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Biochemistry

नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae में Submitochondrial प्रोटीन स्थानीयकरण का आकलन

Published: July 19, 2021 doi: 10.3791/62853
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo

Summary

हाल की प्रगति के बावजूद, कई खमीर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन अभी भी अपने कार्यों के साथ पूरी तरह से अज्ञात हैं। यह प्रोटोकॉल प्रोटीन के सबमिटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए एक सरल और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है, जो उनके आणविक कार्यों के स्पष्टीकरण के लिए मौलिक रहा है।

Abstract

खमीर माइटोकॉन्ड्रियल proteome के लक्षण वर्णन में हाल ही में प्रगति के बावजूद, प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण संख्या के submitochondrial स्थानीयकरण मायावी रहता है। यहां, हम खमीर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के सबऑर्गनेलर स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए एक मजबूत और प्रभावी विधि का वर्णन करते हैं, जिसे माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन फ़ंक्शन स्पष्टीकरण के दौरान एक मौलिक कदम माना जाता है। इस विधि में एक प्रारंभिक चरण शामिल है जिसमें अत्यधिक शुद्ध बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया प्राप्त करना शामिल है। इन माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी को तब हाइपोटोनिक शॉक (सूजन) और प्रोटीनेज के (प्रोटीज) के साथ इनक्यूबेशन से मिलकर एक सबफ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल के अधीन किया जाता है। सूजन के दौरान, बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को चुनिंदा रूप से बाधित किया जाता है, जिससे प्रोटीनेज के को इंटरमेम्ब्रेन स्पेस डिब्बे के प्रोटीन को पचाने की अनुमति मिलती है। समानांतर में, झिल्ली प्रोटीन की टोपोलॉजी के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी को शुरू में सोनिकेटेड किया जाता है, और फिर सोडियम कार्बोनेट के साथ क्षारीय निष्कर्षण के अधीन किया जाता है। अंत में, centrifugation के बाद, इन विभिन्न उपचारों से गोली और supernatant अंशों SDS-PAGE और पश्चिमी धब्बा द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं. सबमिटोकोंड्रियल स्थानीयकरण के साथ-साथ ब्याज के प्रोटीन की झिल्ली टोपोलॉजी ज्ञात मानकों के साथ अपने पश्चिमी धब्बा प्रोफ़ाइल की तुलना करके प्राप्त की जाती है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया यूकेरियोटिक कोशिकाओं के आवश्यक ऑर्गेनेल हैं जो बायोएनर्जेटिक्स, सेलुलर चयापचय और सिग्नलिंग मार्गों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इन कार्यों को ठीक से निष्पादित करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया उनकी संरचना और कार्य के लिए जिम्मेदार प्रोटीन और लिपिड के एक अद्वितीय सेट पर भरोसा करते हैं। नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae व्यापक रूप से माइटोकॉन्ड्रियल प्रक्रियाओं पर जांच के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है, साथ ही साथ अन्य organelles2 के लिए। खमीर में केवल आठ प्रोटीन के लिए माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम कोड; माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के विशाल बहुमत (~ 99%) परमाणु जीन द्वारा एन्कोडेड होते हैं, जिन्हें साइटोसोलिक राइबोसोम पर अनुवादित किया जाता है, और बाद में परिष्कृत प्रोटीन आयात मशीनरी 3,4,5 द्वारा उनके सही सबमिटोकोंड्रियल डिब्बों में आयात किया जाता है। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम 6,7 दोनों की समन्वित अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस में दोष पैदा करने वाले आनुवंशिक उत्परिवर्तन मानव रोगों 8,9,10 से जुड़े हुए हैं।

पिछले दो दशकों में, अत्यधिक-शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया को लक्षित करने वाले उच्च-थ्रूपुट प्रोटिओमिक अध्ययनों के परिणामस्वरूप खमीर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटिओम का एक व्यापक लक्षण वर्णन हुआ, जिसे कम से कम 900 प्रोटीन 11,12,13,14 से बना होने का अनुमान लगाया गया है। यद्यपि इन अध्ययनों ने मूल्यवान जानकारी प्रदान की, चार माइटोकॉन्ड्रियल उप-घटकों में प्रत्येक प्रोटीन का सबऑर्गनेलर स्थानीयकरण, अर्थात्, बाहरी झिल्ली (ओएम), इंटरमेम्ब्रेन स्पेस (आईएमएस), आंतरिक झिल्ली (आईएम), और मैट्रिक्स, अभी भी आवश्यक है। इस प्रश्न को आंशिक रूप से दो छोटे माइटोकॉन्ड्रियल उप-घटकों (ओएम और आईएमएस) 15,16 के प्रोटिओमिक-वाइड अध्ययनों के साथ संबोधित किया गया था। हाल ही में, Vögtle और सहयोगियों ने खमीर में submitochondrial प्रोटीन वितरण का एक उच्च गुणवत्ता वाला वैश्विक नक्शा उत्पन्न करके एक बड़ा कदम आगे बढ़ाया। SILAC-आधारित मात्रात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री, विभिन्न submitochondrial फ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल, और OM और IMS proteomes से सेट किए गए डेटा के संयोजन के एक एकीकृत दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, लेखकों ने 818 प्रोटीन को चार माइटोकॉन्ड्रियल उप-घटकों में सौंपा।

इन उच्च-थ्रूपुट प्रोटिओमिक अध्ययनों द्वारा प्राप्त प्रगति के बावजूद, सबमिटोकॉन्ड्रियल प्रोटिओम संरचना के बारे में हमारा ज्ञान पूरा होने से बहुत दूर है। दरअसल, खमीर माइटोकॉन्ड्रिया में स्थानीयकृत होने के रूप में Vögtle और सहयोगियों द्वारा रिपोर्ट किए गए 986 प्रोटीनों में से, 168 को चार सबमिटोकोंड्रियल डिब्बों में से किसी में भी असाइन नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, लेखकों ने प्रोटीन की झिल्ली टोपोलॉजी के बारे में जानकारी प्रदान नहीं की थी, जिसे माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की परिधि से परिधीय रूप से जुड़े होने की भविष्यवाणी की गई थी। उदाहरण के लिए, यह जानना संभव नहीं है कि क्या एक प्रोटीन जिसे आंतरिक झिल्ली से परिधीय रूप से जुड़ा हुआ सौंपा गया था, मैट्रिक्स या इंटरमेम्ब्रेन स्पेस का सामना कर रहा है। proteome-व्यापक अध्ययनों से इन लापता डेटा के अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण संख्या के suborganellar स्थानीयकरण के बारे में परस्पर विरोधी जानकारी हैं। एक उदाहरण प्रोटीज Prd1 है, जिसे Saccharomyces जीनोम डेटाबेस (SGD) और Uniprot जैसे सामान्य डेटाबेस में एक इंटरमेम्ब्रेन स्पेस प्रोटीन के रूप में असाइन किया गया है। हैरानी की बात है, यहां वर्णित के समान एक सबफ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, Vögtle और सहयोगियों ने स्पष्ट रूप से दिखाया कि Prd1 एक वास्तविक मैट्रिक्स प्रोटीन 13 है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, कई माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के सबमिटोकोंड्रियल स्थानीयकरण को स्पष्ट या पुनर्मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। यहां, हम खमीर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के सबऑर्गनेलर स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए एक सरल और विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल को विभिन्न शोध समूहों द्वारा विकसित और अनुकूलित किया गया था और नियमित रूप से सबमिटोकोंड्रियल स्थानीयकरण, साथ ही साथ कई माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की झिल्ली टोपोलॉजी को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया है।

