Summary
Trots de senaste framstegen finns många jäst mitokondriella proteiner fortfarande kvar med sina funktioner helt okända. Detta protokoll ger en enkel och pålitlig metod för att bestämma den inochondriella lokaliseringen av proteiner, vilket har varit grundläggande för att klargöra deras molekylära funktioner.
Abstract
Trots de senaste framstegen i karakteriseringen av jäst mitokondriellt proteom, är den inochondriella lokaliseringen av ett betydande antal proteiner fortfarande svårfångad. Här beskriver vi en robust och effektiv metod för att bestämma suborganellar lokalisering av jäst mitokondriella proteiner, som anses vara ett grundläggande steg under mitokondriell protein funktion klarering. Denna metod innebär ett första steg som består av att erhålla mycket ren intakt mitokondrier. Dessa mitokondriella preparat utsätts sedan för ett subfractionationsprotokoll bestående av hypoton chock (svullnad) och inkubation med proteinas K (proteas). Under svullnad störs det yttre mitokondriella membranet selektivt, vilket gör det möjligt för proteinaset K att smälta proteiner i det intermembrana rymdutrymmet. Parallellt, för att få information om topologin av membranproteiner, soniskas först mitokondriella preparat och utsätts sedan för alkalisk extraktion med natriumkarbonat. Slutligen, efter centrifugering, analyseras pellet- och supernatantfraktionerna från dessa olika behandlingar av SDS-PAGE och western blot. Den submitochondriella lokaliseringen samt membrantopologin hos proteinet av intresse erhålls genom att jämföra dess västra fläckprofil med kända standarder.
Introduction
Mitokondrier är viktiga organeller av eukaryota celler som spelar avgörande roller i bioenergetik, cellulär metabolism och signaleringsvägar1. För att korrekt utföra dessa uppgifter förlitar sig mitokondrier på en unik uppsättning proteiner och lipider som ansvarar för deras struktur och funktion. Den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae har använts i stor utsträckning som modellsystem för undersökningar av mitokondriella processer, liksom för andra organeller2. Mitokondriellt genom kodar för endast åtta proteiner i jäst; De allra flesta mitokondriella proteiner (~99%) kodas av nukleära gener, som översätts på cytosola ribosomer, och därefter importeras till sina korrekta inochondriella fack av sofistikerade proteinimportmaskiner3,4,5. Således är mitokondriell biogenes beroende av det samordnade uttrycket av både det nukleära och mitokondriella genomet6,7. Genetiska mutationer orsakar defekter i mitokondriell biogenes är associerade med mänskliga sjukdomar8,9,10.
Under de senaste två decennierna har proteomiska studier med hög genomströmning riktade mot högrenade mitokondrier resulterat i en omfattande karakterisering av jäst mitokondriell proteom, som har uppskattats bestå av minst 900 proteiner11,12,13,14. Även om dessa studier gav värdefull information, krävs suborganellar lokalisering av varje protein i de fyra mitokondriella underparterna, nämligen det yttre membranet (OM), intermembrane space (IMS), inre membran (IM) och matris, fortfarande. Denna fråga behandlades delvis med proteomisk-omfattande studier av de två mindre mitokondriella underparterna (OM och IMS)15,16. På senare tid har Vögtle och samarbetspartners tagit ett stort steg framåt genom att ta fram en högkvalitativ global karta över inochondriell proteindistribution i jäst. Med hjälp av en integrerad metod som kombinerar SILAC-baserad kvantitativ masspektrometri, olika inochondriella fraktioneringsprotokoll och datauppsättningen från OM- och IMS-proteomerna, tilldelade författarna 818 proteiner till de fyra mitokondriella underparterna13.
Trots de framsteg som uppnåtts av dessa proteomiska studier med hög genomströmning är vår kunskap om den inochondriella proteomkompositionen långt ifrån fullständig. Bland 986 proteiner som rapporterats av Vögtle och kollaboratörer som lokaliserade till jäst mitokondrier, kunde 168 inte tilldelas i något av de fyra submitochondrial facken13. Dessutom gav författarna inte information om membran topologin av proteiner som förutspåddes vara perifert fäst vid periferin av mitokondriella membran. Det är till exempel inte möjligt att veta om ett protein som tilldelades som perifert fäst vid det inre membranet är vänd mot matrisen eller det intermembrana utrymmet. Bortsett från dessa saknade data från de proteomomfattande studierna finns det motstridig information om suborganellar lokalisering av ett betydande antal mitokondriella proteiner. Ett exempel är proteasen Prd1, som har tilldelats som ett intermembran rymdprotein i de gemensamma databaserna som Saccharomyces Genome Database (SGD) och Uniprot. Överraskande, med hjälp av ett subfractionation protokoll som liknar det som beskrivs här, visade Vögtle och kollaboratörer tydligt att Prd1 är en äkta matrisprotein13. Som nämnts ovan måste den inochondriella lokaliseringen av många mitokondriella proteiner klargöras eller omvärderas. Här tillhandahåller vi ett enkelt och tillförlitligt protokoll för att bestämma suborganellar lokalisering av jäst mitokondriella proteiner. Detta protokoll utvecklades och optimerades av olika forskargrupper och har rutinmässigt använts för att bestämma den inochondriella lokaliseringen, liksom membrantopologin hos många mitokondriella proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillväxt av jästceller
- Isolera enstaka kolonier av intressestammen genom att strimla en liten del av cellerna från en -80 °C glycerolbuljong på en YPD (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos) agarplatta. Inkubera plattan vid 30 °C i 2-3 dagar.
