Summary
Trotz der jüngsten Fortschritte bleiben viele mitochondriale Hefeproteine mit ihren Funktionen völlig unbekannt. Dieses Protokoll bietet eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung der submitochondrialen Lokalisation von Proteinen, die für die Aufklärung ihrer molekularen Funktionen von grundlegender Bedeutung war.
Abstract
Trotz der jüngsten Fortschritte bei der Charakterisierung des mitochondrialen Proteoms von Hefe bleibt die submitochondriale Lokalisation einer signifikanten Anzahl von Proteinen schwer fassbar. Hier beschreiben wir eine robuste und effektive Methode zur Bestimmung der suborganellaren Lokalisation von hefigen mitochondrialen Proteinen, die als grundlegender Schritt bei der mitochondrialen Proteinfunktionsaufklärung angesehen wird. Diese Methode beinhaltet einen ersten Schritt, der darin besteht, hochreine intakte Mitochondrien zu erhalten. Diese mitochondrialen Präparate werden dann einem Subfraktionierungsprotokoll unterzogen, das aus hypotonem Schock (Schwellung) und Inkubation mit Proteinase K (Protease) besteht. Während der Schwellung wird die äußere mitochondriale Membran selektiv gestört, so dass die Proteinase K Proteine des Intermembranraumkompartiments verdauen kann. Parallel dazu werden die mitochondrialen Präparate, um Informationen über die Topologie von Membranproteinen zu erhalten, zunächst beschallt und dann einer alkalischen Extraktion mit Natriumcarbonat unterzogen. Schließlich werden nach der Zentrifugation die Pellet- und Überstandfraktionen aus diesen verschiedenen Behandlungen mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert. Die submitochondriale Lokalisation sowie die Membrantopologie des interessierenden Proteins wird durch den Vergleich seines Western-Blot-Profils mit bekannten Standards erhalten.
Introduction
Mitochondrien sind essentielle Organellen eukaryotischer Zellen, die eine entscheidende Rolle in der Bioenergetik, im Zellstoffwechsel und in Signalwegen spielen1. Um diese Aufgaben richtig auszuführen, verlassen sich Die Mitochondrien auf einen einzigartigen Satz von Proteinen und Lipiden, die für ihre Struktur und Funktion verantwortlich sind. Die knospende Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde häufig als Modellsystem für Untersuchungen an mitochondrialen Prozessen sowie für andere Organellen verwendet2. Das mitochondriale Genom kodiert für nur acht Proteine in Hefe; Die überwiegende Mehrheit der mitochondrialen Proteine (~99%) wird von Kerngenen kodiert, die auf zytosolische Ribosomen übersetzt und anschließend von hochentwickelten Proteinimportmaschinen in ihre korrekten submitochondrialen Kompartimente importiert werden3,4,5. Somit hängt die mitochondriale Biogenese von der koordinierten Expression sowohl des kernigen als auch des mitochondrialen Genoms ab6,7. Genetische Mutationen, die Defekte in der mitochondrialen Biogenese verursachen, sind mit menschlichen Krankheiten assoziiert8,9,10.
In den letzten zwei Jahrzehnten führten Hochdurchsatz-Proteomstudien, die auf hochreine Mitochondrien abzielten, zu einer umfassenden Charakterisierung des hefe-mitochondrialen Proteoms, das schätzungsweise aus mindestens 900 Proteinen besteht11,12,13,14. Obwohl diese Studien wertvolle Informationen lieferten, ist die suborganellare Lokalisation jedes Proteins in den vier mitochondrialen Unterkompartimenten, nämlich der äußeren Membran (OM), dem Intermembranraum (IMS), der inneren Membran (IM) und der Matrix, immer noch erforderlich. Diese Frage wurde teilweise mit proteomweiten Studien der beiden kleineren mitochondrialen Unterkompartimente (OM und IMS)15,16 beantwortet. In jüngerer Zeit haben Vögtle und seine Mitarbeiter einen großen Schritt nach vorne gemacht, indem sie eine qualitativ hochwertige globale Karte der submitochondrialen Proteinverteilung in Hefe erstellt haben. Unter Verwendung eines integrierten Ansatzes, der SILAC-basierte quantitative Massenspektrometrie, verschiedene submitochondriale Fraktionierungsprotokolle und den Datensatz aus den OM- und IMS-Proteomen kombiniert, ordneten die Autoren den vier mitochondrialen Unterkompartimenten 818 Proteine zu13 zu.
Trotz der Fortschritte, die durch diese Hochdurchsatz-Proteomstudien erzielt wurden, ist unser Wissen über die Zusammensetzung des submitochondrialen Proteoms noch lange nicht vollständig. Tatsächlich konnten von den 986 Proteinen, von denen Vögtle und Mitarbeiter berichteten, dass sie in Hefemitochondrien lokalisiert sind, 168 keinem der vier submitochondrialen Kompartimente zugeordnet werden13. Darüber hinaus lieferten die Autoren keine Informationen über die Membrantopologie von Proteinen, von denen vorhergesagt wurde, dass sie peripher an die Peripherie mitochondrialer Membranen gebunden sind. Zum Beispiel ist es nicht möglich zu wissen, ob ein Protein, das als peripher an die innere Membran gebunden zugeordnet wurde, der Matrix oder dem Intermembranraum zugewandt ist. Abgesehen von diesen fehlenden Daten aus den proteomweiten Studien gibt es widersprüchliche Informationen über die suborganellare Lokalisation einer signifikanten Anzahl von mitochondrialen Proteinen. Ein Beispiel ist die Protease Prd1, die in den gängigen Datenbanken wie Saccharomyces Genome Database (SGD) und Uniprot als Intermembranraumprotein zugeordnet wurde. Überraschenderweise zeigten Vögtle und seine Mitarbeiter mit einem Subfraktionierungsprotokoll ähnlich dem hier beschriebenen deutlich, dass Prd1 ein echtes Matrixprotein ist13. Wie oben erwähnt, muss die submitochondriale Lokalisation vieler mitochondrialer Proteine aufgeklärt oder neu bewertet werden. Hier stellen wir ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zur Verfügung, um die suborganellare Lokalisation von hefigen mitochondrialen Proteinen zu bestimmen. Dieses Protokoll wurde von verschiedenen Forschungsgruppen entwickelt und optimiert und wurde routinemäßig verwendet, um die submitochondriale Lokalisation sowie die Membrantopologie vieler mitochondrialer Proteine zu bestimmen.
