Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

Published: July 19, 2021 doi: 10.3791/62853
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo

Summary

למרות ההתקדמות האחרונה, חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים רבים עדיין נשארים עם הפונקציות שלהם לא ידוע לחלוטין. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים, אשר היה בסיסי עבור הפיהור של הפונקציות המולקולריות שלהם.

Abstract

למרות ההתקדמות האחרונה באפיון פרוטאום מיטוכונדריאלי שמרים, לוקליזציה submitochondrial של מספר משמעותי של חלבונים נשאר חמקמק. כאן, אנו מתארים שיטה חזקה ויעילה לקביעת לוקליזציה תת-אורגנית של חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים, אשר נחשב צעד בסיסי במהלך הפרטרה פונקציית חלבון מיטוכונדריאלי. שיטה זו כרוכה בצעד ראשוני המורכב מהשגת מיטוכונדריה שלמה טהורה מאוד. תכשירים מיטוכונדריאליים אלה כפופים לאחר מכן לפרוטוקול תת-ניתוח המורכב מהלם היפוטוני (נפיחות) ודגירה עם פרוטאז K (פרוטאז). במהלך הנפיחות, הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית משובשת באופן סלקטיבי, ומאפשרת לחלבון-ase K לעכל חלבונים של תא החלל הבין-ימי. במקביל, כדי לקבל מידע על הטופולוגיה של חלבוני ממברנה, ההכנות המיטוכונדריאליות הם בתחילה sonicated, ולאחר מכן נתון מיצוי אלקליין עם נתרן קרבונט. לבסוף, לאחר צנטריפוגה, הכדור ושברים על טבעיים מטיפולים שונים אלה מנותחים על ידי SDS-PAGE וכתם מערבי. לוקליזציה submitochondrial, כמו גם את טופולוגיית הממברנה של חלבון העניין מתקבל על ידי השוואת פרופיל כתם המערבי שלה עם סטנדרטים ידועים.

Introduction

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים של תאים אאוקריוטים הממלאים תפקידים מכריעים בביו-אנרגטיקה, חילוף חומרים תאי ומסלולי איתות1. כדי לבצע כראוי משימות אלה, המיטוכונדריה מסתמכת על קבוצה ייחודית של חלבונים ושומנים האחראים על המבנה והתפקוד שלהם. שמרים ניצנים Saccharomyces cerevisiae כבר בשימוש נרחב כמערכת מודל עבור חקירות על תהליכים מיטוכונדריאליים, כמו גם עבור אברונים אחרים2. קודי הגנום המיטוכונדריאליים לשמונה חלבונים בלבד בשמרים; הרוב המכריע של החלבונים המיטוכונדריאליים (כ-99%) מקודדים על ידי גנים גרעיניים, המתורגמים לריבוזומים ציטוזוליים, ולאחר מכן מיובאים לתאי השליחה הנכונים שלהם על ידי מכונות ייבוא חלבונים מתוחכמות3,4,5. לפיכך, ביוגנזה מיטוכונדריאלית תלויה בביטוי המתואם של הגנום הגרעיני והמיטוכונדריאלי6,7. מוטציות גנטיות הגורמות לפגמים בביוגנזה מיטוכונדריאלית קשורות למחלות אנושיות8,9,10.

בשני העשורים האחרונים, מחקרים פרוטאומיים בעלי תפוקה גבוהה המתמקדים במיטוכונדריה מטוהרת מאוד הביאו לאפיון מקיף של פרוטאום מיטוכונדריאלי שמרים, אשר הוערך כי הוא מורכב לפחות 900 חלבונים11,12,13,14. למרות שמחקרים אלה סיפקו מידע רב ערך, לוקליזציה תת-אורגנית של כל חלבון בארבעת תתי-הדירות המיטוכונדריאליות, כלומר, הממברנה החיצונית (OM), המרחב הבין-משרדי (IMS), הממברנה הפנימית (IM) והמטריקס, עדיין נדרשת. שאלה זו טופלה בחלקה במחקרים פרוטאומיים של שתי תתי-התת-קומפרטציות המיטוכונדריאליות הקטנות יותר (OM ו- IMS)15,16. לאחרונה, Vögtle ומשתפי פעולה עשו צעד גדול קדימה על ידי יצירת מפה גלובלית באיכות גבוהה של הפצת חלבון submitochondrial בשמרים. באמצעות גישה משולבת המשלבת ספקטרומטריית מסה כמותית מבוססת SILAC, פרוטוקולי שברים שונים של submitochondrial, ואת ערכת הנתונים מפרוטומים OM ו- IMS, המחברים הקצו 818 חלבונים לארבעת תתי-ההפרשות המיטוכונדריאליות13.

למרות ההתקדמות שהושגו על ידי מחקרים פרוטאומיים בעלי תפוקה גבוהה אלה, הידע שלנו על הרכב הפרוטאום ההגשה רחוק מלהיות שלם. ואכן, בין 986 חלבונים שדווחו על ידי Vögtle ומשתפי פעולה כמו להיות מקומי לתוך מיטוכונדריה שמרים, 168 לא יכול להיות מוקצה בכל אחד מארבעת התאים submitochondrial13. יתר על כן, המחברים לא סיפקו מידע על טופולוגיית הממברנה של חלבונים שהיו צפויים להיות מחוברים באופן היקפי לפריפריה של ממברנות מיטוכונדריאליות. לדוגמה, לא ניתן לדעת אם חלבון שהוקצה כמו מחובר היקפית לממברנה הפנימית פונה למטריצה או לחלל הבין-משרדי. מלבד נתונים חסרים אלה ממחקרים ברחבי פרוטאום, ישנם מידע סותר על לוקליזציה תת-אורגנית של מספר משמעותי של חלבונים מיטוכונדריאליים. דוגמה אחת היא פרוטאז Prd1, אשר הוקצה כחלבון חלל בין-משרדי במסדי הנתונים הנפוצים כגון מסד נתונים גנום Saccharomyces (SGD) ו Uniprot. באופן מפתיע, באמצעות פרוטוקול תת-תרגול דומה לזה המתואר כאן, Vögtle ומשתפי פעולה הראו בבירור כי Prd1 הוא חלבון מטריצה אמיתי13. כפי שהוזכר לעיל, לוקליזציה גש של חלבונים מיטוכונדריאליים רבים צריך להיות מבורר או הערכה מחדש. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פשוט ואמין כדי לקבוע את לוקליזציה תת-אורגנית של חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים. פרוטוקול זה פותח ואופטימיזציה על ידי קבוצות מחקר שונות, שימש באופן שגרתי כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial, כמו גם את טופולוגיית הממברנה של חלבונים מיטוכונדריאליים רבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. צמיחה של תאי שמרים