OBS: S. cerevisiae-stammen som används i detta protokoll härrör från BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Med undantag för de auxotrofa markörgenerna innehåller denna stam inte någon borttagen gen och bär inte på någon plasmid. Således kan det framgångsrikt odlas i ett rikt medium, vilket stimulerar kraftig celltillväxt. När du arbetar med stammar som omvandlas med plasmider, använd lämpligt minimalt medium för plasmidval. - Förbered en startkultur genom att inokurera 2-3 enskilda kolonier från YPD agarplatta i 10-20 ml YPGal-medium (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% galaktos) i en 100 ml Erlenmeyerkolv. Inkubera vid 30 °C i 24 timmar med kraftig skakning.
OBS: Valet av tillväxtmedium beror på den jäststam som används i protokollet. Både YPD och YPGal innehåller fermenterbara kolkällor, vilket möjliggör tillväxt av stammar som inte utför mitokondriell andning. Men eftersom glukos undertrycker uttrycket av många mitokondriella gener, rekommenderas det inte att använda denna kolkälla eftersom det kommer att producera lägre mängder mitokondrier. Vid arbete med andningskompetenta stammar som kan respirre, Det är också möjligt att använda kolkällor såsom glycerol och etanol i ett försök att få ett högre utbyte av mitokondrier. - Späd ut startkulturen till 1 L färskt YPGal-medium till en OD600 mindre än 0,1. Odla cellerna vid 30 °C med kraftig skakning tills OD600 når 1-1,5.
OBS: Bestäm tillväxthastigheten (fördubblingstiden) för varje jäststam innan du utför experimentet. Detta kommer att ge en noggrann uppskattning av den inkubationstid som krävs för att kulturen ska nå en OD600 på 1-1,5.
2. Isolering av högt renade mitokondrier
OBS: Detta protokoll är anpassat från17, med mindre ändringar.
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 3 000 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna med destillerat vatten och samla dem genom centrifugering vid 3 000 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Bestäm cellernas våtvikt.
OBS: Det enklaste sättet att mäta cellpellets vikt från steg 2.2 är att bestämma vikten på det tomma centrifugröret strax före cellernas samling. Efter centrifugering kassera supernatanten och mät vikten på samma rör med cellerna. Cellernas vikt är skillnaden mellan de två mätningarna. - Återanvänd cellerna i DTT-bufferten (2 ml per 1 g celler) med hjälp av pasteurpipetten eller P5000-spetsen. Se tabell 1 för DDT-buffertsammansättning.
- Inkubera cellerna vid 30 °C i 20 minuter med mild skakning (~70 varv/min).
- Centrifugera vid 3 000 x g i 5 min vid rumstemperatur för att pelletera cellerna.
- Tvätta cellerna med Zymolyasbuffert utan enzymet (ca 7 ml per 1 g celler).
Se tabell 1 för Zymolyase-buffertsammansättning. - Centrifugera vid 3 000 x g i 5 min vid rumstemperatur för att pelletera cellerna.
- Återsuspend cellerna i bufferten utan Zymolyase (7 ml per 1 g celler).
- Överför cellfjädringen till en 250 ml Erlenmeyerkolv och tillsätt Zymolyase-20T (3 mg per g våtvikt).
- Inkubera cellerna vid 30 °C i 30-40 min med mild skakning (~70 rpm). Kontrollera effektiviteten i denna process genom att jämföra grumligheten hos cellavstängningen före och efter Zymolyase-behandlingen.
OBS: I detta steg kommer cellerna att omvandlas till sfäroplaster på grund av cellväggsrötning av Zymolyase.- För detta tillsätt 50 μL av varje cellupphängning till separata glasrör som innehåller 2 ml vatten. Efter blandning kraftigt bör grumligheten hos den cell suspension som behandlats med Zymolyase snabbt minska på grund av osmotisk störning av sfäroplaster. Å andra sidan bör grumligheten hos den icke-behandlade cell suspensionen förbli oförändrad.
OBS: Effekterna av grumlighet kan också övervakas genom enkel visuell inspektion eller genom att mäta OD600 för båda proverna. I det andra fallet bör OD600 i det Zymolyasbehandlade provet vara 10-20% av det icke-behandlade provet. En alternativ metod innebär att man räknar cellerna i båda proverna med hjälp av ljusmikroskopi. - Om utbytet av sfäroplastbildning är lågt, tillsätt mer Zymolyase och inkubera i ytterligare 15 min intervall.
