L’obiettivo del metodo è quello di schermare l’ipertermia o le convulsioni indotte dal calore nei modelli murini. Il protocollo descrive l’uso di una camera costruita su misura con monitoraggio continuo della temperatura corporea per determinare se la temperatura corporea elevata porta a convulsioni.
I modelli murini transgenici hanno dimostrato di essere strumenti potenti nello studio di vari aspetti dei disturbi neurologici umani, tra cui l’epilessia. Le epilessie genetiche associate a SCN1A comprendono un ampio spettro di disturbi convulsivi con penetranza incompleta e variabilità clinica. Le mutazioni di SCN1A possono provocare una grande varietà di fenotipi convulsivi che vanno da semplici crisi febbrili associate alla febbre (FS), epilessia genetica di livello moderato con convulsioni febbrili plus (GEFS+) alla sindrome di Dravet (DS) più grave. Sebbene le FS siano comunemente osservate nei bambini di età inferiore ai 6-7 anni che non hanno l’epilessia genetica, le FS nei pazienti GEFS+ continuano a verificarsi nell’età adulta. Tradizionalmente, le FS sperimentali sono state indotte nei topi esponendo l’animale a un flusso di aria secca o lampade di riscaldamento, e il tasso di variazione della temperatura corporea spesso non è ben controllato. Qui, descriviamo una camera di riscaldamento su misura, con un frontale in plexiglass, dotata di un regolatore di temperatura digitale e di un ventilatore elettrico dotato di riscaldatore, che può inviare aria forzata riscaldata nell’arena di prova in modo a temperatura controllata. La temperatura corporea di un topo posto nella camera, monitorata attraverso una sonda rettale, può essere aumentata a 40-42 °C in modo riproducibile aumentando la temperatura all’interno della camera. Il monitoraggio visivo continuo degli animali durante il periodo di riscaldamento dimostra l’induzione di convulsioni indotte dal calore nei topi portatori di una mutazione FS a una temperatura corporea che non provoca convulsioni comportamentali nei compagni di cucciolata selvatici. Gli animali possono essere facilmente rimossi dalla camera e posizionati su un pad di raffreddamento per riportare rapidamente la temperatura corporea alla normalità. Questo metodo prevede un protocollo di screening semplice, rapido e riproducibile per l’insorgenza di convulsioni indotte dal calore in modelli murini di epilessia.
L’epilessia, la quarta famiglia più comune di disturbi neurologici negli Stati Uniti1, è caratterizzata da uno squilibrio di spinta eccitatoria e inibitoria nel SNC che porta a convulsioni ricorrenti. Convulsioni febbrili (FS) o convulsioni associate alla febbre possono verificarsi nella popolazione generale, il più delle volte nei bambini già dai 3 mesi fino ai 6-7 anni di età. Tuttavia, in alcuni individui con mutazioni genetiche, il più delle volte in un gene del canale del sodio, la FS può persistere oltre l’età di 7 anni nell’età adulta. Questa condizione è indicata come convulsioni febbrili plus o FS +. I rapidi progressi nel sequenziamento del genoma hanno identificato oltre 1.300 mutazioni nel gene del canale ionico del sodio umano SCN1A, rendendolo un hotspot per le mutazioni dell’epilessia. Le mutazioni di SCN1A sono state collegate a un ampio spettro di disturbi convulsivi, tra cui convulsioni febbrili (FS), epilessia genetica con convulsioni febbrili plus (GEFS+) e sindrome di Dravet (DS)2,3,4,5,6. Circa il 20% delle mutazioni missenso di SCN1A porta a GEFS+5,7,8. La storia pediatrica di FS complessa o prolungata nell’infanzia può successivamente svilupparsi in forme più debilitanti di epilessia come l’epilessia del lobo temporale (TLE)9,10,11. La sindrome di Dravet insorge a causa di mutazioni di troncamento o mutazioni di perdita di funzione in SCN1A ed è una forma grave di epilessia intrattabile, con insorgenza infantile di convulsioni febbrili che si sviluppano in convulsioni refrattarie ed è spesso associata a disturbi cognitivi, dello sviluppo e motori2,5,12 . Poiché molti individui con GEFS + e / o DS mostrano convulsioni febbrili, diventa imperativo sviluppare nuove terapie per combattere meglio questi disturbi convulsivi.