  1. לבודד מושבות בודדות של זן העניין על ידי פסים חלק קטן של התאים מ -80 °C מלאי גליסול על YPD (1% תמצית שמרים, 2% פפטון, 2% גלוקוז) צלחת אגר. לדגור על הצלחת ב 30 °C (50 °F) במשך 2-3 ימים.
    הערה: זן S. cerevisiae המשמש בפרוטוקול זה נגזר על ידי BY4741 (MATα; שלו3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). למעט הגנים סמן auxotrophic, זן זה אינו מכיל שום גן נמחק ואינו נושא שום plasmid. לכן, זה יכול להיות מעובד בהצלחה במדיום עשיר, מגרה צמיחת תאים נמרצת. בעת עבודה עם זנים שהומרו עם plasmids, להשתמש במדיום המינימלי המתאים עבור בחירה plasmid.
  2. הכן תרבות התחלה על ידי חקיקה 2-3 מושבות בודדות מצלחת אגר YPD ב 10-20 מ"ל של בינוני YPGal (1% תמצית שמרים, 2% פפטון, 2% גלקטוז) בבקבוק ארלנמייר 100 מ"ל. דגירה ב 30 °C (50 °F) במשך 24 שעות עם רועד נמרץ.
    הערה: הבחירה של מדיום הצמיחה תלויה בזן השמרים המשמש בפרוטוקול. הן YPD והן YPGal מכילים מקורות פחמן מותססים, המאפשרים צמיחה של זנים שאינם מבצעים נשימה מיטוכונדריאלית. עם זאת, מאז גלוקוז מדחיק את הביטוי של גנים מיטוכונדריאליים רבים, לא מומלץ להשתמש במקור פחמן זה שכן הוא יפיק כמויות נמוכות יותר של מיטוכונדריה. כאשר עובדים עם זנים מוסמכים נשימתיים שיכולים להנשים, ניתן גם להשתמש במקורות פחמן כגון גליצריול ואתנול בניסיון להשיג תשואה גבוהה יותר של המיטוכונדריה.
  3. לדלל את תרבות המתנע לתוך 1 ליטר של מדיום YPGal טרי ל OD600 פחות מ 0.1. לטפח את התאים ב 30 °C (55 °F) עם רועד נמרץ עד OD600 מגיע 1-1.5.
    הערה: לקבוע את קצב הצמיחה (זמן הכפלה) עבור כל זן שמרים לפני ביצוע הניסוי. זה יספק הערכה מדויקת של זמן הדגירה הנדרש לתרבות כדי להגיע OD600 של 1-1.5.

2. בידוד של מיטוכונדריה מטוהרת מאוד

הערה: פרוטוקול זה מותאם מ- 17, עם שינויים קלים.