- För detta tillsätt 50 μL av varje cellupphängning till separata glasrör som innehåller 2 ml vatten. Efter blandning kraftigt bör grumligheten hos den cell suspension som behandlats med Zymolyase snabbt minska på grund av osmotisk störning av sfäroplaster. Å andra sidan bör grumligheten hos den icke-behandlade cell suspensionen förbli oförändrad.
- Skörda sfäroplasterna genom centrifugering vid 2500 x g i 5 min vid 4 °C.
OBS: Alla ytterligare steg bör utföras snabbt och på is eller vid 4 °C för att undvika proteinnedbrytning av hydrolytiska enzymer. - Tvätta sfäroplasterna två gånger med iskall homogeniseringsbuffert (ca 6,5 ml per 1 g celler) och pellet genom centrifugering vid 2 500 x g i 5 min vid 4 °C. Se tabell 1 för sammansättning av homogeniseringsbuffertar.
- Återsuspend sfäroplasterna i iskall homogeniseringsbuffert (6,5 ml per 1 g celler) och överför den till en förkyld dounce homogenisator i glas. Använd en stor glas homogenisator på cirka 30 ml.
- Homogenisera sfäroplasterna med 15 slag med en pestle.
OBS: Antalet slag ska justeras beroende på pestlepassningen. För tätt pestle är 15 slag tillräckliga. Å andra sidan, om du använder en lös pestle, rekommenderas att utföra upp till 25 slag. - Överför homogenatet till ett 50 ml centrifugrör och tillsätt 1 volym iskall homogeniseringsbuffert.
- Centrifugera homogenatet vid låg hastighet, 1 500 x g i 5 minuter vid 4 °C till pelletkärnor, cellrester och obrutna celler.
- Överför supernatanten till ett nytt 50 ml centrifugrör med en Pasteur-pipett eller P5000-spets för att undvika att pelletsen störs.
- Centrifug vid 4 000 x g i 5 min vid 4 °C.
- Överför supernatanten till ett höghastighetscentrifufuskrör och centrifugera vid 12 000 x g i 15 minuter vid 4 °C för att pelletera den råa mitokondrifraktionen.
- Kassera supernatanten och tvätta försiktigt den råa mitokondriella pelleten i 20-30 ml iskall homogeniseringsbuffert genom skonsam pipettering med en P5000-spets.
- Överför suspensionen till ett 50 ml centrifugrör och centrifug vid 4 000 x g i 5 minuter vid 4 °C för att pelletera det återstående cellskräpet.
- Överför supernatanten till ett höghastighetscentrifufuskrör och centrifugera vid 12 000 x g i 15 minuter vid 4 °C för att pelletera den råa mitokondrifraktionen.
- Kassera supernatanten och återanvänd försiktigt den råa mitokondriella pelleten i en liten volym (vanligtvis 1000 μL) iskall SEM-buffert genom skonsam pipettering med en P1000-spets. Se tabell 1 för SEM-buffertsammansättning.
OBS: Även om denna råa mitokondriella fraktion kan användas direkt i vissa tillämpningar såsom i organello protein import analyser, innehåller den betydande mängder andra cellulära komponenter. Dessa föroreningar kan leda till feltolkningar av resultaten vid bestämning av den inochondriella lokaliseringen av ett protein. Därför krävs ytterligare reningssteg för att få mycket renad mitokondriell beredning, enligt beskrivningen nedan. - Förbered sackaroslösningar i EM-bufferten vid koncentrationer på 60%, 32%, 23% och 15% (w/v). Dessa lösningar är stabila i upp till 1 månad vid 4 °C. Se tabell 1 för EM-buffertsammansättning.
- Förbered en 4-stegs sackarosgradient i ett ultracentrifugerör enligt följande: Placera 1,5 ml 60% (w/v) sackaros på botten av centrifugröret. Därefter pipett försiktigt stegvis: 4 ml 32%, 1,5 ml 23% och 1,5 ml 15% sackaros (w/v). Var försiktig så att du inte stör faserna.
- Ladda försiktigt den råa mitokondriella fraktionen ovanpå sackarogradienten.
- Centrifugera i 1 h vid 134 000 x g vid 4 °C i en svängande skopa rotor.
- Fortsätt försiktigt att ta bort sackaroslösningen tills den mycket renade mitokondrifraktionen uppnås som representeras av ett brunt band vid sackarosgränssnittet på 60%/32%.
- Återvinn den renade mitokondrierna med en P1000-skuren spets och placera den i ett förkylt höghastighetscentrifugerrör.
- Späd ut de återvunna mitokondrierna med 5-10 volymer iskall SEM-buffert.
- Centrifugera i 30 min vid 12 000 x g vid 4 °C.