I modelli animali di epilessia associata a SCN1A si sono dimostrati preziosi nel caratterizzare diversi tipi di convulsioni (febbrili vs generalizzate) e sezionare il meccanismo neuronale della generazione di convulsioni13,14,15,16,17,18. Mentre lo studio delle convulsioni spontanee tramite registrazioni EEG / EMG nel cervello dei roditori è ben consolidato ed è uno strumento molto utile, solo pochi studi hanno tentato di imitare le convulsioni febbrili in modelli murini14,16,19,20,21,22,23 . Studi precedenti hanno utilizzato un getto di aria secca riscaldata, o un cilindro di metacrilato dotato di un sistema termico, o lampade di calore con un regolatore di temperatura in arene di prova chiuse9,16,21,22,23,24 per indurre convulsioni tramite ipertermia. Al fine di aumentare la temperatura corporea in un ambiente più controllato, il protocollo qui descritto utilizza una camera costruita su misura con un sistema di riscaldamento a temperatura controllata che consentiva tassi riproducibili di aumento della temperatura corporea di un mouse all’interno della camera. La camera di calore è stata costruita in legno (lunghezza 40 cm x larghezza 34 cm x altezza 31 cm) ed è stata dotata di un termoregolatore digitale con termocoppia K. Un piccolo ventilatore assiale dotato di un riscaldatore sul pannello posteriore della camera dirige l’aria riscaldata nella camera regolata da un regolatore di temperatura digitale. Questo sistema di riscaldamento ad aria forzata consente di controllare la velocità con cui aumenta la temperatura della camera. (Figura 1A,B). La termocoppia K situata all’interno della camera termica in legno invia feedback al regolatore di temperatura digitale, per mantenere costanti le temperature all’interno della scatola durante il test. L’impostazione della temperatura sul regolatore di temperatura digitale consente alla ventola elettrica di inviare aria forzata riscaldata attraverso le prese d’aria per riscaldare uniformemente la camera (Figura 1A). Il pannello frontale della camera di calore è un foglio di plexiglass trasparente per consentire una facile registrazione video delle prove.
Per ogni esperimento sono stati selezionati topi adulti (P30-P40), eterozigoti per una mutazione missenso in SCN1A che fa sì che GEFS+ e un numero uguale di compagni di cucciolata selvatici fungano da gruppo di controllo. Gli animali, sia maschi che femmine, utilizzati in questi studi pesavano almeno 15 g poiché i topi selvatici che pesavano meno erano più sensibili alle convulsioni indotte dal calore rispetto agli animali più pesanti della stessa età. Nello studio pilota, sia i topi mutanti che quelli selvatici sono stati osservati per cercare gli angoli più freddi della camera sul retro e sono rimasti lì per periodi di tempo prolungati. Per aggirare questo problema, le dimensioni effettive del pavimento all’interno dell’arena di prova della camera di calore sono state ridotte a lunghezza 16,5 cm x larghezza 21,5 cm x altezza 27,5 cm posizionando un blocco di legno B (dimensioni 20 cm x 8 cm x 7,2 cm) sul lato destro della camera (Figura 1A). La camera di calore è stata costruita in compensato di 1,9 cm di spessore (lunghezza 40 cm x larghezza 34 cm x altezza 31 cm) rivestito in laminato bianco e dotato di un termoregolatore digitale con termocoppia K. La superficie laminata delle pareti della camera è impermeabile e può essere facilmente igienizzata tra una prova e l’altra pulendo con il 70% di etanolo. La temperatura della camera termica è stata inizialmente impostata a 50 °C e preriscaldata per almeno 1 ora prima dell’inizio dell’esperimento, per garantire un riscaldamento uniforme all’interno della camera. Ogni topo è stato dotato di un termometro rettale per il monitoraggio continuo della temperatura corporea durante l’esperimento. Un singolo mouse è stato posto nella camera alla volta e la temperatura è stata mantenuta a 50 ° C tra il 1 ° e il 10 ° minuto. La temperatura è stata quindi aumentata a 55 ° C per l’11 ° -20 ° minuto e infine aumentata a 60 ° C per il 21 ° -30 ° minuto. Ciò ha comportato un tasso riproducibile di aumento della temperatura corporea del topo (Figura 2A). Ogni prova è stata videoregistrata e l’analisi comportamentale è stata condotta offline.