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Protocol

1. खमीर कोशिकाओं की वृद्धि

  1. एक YPD (1% खमीर निकालने, 2% पेप्टोन, 2% ग्लूकोज) अगर प्लेट पर एक -80 डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल स्टॉक से कोशिकाओं के एक छोटे से हिस्से को लकीर करके ब्याज के तनाव के एकल उपनिवेशों को अलग करें। प्लेट को 2-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट:: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला S. cerevisiae स्ट्रेन BY4741 (MATα) से व्युत्पन्न है; his3Π1; leu2Π0; met15Π0; ura3Π0). ऑक्सोट्रोफिक मार्कर जीन के अपवाद के साथ, इस तनाव में कोई भी हटाए गए जीन नहीं होते हैं और इसमें कोई प्लास्मिड नहीं होता है। इस प्रकार, इसे एक समृद्ध माध्यम में सफलतापूर्वक खेती की जा सकती है, जो जोरदार सेल विकास को उत्तेजित करती है। प्लास्मिड के साथ परिवर्तित उपभेदों के साथ काम करते समय, प्लास्मिड चयन के लिए उपयुक्त न्यूनतम माध्यम का उपयोग करें।
  2. एक 100 mL Erlenmeyer फ्लास्क में YPGal माध्यम (1% खमीर निकालने, 2% पेप्टोन, 2% गैलेक्टोज) के 10-20 मिलीलीटर में YPD आगर प्लेट से 2-3 व्यक्तिगत उपनिवेशों को टीका लगाकर एक स्टार्टर संस्कृति तैयार करें। जोरदार मिलाते हुए 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: विकास माध्यम की पसंद प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले खमीर तनाव पर निर्भर करती है। YPD और YPGal दोनों में किण्वित कार्बन स्रोत होते हैं, जो उन उपभेदों के विकास की अनुमति देते हैं जो माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन नहीं करते हैं। हालांकि, चूंकि ग्लूकोज कई माइटोकॉन्ड्रियल जीनों की अभिव्यक्ति को दबाता है, इसलिए इस कार्बन स्रोत का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि यह कम मात्रा में माइटोकॉन्ड्रिया का उत्पादन करेगा। श्वसन सक्षम उपभेदों के साथ काम करते समय जो श्वसन कर सकते हैं, माइटोकॉन्ड्रिया की उच्च उपज प्राप्त करने के प्रयास में ग्लिसरॉल और इथेनॉल जैसे कार्बन स्रोतों का उपयोग करना भी संभव है।
  3. स्टार्टर संस्कृति को 1 एल ताजा YPGal माध्यम के 0.1 से कम OD600 में पतला करें। OD600 1-1.5 तक पहुँचने तक जोरदार हिलाने के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की खेती करें।
    नोट: प्रयोग करने से पहले प्रत्येक खमीर तनाव के लिए विकास दर (दोहरीकरण समय) निर्धारित करें। यह संस्कृति के लिए आवश्यक इनक्यूबेशन के समय का एक सटीक अनुमान प्रदान करेगा ताकि 1-1.5 के OD600 तक पहुंच सकें।