  1. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. לשטוף את התאים עם מים מזוקקים ולאסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב 3,000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לקבוע את המשקל הרטוב של התאים.
    הערה: הדרך הקלה ביותר למדוד את המשקל של גלולה התא בשלב 2.2 היא לקבוע את המשקל של צינור הצנטריפוגה הריק ממש לפני איסוף התאים. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולמדוד את המשקל של אותו צינור עם התאים. משקל התאים הוא ההבדל בין שתי המדידות.
  4. תקצה מחדש את התאים במאגר DTT (2 מ"ל לכל 1 גרם תאים) באמצעות פיפטה פסטר או קצה P5000. ראה טבלה 1 עבור הרכב מאגר DDT.
  5. לדגור על התאים ב 30 °C (20 °F) במשך 20 דקות עם רועד עדין (~ 70 סל"ד).
  6. צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים.
  7. לשטוף את התאים עם חיץ זימוליאז ללא האנזים (כ 7 מ"ל לכל 1 גרם של תאים).
    ראה טבלה 1 עבור הרכב מאגר זימוליאז.
  8. צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים.
  9. resuspend התאים במאגר ללא זימוליאז (7 מ"ל לכל 1 גרם של תאים).
  10. מעבירים את ההשעיה של התא לבקבוק ארלנמאייר 250 מ"ל ומוסיפים זימוליאז-20T (3 מ"ג למשקל רטוב).
  11. לדגור על התאים ב 30 °C (30 °F) במשך 30-40 דקות עם רועד עדין (~ 70 סל"ד). בדוק את היעילות של תהליך זה על ידי השוואת עכורות של השעיית התא לפני ואחרי טיפול Zymolyase.
    הערה: בשלב זה, התאים יומרו לספרופלסטים עקב עיכול דופן התא על ידי זימוליאז.
    1. בשביל זה, להוסיף 50 μL של כל מתלה תא צינורות זכוכית נפרדים המכילים 2 מ"ל של מים. לאחר ערבוב נמרץ, את עכוזות של השעיית התא שטופלו עם זימוליאז צריך להקטין במהירות עקב הפרעה osmotic של spheroplasts. מצד שני, העקשניות של השעיית התא הלא מטופל צריכה להישאר ללא שינוי.
      הערה: ההשפעות של עכוז יכול להיות מנוטר גם על ידי בדיקה חזותית פשוטה או על ידי מדידת OD600 של שתי הדגימות. במקרה השני, OD600 של המדגם שטופלו Zymolyase צריך להיות 10%-20% של המדגם שאינו מטופל. שיטה חלופית כוללת ספירת התאים בשתי הדגימות באמצעות מיקרוסקופיה קלה.
    2. אם התשואה של היווצרות spheroplasts נמוכה, להוסיף עוד זימוליאז ודגרה במשך מרווח נוסף של 15 דקות.
  12. קציר את הכדור על ידי צנטריפוגה ב 2500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
    הערה: כל הצעדים הנוספים צריכים להתבצע במהירות על קרח או ב 4 °C (55 °F) כדי למנוע השפלת חלבון על ידי אנזימים הידרוליטיים.
  13. לשטוף את spheroplasts פעמיים עם חוצץ הומוגניזציה קר כקרח (כ 6.5 מ"ל לכל 1 גרם של תאים) וכדור על ידי צנטריפוגה ב 2,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F). ראה טבלה 1 לקבלת הרכב מאגר הומוגניזציה.
  14. resuspend את הכדורים במאגר הומוגניזציה קר כקרח (6.5 מ"ל לכל 1 גרם של תאים) ולהעביר אותו זכוכית מצוננת מראש הומוגניזר Dounce. השתמש הומוגניזר זכוכית גדול של כ 30 מ"ל.
  15. הומוגניזציה של הכדורים עם 15 משיכות באמצעות עלה.
    הערה: יש להתאים את מספר הקווים בהתאם להתאמת העקלים. עבור עלה הדוק, 15 משיכות מספיקות. מצד שני, אם משתמשים בעלילה רופפת, מומלץ לבצע עד 25 משיכות.
  16. מעבירים את ההומוגנית לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ומוסיפים נפח אחד של חיץ הומוגניזציה קר כקרח.
  17. צנטריפוגות הומוגנט במהירות נמוכה, 1,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C כדי גרעיני גלולה, פסולת תאים, ותאים רצוף.
  18. העבר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש 50 מ"ל באמצעות פיפטה פסטר או קצה P5000 דואגים למנוע שיבוש הכדור.
  19. צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
  20. מעבירים את הסופר-נט לצינור צנטריפוגה במהירות גבוהה, וצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי ללגום את שבר המיטוכונדריה הגולמי.
  21. השליכו את גלם העל ושטפו בעדינות את גלולה המיטוכונדריה הגולמית במאגר הומוגניזציה קר כקרח של 20-30 מ"ל על ידי צנרת עדינה באמצעות קצה P5000.
  22. העבר את ההשעיה לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F) כדי גלולה את פסולת התא הנותרת.
  23. מעבירים את הסופר-נט לצינור צנטריפוגה במהירות גבוהה, וצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי ללגום את שבר המיטוכונדריה הגולמי.
  24. השלך את supernatant בעדינות resuspened הכדור המיטוכונדריאלי הגס בנפח קטן (בדרך כלל 1000 μL) של חוצץ SEM קר כקרח על ידי pipetting עדין באמצעות קצה P1000. ראה טבלה 1 עבור הרכב מאגר SEM.
    הערה: למרות שבר מיטוכונדריאלי גולמי זה ניתן להשתמש ישירות ביישומים מסוימים כגון בחלבון organello ייבוא assays, הוא מכיל כמויות משמעותיות של רכיבים תאיים אחרים. זיהומים אלה עלולים להוביל לפרשנות שגויה של התוצאות בעת קביעת לוקליזציה של גישושנדריאלי של חלבון. לכן, צעדי טיהור נוספים נדרשים כדי לקבל הכנה מיטוכונדריאלית מטוהרת מאוד, כמתואר להלן.
  25. הכן פתרונות סוכרוז במאגר EM בריכוזים של 60%, 32%, 23% ו- 15% (w/v). פתרונות אלה יציבים עד חודש אחד ב 4 °C (5 °F). ראה טבלה 1 עבור קומפוזיציה של מאגר EM.
  26. הכן שיפוע סוכרוז 4 שלבים בצינור אולטרה צנטריפוגה כדלקמן: מניחים 1.5 מ"ל של 60% (w / v) סוכרוז על החלק התחתון של צינור הצנטריפוגה. לאחר מכן, pipette בזהירות צעד: 4 מ"ל של 32%, 1.5 מ"ל של 23%, ו 1.5 מ"ל של 15% סוכרוז (w / v). יש להצטפיד להימנע משיבוש השלבים.
  27. טען בזהירות את השבר המיטוכונדריאלי הגולמי על גבי מעבר הצבע סוכרוז.
  28. צנטריפוגה עבור 1 שעות ב 134,000 x g ב 4 °C (50 °F) ברוטור דלי מתנדנד.
  29. בזהירות לשמור על הסרת פתרון סוכרוז עד שבר המיטוכונדריה מטוהר מאוד הוא הגיע אשר מיוצג על ידי פס חום בממשק סוכרוז 60%/32%.
  30. לשחזר את המיטוכונדריה המטוהרת באמצעות קצה לחתוך P1000 ולהניח אותו לתוך צינור צנטריפוגה במהירות גבוהה צונן מראש.
  31. לדלל את המיטוכונדריה התאושש עם 5-10 כרכים של חוצץ SEM קר כקרח.
  32. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 12,000 x גרם ב 4 °C (70 °F).
  33. resuspend המיטוכונדריה הטהורה ב 500 μL של חוצץ SEM קר כקרח על ידי pipetting עדין באמצעות קצה לחתוך P1000.
  34. לקבוע את ריכוז החלבון של הכנת מיטוכונדריאלי מטוהר מאוד באמצעות הליך ברדפורד בעקבות הוראות היצרן. התאם את ריכוז החלבון ל-10 מ"ג חלבון/מ"ל עם חוצץ SEM קר כקרח.
    הערה: עבור פרוטוקול הפירוק של השליח המתואר להלן, מומלץ להשתמש במיטוכונדריה שהוכנה זה עתה. עם זאת, Vögtle ומשתפי פעולה ביצעו ניתוח בקרת איכות מפורט של שלמות המיטוכונדריה והראו כי אברונים קפואים יכולים לשמש גם בפרוטוקול זה13. בשביל זה, לעשות aliquots של 40 μL ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. יש לאחסן ב-80 °C (70 °F).