Il protocollo di riscaldamento può essere facilmente modificato per modificare la temperatura iniziale della camera di calore e la velocità di riscaldamento della camera, che a sua volta cambia la velocità con cui la temperatura corporea del mouse viene elevata durante il test. Pertanto, questo metodo offre una maggiore flessibilità rispetto ai metodi tradizionali nella creazione di schermi comportamentali che coinvolgono convulsioni indotte dal calore. Il protocollo di crisi indotta dal calore può anche essere utilizzato per lo screening di farmaci antiepilettici che rendono i topi mutanti più resistenti alle convulsioni indotte dal calore o aumentano la temperatura di soglia a cui si osservano le convulsioni. Allo stesso modo, gli effetti benefici di regimi dietetici restrittivi come la dieta cheto sulle convulsioni indotte dal calore possono essere esaminati nei normali topi nutriti con chow e cheto.
Figura 1: Descrizione della camera di calore del mouse costruita su misura. (A) Il pannello frontale della camera di calore del mouse in legno mostra il pannello di controllo laterale contenente l’interruttore Power ON/OFF che accende il regolatore di temperatura digitale, la termocoppia K, l’interruttore ON/OFF del termoventilatore e l’indicatore di calore. Le dimensioni esterne della scatola e dell’arena di prova interna sono mostrate in cm. Viene anche mostrato un blocco di legno B utilizzato per ridurre efficacemente la superficie dell’arena di prova. Il fondo dell’arena di prova è coperto da lettino di pannocchia per impedire ai topi di entrare direttamente in contatto con superfici di legno riscaldate. (B) Il pannello posteriore della camera di calore mostra la ventola montata sulla presa d’aria superiore e il cavo di alimentazione per fornire elettricità alla camera. Questa cifra è modificata dalla Figura 3 in Das et al., 2021, eNeuro14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Descriviamo un protocollo semplice ed efficace per lo screening del verificarsi di convulsioni indotte dal calore nei topi, l’equivalente comportamentale delle convulsioni febbrili nei pazienti umani. Il test valuta diversi parametri – tra cui la percentuale di topi che mostrano convulsioni, soglia convulsiva, gravità delle convulsioni su scala Racine, al fine di confrontare la sensibilità dei gruppi di topi di controllo e test agli aumenti della temperatura corporea.
Un passaggio critico in questo protocollo prevede l’aumento del calore nella camera mentre si monitora continuamente la temperatura corporea del mouse. È imperativo che la temperatura corporea massima che i topi sperimenteranno in questi test sia di 44 ° C perché gli animali selvatici possono subire convulsioni indotte dal calore a temperature corporee >44 ° C. Il pretrattamento con anestesia generale o analgesici potrebbe ridurre la temperatura corporea interna degli animali o interferire con la termoregolazione, che a sua volta confonderebbe la raccolta dei dati sulla temperatura della soglia convulsiva. Pertanto, i topi sotto questo protocollo di screening non hanno potuto essere forniti con questi agenti durante la finestra di prova di 30 minuti. Tutte le procedure devono essere approvate dal comitato IACUC dell’istituzione. Per garantire un monitoraggio continuo della temperatura corporea interna del topo durante il test, fissare saldamente la sonda di temperatura rettale alla coda dei topi. Se durante il test, la temperatura corporea del topo rimane invariata per periodi di tempo prolungati anche dopo aver aumentato la temperatura della camera del topo, assicurarsi che la sonda di temperatura rettale non sia uscita dal mouse o sia attaccata liberamente alla coda.
Il background genetico dei modelli murini può influenzare la sensibilità alla mutazione SCN1A e le convulsioni farmacologicamente indotte18,25,26,27. Come discusso nei risultati sopra, il background genetico dei topi può influenzare la loro suscettibilità alle convulsioni indotte dal calore. Scn1a · I topi mutanti K1270T GEFS+ sono stati testati in due background genetici – 129X1 e B6NJ, e una piccola percentuale di topi wild-type (33%) nello sfondo B6NJ sensibile alle convulsioni, sono stati anche osservati per subire convulsioni indotte dal calore. Tuttavia, rispetto ai topi mutanti eterozigoti Scn1aKT/+, i topi wild-type B6NJ hanno avuto convulsioni indotte dal calore a una soglia di temperatura significativamente più alta. Ciò conferma che la mutazione genetica (Scn1a K1270T) introdotta dal knock-in CRISPR rende i topi mutanti più suscettibili alle convulsioni indotte da ipertermia.