2. अत्यधिक शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया का अलगाव

नोट:: यह प्रोटोकॉल 17 से, मामूली संशोधनों के साथ अनुकूलित है।

  1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3,000 x g पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं की कटाई।
  2. आसुत पानी के साथ कोशिकाओं को धोएं और उन्हें कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3,000 x g पर centrifugation द्वारा एकत्र करें।
  3. कोशिकाओं के गीले वजन का निर्धारण करें।
    नोट: चरण 2.2 से सेल गोली के वजन को मापने का सबसे आसान तरीका कोशिकाओं के संग्रह से ठीक पहले खाली सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का वजन निर्धारित करना है। centrifugation के बाद, supernatant त्याग और कोशिकाओं के साथ एक ही ट्यूब के वजन को मापने. कोशिकाओं का वजन दो मापों के बीच का अंतर है।
  4. एक पाश्चर पिपेट या P5000 टिप का उपयोग कर DTT बफर (2 mL प्रति 1 ग्राम कोशिकाओं) में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। DDT बफ़र संरचना के लिए तालिका 1 देखें।
  5. कोमल मिलाते हुए (~ 70 आरपीएम) के साथ 20 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  7. एंजाइम के बिना Zymolyase बफर के साथ कोशिकाओं को धोएं (कोशिकाओं के प्रति 1 ग्राम लगभग 7 मिलीलीटर)।
    Zymolyase बफ़र संरचना के लिए तालिका 1 देखें।
  8. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  9. Zymolyase के बिना बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (कोशिकाओं के प्रति 1 ग्राम 7 मिलीलीटर)।
  10. सेल निलंबन को 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में स्थानांतरित करें और Zymolyase-20T (3 मिलीग्राम प्रति ग्राम गीला वजन) जोड़ें।
  11. कोमल मिलाते हुए (~ 70 आरपीएम) के साथ 30-40 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। Zymolyase उपचार से पहले और बाद में सेल निलंबन की turbidity की तुलना करके इस प्रक्रिया की दक्षता की जांच करें।
    नोट: इस चरण में, कोशिकाओं को Zymolyase द्वारा सेल-दीवार पाचन के कारण स्फेरोप्लास्ट में परिवर्तित किया जाएगा।
    1. इसके लिए, 2 मिलीलीटर पानी वाले ग्लास ट्यूबों को अलग करने के लिए प्रत्येक सेल निलंबन का 50 μL जोड़ें। सख्ती से मिश्रण करने के बाद, Zymolyase के साथ इलाज सेल निलंबन की turbidity तेजी से spheroplasts के आसमाटिक व्यवधान के कारण कम होना चाहिए। दूसरी ओर, गैर-उपचारित सेल निलंबन की टर्बिडिटी अपरिवर्तित रहनी चाहिए।
      नोट: टर्बिडिटी के प्रभावों को सरल दृश्य निरीक्षण द्वारा या दोनों नमूनों के OD600 को मापकर भी मॉनिटर किया जा सकता है। दूसरे मामले में, Zymolyase इलाज नमूने के OD600 गैर इलाज नमूने का 10% -20% होना चाहिए। एक वैकल्पिक विधि में प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके दोनों नमूनों में कोशिकाओं की गिनती शामिल है।
    2. यदि स्फेरोप्लास्ट गठन की उपज कम है, तो अधिक Zymolyase जोड़ें और एक और 15 मिनट के अंतराल के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2500 x g पर centrifugation द्वारा स्फेरोप्लास्ट फसल।
    नोट: हाइड्रोलाइटिक एंजाइमों द्वारा प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए सभी आगे के चरणों को तेजी से और बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए।
  13. बर्फ-ठंडे होमोजेनाइजेशन बफर (कोशिकाओं के प्रति 1 ग्राम लगभग 6.5 मिलीलीटर) के साथ स्फेरोप्लास्ट को दो बार धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,500 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके गोली। Homogenization बफर संरचना के लिए तालिका 1 देखें।
  14. बर्फ-ठंडे homogenization बफर (6.5 mL प्रति 1 ग्राम कोशिकाओं) में स्फेरोप्लास्ट को फिर से निलंबित करें और इसे एक पूर्व-ठंडा ग्लास डौंस होमोजेनाइज़र में स्थानांतरित करें। लगभग 30 मिलीलीटर के एक बड़े ग्लास होमोजेनाइज़र का उपयोग करें।
  15. एक पेस्टल का उपयोग करके 15 स्ट्रोक के साथ स्फेरोप्लास्ट को homogenize.
    नोट: स्ट्रोक की संख्या को पेस्टल फिटिंग के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए। तंग पेस्टल के लिए, 15 स्ट्रोक पर्याप्त हैं। दूसरी ओर, यदि एक ढीले पेस्टल का उपयोग कर रहे हैं, तो 25 स्ट्रोक तक प्रदर्शन करने की सिफारिश की जाती है।
  16. एक 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए homogenate हस्तांतरण और बर्फ ठंडा homogenization बफर की 1 मात्रा जोड़ें.
  17. कम गति पर होमोजेनेट को सेंट्रीफ्यूज करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,500 x g गोली नाभिक, सेल मलबे और अटूट कोशिकाओं के लिए।
  18. एक पाश्चर पिपेट या P5000 टिप का उपयोग कर एक नया 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब करने के लिए supernatant स्थानांतरण गोली को बाधित करने से बचने के लिए देखभाल ले रही है.
  19. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  20. supernatant को एक उच्च गति सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और कच्चे माइटोकॉन्ड्रिया अंश को गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  21. supernatant त्यागें और धीरे से एक P5000 टिप का उपयोग कर कोमल pipetting द्वारा 20-30 mL बर्फ-ठंडा homogenization बफर में कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल गोली धो.
  22. एक 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज करने के लिए एक 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज करने के लिए 4°C पर 5 मिनट के लिए 4 °C पर निलंबन हस्तांतरण शेष सेल मलबे गोली करने के लिए.
  23. supernatant को एक उच्च गति सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और कच्चे माइटोकॉन्ड्रिया अंश को गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  24. supernatant त्यागें और धीरे से एक P1000 टिप का उपयोग कर कोमल pipetting द्वारा बर्फ-ठंडा SEM बफर की एक छोटी मात्रा (आमतौर पर 1000 μL) में कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल गोली resuspend. SEM बफ़र संरचना के लिए तालिका 1 देखें।
    नोट: हालांकि इस कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल अंश का उपयोग सीधे कुछ अनुप्रयोगों में किया जा सकता है जैसे कि ऑर्गेनेलो प्रोटीन आयात assays में, इसमें अन्य सेलुलर घटकों की पर्याप्त मात्रा होती है। इन संदूषणों से प्रोटीन के सबमिटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकरण का निर्धारण करते समय परिणामों की गलत व्याख्या हो सकती है। इसलिए, अत्यधिक शुद्ध माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी प्राप्त करने के लिए आगे के शुद्धिकरण चरणों की आवश्यकता होती है, जैसा कि नीचे वर्णित है।
  25. 60%, 32%, 23%, और 15% (w / v) की सांद्रता पर EM बफर में सुक्रोज समाधान तैयार करें। ये समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक स्थिर होते हैं। EM बफ़र संरचना के लिए तालिका 1 देखें.
  26. एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक 4-चरणीय सुक्रोज ग्रेडिएंट तैयार करें जो निम्नानुसार है: सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के नीचे 60% (डब्ल्यू / वी) सुक्रोज के 1.5 मिलीलीटर रखें। अगला, पिपेट सावधानीपूर्वक चरणबद्ध रूप से: 32% का 4 एमएल, 23% का 1.5 मिलीलीटर, और 15% सुक्रोज (डब्ल्यू / वी) का 1.5 एमएल। चरणों को बाधित करने से बचने के लिए ध्यान रखें।
  27. सुक्रोज ढाल के शीर्ष पर कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल अंश को सावधानीपूर्वक लोड करें।
  28. एक झूलती हुई बाल्टी रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 134,000 x g पर 1 घंटे के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  29. सावधानीपूर्वक सुक्रोज समाधान को तब तक हटाते रहें जब तक कि अत्यधिक शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया अंश तक नहीं पहुंच जाता है जिसे 60% / 32% सुक्रोज इंटरफ़ेस पर भूरे रंग के बैंड द्वारा दर्शाया जाता है।
  30. एक P1000 कट टिप का उपयोग कर शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया को पुनर्प्राप्त करें और इसे एक पूर्व-ठंडा उच्च गति सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
  31. बर्फ ठंडा SEM बफर के 5-10 संस्करणों के साथ बरामद माइटोकॉन्ड्रिया पतला.
  32. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x g पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  33. एक P1000 कट टिप का उपयोग कर कोमल pipetting द्वारा बर्फ-ठंडे SEM बफर के 500 μL में शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया resuspend.
  34. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए ब्रैडफोर्ड प्रक्रिया का उपयोग करके अत्यधिक शुद्ध माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें। बर्फ-ठंडे SEM बफर के साथ प्रोटीन / एमएल के 10 मिलीग्राम के लिए प्रोटीन एकाग्रता को समायोजित करें।
    नोट: नीचे वर्णित सबमिटोकॉन्ड्रियल फ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल के लिए, ताजा तैयार माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, Vögtle और सहयोगियों ने माइटोकॉन्ड्रियल अक्षुण्णता का एक विस्तृत गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण किया और दिखाया कि जमे हुए ऑर्गेनेल का उपयोग इस प्रोटोकॉल 13 में भी किया जा सकता है। इसके लिए 40 μL के ऐलीकोट बनाकर लिक्विड नाइट्रोजन में फ्रीज कर दें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. Submitochondrial फ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल

नोट: यह प्रोटोकॉल संदर्भ 18 से अनुकूलित है और दो चरणों से बना है: (1) प्रोटीनेज के की उपस्थिति या अनुपस्थिति में हाइपोटोनिक सूजन, और (2) कार्बोनेट निष्कर्षण के बाद sonication। प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर दोनों प्रोटोकॉल के सभी चरणों का प्रदर्शन करें।

  1. प्रोटीनेज K की उपस्थिति में हाइपोटोनिक सूजन
    1. 10 मिलीग्राम / एमएल (400 μg) पर अत्यधिक शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया के 40 μL को चार 1.5 mL पूर्व-ठंडा लेबल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    2. ट्यूब 1 और 2 में SEM बफ़र के 360 μL जोड़ें।
    3. ट्यूब 3 और 4 में EM बफर के 360 μL जोड़ें।
    4. ट्यूब 2 और 4 में प्रोटीनेज K (10 mg/mL) के 4 μL जोड़ें। गलतियों से बचने के लिए तालिका 2 में सूचीबद्ध पिपेटिंग योजना का उपयोग करें।
      नोट: उपयोग से तुरंत पहले पानी में प्रोटीनेज के का 10 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार करें। प्रयोग में प्रोटीनेज के की अंतिम एकाग्रता लगभग 50-100 μg / mL होनी चाहिए। कृपया अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें.
    5. सभी ट्यूबों को धीरे से मिलाएं और कभी-कभी मिश्रण के साथ 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    6. प्रोटीनेज के गतिविधि को रोकने के लिए सभी चार ट्यूबों में 200 mM PMSF के 4 μL जोड़ें।
      सावधानी: PMSF अत्यधिक विषाक्त है। PMSF युक्त समाधानों के साथ काम करते समय दस्ताने पहनें।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    8. Supernatant ले लीजिए और यह एक नया 1.5 mL पूर्व ठंडा लेबल microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण. गोली को बाधित करने से बचने के लिए ध्यान रखें।
      नोट: गोली सीधे आगे SDS-पृष्ठ और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए नमूना बफ़र में resuspended किया जा सकता है। हालांकि, पीएमएसएफ उपचार के बाद भी प्रोटीनेज के निशान सक्रिय रह सकते हैं और अंततः एसडीएस युक्त नमूना बफर में गोली को भंग करने के बाद कुछ प्रोटीन को पचा सकते हैं। इस समस्या से बचने के लिए, प्रोटीनेज के को ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड (टीसीए) के साथ नमूनों के उपचार द्वारा पूरी तरह से निष्क्रिय किया जा सकता है जैसा कि नीचे वर्णित है।
      सावधानी: टीसीए अत्यधिक विषाक्त है। टीसीए युक्त समाधानों के साथ काम करते समय दस्ताने पहनें।
    9. बर्फ-ठंडे SEM बफर के 400 μL में चरण 3.1.8 से गोली को फिर से निलंबित करें।
    10. Supernatant (चरण 3.1.8 से) और resuspended गोली (चरण 3.1.9 से) TCA के साथ 10% (w / v) की अंतिम एकाग्रता के लिए अवक्षेपित करें।
    11. 10 मिनट के लिए बर्फ पर सभी ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x g पर 10 मिनट के लिए TCA-उपचारित नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    13. supernatant निकालें और नमूना बफर के 200 μL में गोली resuspend.
      नोट: यह संभव है कि ब्रोमोफेनॉल नीले पीएच संकेतक एसिड उपचार के कारण पीला हो जाता है। यदि ऐसा होता है, तो 1 M Tris बेस के छोटे ऐलीकोट (1-5 μL) जोड़ें जब तक कि यह नीला न हो जाए।
    14. सभी ट्यूबों के लिए 200 mM PMSF के 4 μL जोड़ें।
    15. SDS-PAGE और पश्चिमी धब्बा द्वारा आगे के विश्लेषण तक -80 °C पर सभी नमूनों को स्टोर करें।
  2. Sonication और कार्बोनेट निष्कर्षण
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, एक बार sonication माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के टूटने का कारण बनता है, तो ताजा तैयार माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग करना आवश्यक नहीं है।
    1. 10 मिलीग्राम / एमएल (2 मिलीग्राम प्रोटीन) पर अत्यधिक शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया के 200 μL को 1.5 मिलीलीटर पूर्व-ठंडा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. बर्फ-ठंडे SEM बफर के साथ माइटोकॉन्ड्रिया को एक गुना पतला करें।
    3. बर्फ पर 3 x 30 s के लिए Sonicate माइटोकॉन्ड्रिया. छोटे वॉल्यूम के लिए संगत एक sonicator का उपयोग करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 x g पर 30 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. Supernatant ले लीजिए और यह एक नया 1.5 mL पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण. इसे बर्फ पर रखें। इस नमूने को घुलनशील प्रोटीन अंश (एस) नाम दिया जाएगा।
    6. बर्फ-ठंडे SEM बफर के 400 μL में चरण 3.2.4 से गोली को फिर से निलंबित करें।
    7. चरण 3.2.6 से पुन: निलंबित गोली के 100 μL ले लो और इसे एक नए 1.5 mL पूर्व-ठंडा microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरित करें। इसे बर्फ पर रखें। इस नमूने को submitochondrial particles fraction (SMP) नाम दिया जाएगा।
    8. ताजा तैयार 200 mM सोडियम कार्बोनेट के साथ चरण 3.2.6 एक गुना से शेष 300 μL पतला.
    9. 30 मिनट के लिए बर्फ पर चरण 3.2.8 से नमूने को इनक्यूबेट करें।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 x g पर 30 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
    11. Supernatant ले लीजिए और यह एक नया 1.5 mL पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण. इसे बर्फ पर रखें। इस नमूने को कार्बोनेट supernatant अंश (सीएस) नाम दिया जाएगा।
    12. बर्फ-ठंडे SEM बफर के 400 μL में चरण 3.2.10 से गोली को फिर से निलंबित करें। इस नमूने को कार्बोनेट अवक्षेपित अंश (सीपी) नाम दिया जाएगा।
    13. टीसीए के साथ सभी नमूनों (एस, एसएमपी, सीएस और सीपी) को 10% (डब्ल्यू / वी) की अंतिम एकाग्रता के लिए अवक्षेपित करें।
    14. 10 मिनट के लिए बर्फ पर सभी ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    15. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x g पर 10 मिनट के लिए TCA-उपचारित नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    16. supernatant निकालें और नमूना बफर में प्रत्येक गोली resuspend. यदि नमूना बफर पीला हो जाता है, तो 1 M Tris बेस के छोटे ऐलीकोट (1-5 μL) जोड़ें जब तक कि यह नीला न हो जाए।
    17. सभी ट्यूबों के लिए 200 mM PMSF के 1 μL जोड़ें।
    18. SDS-PAGE और पश्चिमी धब्बा द्वारा आगे के विश्लेषण तक -80 °C पर सभी नमूनों को स्टोर करें।