3. פרוטוקול פירוק של שלשה

הערה: פרוטוקול זה מותאם מ- reference18 ומורכב משני שלבים: (1) נפיחות היפוטונית בנוכחות או היעדר פרוטאינאז K, ו - (2) sonication ואחריו מיצוי קרבונט. בצע את כל השלבים של שני הפרוטוקולים על קרח או ב 4 °C (7 °F) כדי למנוע השפלת חלבון.

  1. נפיחות היפוטונית בנוכחות פרוטאינאז K
    1. העבר 40 μL של מיטוכונדריה מטוהרת מאוד ב 10 מ"ג / מ"ל (400 מיקרוגרם) לארבעה 1.5 מ"ל מראש מצוננים מראש שכותרתו צינורות microcentrifuge.
    2. הוסף 360 μL של מאגר SEM בצינורות 1 ו- 2.
    3. הוסף 360 μL של חיץ EM בצינורות 3 ו -4.
    4. יש להוסיף 4 מיקרו-אל של פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל) בצינורות 2 ו-4. השתמש בערכת ההצינורות המפורטת בטבלה 2 כדי למנוע טעויות.
      הערה: הכן פתרון של 10 מ"ג/מ"ל של פרוטאינאז K במים מיד לפני השימוש. הריכוז הסופי של פרוטאינאז K בניסוי צריך להיות סביב 50-100 מיקרוגרם /מ"ל. נא עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים.
    5. מערבבים את כל הצינורות בעדינות ודגרה על קרח במשך 30 דקות עם ערבוב מדי פעם.
    6. הוסף 4 μL של 200 mM PMSF לכל ארבעת הצינורות כדי לעצור את פעילות proteinase K.
      זהירות: PMSF הוא רעיל מאוד. ללבוש כפפות בעת עבודה עם פתרונות המכילים PMSF.
    7. צנטריפוגה ב 20,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F).
    8. לאסוף את supernatant ולהעביר אותו חדש 1.5 מ"ל מראש מצונן שכותרתו צינור microcentrifuge. יש לה מקפיד להימנע משיבוש הכדור.
      הערה: ניתן תולה ישירות resuspended במאגר המדגם לניתוח SDS-PAGE נוסף כתם מערבי. עם זאת, עקבות של חלבון K יכול להישאר פעיל גם לאחר טיפול PMSF ובסופו של דבר יכול לעכל כמה חלבונים לאחר הכדור כבר מומס במאגר מדגם המכיל SDS. כדי למנוע בעיה זו, proteinase K יכול להיות מומת לחלוטין על ידי טיפול של דגימות עם חומצה trichloroacetic (TCA) כפי שתואר להלן.
      זהירות: TCA רעיל מאוד. ללבוש כפפות בעת עבודה עם פתרונות המכילים TCA.
    9. resuspend הכדור מ שלב 3.1.8 ב 400 μL של חוצץ SEM קר כקרח.
    10. לזרז את supernatant (מן שלב 3.1.8) ואת הכדור resuspended (מן שלב 3.1.9) עם TCA לריכוז סופי של 10% (w / v).
    11. לדגור את כל הצינורות על קרח במשך 10 דקות.
    12. צנטריפוגה דגימות שטופלו TCA במשך 10 דקות ב 12,000 x g ב 4 °C (70 °F).
    13. הסר את supernatant ו resuspend הכדור ב 200 μL של חוצץ מדגם.
      הערה: ייתכן כי מחוון pH כחול ברומופנול הופך צהוב בגלל הטיפול בחומצה. במקרה כזה, הוסיפו עליקוטים קטנים (1-5 μL) של בסיס טריס אחד M עד שהוא הופך לכחול.
    14. הוסף 4 μL של 200 mM PMSF לכל הצינורות.
    15. אחסן את כל הדגימות ב--80 °C (80 °F) עד לניתוח נוסף על-ידי SDS-PAGE וכתם מערבי.
  2. סוניקציה ומיצוי פחמתי
    הערה: בפרוטוקול זה, אין צורך להשתמש במיטוכונדריה שהוכנה טרי ברגע sonication גורם לקרע של הממברנות המיטוכונדריאליות.
    1. העבר 200 μL של מיטוכונדריה מטוהרת מאוד ב 10 מ"ג / מ"ל (2 חלבון מ"ג) לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל מקורר מראש.
    2. לדלל את המיטוכונדריה פי אחד עם חוצץ SEM קר כקרח.
    3. סוניקאט מיטוכונדריה במשך 3 על 30 s על קרח. השתמש בסוניקאטור התואם לאמצעי אחסון קטנים.
    4. צנטריפוגה הדגימה במשך 30 דקות ב 100,000 x g ב 4 °C (70 °F).
    5. לאסוף את supernatant ולהעביר אותו צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל חדש מצונן מראש. שמור את זה על קרח. מדגם זה ייקרא שבר חלבון מסיס (S).
    6. resuspend הכדור מ שלב 3.2.4 ב 400 μL של חוצץ SEM קר כקרח.
    7. קח 100 μL של הכדור resuspended מ שלב 3.2.6 ולהעביר אותו צינור microcentrifuge חדש 1.5 מ"ל מקורר מראש. שמור את זה על קרח. מדגם זה ייקרא שבר חלקיקים שולחים (SMP).
    8. לדלל את 300 μL הנותרים משלב 3.2.6 פי אחד עם 200 mM מוכן טרי נתרן קרבונט.
    9. לדגור על המדגם מ שלב 3.2.8 על קרח במשך 30 דקות.
    10. צנטריפוגה הדגימה במשך 30 דקות ב 100,000 x g ב 4 °C (70 °F).
    11. לאסוף את supernatant ולהעביר אותו צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל חדש מצונן מראש. שמור את זה על קרח. מדגם זה ייקרא שבר על-טבעי פחמתי (CS).
    12. resuspend הכדור מ שלב 3.2.10 ב 400 μL של חוצץ SEM קר כקרח. מדגם זה ייקרא שבר מזורם קרבונט (CP).
    13. לזרז את כל הדגימות (S, SMP, CS, ו- CP) עם TCA לריכוז סופי של 10% (w/ v).
    14. לדגור את כל הצינורות על קרח במשך 10 דקות.
    15. צנטריפוגה דגימות שטופלו TCA במשך 10 דקות ב 12,000 x g ב 4 °C (70 °F).
    16. הסר את supernatant ו resuspend כל גלולה במאגר המדגם. אם מאגר המדגם הופך לצהוב, הוסף עליקוטים קטנים (1-5 μL) של בסיס טריס 1 M עד שהוא הופך לכחול.
    17. הוסף 1 μL של 200 mM PMSF לכל הצינורות.
    18. אחסן את כל הדגימות ב--80 °C (80 °F) עד לניתוח נוסף על-ידי SDS-PAGE וכתם מערבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההצלחה של פרוטוקול הפירוק של ההגשה תלויה בהשגת מיטוכונדריה שלמה מטוהרת מאוד. בשביל זה, זה חיוני כי במהלך תמוגה תא שמרים, שלמות של organelles נשאר כמעט לחלוטין השתמר. זה מושגת באמצעות פרוטוקול תמוגה תא המשלב את העיכול אנזימטי של דופן התא ואחריו הפרעה פיזית של קרום הפלזמה באמצעות homogenizer Dounce. התוכן המיטוכונדריאלי נאסף לאחר מכן על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית. שבר תת-תאי זה מניב שבר מיטוכונדריאלי מועשר, כפי שאושר על ידי נוכחות של רמות גבוהות של פורינו (Por1), חלבון סמן מיטוכונדריאלי (איור 1, נתיב 2). עם זאת, זהו שבר מיטוכונדריה גולמי, המכיל כמויות משמעותיות של תאים סלולריים אחרים, כולל רשתית אנדופלסמית, חלול, ציטוסול ואנדום (איור 1, נתיב 2). זיהומים אלה עשויים להציג חפצים ביישומים מסוימים, כגון ניסויי לוקליזציה של חלבונים. כדי להקטין את כמות הזיהומים האלה, השבר המיטוכונדריאלי הגולמי מטוהר עוד יותר על צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. שלב טיהור נוסף זה יוצר שבר מיטוכונדריאלי טהור ביותר, כפי שמעיד הפחתה משמעותית בתכולת סמני החלבון לתאים תאיים אחרים (איור 1, נתיב 3).