- Återanvänd den rena mitokondrierna i 500 μL iskall SEM-buffert genom skonsam pipettering med en P1000-skuren spets.
- Bestäm proteinkoncentrationen i det högt renade mitokondriella preparatet med hjälp av Bradford-proceduren enligt tillverkarens instruktioner. Justera proteinkoncentrationen till 10 mg protein/ml med iskall SEM-buffert.
OBS: För det inochondriella fraktioneringsprotokoll som beskrivs nedan rekommenderas att använda nyberedd mitokondrier. Vögtle och kollaboratörer utförde dock en detaljerad kvalitetskontroll analys av mitokondriell intakthet och visade att frysta organeller också kan användas i detta protokoll13. För detta, gör alikvoter på 40 μL och frys dem i flytande kväve. Förvara vid -80 °C.
3. Protokoll för inochondriell fraktionering
OBS: Detta protokoll är anpassat från reference18 och består av två steg: (1) hypoton svullnad i närvaro eller frånvaro av proteinas K och (2) ultraljudsbehandling följt av karbonat extraktion. Utför alla steg i både protokollen på is eller vid 4 °C för att undvika proteinnedbrytning.
- Hypoton svullnad i närvaro av proteinas K
- Överför 40 μL högrenad mitokondri vid 10 mg/ml (400 μg) till fyra 1,5 ml förkylda märkta mikrocentrifugerör.
- Tillsätt 360 μL SEM-buffert i rör 1 och 2.
- Tillsätt 360 μL EM-buffert i rör 3 och 4.
- Tillsätt 4 μL proteinas K (10 mg/ml) i rör 2 och 4. Använd pipetteringsschemat i tabell 2 för att undvika misstag.
OBS: Förbered en 10 mg/ml-lösning av proteinas K i vatten omedelbart före användning. Den slutliga koncentrationen av proteinas K i försöket bör vara cirka 50-100 μg/ml. Mer information finns i avsnittet Diskussion . - Blanda alla rör försiktigt och inkubera på is i 30 min med tillfällig blandning.
- Tillsätt 4 μL 200 mM PMSF till alla fyra rören för att stoppa proteinas K-aktiviteten.
VARNING: PMSF är mycket giftigt. Använd handskar när du arbetar med lösningar som innehåller PMSF. - Centrifug vid 20 000 x g i 30 min vid 4 °C.
- Samla supernatanten och överför den till ett nytt 1,5 mL förkylt märkt mikrocentrifugerör. Var noga med att undvika att störa pelleten.
OBS: Pelleten kan återanvändas direkt i provbufferten för ytterligare SDS-PAGE- och western blot-analys. Spår av proteinas K kan dock förbli aktiva även efter PMSF-behandling och kan så småningom smälta vissa proteiner efter att pelleten har lösts upp i den SDS-innehållande provbufferten. För att undvika detta problem kan proteinas K inaktiveras helt genom behandling av proverna med trikloreättisk syra (TCA) enligt beskrivningen nedan.
VARNING: TCA är mycket giftigt. Använd handskar när du arbetar med lösningar som innehåller TCA. - Återsuspendera pelleten från steg 3.1.8 i 400 μL iskall SEM-buffert.
- Fäll ut supernatanten (från steg 3.1.8) och den återanslutna pelleten (från steg 3.1.9) med TCA till en slutlig koncentration på 10% (w/v).
- Inkubera alla rör på is i 10 min.
- Centrifugera de TCA-behandlade proverna i 10 minuter vid 12 000 x g vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och återanvänd pelleten i 200 μL provbuffert.
OBS: Det är möjligt att bromofenolblå pH-indikatorn blir gul på grund av syrabehandlingen. Om detta händer, tillsätt små alikvoter (1-5 μL) av 1 M Tris-basen tills den blir blå. - Tillsätt 4 μL av 200 mM PMSF till alla rör.
- Förvara alla prover vid -80 °C tills vidare analys av SDS-PAGE och western blot.
- Ultraljudsbehandling och karbonatutvinning
OBS: I detta protokoll är det inte nödvändigt att använda nyberedd mitokondrier när ultraljudsbehandling orsakar bristning av mitokondriella membran.- Överför 200 μL högrenad mitokondri vid 10 mg/ml (2 mg protein) till ett 1,5 ml förkylt mikrocentrifugerör.
- Späd mitokondrierna enfaldigt med iskall SEM-buffert.
- Sonicate mitokondrier för 3 x 30 s på is. Använd en ljudbehandlingskompatibel för små volymer.
- Centrifugera provet i 30 minuter vid 100 000 x g vid 4 °C.
- Samla supernatanten och överför den till ett nytt 1,5 mL förkylt mikrocentrifugerör. Håll den på is. Detta prov kommer att heta löslig proteinfraktion (S).
- Återsuspend pelleten från steg 3.2.4 i 400 μL iskall SEM-buffert.