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Representative Results

Submitochondrial fractionation प्रोटोकॉल की सफलता अत्यधिक शुद्ध बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया प्राप्त करने पर निर्भर करती है। इसके लिए, यह आवश्यक है कि खमीर सेल लाइसिस के दौरान, ऑर्गेनेल की अक्षुण्णता लगभग पूरी तरह से संरक्षित रहती है। यह एक सेल लाइसिस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है जो सेल की दीवार के एंजाइमेटिक पाचन को जोड़ता है, जिसके बाद एक डौंस होमोजेनाइज़र का उपयोग करके प्लाज्मा झिल्ली के भौतिक व्यवधान के बाद होता है। माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री को तब विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया जाता है। यह उपकोशिकीय फ्रैक्शनेशन एक समृद्ध माइटोकॉन्ड्रियल अंश उत्पन्न करता है, जैसा कि पोरिन (पोर 1) के उच्च स्तर की उपस्थिति से पुष्टि की जाती है, एक माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर प्रोटीन (चित्रा 1, लेन 2)। हालांकि, यह एक क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया अंश है, जिसमें एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम, रिक्तिका, साइटोसोल और एंडोसोम (चित्रा 1, लेन 2) सहित अन्य सेलुलर डिब्बों की पर्याप्त मात्रा होती है। ये संदूषण कुछ अनुप्रयोगों में कलाकृतियों को पेश कर सकते हैं, जैसे कि सबमिटोकोंड्रियल प्रोटीन स्थानीयकरण प्रयोग। इन संदूषणों की मात्रा को कम करने के लिए, कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल अंश को सुक्रोज घनत्व ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन पर आगे शुद्ध किया जाता है। यह अतिरिक्त शुद्धिकरण चरण एक अत्यधिक शुद्ध माइटोकॉन्ड्रियल अंश उत्पन्न करता है, जैसा कि अन्य सेलुलर डिब्बों (चित्रा 1, लेन 3) के लिए प्रोटीन मार्करों की सामग्री में महत्वपूर्ण कमी से स्पष्ट है।

प्रोटीन के सबमिटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए, अत्यधिक शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया को उनके उप-घटकों (चित्रा 2 ए) में आगे विभाजित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में हाइपोटोनिक आसमाटिक सदमे द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया को माइटोप्लास्ट में परिवर्तित करना शामिल है। इस प्रक्रिया में, बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया को हाइपोओस्मोटिक बफर में इनक्यूबेट किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप ऑर्गेनेल की सूजन होती है। सूजन के दौरान, बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को आसमाटिक असंतुलन द्वारा चुनिंदा रूप से तोड़ दिया जाता है और इंटरमेम्ब्रेन स्पेस प्रोटीन सामग्री को सुपरनेटेंट में जारी किया जाता है। यह सभी प्रक्रिया प्रोटीनेज के की उपस्थिति या अनुपस्थिति में की जाती है। बाहरी झिल्ली व्यवधान के परिणामस्वरूप, प्रोटीज इंटरमेम्ब्रेन स्पेस प्रोटीन सामग्री तक पहुंच प्राप्त करता है और संबंधित प्रोटीन के क्षरण को बढ़ावा देता है। इसके विपरीत, माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स की प्रोटीन सामग्री आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की अखंडता के कारण प्रोटीज के हमले से सुरक्षित रहती है। इन उपचारों के बाद, विभिन्न नमूनों की प्रोटीन सामग्री का मूल्यांकन एसडीएस-पेज और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा किया जाता है।

आसमाटिक सदमे (सूजन) द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया के माइटोप्लास्ट में कुशल रूपांतरण को दो तरीकों से मॉनिटर किया जा सकता है: (1) घुलनशील इंटरमेम्ब्रेन स्पेस मार्कर प्रोटीन (जैसे, साइटोक्रोम साइट) का गायब होना। बी 2) supernatant अंश में अपनी सहवर्ती उपस्थिति के साथ mitoplasts से गोली अंश में (चित्रा 2B, लेन 7 के साथ लेन 3 की तुलना); (2) आंतरिक-झिल्ली मार्कर प्रोटीन का चयनात्मक क्षरण इंटरमेम्ब्रेन स्पेस (जैसे, एसओआई) का सामना करना पड़ रहा है, केवल माइटोप्लास्ट में प्रोटीनेज के द्वारा (चित्रा 2 बी, लेन 4)। इसके अलावा, मार्करों साइट की सुरक्षा। माइटोकॉन्ड्रिया से गोली अंश में प्रोटीनेज के क्षरण के खिलाफ बी 2 और एसओआई का उपयोग बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की अखंडता की पुष्टि करने के लिए किया जाता है (चित्रा 2 बी, लेन 2)। दूसरी ओर, आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की अखंडता की पुष्टि मैट्रिक्स घुलनशील प्रोटीन मार्कर α-केजीडी की सुरक्षा द्वारा प्रोटीनेज के क्षरण के खिलाफ की जाती है (चित्रा 2 बी, लेन 4)। ब्याज के एक प्रोटीन के submitochondrial स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए, बस ज्ञात स्थानीयकरण के साथ इन मानकों के प्रोफाइल के साथ अपने पश्चिमी धब्बा प्रोफ़ाइल की तुलना करें।

चित्रा 2B (Prx1) में दर्शाए गए प्रोटीन के मामले में, इसकी पश्चिमी धब्बा प्रोफ़ाइल दोहरी माइटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकरण के साथ एक प्रोटीन का संकेत है: इंटरमेम्ब्रेन स्पेस और मैट्रिक्स। पहली नज़र में, इसकी फ्रैक्शनेशन प्रोफ़ाइल α-केजीडी के समान है, जो एक मैट्रिक्स स्थानीयकरण का संकेत देती है। हालांकि, माइटोप्लास्ट के supernatant में इसकी उपस्थिति भी एक intermembrane अंतरिक्ष स्थानीयकरण को इंगित करता है। ऊपर वर्णित प्रोटीन मार्करों के फ्रैक्शनेशन प्रोफाइल माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी की अखंडता से जुड़े संभावित कलाकृतियों को खत्म करते हैं और Prx119 के दोहरे स्थानीयकरण की पुष्टि करते हैं।

माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली पर प्रोटीन की टोपोलॉजी की जांच करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया को दो अतिरिक्त उपचारों के लिए प्रस्तुत किया जाता है: sonication और कार्बोनेट निष्कर्षण (चित्रा 3 ए)। जबकि sonication supernatant fraction13 में केवल घुलनशील प्रोटीन जारी करता है, सोडियम कार्बोनेट के साथ क्षारीय निष्कर्षण अतिरिक्त रूप से परिधीय झिल्ली से जुड़े प्रोटीन 13,20 solubilizes। दोनों उपचारों में, अभिन्न झिल्ली प्रोटीन गोली अंश 13 में रहते हैं। इन मान्यताओं की पुष्टि दोनों उपचारों (चित्रा 3 बी) से गोली और supernatant अंशों के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा की जाती है। एक अभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली प्रोटीन (उदाहरण के लिए, पोरिन पोर 1) को सोडियम कार्बोनेट (चित्रा 3 बी, लेन 3 और 5) के साथ क्षार उपचार के बाद भी गोली अंश में पूरी तरह से पाए जाने की उम्मीद है। दूसरी ओर, एक घुलनशील मैट्रिक्स प्रोटीन (उदाहरण के लिए, α-केजीडी) को दोनों उपचारों (चित्रा 3 बी, लेन 2 और 4) में पूरी तरह से घुलनशील होने की उम्मीद है। sonication (चित्रा 3B, लेन 3, SMP अंश) से गोली में α-KGD के महत्वपूर्ण प्रतिधारण sonication पैरामीटर है कि तथाकथित submitochondrial कणों के गठन को प्रभावित कर सकते हैं, जो कुशलतापूर्वक ultracentrifugation द्वारा तलछट कर रहे हैं में मामूली भिन्नताओं के कारण हो सकता है। ज्ञात घुलनशीलता प्रोफाइल के साथ इन प्रोटीनों के व्यवहार का उपयोग तब ब्याज के प्रोटीन की माइटोकॉन्ड्रियल घुलनशीलता को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। Prx1 के मामले में, इसकी पश्चिमी धब्बा प्रोफ़ाइल झिल्ली परिधि से जुड़े प्रोटीन का विचारोत्तेजक है और क्षारीय उपचार इसके घुलनशीलता को प्रेरित करता है (चित्रा 3 बी, लेन 4)।

Figure 1
चित्रा 1: अत्यधिक शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया का अलगाव। कुल लिसेट अंश (लेन 1), एक कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल अंश (लेन 2), और अत्यधिक शुद्ध माइटोकॉन्ड्रियल अंश (लेन 3) का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। अंशों को एसडीएस-पेज द्वारा 12% पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर अलग किया गया था, जिसे नाइट्रोसेल्यूलोज में स्थानांतरित कर दिया गया था और जेल के दाईं ओर वर्णित अलग-अलग सेलुलर डिब्बों के लिए मार्करों के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी। इस आंकड़े को संदर्भ 19 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटीनेज की उपस्थिति में हाइपोटोनिक सूजन द्वारा Submitochondrial fractionation प्रोटोकॉल (ए) submitochondrial fractionation प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। अत्यधिक शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-अलग आइसोटोनिक या हाइपोटोनिक उपचार (सूजन) के अधीन किया जाता है, जो प्रोटीनेज के की उपस्थिति (+) या अनुपस्थिति (-) में होता है। उपचार के बाद, प्रोटीनेज के की गतिविधि को पीएमएसएफ के अलावा से बाधित किया जाता है, और माइटोकॉन्ड्रिया और माइटोप्लास्ट को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पुनर्प्राप्त किया जाता है। परिणामी गोली और supernatant अंशों से प्रोटीन सामग्री TCA द्वारा अवक्षेपित है, और फिर SDS-PAGE और पश्चिमी धब्बा द्वारा विश्लेषण किया जाता है। रंग क्षेत्र के लिए submitochondrial प्रोटीन मार्करों का प्रतिनिधित्व करते हैं: एक घुलनशील intermembrane अंतरिक्ष प्रोटीन (हरा), एक आंतरिक झिल्ली प्रोटीन है कि इंटरमेम्ब्रेन अंतरिक्ष (गुलाबी), और एक घुलनशील मैट्रिक्स प्रोटीन (हल्के नीले) का सामना करना पड़ता है। (बी) सबमिटोकोंड्रियल फ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल से पैलेट और सुपरनेटेंट अंशों का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। अंशों को एसडीएस-पेज द्वारा 12% पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर अलग किया गया था, जिसे नाइट्रोसेल्यूलोज में स्थानांतरित कर दिया गया था और ए में दर्शाए गए अलग-अलग सबमिटोकॉन्ड्रियल डिब्बों के लिए मार्करों के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी। अधिक जानकारी के लिए पाठ देखें. इस आंकड़े को 19 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: sonication और कार्बोनेट निष्कर्षण द्वारा Submitochondrial fractionation प्रोटोकॉल. (A) माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की घुलनशीलता और झिल्ली टोपोलॉजी को निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। माइटोकॉन्ड्रिया शुरू में sonicated और centrifuged होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक घुलनशील प्रोटीन अंश (एस), और कंपार्टमेंटलाइज्ड झिल्लीदार उत्पाद होता है, जिसे सबमिटोकॉन्ड्रियल पार्टिकल (एसएमपी) कहा जाता है। sonication चरण से गोली बाद में सोडियम कार्बोनेट (Na2CO3) और centrifuged के साथ एक क्षारीय उपचार के लिए प्रस्तुत किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कार्बोनेट supernatant (सीएस) और कार्बोनेट अवक्षेपित अंश (सीपी) में जिसके परिणामस्वरूप। (बी) sonication और कार्बोनेट निष्कर्षण प्रोटोकॉल से गोली और supernatant अंशों के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण. अंशों को एसडीएस-पेज द्वारा 12% पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर अलग किया गया था, जिसे नाइट्रोसेल्यूलोज में स्थानांतरित कर दिया गया था और घुलनशीलता के अलग-अलग स्तरों को दिखाते हुए प्रोटीन मार्करों के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी। अधिक जानकारी के लिए पाठ देखें. इस आंकड़े को 19 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