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Protocol
1. Wachstum von Hefezellen
- Isolieren Sie einzelne Kolonien des interessierenden Stammes, indem Sie einen kleinen Teil der Zellen aus einem -80 °C Glycerinvorrat auf eine YPD-Agarplatte (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose) streifen. Die Platte bei 30 °C für 2-3 Tage inkubieren.
HINWEIS: Der in diesem Protokoll verwendete Stamm S. cerevisiae ist von BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Mit Ausnahme der auxotrophen Markergene enthält dieser Stamm kein gelöschtes Gen und trägt kein Plasmid. So kann es erfolgreich in einem reichen Medium kultiviert werden und stimuliert kräftiges Zellwachstum. Wenn Sie mit Stämmen arbeiten, die mit Plasmiden transformiert wurden, verwenden Sie das geeignete minimale Medium für die Plasmidauswahl. - Bereiten Sie eine Starterkultur vor, indem Sie 2-3 einzelne Kolonien aus YPD-Agarplatte in 10-20 ml YPGal-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Galaktose) in einem 100 ml Erlenmeyerkolben impfen. Bei 30 °C 24 h mit kräftigem Schütteln inkubieren.
HINWEIS: Die Wahl des Wachstumsmediums hängt von dem im Protokoll verwendeten Hefestamm ab. Sowohl YPD als auch YPGal enthalten fermentierbare Kohlenstoffquellen, die das Wachstum von Stämmen ermöglichen, die keine mitochondriale Atmung durchführen. Da Glukose jedoch die Expression vieler mitochondrialer Gene unterdrückt, wird nicht empfohlen, diese Kohlenstoffquelle zu verwenden, da sie geringere Mengen an Mitochondrien produziert. Bei der Arbeit mit atemaktiven Atemwegsstämmen ist es auch möglich, Kohlenstoffquellen wie Glycerin und Ethanol zu verwenden, um eine höhere Ausbeute an Mitochondrien zu erzielen. - Verdünnen Sie die Starterkultur in 1 l frisches YPGal-Medium auf ein OD600 kleiner als 0,1. Kultivieren Sie die Zellen bei 30 °C mit kräftigem Schütteln, bis OD600 1-1,5 erreicht.
HINWEIS: Bestimmen Sie die Wachstumsrate (Verdopplungszeit) für jeden Hefestamm, bevor Sie den Versuch durchführen. Dies liefert eine genaue Schätzung der Inkubationszeit, die erforderlich ist, damit die Kultur einen OD600 von 1-1,5 erreicht.
2. Isolierung hochreiner Mitochondrien
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von 17 mit geringfügigen Änderungen angepasst.
- Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen mit destilliertem Wasser und sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Bestimmen Sie das Nassgewicht der Zellen.
HINWEIS: Der einfachste Weg, das Gewicht des Zellpellets aus Schritt 2.2 zu messen, besteht darin, das Gewicht des leeren Zentrifugenröhrchens kurz vor der Sammlung der Zellen zu bestimmen. Verwerfen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und messen Sie das Gewicht desselben Röhrchens mit den Zellen. Das Gewicht der Zellen ist die Differenz zwischen den beiden Messungen. - Resuspendieren Sie die Zellen in DTT-Puffer (2 ml pro 1 g Zellen) mit einer Pasteur-Pipette oder P5000-Spitze. Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des DDT-Puffers.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 30 °C für 20 min mit sanftem Schütteln (~70 U/min).
- Zentrifugiere bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
- Waschen Sie die Zellen mit Zymolyase-Puffer ohne das Enzym (ca. 7 ml pro 1 g Zellen).
Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des Zymolyasepuffers. - Zentrifugiere bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
- Resuspendieren Sie die Zellen im Puffer ohne Zymolyase (7 ml pro 1 g Zellen).
- Die Zellsuspension wird in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben gegeben und mit Zymolyase-20T (3 mg pro g Nassgewicht) versetzt.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 30 °C für 30-40 min mit sanftem Schütteln (~70 U/min). Überprüfen Sie die Wirksamkeit dieses Prozesses, indem Sie die Trübung der Zellsuspension vor und nach der Zymolyase-Behandlung vergleichen.
HINWEIS: In diesem Schritt werden die Zellen aufgrund der Zellwandverdauung durch Zymolyase in Spheroplasten umgewandelt.- Dazu werden 50 μL jeder Zellsuspension in separate Glasröhrchen mit 2 mL Wasser gegeben. Nach kräftigem Mischen sollte die Trübung der mit Zymolyase behandelten Zellsuspension aufgrund der osmotischen Störung von Spheroplasten schnell abnehmen. Andererseits sollte die Trübung der unbehandelten Zellsuspension unverändert bleiben.
