,3,4. Пептиды, соединенные с поверхностью стеклянных слайдов и стеклянных шариков, были предложены в качестве количественных контрольных 7,8,9. Каждый из потенциальных методов имеет перекрывающиеся преимущества и ограничения. Гели BSA-антигена имеют ряд преимуществ. Они просты в изготовлении и адаптируются к различным антигенным составам и концентрациям. Они воспроизводят часть трехмерной архитектуры образцов тканей, контролируя присущую им гетерогенность, обнаруженную в биологических образцах. Поскольку синтетические антигенные гели могут быть изготовлены с выбираемыми пользователем концентрациями антигенов, простирающимися от предела обнаружения до самых высоких концентраций, обнаруженных в биологических образцах (~ 10-4 М)2, они предлагают возможности для калибровки и стандартизации анализов, выполняемых с помощью современных методов, например, AQUA18 и масс-спектрометрии изображений 19 , динамический диапазон которого значительно превышает традиционный хромогенный IHC. Кроме того, метод позволяет осуществлять контроль, включающий более одного антигена, который может быть использован при разработке и стандартизации мультиплексных анализов.
Хотя метод требует, чтобы пользователь знал эпитопы для интересующих антител, многие антитела связываются с хорошо документированными линейными эпитопами. Методы эпитопного картирования 20,21,22 часто могут идентифицировать неопределенные линейные эпитопы, а синтетические пептиды, включая известные линейные эпитопы, можно приобрести по умеренной цене. Другие антитела связываются с конформационными эпитопами, которые не воспроизводятся линейными пептидами, но сохраняются в цельных белках или белковых доменах. Для некоторых из этих антител коммерчески доступны рекомбинантные формы антигенов-мишеней.
Для создания контрольных образцов с оптимальной однородностью и воспроизводимостью пептид или другой антиген-мишень должен быть полностью растворен и тщательно разбавлен в растворах BSA. Также важно, чтобы эффективное, быстрое смешивание раствора BSA/пептида с 37% формальдегидом происходило до того, как образец начинает гель, и чтобы смешанный образец затем быстро помещался при 85 °C в течение 10 мин. Чтобы избежать чрезмерной фиксации и обработки артефактов, гели следует принимать путем обработки и встраивания парафина в соответствии с рекомендуемым графиком.
Варианты метода, описанного здесь, могут быть полезны в конкретных контекстах. Например, альтернативные N- и C-концевые пептидные последовательности могут быть использованы для оптимизации обнаружения пептидов, связанных с BSA2. Следует ожидать, что антитела, распознающие эпитопы из экстремальных С-терминов белков, могут быть по-разному чувствительны к С-концевым модификациям нативной последовательности. Образцы пептид-BSA-геля также могут быть сформированы путем нагревания при 85 °C в течение 10 мин без фиксатора, а затем приготовлены в виде замороженных блоков или постфиксированы с помощью различных химических веществ2. Кроме того, конъюгация пептидов может быть выполнена с помощью химии малеимида или других методов, описанных здесь.
Биологические образцы, такие как клеточные линии и ткани, имеют преимущество в качестве контроля, представляя сложность многих переменных, встречающихся только в жизни. С другой стороны, поскольку стандарты тканей и клеток внутренне неоднородны и изменчивы от образца к образцу, интерпретация переменного окрашивания от пробега к прогону сбивается с толку. Кроме того, концентрации антигенов в тканях и клетках часто известны только качественно, хотя с увеличением использования количественной масс-спектрометрии абсолютные концентрации белка сообщаютсячаще 23. Контроль BSA-антигена, описанный здесь, намеренно устраняет пространственный и биологический контекст белков в клетках и тканях. По этой причине корреляция между интенсивностью сигнала IHC и концентрацией антигена, обнаруженная в этих контрольных группах, может несовершенно воспроизводить то, что наблюдается в тканях. Синтетические элементы управления, описанные здесь, могут быть полезны для оптимизации и стандартизации некоторых аспектов эффективности анализа IHC. Тем не менее, они не препятствуют необходимости надлежащего использования других контрольных образцов. Например, потенциальное неспецифическое окрашивание в ткани-мишени может быть оценено только путем параллельного использования отрицательного контрольного образца ткани. Кроме того, контроль Геля BSA-антигена не воспроизводит тканеспецифические преданалитические переменные, включая время теплой и холодной ишемии, протеолиз или условия фиксации и обработки, которые могут повлиять на производительность IHC. Соответственно, и как обсуждалось в другом месте более подробно 1,3,4, исследователи должны вдумчиво использовать клеточные и тканевые стандарты, чтобы точно охарактеризовать производительность системы IHC.
Контроль BSA-антигенов может использоваться для разработки или оптимизации протоколов окрашивания и служить в качестве внутри- и межлабораторных эталонных образцов при оценке воспроизводимости установленных протоколов. Доступ к четко определенным стандартным образцам должен позволить пользователям более строго характеризовать поведение реакции IHC, выявлять различия в производительности окрашивания и оптимизировать условия реакции для достижения конкретных целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Чарльз А. Хавнар, Кэти Хётцель, Чарльз А. Джонс, Кармина М. Эспириту, Линда К. Рэнджелл и Франклин В. Пил являются сотрудниками и акционерами Genentech и Roche. Их филиалы производят реагенты и инструменты, используемые в этом исследовании.
Acknowledgments
Авторы с благодарностью отмечают своих коллег Джеффри Тома и Аймин Сонг за синтез пептидов, Нянфэн Гэ за построение TMA, Шари Лау за окрашивание IHC, Мелиссу Эдик за цифровое микроскопическое сканирование и Хай Нгу за количественную оценку цифрового изображения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HER2/neu clone 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
| Biopsy Wraps | Leica | 3801090 | |
| Bovine Serum Albumin, ultra pure | Cell Signaling Technology | BSA #9998 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| Disposable base mold (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
| Disposable base mold (24 mm x 24 mm) |
Fisher | 22-363-554 | |
| Disposable spatula | VWR | 80081-188 | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
| 37% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | |
| ERBB2 / HER2 peptide | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
| Magnetic Stir Bar | |||
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL | |||
| Paraplast paraffin | Leica | 39601006 | |
| Peptide parameter calculator | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
| Peptide suppliers | ABclonal Science | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | |
| Anaspec Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| CPC Scientific | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| New England Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
| Phosphate Buffered Saline pH 7.2 | |||
| Reagent Alcohol | Thermo Scientific | 9111 | |
| Single Edge Razor | VWR | 55411-050 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).
- Hötzel, K. J., et al. Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).
- Martinez-Morilla, S., et al. Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray. Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Sompuram, S. R., et al. Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets. Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).
- Sompuram, S. R., et al. A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).
- Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).
- Vani, K., et al. Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).
- Brandtzaeg, P. Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity. Immunology. 22, 177-183 (1972).
- Matute, C., Streit, P. Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity. Histochemistry. 86, 147-157 (1986).
- Ottersen, O. P. Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing. Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).
- Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. 'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).
- Arabi, S. H., et al. Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties. Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).
- Schrohl, A. -S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Brünner, N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies. Histopathology. 59, 975-983 (2011).
- Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).
- Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Forsström, B., et al. Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).
- Forsström, B., et al. Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes. PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).
- Prasad, B., et al. Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).