כדי לקבוע את ההגשה של לוקליזציה של חלבונים, המיטוכונדריה המטוהרת ביותר מחולקת עוד יותר לתת-ההפרשות שלהם (איור 2A). פרוטוקול זה כרוך בהמרת המיטוכונדריה למיטופלסטים על ידי הלם אוסמוטי היפוטוני. בתהליך זה, מיטוכונדריה שלמה הם דגירה במאגר hypoosmotic וכתוצאה מכך נפיחות של organelle. במהלך הנפיחות, הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית נקרעת באופן סלקטיבי על ידי חוסר איזון אוסמוטי ותכולת חלבון החלל הבין-ימית משתחררת לסופר-נטנטי. כל הליך זה מבוצע בנוכחות או היעדר פרוטאינאז K. כתוצאה מהפרעת הממברנה החיצונית, הפרוטאז מקבל גישה לתכולת חלבון החלל הבין-משרדית ומקדם את ההשפלה של החלבונים המתאימים. לעומת זאת, תכולת החלבון של מטריצת המיטוכונדריה נותרת מוגנת מפני התקפה של הפרוטאז בשל שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית. לאחר טיפולים אלה, תכולת החלבון של הדגימות השונות מוערכת על ידי SDS-PAGE ומנתחי כתם מערבי.

ההמרה היעילה של המיטוכונדריה למיטופלסטים על ידי הלם אוסמוטי (נפיחות) ניתן לפקח בשתי דרכים: (1) היעלמות של חלבון סמן החלל הבין-מסיס (למשל, ציטוכרום קיט. b2) בשבר הכדור ממיטופלסטים עם המראה במקביל בשבר העל-טבעי (איור 2B, השווה את נתיב 3 לנתיב 7); (2) השפלה סלקטיבית של חלבון סמן הממברנה הפנימית הפונה לחלל הבין-ממברני (למשל, ScoI) על ידי פרוטאינאז K רק במיטופלסטים (איור 2B, נתיב 4). בנוסף, ההגנה של הסמנים Cyt. b2 ו-ScoI נגד השפלת פרוטאינאז K בשבר הכדור מהמיטוכונדריה משמשים לאישור שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית (איור 2B, נתיב 2). מצד שני, השלמות של הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית מאושרת על ידי ההגנה על סמן החלבון המסיס במטריצה α-KGD מפני השפלת חלבון K (איור 2B, נתיב 4). כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבון של עניין, פשוט להשוות את פרופיל כתם המערבי שלה עם הפרופילים של סטנדרטים אלה עם לוקליזציה ידועה.

במקרה של החלבון המתואר באיור 2B (Prx1), פרופיל הכתם המערבי שלו מעיד על חלבון עם לוקליזציה מיטוכונדריאלית כפולה: מרחב בין-משרדי ומטריצה. במבט ראשון, פרופיל השבר שלו דומה α-KGD, המציין לוקליזציה של מטריצה. עם זאת, נוכחותו בסופרנטאנט של mitoplasts גם מצביע על לוקליזציה של החלל הבין-משרדי. פרופילי השבר של סמני החלבון שתוארו לעיל מבטלים את הממצאים האפשריים הקשורים לשלמות ההכנה המיטוכונדריאלית ומאששים את לוקליזציה כפולה של Prx119.