HINWEIS: Die Auswirkungen der Trübung können auch durch einfache Sichtprüfung oder durch Messung des OD600 beider Proben überwacht werden. Im zweiten Fall sollte die OD600 der mit Zymolyase behandelten Probe 10% -20% der nicht behandelten Probe betragen. Eine alternative Methode besteht darin, die Zellen in beiden Proben mit Hilfe der Lichtmikroskopie zu zählen. - Wenn die Ausbeute der Spheroplastenbildung gering ist, fügen Sie mehr Zymolyase hinzu und inkubieren Sie für weitere 15 Minuten.
- Dazu werden 50 μL jeder Zellsuspension in separate Glasröhrchen mit 2 mL Wasser gegeben. Nach kräftigem Mischen sollte die Trübung der mit Zymolyase behandelten Zellsuspension aufgrund der osmotischen Störung von Spheroplasten schnell abnehmen. Andererseits sollte die Trübung der unbehandelten Zellsuspension unverändert bleiben.
- Ernten Sie die Spheroplasten durch Zentrifugation bei 2500 x g für 5 min bei 4 °C.
HINWEIS: Alle weiteren Schritte sollten schnell und auf Eis oder bei 4 °C durchgeführt werden, um den Proteinabbau durch hydrolytische Enzyme zu vermeiden. - Waschen Sie die Spheroplasten zweimal mit eiskaltem Homogenisierungspuffer (ca. 6,5 ml pro 1 g Zellen) und Pellet durch Zentrifugieren bei 2.500 x g für 5 min bei 4 °C. Siehe Tabelle 1 zur Zusammensetzung des Homogenisierungspuffers.
- Resuspendieren Sie die Spheroplasten in eiskaltem Homogenisierungspuffer (6,5 ml pro 1 g Zellen) und übertragen Sie sie in einen vorgekühlten Glas-Dounce-Homogenisator. Verwenden Sie einen großen Glashomogenisator von ca. 30 ml.
- Homogenisieren Sie die Sphäroplasten mit 15 Schlägen mit einem Stößel.
HINWEIS: Die Anzahl der Hübe sollte in Abhängigkeit von der Stößelanpassung angepasst werden. Für einen dichten Stößel reichen 15 Schläge aus. Auf der anderen Seite, wenn Sie einen losen Stößel verwenden, wird empfohlen, bis zu 25 Schläge durchzuführen. - Das Homogenat in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben und 1 Volumen eiskalten Homogenisierungspuffer hinzufügen.
- Zentrifugieren Sie das Homogenat mit niedriger Geschwindigkeit, 1.500 x g für 5 min bei 4 °C, um Kerne, Zelltrümmer und ungebrochene Zellen zu pelletieren.
- Überführen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette oder einer P5000-Spitze auf ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen, wobei darauf zu achten ist, dass das Pellet nicht gestört wird.
- Zentrifuge bei 4.000 x g für 5 min bei 4 °C.
- Den Überstand in ein Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen überführen und bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren, um die rohe Mitochondrienfraktion zu pelletieren.
- Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das rohe mitochondriale Pellet vorsichtig in 20-30 ml eiskaltem Homogenisierungspuffer durch sanftes Pipettieren mit einer P5000-Spitze.
- Die Suspension wird in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 4.000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert, um die verbleibenden Zelltrümmer zu pelletieren.
- Den Überstand in ein Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen überführen und bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren, um die rohe Mitochondrienfraktion zu pelletieren.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das rohe mitochondriale Pellet vorsichtig in einem kleinen Volumen (typischerweise 1000 μL) eiskaltem REM-Puffer durch sanftes Pipettieren mit einer P1000-Spitze. Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des REM-Puffers.
HINWEIS: Obwohl diese rohe mitochondriale Fraktion in einigen Anwendungen direkt verwendet werden kann, z. B. in Organello-Protein-Import-Assays, enthält sie erhebliche Mengen anderer zellulärer Komponenten. Diese Kontaminationen können zu Fehlinterpretationen der Ergebnisse bei der Bestimmung der submitochondrialen Lokalisation eines Proteins führen. Daher sind weitere Reinigungsschritte erforderlich, um eine hochreine mitochondriale Zubereitung zu erhalten, wie unten beschrieben. - Saccharoselösungen im EM-Puffer in Konzentrationen von 60%, 32%, 23% und 15% (w/v) herstellen. Diese Lösungen sind bis zu 1 Monat bei 4 °C stabil. Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des EM-Puffers.
- Bereiten Sie einen 4-stufigen Saccharosegradienten in einem Ultrazentrifugenröhrchen wie folgt vor: Geben Sie 1,5 ml 60% (w/v) Saccharose auf den Boden des Zentrifugenröhrchens. Als nächstes vorsichtig schrittweise pipettieren: 4 ml von 32%, 1,5 ml von 23% und 1,5 ml von 15% Saccharose (w / v). Achten Sie darauf, die Phasen nicht zu stören.
- Laden Sie vorsichtig die rohe mitochondriale Fraktion auf den Saccharosegradienten.
- Zentrifuge für 1 h bei 134.000 x g bei 4 °C in einem schwingenden Schaufelrotor.
- Entfernen Sie die Saccharoselösung vorsichtig, bis die hochgereinigte Mitochondrienfraktion erreicht ist, die durch ein braunes Band an der 60% / 32% Saccharose-Grenzfläche dargestellt wird.
- Gewinnen Sie die gereinigten Mitochondrien mit einer P1000-Schnittspitze zurück und legen Sie sie in ein vorgekühltes Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenrohr.
- Verdünnen Sie die wiederhergestellten Mitochondrien mit 5-10 Volumen eiskaltem REM-Puffer.
- Zentrifuge für 30 min bei 12.000 x g bei 4 °C.