Ci sono diversi vantaggi nell’adottare questo protocollo, che sono riassunti di seguito. In primo luogo, a differenza dell’uso di flusso di aria secca o lampade riscaldate, un’aria forzata a temperatura controllata installata all’interno di uno spazio chiuso fornisce allo sperimentatore un maggiore controllo sul riscaldamento dell’arena di prova alla velocità desiderata. I passaggi nel protocollo di riscaldamento possono essere facilmente modificati per aumentare / diminuire la temperatura iniziale, la durata di ogni passaggio, ecc. Per schermare i topi più vecchi che sono roditori più pesanti o più grandi come i ratti. In secondo luogo, il monitoraggio continuo della temperatura corporea del topo tramite la sonda rettale collegata, fornisce preziose informazioni sulla velocità di variazione della temperatura corporea nel singolo topo, durante tutto il test. Ciò consente allo sperimentatore di osservare da vicino che il tasso di variazione della temperatura nel topo non supera 0,25-0,5 ° C / min (che potrebbe essere stressante per gli animali), quando si adatta questo protocollo ad altre arene di prova. È importante sottolineare che il tasso di variazione della temperatura corporea nel tempo in diversi gruppi di topi può far luce sulla loro capacità di termoregolarsi e potrebbe essere utile per capire se le convulsioni febbrili che causano mutazioni alterano anche la termoregolazione nei topi. In terzo luogo, il monitoraggio continuo della temperatura corporea garantisce che le misurazioni della temperatura della soglia convulsiva utilizzando questo protocollo siano accurate, poiché vengono registrate in concomitanza con il primo attacco di convulsioni sperimentato dal topo. Se la temperatura corporea dell’animale non viene monitorata continuamente o la temperatura della soglia convulsiva viene misurata dopo aver portato l’animale fuori dall’arena di prova, i valori della soglia di convulsione possono variare a causa del tempo impiegato per gestire i topi dopo le convulsioni. Infine, questo metodo aggira la necessità di utilizzare metodi invasivi per indurre la febbre (iniettando agenti patogeni) nei topi per imitare le convulsioni febbrili nei pazienti umani.
Uno dei limiti di questo protocollo è che è difficile lo screening dei topi giovani (meno di P30 di età) per le convulsioni indotte dal calore. Il protocollo è stato sviluppato per lo screening della sensibilità dei topi adulti (P30-P40 e superiori) alle convulsioni indotte da calore o ipertermia. Nella nostra esperienza, i topi selvatici più giovani, in particolare quelli di peso inferiore a 15 g, hanno maggiori probabilità di subire convulsioni indotte dal calore, che potrebbero essere dovute a meccanismi di termoregolazione sottosviluppati, stress termico fisiologico o una combinazione di entrambi. Quindi, non è l’ideale eseguire lo screening convulsivo indotto dal calore su topi giovani usando questo protocollo.
Studi futuri che combinano il monitoraggio EEG mentre sottopongono il topo a convulsioni indotte dal calore possono far luce sui modelli di crisi EEG delle convulsioni indotte dal calore, simile a uno studio precedente19. L’attività neuronale in aree specifiche del cervello del topo può essere rintracciata combinando approcci optogenetici e studi basati sull’immunoistochimica dopo la raccolta del tessuto cerebrale. Inoltre, gli effetti di diete restrittive come la dieta cheto sulla riduzione delle convulsioni febbrili possono essere valutati sottoponendo topi cheto-nutriti e topi normali nutriti con chow a un protocollo di convulsioni indotte dal calore. Allo stesso modo, i paradigmi di screening dei farmaci per l’epilessia possono essere sviluppati per testare e identificare i candidati farmaci antiepilettici che migliorano o sopprimono le convulsioni indotte dal calore nei topi nutriti con farmaci o trattati rispetto ai topi alimentati con veicoli o di controllo.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Connor J. Smith per il suo aiuto nella costruzione della camera termica del mouse personalizzata. Riconosciamo l’aiuto dei membri del laboratorio O’Dowd, Lisha Zeng e Andrew Salgado per la standardizzazione del protocollo di riscaldamento durante le prime fasi dello sviluppo del test. Ringraziamo anche Danny Benavides e Kumar Perinbam per aver registrato parti della procedura sperimentale per il manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH (NS083009) assegnata a D.O.D.
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