घोल घटक टिप्पणियाँ
YPD माध्यम 1% (w / v) खमीर निकालने, 2% (w / v) पेप्टोन, 2% (डब्ल्यू / वी) ग्लूकोज भंग 10 ग्राम Bacto खमीर निकालने, 20 ग्राम Bacto Peptone और आसुत पानी के 900 मीटर में 20 ग्राम ग्लूकोज जोड़ा. 1000 मिलीलीटर तक भरें और ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल करें।
YPGal माध्यम 1% (w / v) खमीर निकालने, 2% (w / v) पेप्टोन, 2% (डब्ल्यू / वी) गैलेक्टोज भंग 10 ग्राम Bacto खमीर निकालने, 20 ग्राम Bacto Peptone और आसुत पानी के 900 मीटर में 20 ग्राम गैलेक्टोज जोड़ा. 1000 मिलीलीटर तक भरें और ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल करें।
डीटीटी बफर 100 mM Tris-H2SO4 (pH 9.4), 10 mM dithiothreitol (DTT) 15 मिलीलीटर बनाने के लिए: 1 M Tris-H2SO4 के 1.5 मिलीलीटर, पीएच 9.4 को 1M DTT के 150 μL के साथ 30 °C पर पूर्वव्यापी करें।
ddH2O के साथ 15 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम
उपयोग करने से पहले ताजा तैयार करें
Zymolyase बफर 20 mM पोटेशियम फॉस्फेट बफर (pH 7.4), 1.2 M sorbitol 100 मिलीलीटर बनाने के लिए: 2 एम सोर्बिटोल के 60 मिलीलीटर के साथ 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.4) के 2 मिलीलीटर मिलाएं
ddH2O के साथ 15 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम
उपयोग करने से ठीक पहले बफर में आर्थ्रोबैक्टर ल्यूटियस (एमपी बायोमेडिकल्स, इरविन, सीए) से Zymolyase-20T के पाउडर (3 मिलीग्राम प्रति ग्राम गीला वजन) को भंग करें
समरूपता बफर 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0.2% (w/v) गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA), 1 mM phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) 250 मिलीलीटर बनाने के लिए: 2.5 मिलीलीटर 1 M Tris-HCl बफर (pH 7.4) के 2.5 मिलीलीटर को 2 M sorbitol के 75 ml, 500 mM EDTA के 500 μL और BSA के 0.5 g (अनिवार्य रूप से फैटी एसिड-मुक्त) के साथ मिलाएं
ddH2O के साथ 250 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम
4 डिग्री सेल्सियस पर प्री-कूल
उपयोग करने से ठीक पहले बफ़र में PMSF और BSA जोड़ें
SEM बफर 10 mM MOPS-KOH (pH 7.2), 250 mM सुक्रोज, 1 mM EDTA 250 मिलीलीटर बनाने के लिए: 2.5 मिलीलीटर 1 एम MOPS-KOH बफर (पीएच 7.2) के 31.25 मिलीलीटर 2 एम सुक्रोज और 500 mM EDTA के 500 μL के साथ मिश्रण
ddH2O के साथ 250 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम
उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर प्री-कूल।
EM बफर 10 mM MOPS-KOH (pH 7.2), 1 mM EDTA 250 मिलीलीटर बनाने के लिए: 500 mM EDTA के 500 μL के साथ 1 M MOPS-KOH बफर (pH 7.2) के 2.5 मिलीलीटर मिश्रण
ddH2O के साथ 250 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम
उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर प्री-कूल
नमूना बफर 2% (w/v) सोडियम डोडेसिलसल्फेट (SDS), 50 mM DTT, 10% (v/v) ग्लिसरॉल, 0.02% ब्रोमोफेनॉल
नीला, 60 mM Tris-HCl (पीएच 6.8),

तालिका 1: मीडिया, समाधान, और बफ़र्स.

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) 1 2 3 4
माइटोकॉन्ड्रिया (10 मिलीग्राम / एमएल) 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL
SEM बफर 360 μL 360 μL - -
EM बफर - - 360 μL 360 μL
प्रोटीनेज के (10 मिलीग्राम / एमएल) - 4 μL - 4 μL

तालिका 2: हाइपोटोनिक सूजन करने के लिए पिपेटिंग योजना।

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Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है और सबमिटोकोंड्रियल डिब्बों में प्रोटीन स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए लंबे समय तक लगातार अनुकूलित किया गया है13,14,18,21,22,23। इस प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता और पुनरुत्पादकता दृढ़ता से माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी की शुद्धता और अखंडता पर निर्भर करती है। इन दोनों आवश्यकताओं को कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी 13,24,25 (चित्रा 1) के लिए एक अतिरिक्त शुद्धिकरण चरण (सुक्रोज घनत्व ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन) जोड़कर प्राप्त किया जाता है। अवांछित nonmitochondrial contaminants को खत्म करने के अलावा, यह अतिरिक्त शुद्धिकरण कदम टूटे हुए माइटोकॉन्ड्रिया और माइटोप्लास्ट को भी समाप्त करता है जो प्रोटोकॉल 18 के दौरान नमूने के कई भौतिक जोड़तोड़ से उत्पन्न हो सकते हैं। इस प्रकार, प्रक्रिया के समय को बढ़ाने के बावजूद, यह सुक्रोज ग्रेडिएंट शुद्धिकरण चरण अत्यधिक शुद्ध बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया उत्पन्न करता है, जिसे सबमिटोकोंड्रियल फ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल 18,22 की सफलता के लिए आवश्यक माना जाता है।

Vögtle और सहयोगियों ने बताया कि जमे हुए ऑर्गेनेल (-80 डिग्री सेल्सियस पर) को भी सबमिटोकोंड्रियल फ्रैक्शनेशन 13 के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, हम ताजा माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी का उपयोग करने की सलाह देते हैं। पसंद से स्वतंत्र, शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया की अक्षुण्णता की पुष्टि बाहरी रूप से जोड़े गए प्रोटीनेज के खिलाफ इंटरमेम्ब्रेन स्पेस प्रोटीन की संवेदनशीलता की जांच करके की जा सकती है। यदि ऑर्गेनेल बरकरार हैं, तो इस डिब्बे के प्रोटीन जैसे कि साइट। b2 और Sco1 को बाहरी झिल्ली द्वारा प्रदान की गई बाधा के कारण प्रोटियोलिटिक गिरावट से संरक्षित रहना चाहिए (चित्रा 2B, लेन 2)। इसके विपरीत, जब ऑर्गेनेल को हाइपोओस्मोटिक बफर में इनक्यूबेट किया जाता है, तो आसमाटिक शॉक (सूजन) के कारण बाहरी झिल्ली का टूटना इन प्रोटीनों को प्रोटीज गिरावट (चित्रा 2 बी, लेन 4) के लिए प्रवण बनाता है। दूसरी ओर, मैट्रिक्स डिब्बे में मौजूद प्रोटीन, जैसे कि α-केजीडी, आंतरिक झिल्ली की अखंडता के कारण माइटोकॉन्ड्रिया और माइटोप्लास्ट दोनों में गिरावट के खिलाफ संरक्षित रहना चाहिए (चित्रा 2 बी, लेन 2 और 4)। इस प्रकार, इन अच्छी तरह से अध्ययन किए गए माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर प्रोटीन के प्रोफाइल का उपयोग या तो माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी की अखंडता या फ्रैक्शनेशन प्रोटोकॉल की सफलता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, ब्याज के एक प्रोटीन के submitochondrial स्थानीयकरण बस मार्कर प्रोटीन 18,22 (चित्रा 2B) से उन लोगों के साथ अपने फ्रैक्शनेशन प्रोफ़ाइल की तुलना से प्राप्त किया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, यदि माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर प्रोटीन ऊपर वर्णित व्यवहार से अलग व्यवहार दिखाते हैं, तो ऑर्गेनेल की अखंडता से समझौता किया जाता है और इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी का उपयोग इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य के लिए नहीं किया जाना चाहिए।

यद्यपि हाइपोटोनिक शॉक इंटरमेम्ब्रेन स्पेस प्रोटीन बनाम मैट्रिक्स के बीच अंतर करने के लिए एक विश्वसनीय विधि साबित हुई है, यह विधि यह जानकारी प्रदान नहीं करती है कि मैट्रिक्स प्रोटीन घुलनशील है या माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली में जुड़ा हुआ है। यह जानकारी सोडियम कार्बोनेट (चित्रा 3) के साथ क्षारीय निष्कर्षण के बाद sonication के लिए माइटोकॉन्ड्रिया प्रस्तुत करके प्राप्त की जा सकती है। जबकि घुलनशील मैट्रिक्स प्रोटीन sonication पर supernatant अंश में जारी किया जा करने की उम्मीद कर रहे हैं, झिल्ली के साथ जुड़े प्रोटीन अवक्षेप 13 में हो जाते हैं. दूसरी ओर, सोडियम कार्बोनेट के साथ क्षारीय निष्कर्षण कुशलतापूर्वक झिल्ली से जुड़े प्रोटीन को परिधीय रूप से घुलनशील बनाता है, लेकिन अभिन्न झिल्ली प्रोटीन 13,20 नहीं। इस प्रकार, यदि एक प्रोटीन सूजन के बाद प्रोटीज गिरावट के खिलाफ प्रतिरोधी है, लेकिन क्षार उपचार द्वारा supernatant में जारी किया जाता है, तो यह शायद मैट्रिक्स डिब्बे का सामना करने वाला एक परिधीय रूप से संलग्न आंतरिक-झिल्ली प्रोटीन है। यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि प्रोटीज-संवेदनशीलता परख की सफलता पाचन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटीज के खिलाफ ब्याज के प्रोटीन की संवेदनशीलता पर निर्भर करती है। कुछ माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन मानक प्रोटीनेस के एकाग्रता (0.1 मिलीग्राम / एमएल) पर प्रोटियोलिटिक गिरावट के खिलाफ प्रतिरोधी प्रतीत होते हैं, जो आमतौर पर उप-फ्रैक्चरेशन प्रोटोकॉल (चित्रा 2 बी, लेन 8) 19 में नियोजित होते हैं। दोहरीकरण प्रोटीनेज के एकाग्रता (0.2 मिलीग्राम / एमएल) एक पूर्ण प्रोटियोलिटिक गिरावट को सक्षम करने के लिए पर्याप्त प्रतीत होता है। हालांकि, ध्यान रखें कि प्रोटीज की उच्च सांद्रता बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को अस्थिर कर सकती है और अंततः प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता से समझौता कर सकती है।

इसमें कोई संदेह नहीं है कि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के कार्य को स्पष्ट करने के लिए, उनके सबमिटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकरण को निर्धारित करना आवश्यक है। इस संबंध में, यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है जो माइटोकॉन्ड्रिया का अध्ययन करना शुरू कर रहे हैं। खमीर के लिए निर्देशित होने के बावजूद, इसके कई सिद्धांत आसानी से अन्य जीवों पर लागू हो सकते हैं। दरअसल, माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धिकरण चरणों के अपवाद के साथ, बाकी प्रोटोकॉल अन्य जीवों के लिए रिपोर्ट किए गए लोगों के समान है26,27,28। इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण योगदान एस सेरेविसिया के उत्परिवर्ती के अध्ययन में इसकी प्रयोज्यता है जो परिवर्तित माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस को दर्शाता है। यह व्यापक रूप से बताया गया है कि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन आयात मशीनरी के लिए खमीर उत्परिवर्ती माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन 5,29 के परिवर्तित वितरण को दिखाते हैं। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उपयोग नियमित रूप से उत्परिवर्तन के कारण माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन वितरण पर परिणामों की जांच करने के लिए किया जा सकता है जो माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस को बदल सकते हैं। अंत में, प्रोटोकॉल प्रोटीन की जांच के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जो दोहरे माइटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकरण 19,30 दिखाते हैं।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम डॉ ए Tzagoloff (कोलंबिया विश्वविद्यालय) submitochondrial मार्कर प्रोटीन साइट के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए धन्यवाद. b2, αKGD, और Sco1. हम इस प्रोटोकॉल की स्थापना के दौरान उपयोगी चर्चा और टिप्पणियों के लिए डॉ मारियो हेनरिक डी बैरोस (Universidade de Sao Paulo) को भी धन्यवाद देते हैं।

इस काम Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP) (अनुदान 2013/07937-8) से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित था।

फर्नांडो गोम्स और हेलेना तुरानो भी FAPESP द्वारा समर्थित हैं, क्रमशः 2017/09443-3 और 2017/23839-7 अनुदान देते हैं। Angélica Ramos भी Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Peptone BD 211677
Bacto Yeast extract BD 212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm Beckman Coulter 344059
Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) Sigma-Aldrich A7030 Component of Homogenization buffer
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43815 Component of DDT buffer
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884
Galactose Sigma-Aldrich G0625
Glucose Sigma-Aldrich G7021
MOPS Sigma-Aldrich M1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used to inactivate proteinase K
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662
Proteinase K Sigma-Aldrich
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma-Aldrich T6399
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus MP Biomedicals, Irvine, CA 320921 Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast

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References

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जैव रसायन अंक 173 माइटोकॉन्ड्रिया नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae submitochondrial डिब्बों submitochondrial फ्रैक्शनेशन submitochondrial स्थानीयकरण sonication कार्बोनेट निष्कर्षण पश्चिमी धब्बा
नवोदित खमीर <em>Saccharomyces cerevisiae</em> में Submitochondrial प्रोटीन स्थानीयकरण का आकलन
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Gomes, F., Turano, H., Ramos, A.,… More

Gomes, F., Turano, H., Ramos, A., Netto, L. E. S. Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (173), e62853, doi:10.3791/62853 (2021).

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