- Resuspendieren Sie die reinen Mitochondrien in 500 μL eiskaltem REM-Puffer durch sanftes Pipettieren mit einer P1000-Schnittspitze.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des hochgereinigten mitochondrialen Präparats mit dem Bradford-Verfahren nach den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie die Proteinkonzentration mit eiskaltem REM-Puffer auf 10 mg Protein/ml ein.
HINWEIS: Für das unten beschriebene submitochondriale Fraktionierungsprotokoll wird empfohlen, frisch zubereitete Mitochondrien zu verwenden. Vögtle und seine Mitarbeiter führten jedoch eine detaillierte Qualitätskontrollanalyse der mitochondrialen Unversehrtheit durch und zeigten, dass gefrorene Organellen auch in diesem Protokoll verwendet werden können13. Machen Sie dazu Aliquots von 40 μL und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein. Bei -80 °C lagern.
3. Submitochondriales Fraktionierungsprotokoll
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Referenz18 adaptiert und besteht aus zwei Schritten: (1) hypotonische Schwellung in Gegenwart oder Abwesenheit von Proteinase K und (2) Beschallung, gefolgt von einer Karbonatextraktion. Führen Sie alle Schritte beider Protokolle auf Eis oder bei 4 ° C durch, um den Proteinabbau zu vermeiden.
- Hypotonische Schwellung in Gegenwart von Proteinase K
- Transfer von 40 μL hochreinen Mitochondrien bei 10 mg/ml (400 μg) in vier 1,5 ml vorgekühlte markierte Mikrozentrifugenröhrchen.
- 360 μL REM-Puffer in die Röhrchen 1 und 2 geben.
- 360 μL EM-Puffer in die Röhrchen 3 und 4 geben.
- 4 μL Proteinase K (10 mg/ml) werden in die Röhrchen 2 und 4 gegeben. Verwenden Sie das in Tabelle 2 aufgeführte Pipettierschema, um Fehler zu vermeiden.
HINWEIS: Bereiten Sie unmittelbar vor Gebrauch eine 10 mg/ml-Lösung der Proteinase K in Wasser vor. Die Endkonzentration der Proteinase K im Experiment sollte bei etwa 50-100 μg/ml liegen. Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Diskussion . - Mischen Sie alle Röhrchen vorsichtig und inkubieren Sie auf Eis für 30 min mit gelegentlichem Mischen.
- Fügen Sie 4 μL 200 mM PMSF zu allen vier Röhrchen hinzu, um die Proteinase-K-Aktivität zu stoppen.
VORSICHT: PMSF ist hochgiftig. Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie mit Lösungen arbeiten, die PMSF enthalten. - Zentrifuge bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C.
- Sammeln Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein neues 1,5 ml vorgekühltes markiertes Mikrozentrifugenröhrchen. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
HINWEIS: Das Pellet kann direkt im Probenpuffer für weitere SDS-PAGE- und Western-Blot-Analysen resuspendiert werden. Spuren von Proteinase K können jedoch auch nach der PMSF-Behandlung aktiv bleiben und schließlich einige Proteine verdauen, nachdem das Pellet im SDS-haltigen Probenpuffer gelöst wurde. Um dieses Problem zu vermeiden, könnte die Proteinase K durch die Behandlung der Proben mit Trichloressigsäure (TCA) wie unten beschrieben vollständig inaktiviert werden.
VORSICHT: TCA ist hochgiftig. Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie mit Lösungen arbeiten, die TCA enthalten. - Resuspendieren Sie das Pellet aus Schritt 3.1.8 in 400 μL eiskaltem REM-Puffer.
- Den Überstand (ab Schritt 3.1.8) und das resuspendierte Pellet (ab Schritt 3.1.9) mit TCA auf eine Endkonzentration von 10 % (w/v) auszubringen.
- Alle Röhrchen 10 Minuten auf Eis inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die TCA-behandelten Proben für 10 min bei 12.000 x g bei 4 °C.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Pellet in 200 μL Probenpuffer.
HINWEIS: Es ist möglich, dass der Bromphenolblau-pH-Indikator aufgrund der Säurebehandlung gelb wird. Wenn dies geschieht, fügen Sie kleine Aliquots (1-5 μL) von 1 M Tris Base hinzu, bis sie blau wird. - Fügen Sie 4 μL 200 mM PMSF zu allen Röhrchen hinzu.
- Alle Proben bis zur weiteren Analyse durch SDS-PAGE und Western Blot bei -80 °C lagern.
- Beschallung und Karbonatextraktion
HINWEIS: In diesem Protokoll ist es nicht notwendig, frisch zubereitete Mitochondrien zu verwenden, sobald die Beschallung den Bruch der mitochondrialen Membranen verursacht.- Übertragen Sie 200 μL hochgereinigte Mitochondrien mit 10 mg/ml (2 mg Protein) in ein 1,5 ml vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen.
- Verdünnen Sie die Mitochondrien einfach mit eiskaltem REM-Puffer.
- Beschallung der Mitochondrien für 3 x 30 s auf Eis. Verwenden Sie einen Ultraschallgerät, das für kleine Volumina kompatibel ist.
- Zentrifugieren Sie die Probe für 30 min bei 100.000 x g bei 4 °C.
- Sammeln Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein neues 1,5 ml vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie es auf Eis. Diese Probe wird als lösliche Proteinfraktion (S) bezeichnet.
- Resuspendieren Sie das Pellet aus Schritt 3.2.4 in 400 μL eiskaltem REM-Puffer.