- Ta 100 μL av den återsuspenderade pelleten från steg 3.2.6 och överför den till ett nytt 1,5 ml förkylt mikrocentrifugerör. Håll den på is. Detta prov kommer att heta submitochondrial particles fraction (SMP).
- Späd de återstående 300 μL från steg 3.2.6 enfaldigt med nyberedd 200 mM natriumkarbonat.
- Inkubera provet från steg 3.2.8 på is i 30 minuter.
- Centrifugera provet i 30 minuter vid 100 000 x g vid 4 °C.
- Samla supernatanten och överför den till ett nytt 1,5 mL förkylt mikrocentrifugerör. Håll den på is. Detta prov kommer att heta karbonat supernatant fraktion (CS).
- Återsuspend pelleten från steg 3.2.10 i 400 μL iskall SEM-buffert. Detta prov kommer att heta karbonat fällda fraktioner (CP).
- Fäll ut alla prover (S, SMP, CS och CP) med TCA till en slutlig koncentration på 10% (w/v).
- Inkubera alla rör på is i 10 min.
- Centrifugera de TCA-behandlade proverna i 10 minuter vid 12 000 x g vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och återanvänd varje pellet i provbufferten. Om provbufferten blir gul, tillsätt små alikvoter (1-5 μL) av 1 M Tris-bas tills den blir blå.
- Tillsätt 1 μL 200 mM PMSF till alla rör.
- Förvara alla prover vid -80 °C tills vidare analys av SDS-PAGE och western blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgången för submitochondrial fraktionering protokoll beror på att erhålla högt renade intakt mitokondrier. För detta är det viktigt att under jästcelllysen förblir organellernas intakthet nästan helt bevarad. Detta uppnås genom att använda ett celllysprotokoll som kombinerar cellväggens enzymatiska matsmältning följt av fysisk störning av plasmamembranet med hjälp av en Dounce homogenisator. Mitokondriellt innehåll samlas sedan in genom differentiell centrifugering. Denna subcellulära fraktionering ger en berikad mitokondriell fraktion, vilket bekräftas av förekomsten av höga nivåer av porin (Por1), ett mitokondriellt markörprotein (figur 1, körfält 2). Detta är dock en rå mitokondrierfraktion, som innehåller betydande mängder andra cellulära fack, inklusive endoplasmiskt retikulum, vakuol, cytosol och endosom (figur 1, körfält 2). Dessa föroreningar kan införa artefakter i vissa tillämpningar, såsom submitochondrial protein lokalisering experiment. För att minska mängden av dessa föroreningar renas den råa mitokondriella fraktionen ytterligare på sackarosdensitetsgradientcentreringen. Detta ytterligare reningssteg genererar en mycket ren mitokondriell fraktion, vilket framgår av en betydande minskning av innehållet i proteinmarkörerna för andra cellulära fack (figur 1, körfält 3).
För att bestämma den inochondriella lokaliseringen av proteiner, är de högt renade mitokondrierna ytterligare fraktionerade i sina underparter (figur 2A). Detta protokoll innebär omvandling av mitokondrier till mitoplasts av hypotonosmotisk chock. I denna process inkuberas intakta mitokondrier i en hypoosmotisk buffert som resulterar i svullnad av organellen. Under svullnad bryts det yttre mitokondriella membranet selektivt av osmotisk obalans och det intermembrana rymdproteininnehållet släpps ut i supernatanten. All denna procedur utförs i närvaro eller frånvaro av proteinas K. Som en följd av den yttre membranstörningen får proteasen tillgång till intermembran rymdproteininnehåll och främjar nedbrytningen av motsvarande proteiner. Däremot förblir proteininnehållet i mitokondriell matris skyddad från attack av proteasen på grund av integriteten hos det inre mitokondriella membranet. Efter dessa behandlingar utvärderas proteininnehållet i de olika proverna av SDS-PAGE och western blot analyser.
Effektiv omvandling av mitokondrier till mitoplaster genom osmotisk chock (svullnad) kan övervakas på två sätt: (1) försvinnande av det lösliga intermembrane rymdmarkörproteinet (t.ex. cytokrom Cyt. b2) i pelletfraktionen från mitoplaster med dess samtidiga utseende i supernatantfraktionen (figur 2B, jämför körfält 3 med bana 7); (2) Selektiv nedbrytning av proteinet för innermembranmarkörer som vetter mot det intermembrana utrymmet (t.ex. ScoI) genom proteinas K endast i mitoplaster (figur 2B, körfält 4). Dessutom skyddet av markörer Cyt. b2 och ScoI mot proteinas K nedbrytning i pelletfraktionen från mitokondrier används för att bekräfta integriteten hos det yttre mitokondriella membranet (figur 2B, körfält 2). Å andra sidan bekräftas integriteten hos det inre mitokondriella membranet genom skyddet av matrislösliga proteinmarkören α-KGD mot proteinas K nedbrytning (figur 2B, körfält 4). För att bestämma den inochondriella lokaliseringen av ett protein av intresse, jämför helt enkelt dess västra fläckprofil med profilerna för dessa standarder med känd lokalisering.