כדי לחקור את הטופולוגיה של חלבונים על ממברנות מיטוכונדריאליות, המיטוכונדריה מוגשת לשני טיפולים נוספים: סוניקציה ומיצוי קרבונט (איור 3A). בעוד sonication משחרר רק חלבונים מסיסים לתוך שבר על טבעי13, מיצוי אלקליין עם נתרן קרבונט בנוסף solubilizes חלבונים הקשורים לממברנה היקפית13,20. בשני הטיפולים, חלבונים ממברנה אינטגרליים נשארים בשבריר 13. הנחות אלה מאושרות על ידי ניתוח כתם מערבי של הכדורים ושברים על-טבעיים משני הטיפולים (איור 3B). חלבון ממברנה מיטוכונדריאלי אינטגרלי (למשל, פורין Por1) צפוי להימצא לחלוטין בשבר הכדור, גם לאחר הטיפול האלקלי בנתרן קרבונט (איור 3B, נתיבים 3 ו-5). מצד שני, חלבון מטריצה מסיס (למשל, α-KGD) צפוי להיות מפוסל לחלוטין בשני הטיפולים (איור 3B, נתיבים 2 ו-4). השימור המשמעותי של α-קג"ד בכדור מ sonication (איור 3B, נתיב 3, שבר SMP) עשוי להיות בשל וריאציות קלות בפרמטרים sonication שיכול להשפיע על היווצרות של מה שנקרא חלקיקי submitochondrial, אשר מועשרים ביעילות על ידי אולטרה צנטריפוגה. ההתנהגות של חלבונים אלה עם פרופילי מסיסות ידועים משמשים לאחר מכן כדי לקבוע את המסיסות המיטוכונדריאלית של חלבון של עניין. במקרה של Prx1, פרופיל הכתם המערבי שלו מרמז על חלבון הקשור לפריפריה של הממברנה ולטיפול האלקליין שלו גורם לסולוביליזציה שלו (איור 3B, נתיב 4).

Figure 1
איור 1: בידוד של מיטוכונדריה מטוהרת מאוד. ניתוח כתם מערבי של שבר ליסאט כולל (נתיב 1), שבר מיטוכונדריאלי גולמי (נתיב 2) ושבר מיטוכונדריאלי מטוהר מאוד (נתיב 3). השברים הופרדו על ידי SDS-PAGE על ג'ל פוליאקרילמיד 12%, הועברו לניטרוסלולוז ונבדקו עם נוגדנים שהועלו כנגד סמנים לתאים תאיים נפרדים כמתואר בצד ימין של הג'ל. איור זה שונה מהפניה19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פרוטוקול ההגשה של ההחלקה על ידי נפיחות היפוטונית בנוכחות פרוטאינאז ק. (A) ייצוג סכמטי של פרוטוקול הפירוק של ההגשה. מיטוכונדריה מטוהרת מאוד כפופה בנפרד לטיפולים איזוטוניים או היפוטוניים (נפיחות) בנוכחות (+) או היעדר (-) של פרוטאינאז K. לאחר הטיפול, הפעילות של פרוטאינאז K מעוכבת על ידי תוספת של PMSF, ומיטוכונדריה ומיטופלסטים מתאוששים על ידי צנטריפוגה. תכולת החלבון מהכדורים ושברים על-טבעיים הנובעים מכך מואצת על ידי TCA, ולאחר מכן מנותחת על ידי SDS-PAGE והכתם המערבי. ספירות הצבע מייצגות סמני חלבון גישושנדריאליים עבור: חלבון חלל בין-מסיס (ירוק), חלבון ממברנה פנימית הפונה למרחב הבין-משרדי (ורוד) וחלבון מטריצה מסיס (כחול בהיר). (B) ניתוח כתם מערבי של כדורים ושברים על-טבעיים מפרוטוקול הפירוק של ההגשה. השברים הופרדו על ידי SDS-PAGE על ג'ל פוליאקרילמיד 12%, הועברו לניטרוסלולוז ונבדקו עם נוגדנים שהועלו כנגד סמנים לתאי גישושנדריאליים נפרדים כמתואר ב- A. עיין בטקסט לקבלת פרטים נוספים. נתון זה שונה מ- 19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פרוטוקול פירוק כניעה על ידי sonication ומיצוי קרבונט. (A) ייצוג סכמטי של הפרוטוקול המשמש לקביעת המסיסות והטופולוגיה של הממברנה של חלבונים מיטוכונדריאליים. המיטוכונדריה הם בתחילה sonicated וצנטריפוגה, וכתוצאה מכך שבר חלבון מסיס (S), ואת המוצר ממודר membranous, הנקרא חלקיק submitochondrial (SMP). הכדור מצעד sonication מוגש לאחר מכן לטיפול אלקליין עם נתרן קרבונט (Na2CO3) וצנטריפוגה, וכתוצאה מכך supernatant פחמתי (CS) ושברים פחמתיים (CP). (B) ניתוח כתם מערבי של כדורים ושברים על-טבעיים מפרוטוקול החילוץ של סוניקציה ופחמתי. השברים הופרדו על ידי SDS-PAGE על ג'ל פוליאקרילמיד 12%, הועברו לניטרוסלולוז ונבדקו עם נוגדנים שהועלו כנגד סמני חלבון המראים רמות ברורות של מסיסות. עיין בטקסט לקבלת פרטים נוספים. נתון זה שונה מ- 19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תמיסה רכיבים הערות
בינוני YPD 1% (w/v) תמצית שמרים, 2% (w/v) פפטון, 2% (w/v) גלוקוז יש להמיס 10 גר' תמצית שמרי באקטו, 20 גרם באקטו פפטון ו-20 גרם גלוקוז ב-900 מ' של מים מזוקקים. מלא עד 1000 מ"ל ולחטא על ידי autoclaving.
בינוני YPGal 1% (w/v) תמצית שמרים, 2% (w/v) פפטון, 2% (w/v) גלקטוז יש להמיס 10 גר' תמצית שמרי באקטו, 20 גרם באקטו פפטון ו-20 גרם גלקטוז ב-900 מ' של מים מזוקקים. מלא עד 1000 מ"ל ולחטא על ידי autoclaving.
מאגר DTT 100 מ"מ טריס-H2SO4 (pH 9.4), 10 mM dithiothreitol (DTT) כדי להפוך 15 מ"ל: לערבב 1.5 מ"ל של 1 M Tris-H2SO4, pH 9.4 עם 150 μL של 1M DTT מוזהר מראש ב 30 °C (50 °F).
נפח עד 15 מ"ל עם ddH2O
יש להכין טרי לפני השימוש
מאגר זימוליאז חוצץ אשלגן פוספט 20 מ"מ (pH 7.4), 1.2 M סורביטול כדי להפוך 100 מ"ל: לערבב 2 מ"ל של 1 M אשלגן פוספט חוצץ (pH 7.4) עם 60 מ"ל של 2 M סורביטול
נפח עד 15 מ"ל עם ddH2O
להמיס את האבקה (3 מ"ג לגרם משקל רטוב) של זימוליאז-20T מארתרובקטרי לוטוס (MP ביו-רפואיים, אירווין, קליפורניה) במאגר רגע לפני השימוש
מאגר הומוגניזציה 10 mM טריס-HCl (pH 7.4), 0.6 M סורביטול, 1 mM EDTA, 0.2% (w/v) אלבומין סרום בקר (BSA), 1 mM פנילמתילסולפוניל פלואוריד (PMSF) כדי להפוך 250 מ"ל: לערבב 2.5 מ"ל של 1 M חוצץ Tris-HCl (pH 7.4) עם 75 מ"ל של 2 M סורביטול, 500 μL של 500 mM EDTA ו 0.5 גרם של BSA (בעצם ללא חומצות שומן)
נפח עד 250 מ"ל עם ddH2O
קריר מראש ב-4°C
הוסף PMSF ו- BSA במאגר רגע לפני השימוש
מאגר SEM 10 מ"מ MOPS-KOH (pH 7.2), 250 mM סוכרוז, 1 mM EDTA כדי להפוך 250 מ"ל: לערבב 2.5 מ"ל של 1 M MOPS-KOH חוצץ (pH 7.2) עם 31.25 מ"ל של 2 סוכרוז M ו 500 μL של 500 mM EDTA
נפח עד 250 מ"ל עם ddH2O
מצננים מראש ב-4 מעלות צלזיוס ממש לפני השימוש.
מאגר EM 10 מ"מ MOPS-KOH (pH 7.2), 1 mM EDTA כדי להפוך 250 מ"ל: לערבב 2.5 מ"ל של 1 M MOPS-KOH חוצץ (pH 7.2) עם 500 μL של 500 mM EDTA
נפח עד 250 מ"ל עם ddH2O
מצננים מראש ב-4°C רגע לפני השימוש
מאגר לדוגמה 2% (w/v) נתרן דודצילסולפט (SDS), 50 mM DTT, 10% (v/v) גליסול, 0.02% ברומופנול
כחול, 60 מ"מ טריס-HCl (pH 6.8),