- Nehmen Sie 100 μL des resuspendierten Pellets aus Schritt 3.2.6 und geben Sie es in ein neues 1,5 ml vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie es auf Eis. Diese Probe wird als Submitochondriale Partikelfraktion (SMP) bezeichnet.
- Die restlichen 300 μL aus Schritt 3.2.6 werden einfach mit frisch zubereitetem 200 mM Natriumcarbonat verdünnt.
- Die Probe aus Schritt 3.2.8 wird 30 min auf Eis inkubiert.
- Zentrifugieren Sie die Probe für 30 min bei 100.000 x g bei 4 °C.
- Sammeln Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein neues 1,5 ml vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie es auf Eis. Diese Probe wird als Carbonat-Überstandsfraktion (CS) bezeichnet.
- Resuspendieren Sie das Pellet aus Schritt 3.2.10 in 400 μL eiskaltem REM-Puffer. Diese Probe wird als Carbonate Precipitated Fraction (CP) bezeichnet.
- Alle Proben (S, SMP, CS und CP) mit TCA auf eine Endkonzentration von 10% (w/v) niederschlagen.
- Alle Röhrchen 10 Minuten auf Eis inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die TCA-behandelten Proben für 10 min bei 12.000 x g bei 4 °C.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet im Probenpuffer. Wenn der Probenpuffer gelb wird, fügen Sie kleine Aliquots (1-5 μL) von 1 M Tris Base hinzu, bis er blau wird.
- Geben Sie 1 μL 200 mM PMSF zu allen Röhrchen hinzu.
- Alle Proben bis zur weiteren Analyse durch SDS-PAGE und Western Blot bei -80 °C lagern.
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Representative Results
Der Erfolg des submitochondrialen Fraktionierungsprotokolls hängt von der Gewinnung hochgereinigter intakter Mitochondrien ab. Dazu ist es wichtig, dass während der Hefezelllyse die Unversehrtheit der Organellen nahezu vollständig erhalten bleibt. Dies wird durch die Verwendung eines Zelllyseprotokolls erreicht, das den enzymatischen Aufschluss der Zellwand mit anschließender physikalischer Störung der Plasmamembran unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators kombiniert. Die mitochondrialen Inhalte werden dann durch differentielle Zentrifugation gesammelt. Diese subzelluläre Fraktionierung ergibt eine angereicherte mitochondriale Fraktion, was durch das Vorhandensein hoher Porinspiegel (Por1), eines mitochondrialen Markerproteins, bestätigt wird (Abbildung 1, Bahn 2). Dies ist jedoch eine rohe Mitochondrienfraktion, die erhebliche Mengen anderer zellulärer Kompartimente enthält, einschließlich endoplasmatisches Retikulum, Vakuole, Zytosol und Endosom (Abbildung 1, Bahn 2). Diese Kontaminationen können in einigen Anwendungen Artefakte einführen, z. B. bei Experimenten zur Lokalisierung von submitochondrialen Proteinen. Um die Menge dieser Kontaminationen zu verringern, wird die rohe mitochondriale Fraktion durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation weiter gereinigt. Dieser zusätzliche Reinigungsschritt erzeugt eine hochreine mitochondriale Fraktion, was durch eine signifikante Reduktion der Gehalte der Proteinmarker für andere zelluläre Kompartimente belegt wird (Abbildung 1, Bahn 3).
Um die submittochondriale Lokalisation von Proteinen zu bestimmen, werden die hochgereinigten Mitochondrien weiter in ihre Unterkompartimente fraktioniert (Abbildung 2A). Dieses Protokoll beinhaltet die Umwandlung von Mitochondrien in Mitoplasten durch hypotonen osmotischen Schock. Bei diesem Prozess werden intakte Mitochondrien in einem hypoosmotischen Puffer inkubiert, was zu einer Schwellung der Organelle führt. Während der Schwellung wird die äußere mitochondriale Membran selektiv durch osmotische Unausgewogenheit gerissen und der Gehalt an Intermembranraumproteinen wird in den Überstand freigesetzt. Alle diese Verfahren werden in Gegenwart oder Abwesenheit von Proteinase K durchgeführt. Als Folge der äußeren Membranstörung erhält die Protease Zugang zum Intermembranraumproteingehalt und fördert den Abbau der entsprechenden Proteine. Im Gegensatz dazu bleibt der Proteingehalt der mitochondrialen Matrix aufgrund der Integrität der inneren Mitochondrialenmembran vor einem Angriff der Protease geschützt. Nach diesen Behandlungen wird der Proteingehalt der verschiedenen Proben durch SDS-PAGE- und Western-Blot-Analysen bewertet.
Die effiziente Umwandlung von Mitochondrien in Mitoplasten durch osmotischen Schock (Schwellung) kann auf zwei Arten überwacht werden: (1) Verschwinden des löslichen Intermembran-Raummarkerproteins (z. B. Cytochrom Cyt. b2) in der Pelletfraktion von Mitoplasten mit ihrem gleichzeitigen Auftreten in der überstehenden Fraktion (Abbildung 2B, Vergleichsspur 3 mit Bahn 7); (2) selektiver Abbau des inneren Membranmarkerproteins, das dem Intermembranraum zugewandt ist (z. B. ScoI), durch Proteinase K nur in Mitoplasten (Abbildung 2B, Spur 4). Darüber hinaus ist der Schutz der Marker Cyt. b2 und ScoI gegen den Proteinase-K-Abbau in der Pelletfraktion aus Mitochondrien werden verwendet, um die Integrität der äußeren mitochondrialen Membran zu bestätigen (Abbildung 2B, Bahn 2). Andererseits wird die Integrität der inneren mitochondrialen Membran durch den Schutz des matrixlöslichen Proteinmarkers α-KGD gegen den Abbau von Proteinase K bestätigt (Abbildung 2B, Bahn 4). Um die submitochondriale Lokalisation eines Proteins von Interesse zu bestimmen, vergleichen Sie einfach sein Western-Blot-Profil mit den Profilen dieser Standards mit bekannter Lokalisation.
Im Falle des in Abbildung 2B (Prx1) dargestellten Proteins ist sein Western-Blot-Profil ein Hinweis auf ein Protein mit doppelter mitochondrialer Lokalisation: Intermembranraum und Matrix. Auf den ersten Blick ähnelt sein Fraktionierungsprofil α-KGD, was auf eine Matrixlokalisierung hinweist. Seine Anwesenheit im Überstand von Mitoplasten deutet jedoch auch auf eine Intermembranraumlokalisierung hin. Die oben beschriebenen Fraktionierungsprofile von Proteinmarkern eliminieren die möglichen Artefakte, die mit der Integrität der mitochondrialen Zubereitung verbunden sind, und bestätigen die doppelte Lokalisation von Prx119.
Um die Topologie von Proteinen auf mitochondrialen Membranen zu untersuchen, werden Mitochondrien zwei zusätzlichen Behandlungen unterzogen: Beschallung und Karbonatextraktion (Abbildung 3A). Während bei der Beschallung nur lösliche Proteine in die überstehende Fraktion13 freigesetzt werden, löst die alkalische Extraktion mit Natriumcarbonat zusätzlich peripher membranassoziierte Proteine13,20. Bei beiden Behandlungen verbleiben integrale Membranproteine in der Pelletfraktion13. Diese Annahmen werden durch die Western-Blot-Analyse der Pellet- und Überstandsfraktionen aus beiden Behandlungen bestätigt (Abbildung 3B). Es wird erwartet, dass ein integrales mitochondriales Membranprotein (z. B. Porin Por1) auch nach der Alkalibehandlung mit Natriumcarbonat vollständig in der Pelletfraktion gefunden wird (Abbildung 3B, Bahnen 3 und 5). Andererseits wird erwartet, dass ein lösliches Matrixprotein (z. B. α-KGD) in beiden Behandlungen vollständig gelöst ist (Abbildung 3B, Bahnen 2 und 4). Die signifikante Retention von α-KGD im Pellet aus der Beschallung (Abbildung 3B, Bahn 3, SMP-Fraktion) könnte auf geringfügige Schwankungen der Beschallungsparameter zurückzuführen sein, die die Bildung der sogenannten submitochondrialen Partikel beeinflussen können, die durch Ultrazentrifugation effizient sedimentiert werden. Das Verhalten dieser Proteine mit bekannten Löslichkeitsprofilen wird dann verwendet, um die mitochondriale Löslichkeit eines interessierenden Proteins zu bestimmen. Im Fall von Prx1 deutet sein Western-Blot-Profil auf ein Protein hin, das mit der Membranperipherie assoziiert ist, und die alkalische Behandlung induziert seine Solubilisierung (Abbildung 3B, Spur 4).
Abbildung 1: Isolierung hochgereinigter Mitochondrien. Western-Blot-Analyse der gesamten Lysatfraktion (Bahn 1), einer rohen mitochondrialen Fraktion (Bahn 2) und einer hochreinen mitochondrialen Fraktion (Bahn 3). Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE auf einem 12% igen Polyacrylamidgel getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit Antikörpern gegen Marker für verschiedene zelluläre Kompartimente untersucht, wie auf der rechten Seite des Gels beschrieben. Diese Zahl wurde gegenüber Referenz19 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Submitochondriales Fraktionierungsprotokoll durch hypotonische Schwellung in Gegenwart von Proteinase K. (A) Schematische Darstellung des submitochondrialen Fraktionierungsprotokolls. Hochreine Mitochondrien werden separat isotonischen oder hypotonischen Behandlungen (Schwellung) in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (-) der Proteinase K unterzogen. Nach der Behandlung wird die Aktivität der Proteinase K durch die Zugabe von PMSF gehemmt, und Mitochondrien und Mitoplasten werden durch Zentrifugation wiederhergestellt. Der Proteingehalt aus den resultierenden Pellet- und Überstandsfraktionen wird durch TCA ausgefällt und dann durch SDS-PAGE und Western Blot analysiert. Die Farbsphären stellen submitochondriale Proteinmarker dar für: ein lösliches Intermembranraumprotein (grün), ein inneres Membranprotein, das dem Intermembranraum zugewandt ist (rosa), und ein lösliches Matrixprotein (hellblau). (B) Western-Blot-Analyse von Pellet- und Überstandsfraktionen aus dem Submitochondrialfraktionierungsprotokoll. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE auf einem 12% igen Polyacrylamidgel getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit Antikörpern gegen Marker für unterschiedliche submitochondriale Kompartimente untersucht, wie in A dargestellt. Weitere Informationen finden Sie im Text. Diese Zahl wurde von 19 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Submitochondriales Fraktionierungsprotokoll durch Beschallung und Karbonatextraktion. (A) Schematische Darstellung des Protokolls, das zur Bestimmung der Löslichkeit und Membrantopologie mitochondrialer Proteine verwendet wird. Mitochondrien werden zunächst beschallt und zentrifugiert, was zu einer löslichen Proteinfraktion (S) und dem kompartimentierten membranösen Produkt führt, das als submitochondriales Partikel (SMP) bezeichnet wird. Das Pellet aus dem Ultraschallschritt wird anschließend einer alkalischen Behandlung mit Natriumcarbonat (Na2CO3) unterzogen und zentrifugiert, wodurch Karbonatüberstand (CS) und Carbonat-ausgefällte Fraktionen (CP) entstehen. (B) Western-Blot-Analyse von Pellet- und Überstandsfraktionen aus dem Ultraschall- und Karbonatextraktionsprotokoll. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE auf einem 12% igen Polyacrylamidgel getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit Antikörpern gegen Proteinmarker untersucht, die unterschiedliche Löslichkeitsgrade aufweisen. Weitere Informationen finden Sie im Text. Diese Zahl wurde von 19 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Lösung | Komponenten | Kommentare | |
| YPD mittel | 1% (w/v) Hefeextrakt, 2% (w/v) Pepton, 2% (w/v) Glucose | 10 g Bacto-Hefe-Extrakt, 20 g Bacto Pepton und 20 g Glucose in 900 m destilliertem Wasser auflösen. Bis zu 1000 ml auffüllen und autoklavieren. | |
| YPGal mittel | 1% (w/v) Hefeextrakt, 2% (w/v) Pepton, 2% (w/v) Galaktose | 10 g Bacto Hefeextrakt, 20 g Bacto Pepton und 20 g Galactose werden in 900 m destilliertem Wasser gelöst. Bis zu 1000 ml auffüllen und autoklavieren. | |
| DTT-Puffer | 100 mM Tris-H2SO4 (pH 9,4), 10 mM Dithiothreitol (DTT) | Um 15 ml herzustellen: Mischen Sie 1,5 ml 1 M Tris-H2SO4, pH 9,4 mit 150 μL 1M DTT vorgewärmt bei 30 ° C. Volumen bis 15 ml mit ddH2O Vor Gebrauch frisch zubereiten |
|
| Zymolyase-Puffer | 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4), 1,2 M Sorbit | Um 100 ml herzustellen: Mischen Sie 2 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) mit 60 ml 2 M Sorbit Volumen bis 15 ml mit ddH2O Das Pulver (3 mg pro Gramm Nassgewicht) von Zymolyase-20T aus Arthrobacter luteus (MP Biomedicals, Irvine, CA) kurz vor Gebrauch im Puffer auflösen |
|
| Homogenisierungspuffer | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,6 M Sorbit, 1 mM EDTA, 0,2% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) | Um 250 ml herzustellen: Mischen Sie 2,5 ml 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) mit 75 ml 2 M Sorbitol, 500 μL 500 mM EDTA und 0,5 g BSA (im Wesentlichen fettsäurefrei) Volumen bis 250 ml mit ddH2O Vorkühlen bei 4°C Fügen Sie PMSF und BSA kurz vor der Verwendung im Puffer hinzu |
|
| REM-Puffer | 10 mM MOPS-KOH (pH 7,2), 250 mM Saccharose, 1 mM EDTA | Um 250 ml herzustellen: Mischen Sie 2,5 ml 1 M MOPS-KOH-Puffer (pH 7,2) mit 31,25 ml 2 M Saccharose und 500 μL 500 mM EDTA Volumen bis 250 ml mit ddH2O Kurz vor Gebrauch bei 4°C vorkühlen. |
|
| EM-Puffer | 10 mM MOPS-KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA | Um 250 ml herzustellen: Mischen Sie 2,5 ml 1 M MOPS-KOH-Puffer (pH 7,2) mit 500 μL 500 mM EDTA Volumen bis 250 ml mit ddH2O Kurz vor Gebrauch bei 4°C vorkühlen |
|
| Probenpuffer | 2% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM DTT, 10% (v/v) Glycerin, 0,02% Bromphenol blau, 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), |
||
Tabelle 1: Medien, Lösungen und Puffer.
| Reagenz | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| Mitochondrien (10 mg/ml) | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | |
| REM-Puffer | 360 μL | 360 μL | - | - | |
| EM-Puffer | - | - | 360 μL | 360 μL | |
| Proteinase K (10 mg/ml) | - | 4 μL | - | 4 μL | |
Tabelle 2: Pipettierschema zur Durchführung hypotonischer Schwellungen.
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Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll wird seit langem erfolgreich eingesetzt und kontinuierlich optimiert, um die Proteinlokalisation in den submitochondrialen Kompartimenten zu bestimmen13,14,18,21,22,23. Die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit dieses Protokolls hängen stark von der Reinheit und Integrität der mitochondrialen Präparate ab18. Beide Anforderungen werden durch Hinzufügen eines zusätzlichen Reinigungsschritts (Saccharosedichtegradientenzentrifugation) zu rohen mitochondrialen Präparaten erreicht13,24,25 (Abbildung 1). Dieser zusätzliche Reinigungsschritt eliminiert nicht nur unerwünschte nicht-atpoondriale Verunreinigungen, sondern beseitigt auch gebrochene Mitochondrien und Mitoplasten, die durch die zahlreichen physikalischen Manipulationen der Probe während des Protokolls entstehen können18. So erzeugt dieser Saccharosegradientenreinigungsschritt trotz der Verlängerung der Verfahrensdauer hochgereinigte intakte Mitochondrien, die als wesentlich für den Erfolg des submitochondrialen Fraktionierungsprotokolls angesehen werden18,22.