När det gäller proteinet som beskrivs i figur 2B (Prx1) är dess västra fläckprofil vägledande för ett protein med dubbel mitokondriell lokalisering: intermembranutrymme och matris. Vid första anblicken liknar dess fraktioneringsprofil α-KGD, vilket indikerar en matrislokalisering. Emellertid, dess närvaro i supernatant av mitoplasts indikerar också en intermembrane utrymme lokalisering. Fraktioneringsprofilerna för proteinmarkörer som beskrivs ovan eliminerar de möjliga artefakter som är associerade med mitokondriell förberedelsens integritet och bekräftar den dubbla lokaliseringen av Prx119.
För att undersöka topologin av proteiner på mitokondriella membran, mitokondrier skickas till två ytterligare behandlingar: ultraljudsbehandling och karbonat extraktion (figur 3A). Medan ultraljudsbehandling frigör endast lösliga proteiner i den supernatant fraktionen13, solubiliserar alkalisk extraktion med natriumkarbonat dessutom perifert membranassocierade proteiner13,20. I båda behandlingarna finns integrerade membranproteiner kvar i pelletfraktionen13. Dessa antaganden bekräftas av western blot analys av pellet och supernatant fraktioner från båda behandlingarna (figur 3B). Ett integrerat mitokondriellt membranprotein (t.ex. porin Por1) förväntas finnas helt i pelletfraktionen, även efter alkalibehandlingen med natriumkarbonat (figur 3B, körfält 3 och 5). Å andra sidan förväntas ett lösligt matrisprotein (t.ex. α-KGD) vara helt solubiliserat i båda behandlingarna (figur 3B, körfält 2 och 4). Den betydande kvarhållandet av α-KGD i pelleten från ultraljudsbehandling (figur 3B, körfält 3, SMP fraktion) kan bero på att små variationer i ultraljudsbehandling parametrar som kan påverka bildandet av de så kallade submitochondrial partiklarna, som effektivt sedimenteras av ultracentrifugation. Beteendet hos dessa proteiner med kända löslighetsprofiler används sedan för att bestämma mitokondriell löslighet hos ett protein av intresse. När det gäller Prx1 är dess västra fläckprofil suggestiv av ett protein som är associerat med membranets periferi och alkalisk behandling inducerar dess solubilisering (figur 3B, körfält 4).
Figur 1: Isolering av högt renade mitokondrier. Western blot analys av total lysate fraktion (lane 1), en rå mitokondriell fraktion (lane 2) och högt renad mitokondriell fraktion (lane 3). Fraktionerna separerades av SDS-PAGE på en 12% polyakrylamid gel, överfördes till nitrocellulosa och probed med antikroppar upphöjda mot markörer för distinkta cellulära fack som beskrivs på höger sida av gelén. Denna siffra har ändrats från referens19. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Inochondriellt fraktioneringsprotokoll genom hypoton svullnad i närvaro av proteinas K. (A) Schematisk representation av protokollet för inochondriell fraktionering. Högt renade mitokondrier utsätts separat för isotoniska eller hypotona behandlingar (svullnad) i närvaro (+) eller frånvaro (-) av proteinas K. Efter behandling hämmas aktiviteten av proteinas K genom tillsats av PMSF, och mitokondrier och mitoplaster återvinns genom centrifugering. Proteinhalten från de resulterande pellets- och supernatantfraktionerna fälls ut av TCA och analyseras sedan av SDS-PAGE och western blot. Färgsfärerna representerar submitochondriella proteinmarkörer för: ett lösligt intermembrane rymdprotein (grönt), ett inre membranprotein som vetter mot det intermembrana utrymmet (rosa) och ett lösligt matrisprotein (ljusblått). B) Western blot analys av pellet och supernatant fraktioner från submitochondrial fraktionering protokoll. Fraktionerna separerades av SDS-PAGE på en 12% polyakrylamid gel, överfördes till nitrocellulosa och probed med antikroppar upphöjda mot markörer för distinkta submitochondrial fack som anges i A. Se text för mer information. Denna siffra har ändrats från19. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Inochondriell fraktionering protokoll genom ultraljudsbehandling och karbonat extraktion. (A) Schematisk representation av protokollet som används för att bestämma löslighet och membran topologi av mitokondriellt proteiner. Mitokondrier är initialt sonicated och centrifugerade, vilket resulterar i en löslig proteinfraktion (S), och den compartmentalized membranous produkten, kallas submitochondrial particle (SMP). Pelleten från ultraljudsbehandlingssteget skickas därefter till en alkalisk behandling med natriumkarbonat (Na2CO3) och centrifugeras, vilket resulterar i karbonat supernatant (CS) och karbonat-fällda fraktioner (CP). (B) Western blot analys av pellet och supernatant fraktioner från ultraljudsbehandling och karbonat extraktion protokoll. Fraktionerna separerades av SDS-PAGE på en 12% polyakrylamid gel, överfördes till nitrocellulosa och probed med antikroppar uppfödda mot protein markörer visar distinkta nivåer av löslighet. Se text för mer information. Denna siffra har ändrats från19. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Lösning | Komponenter | Kommentarer | |
| YPD-medium | 1% (w/v) jästextrakt, 2% (w/v) pepton, 2% (w/v) glukos | Lös upp 10 g Bacto Jästextrakt, 20 g Bacto Peptone och 20 g glukos i 900 m destillerat vatten tillsatt. Fyll upp till 1000 ml och sterilisera genom autoklavering. | |
| YPGal medium | 1% (w/v) jästextrakt, 2% (w/v) pepton, 2% (w/v) galaktos | Lös upp 10 g Bacto Jästextrakt, 20 g Bacto Peptone och 20 g galaktos i 900 m destillerat vatten tillsatt. Fyll upp till 1000 ml och sterilisera genom autoklavering. | |
| DTT-buffert | 100 mM Tris-H2SO4 (pH 9,4), 10 mM dithiothreitol (DTT) | För att göra 15 ml: blanda 1,5 ml 1 M Tris-H2SO4, pH 9,4 med 150 μL 1M DTT förvarnat vid 30 °C. Volym till 15 ml med ddH2O Förbered ny före användning |
|
| Zymolyasbuffert | 20 mM kaliumfosfatbuffert (pH 7.4), 1,2 M sorbitol | För att göra 100 ml: blanda 2 ml 1 M kaliumfosfatbuffert (pH 7.4) med 60 ml 2 M sorbitol Volym till 15 ml med ddH2O Lös upp pulvret (3 mg per gram våtvikt) av Zymolyase-20T från Arthrobacter luteus (MP Biomedicals, Irvine, CA) i bufferten strax före användning |
|
| Homogeniseringsbuffert | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w/v) bovint serumalbumin (BSA), 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) | För att göra 250 ml: blanda 2,5 ml 1 M Tris-HCl buffert (pH 7.4) med 75 ml 2 M sorbitol, 500 μL 500 mM EDTA och 0,5 g BSA (i huvudsak fettsyrafri) Volym till 250 ml med ddH2O Förkyld vid 4°C Lägg till PMSF och BSA i bufferten strax före användning |
|
| SEM-buffert | 10 mM MOPS-KOH (pH 7,2), 250 mM sackaros, 1 mM EDTA | För att göra 250 ml: blanda 2,5 ml 1 M MOPS-KOH-buffert (pH 7.2) med 31,25 ml 2 M sackaros och 500 μL 500 mM EDTA Volym till 250 ml med ddH2O Förkyl vid 4°C strax före användning. |
|
| EM-buffert | 10 mM MOPS-KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA | För att göra 250 ml: blanda 2,5 ml 1 M MOPS-KOH-buffert (pH 7.2) med 500 μL 500 mM EDTA Volym till 250 ml med ddH2O Förkyl vid 4°C strax före användning |
|
| exempelbuffert | 2% (w/v) natrium dodecylsulfat (SDS), 50 mM DTT, 10% (v/v) glycerol, 0,02% bromofenol blå, 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), |
||
Tabell 1: Media, lösningar och buffertar.
| Reagens | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| Mitokondrier (10 mg/ml) | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | |
| SEM-buffert | 360 μL | 360 μL | - | - | |
| EM-buffert | - | - | 360 μL | 360 μL | |
| Proteinas K (10 mg/ml) | - | 4 μL | - | 4 μL | |
Tabell 2: Pipetteringsschema för att utföra hypoton svullnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som presenteras här har framgångsrikt använts och kontinuerligt optimerats under lång tid för att bestämma proteinlokaliseringen i de inochondriella facken13,14,18,21,22,23. Tillförlitligheten och reproducerbarheten av detta protokoll är starkt beroende av renheten och integriteten hos mitokondriella preparat18. Båda dessa krav uppnås genom att lägga till ytterligare ett reningssteg (sackarosdensdensitetsgradientcentration) till råa mitokondriella preparat13,24,25 (figur 1). Förutom att eliminera oönskade nonmitochondriella föroreningar eliminerar detta ytterligare reningssteg också trasiga mitokondrier och mitoplaster som kan uppstå från de många fysiska manipuleringarna av provet under protokollet18. Således, trots att öka tiden för förfarandet, genererar detta sackaros gradient rening steg mycket renade intakta mitokondrier, vilket anses vara avgörande för framgången för submitochondrial fraktionering protokoll18,22.