טבלה 1: מדיה, פתרונות ומאגרים.

מגיב 1 2 3 4
מיטוכונדריה (10 מ"ג/מ"ל) 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL
מאגר SEM 360 μL 360 μL - -
מאגר EM - - 360 μL 360 μL
פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל) - 4 μL - 4 μL

טבלה 2: ערכת צנרת לביצוע נפיחות היפוטונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן נעשה שימוש מוצלח ואופטימיזציה רציפה במשך זמן רב כדי לקבוע את לוקליזציה חלבון בתאי submitochondrial13,14,18,21,22,23. האמינות והשחזור של פרוטוקול זה תלויים מאוד בטוהר ושלמות ההכנות המיטוכונדריאליות18. שתי הדרישות הללו מושגות על-ידי הוספת שלב טיהור נוסף (צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז) לתכשירים מיטוכונדריאליים גולמיים13,24,25(איור 1). מלבד ביטול מזהמים לא רצויים שאינם מיטוכונדריאליים, שלב טיהור נוסף זה מבטל גם מיטוכונדריה שבורה ומיטופלסטים שיכולים לנבוע מהמניפולציות הפיזיות הרבות של המדגם במהלך הפרוטוקול18. לכן, למרות הגדלת זמן ההליך, שלב טיהור הדרגתי סוכרוז זה מייצר מיטוכונדריה שלמה מטוהרת מאוד, אשר נחשב חיוני להצלחת פרוטוקול הפירוק submitochondrial18,22.

Vögtle ומשתפי פעולה דיווחו כי אברונים קפואים (ב -80 °C) יכול לשמש בהצלחה גם עבור פירוק submitochondrial13; אנו, לעומת זאת, ממליצים להשתמש בהכנה מיטוכונדריאלית טרייה. ללא תלות בבחירה, השלמות של המיטוכונדריה המטוהרת יכולה להיות מאושרת על ידי בדיקת הרגישות של חלבוני חלל בין-קבוצתיים נגד חלבון מוסף חיצוני K. אם האברונים שלמים, חלבונים של התא הזה כגון Cyt. b2 ו-Sco1 צריכים להישאר מוגנים מפני השפלה פרוטאוליטית בשל המכשול שמספקת הממברנה החיצונית (איור 2B, נתיב 2). לעומת זאת, כאשר האברונים דוגרים במאגר היפואוזמוטי, הקרע של הממברנה החיצונית עקב הלם אוסמוטי (נפיחות) גורם לחלבונים אלה הנוטים להשפלת פרוטאז (איור 2B, נתיב 4). מצד שני, החלבונים הנמצאים בתא המטריצה, כגון α-KGD, צריכים להישאר מוגנים מפני השפלה הן במיטוכונדריה והן במיטופלסטים בשל שלמות הממברנה הפנימית (איור 2B, נתיבים 2 ו-4). לכן, הפרופילים של חלבוני סמן מיטוכונדריאליים אלה נחקר היטב ניתן להשתמש או כדי להעריך את השלמות של תכשירים מיטוכונדריאליים או את ההצלחה של פרוטוקול הפירוק. יתר על כן, לוקליזציה של חלבון בעל עניין מתקבלת פשוט על ידי השוואה של פרופיל הפירוק שלו עם אלה מחלבוני הסמן18,22(איור 2B). חשוב לציין, אם חלבוני הסמן המיטוכונדריאלי מראים התנהגות שונה מזו שתוארה לעיל, שלמות האברונים נפגעת ככל הנראה, ולכן אין להשתמש בהכנה המיטוכונדריאלית לצורך פרוטוקול זה.