Vögtle und Mitarbeiter berichteten, dass gefrorene Organellen (bei -80 °C) auch erfolgreich zur submitochondrialen Fraktionierung eingesetzt werden könnten13; Wir empfehlen jedoch die Verwendung von frischem mitochondrialem Präparat. Unabhängig von der Wahl kann die Unversehrtheit der gereinigten Mitochondrien bestätigt werden, indem die Empfindlichkeit von Intermembranraumproteinen gegen extern hinzugefügte Proteinase K überprüft wird. Wenn die Organellen intakt sind, können Proteine dieses Kompartiments wie Cyt. b2 und Sco1 sollten aufgrund der von der äußeren Membran bereitgestellten Barriere vor proteolytischem Abbau geschützt bleiben (Abbildung 2B, Spur 2). Im Gegensatz dazu, wenn die Organellen in einem hypoosmotischen Puffer inkubiert werden, macht der Bruch der äußeren Membran aufgrund eines osmotischen Schocks (Schwellung) diese Proteine anfällig für den Proteaseabbau (Abbildung 2B, Spur 4). Andererseits sollten die im Matrixkompartiment vorhandenen Proteine, wie α-KGD, aufgrund der Integrität der inneren Membran sowohl in Mitochondrien als auch in Mitoplasten vor dem Abbau geschützt bleiben (Abbildung 2B, Lanes 2 und 4). So können die Profile dieser gut untersuchten mitochondrialen Markerproteine entweder zur Beurteilung der Integrität mitochondrialer Präparate oder des Erfolgs des Fraktionierungsprotokolls verwendet werden. Darüber hinaus erhält man die submitochondriale Lokalisation eines interessierenden Proteins einfach durch Vergleich seines Fraktionierungsprofils mit denen der Markerproteine18,22 (Abbildung 2B). Wichtig ist, wenn die mitochondrialen Markerproteine ein Verhalten zeigen, das sich von dem oben beschriebenen unterscheidet, ist die Integrität der Organellen wahrscheinlich beeinträchtigt und daher sollte das mitochondriale Präparat nicht für den Zweck dieses Protokolls verwendet werden.
Obwohl sich der hypotonische Schock als zuverlässige Methode zur Unterscheidung zwischen Intermembran-Raumproteinen und Matrix erwiesen hat, liefert diese Methode keine Informationen darüber, ob ein Matrixprotein löslich ist oder an die mitochondriale innere Membran gebunden ist. Diese Information kann erreicht werden, indem mitochondrien der Beschallung unterzogen werden, gefolgt von einer alkalischen Extraktion mit Natriumcarbonat (Abbildung 3). Während erwartet wird, dass lösliche Matrixproteine bei der Beschallung in die überstehende Fraktion freigesetzt werden, neigen Proteine, die mit Membranen assoziiert sind, dazu, sich im Niederschlag zu befinden13. Auf der anderen Seite löst die alkalische Extraktion mit Natriumcarbonat effizient Proteine, die peripher an Membranen gebunden sind, aber nicht integrale Membranproteine13,20. Wenn also ein Protein nach Schwellung gegen den Proteaseabbau resistent ist, aber durch Alkalibehandlung in den Überstand freigesetzt wird, handelt es sich wahrscheinlich um ein peripher angebundenes Innermembranprotein, das dem Matrixkompartiment zugewandt ist. Es ist wichtig zu bedenken, dass der Erfolg des Protease-Sensitivitätstests auffallend von der Empfindlichkeit des interessierenden Proteins gegen die für die Verdauung verwendete Protease abhängt. Einige mitochondriale Proteine scheinen bei der Standardproteinase-K-Konzentration (0,1 mg/ml), die üblicherweise in Subfraktionierungsprotokollen verwendet wird, resistent gegen den proteolytischen Abbau zu sein (Abbildung 2B, Spur 8)19. Die Verdoppelung der Proteinase-K-Konzentration (0,2 mg/ml) scheint ausreichend zu sein, um einen vollständigen proteolytischen Abbau zu ermöglichen. Denken Sie jedoch daran, dass höhere Konzentrationen von Protease die äußere mitochondriale Membran destabilisieren und schließlich die Wirksamkeit des Protokolls beeinträchtigen können.
Es besteht kein Zweifel, dass es zur Aufklärung der Funktion mitochondrialer Proteine unerlässlich ist, ihre submitochondriale Lokalisation zu bestimmen. In dieser Hinsicht stellt dieses Protokoll ein mächtiges Werkzeug für Forscher dar, die beginnen, Mitochondrien zu untersuchen. Obwohl sie auf Hefe gerichtet sind, könnten viele ihrer Prinzipien leicht auf andere Organismen anwendbar sein. Mit Ausnahme der mitochondrialen Reinigungsschritte ist der Rest des Protokolls den für andere Organismen berichteten sehr ähnlich26,27,28. Ein weiterer wichtiger Beitrag dieses Protokolls ist seine Anwendbarkeit bei der Untersuchung von Mutanten von S. cerevisiae, die eine veränderte mitochondriale Biogenese zeigen. Es wurde weithin berichtet, dass Hefemutanten für mitochondriale Proteinimportmaschinen eine veränderte Verteilung von mitochondrialen Proteinen zeigen5,29. Daher kann dieses Protokoll routinemäßig verwendet werden, um die Folgen für die mitochondriale Proteinverteilung zu untersuchen, die durch Mutationen verursacht werden, die die mitochondriale Biogenese verändern können. Schließlich kann das Protokoll besonders nützlich sein, um Proteine zu untersuchen, die eine duale mitochondriale Lokalisation aufweisen19,30.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Dr. A. Tzagoloff (Columbia University) für die Bereitstellung von Antikörpern gegen submitochondriale Markerproteine Cyt. b2, αKGD und Sco1. Wir danken auch Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) für hilfreiche Diskussionen und Kommentare während der Erstellung dieses Protokolls.
Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) unterstützt (Stipendium 2013/07937-8).
Fernando Gomes und Helena Turano werden auch von FAPESP unterstützt, Stipendien 2017/09443-3 bzw. 2017/23839-7. Angélica Ramos wird auch von Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
References
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