Vögtle och kollaboratörer rapporterade att frysta organeller (vid -80 °C) också framgångsrikt kunde användas för inochondriell fraktionering13; Vi rekommenderar dock att du använder färska mitokondriella preparat. Oberoende av val kan intaktheten hos renade mitokondrier bekräftas genom att kontrollera känsligheten hos intermembrana rymdproteiner mot externt tillsatt proteinas K. Om organellerna är intakta, proteiner i detta fack som Cyt. b2 och Sco1 bör förbli skyddade mot proteolytisk nedbrytning på grund av den barriär som det yttre membranet tillhandahåller (figur 2B, körfält 2). När organellerna däremot inkuberas i en hypoosmotisk buffert gör sprängningen av det yttre membranet på grund av osmotisk chock (svullnad) dessa proteiner benägna att proteasnedbrytning (figur 2B, bana 4). Å andra sidan bör de proteiner som finns i matrisutrymmet, såsom α-KGD, förbli skyddade mot nedbrytning i både mitokondrier och mitoplaster på grund av det inre membranets integritet (figur 2B, körfält 2 och 4). Således kan profilerna för dessa väl studerade mitokondriella markörproteiner användas antingen för att bedöma mitokondriella preparats integritet eller framgången för fraktioneringsprotokollet. Dessutom erhålls den inochondriella lokaliseringen av ett protein av intresse endast genom jämförelse av dess fraktioneringsprofil med dem från markörproteinerna18,22 (figur 2B). Viktigt, om mitokondriella markörproteiner visar ett beteende som skiljer sig från det som beskrivs ovan, äventyras organellernas integritet sannolikt och därför bör mitokondriell beredning inte användas för detta protokoll.
Även om hypoton chock har visat sig vara en pålitlig metod för att skilja mellan intermembrane rymdproteiner kontra matris, ger denna metod inte information om huruvida ett matrisprotein är lösligt eller fäst i mitokondriellt inre membran. Denna information kan uppnås genom att lämna mitokondrier till ultraljudsbehandling följt av alkalisk extraktion med natriumkarbonat (figur 3). Medan lösliga matrisproteiner förväntas släppas ut i den supernatant fraktionen vid ultraljudsbehandling, tenderar proteiner associerade med membran att vara i fällningen13. Å andra sidan, alkalisk extraktion med natriumkarbonat solubiliserar effektivt proteiner perifert fästa vid membran, men inte integrerade membranproteiner13,20. Således, om ett protein är resistent mot proteasnedbrytning efter svullnad men släpps ut i supernatanten genom alkalibehandling, är det förmodligen ett perifert fäst inre membranprotein som vetter mot matrisutrymmet. Det är viktigt att komma ihåg att framgången för proteaskänslighetsanalys är slående beroende av känsligheten hos proteinet av intresse mot det proteas som används för matsmältningen. Vissa mitokondriella proteiner verkar vara resistenta mot proteolytisk nedbrytning vid standardproteinas K-koncentrationen (0, 1 mg/ml) som vanligtvis används i subfractionationsprotokoll (figur 2B, körfält 8)19. Fördubbling av proteinas K koncentration (0,2 mg/ml) verkar vara tillräckligt för att möjliggöra en fullständig proteolytisk nedbrytning. Tänk dock på att högre koncentrationer av proteas kan destabilisera det yttre mitokondriella membranet och så småningom äventyra protokollets effektivitet.
Det råder ingen tvekan om att för att klargöra funktionen av mitokondriella proteiner är det viktigt att bestämma deras submitochondriella lokalisering. I detta avseende representerar detta protokoll ett kraftfullt verktyg för forskare som börjar studera mitokondrier. Trots att de riktas mot jäst kan många av dess principer lätt tillämpas på andra organismer. Med undantag för mitokondriella reningssteg är resten av protokollet mycket likt de som rapporterats för andra organismer26,27,28. Ett annat viktigt bidrag till detta protokoll är dess tillämplighet i studien av mutanter av S. cerevisiae som visar förändrad mitokondriell biogenes. Det har rapporterats allmänt att jästmutanter för mitokondriell protein import maskiner visar en förändrad distribution av mitokondriella proteiner5,29. Således kan detta protokoll rutinmässigt användas för att undersöka konsekvenserna på mitokondriell proteinfördelning orsakad av mutationer som kan förändra mitokondriell biogenes. Slutligen kan protokollet vara särskilt användbart för att undersöka proteiner som visar dubbel mitokondriell lokalisering19,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. A. Tzagoloff (Columbia University) för att tillhandahålla antikroppar som höjts mot submitochondriella markörproteiner Cyt. b2, αKGD och Sco1. Vi tackar också Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) för hjälpsam diskussion och kommentarer under upprättandet av detta protokoll.
Detta arbete stöddes av forskningsanslag från Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (anslag 2013/07937-8).
Fernando Gomes och Helena Turano stöds också av FAPESP, bidrag 2017/09443-3 respektive 2017/23839-7. Angélica Ramos stöds också av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
- Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
- Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
- Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
- Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
- Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
- Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
- Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
- Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
- Vögtle, F. N., et al.
- Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
- Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
- Vögtle, F. -N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
- Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
- Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
- Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
- Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
- Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N.
- Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463 (2016).
- Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484 (2016).
- Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
- Neupert, W., Herrmann, J. M.
- Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).