למרות שהלם היפוטוני הוכיח את עצמו כשיטה אמינה להבחין בין חלבוני חלל בין-ימיים לעומת מטריצה, שיטה זו אינה מספקת מידע אם חלבון מטריצה מסיס או מחובר לממברנה הפנימית המיטוכונדריאלית. מידע זה ניתן להשיג על ידי הגשת המיטוכונדריה ל sonication ואחריו מיצוי אלקליין עם נתרן קרבונט (איור 3). בעוד חלבוני מטריצה מסיסים צפויים להשתחרר לתוך שבר על טבעי על sonication, חלבונים הקשורים ממברנות נוטים להיות משקעים13. מצד שני, מיצוי אלקליין עם נתרן קרבונט ביעילות solubilize חלבונים מחוברים היקפית ממברנות, אבל לא חלבונים ממברנה אינטגרלי13,20. לכן, אם חלבון עמיד מפני השפלת פרוטאז לאחר נפיחות אך משתחרר לתוך supernatant על ידי טיפול אלקלי, זה כנראה חלבון קרום פנימי מחובר היקפית מול תא המטריצה. חשוב לזכור כי ההצלחה של עשיית רגישות פרוטאז תלויה באופן בולט ברגישות של חלבון העניין נגד הפרוטאז המשמש לעיכול. נראה כי חלבונים מיטוכונדריאליים מסוימים עמידים בפני השפלה פרוטאוליטית בריכוז K פרוטאנאז סטנדרטי (0.1 מ"ג/מ"ל) המועסקים בדרך כלל בפרוטוקולי תת-פירוק (איור 2B, נתיב 8)19. הכפלת ריכוז חלבון K (0.2 מ"ג/מ"ל) נראה מספיק כדי לאפשר השפלה פרוטאוליטית מלאה. עם זאת, יש לזכור כי ריכוזים גבוהים יותר של פרוטאז עלול לערער את הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית ובסופו של דבר לסכן את האפקטיביות של הפרוטוקול.

אין ספק כי כדי להבהיר את הפונקציה של חלבונים מיטוכונדריאליים, זה חיוני כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial שלהם. בהקשר זה, פרוטוקול זה מייצג כלי רב עוצמה עבור חוקרים שמתחילים לחקור מיטוכונדריה. למרות היותו מופנה שמרים, רבים מעקרונותיה יכולים להיות ישימים בקלות על אורגניזמים אחרים. ואכן, למעט צעדי טיהור מיטוכונדריאליים, שאר הפרוטוקול דומה מאוד לאלה שדווחו עבור אורגניזמים אחרים26,27,28. תרומה חשובה נוספת של פרוטוקול זה היא תחולתו בחקר מוטציות של S. cerevisiae המראים ביוגנזה מיטוכונדריאלית שונה. דווח בהרחבה כי מוטציות שמרים עבור מכונות ייבוא חלבון מיטוכונדריאלי להראות התפלגות שונה של חלבונים מיטוכונדריאליים5,29. לכן, פרוטוקול זה יכול לשמש באופן שגרתי כדי לחקור את ההשלכות על התפלגות חלבון מיטוכונדריאלי הנגרמת על ידי מוטציות שיכולות לשנות ביוגנזה מיטוכונדריאלית. לבסוף, הפרוטוקול יכול להיות שימושי במיוחד לחקירת חלבונים המראים לוקליזציה מיטוכונדריאלית כפולה19,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר א. ציגלוף (אוניברסיטת קולומביה) על אספקת נוגדנים שהועלו כנגד חלבוני סמן קשירת ים Cyt. b2, αKGD וסקו1. אנו מודים גם לד"ר מריו הנריקה דה בארוס (Universidade de São Paulo) על דיון והערות מועילות במהלך הקמת פרוטוקול זה.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (grant 2013/07937-8).

פרננדו גומס והלנה טוראנו נתמכים גם על ידי FAPESP, מענקים 2017/09443-3 ו 2017/23839-7, בהתאמה. Angélica Ramos נתמך גם על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Peptone BD 211677
Bacto Yeast extract BD 212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm Beckman Coulter 344059
Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) Sigma-Aldrich A7030 Component of Homogenization buffer
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43815 Component of DDT buffer
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884
Galactose Sigma-Aldrich G0625
Glucose Sigma-Aldrich G7021
MOPS Sigma-Aldrich M1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used to inactivate proteinase K
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662
Proteinase K Sigma-Aldrich
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma-Aldrich T6399
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus MP Biomedicals, Irvine, CA 320921 Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
  3. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
  4. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
  5. Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
  6. Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
  7. Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
  8. Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
  9. Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
  10. Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
  11. Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
  12. Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
  13. Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).
  14. Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
  15. Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
  16. Vögtle, F. -N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
  17. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).
  18. Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
  19. Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
  20. Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
  21. Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
  22. Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
  23. Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
  24. Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
  25. Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), Clifton, N.J. 33-39 (2006).
  26. Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463 (2016).
  27. Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484 (2016).
  28. Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
  29. Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
  30. Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).

Tags

ביוכימיה גיליון 173 מיטוכונדריה שמרים ניצנים סרביסיה Saccharomyces תאי submitochondrial חלוקה submitochondrial לוקליזציה submitochondrial sonication מיצוי קרבונט כתם מערבי
הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים <em>שמרים Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gomes, F., Turano, H., Ramos, A.,… More

Gomes, F., Turano, H., Ramos, A., Netto, L. E. S. Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (173), e62853, doi:10.3791/62853 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter