Summary
प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग-रेडियोलिगैंड उपचारित ऊतक (एफएसीएस-आरटीटी) सेलुलर पैमाने पर अल्जाइमर रोग में 18 केडीए ट्रांसलोकेटर प्रोटीन या सेरोटोनिन 5 एचटी2 ए-रिसेप्टर अभिव्यक्ति की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह प्रोटोकॉल टीजीएफ 344-एडी चूहे मॉडल में एफएसीएस-आरटीटी के पूर्व-विवो आवेदन का वर्णन करता है।
Abstract
ग्लियल कोशिकाओं में संभवतः न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के पैथोफिजियोलॉजी में काफी निहितार्थ होता है, जैसे कि अल्जाइमर रोग (एडी)। उनके परिवर्तन शायद एक समर्थक भड़काऊ राज्य से जुड़े हुए हैं। टीजीएफ 344-एडी चूहे के तनाव को मानव एपीपी और मानव पीएस 1ई 9 जीन को व्यक्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो अमाइलॉइड प्रोटीन ए -40 और ए -42 के लिए एन्कोडिंग है और उम्र बढ़ने के साथ अमाइलॉइड विकृति और संज्ञानात्मक घाटे को प्रदर्शित करता है। टीजीएफ 344-एडी चूहे मॉडल का उपयोग इस अध्ययन में 18 केडीए ट्रांसलोकेटर प्रोटीन (टीएसपीओ, ग्लियाल सेल सक्रियण का एक मार्कर) बाध्यकारी, और 5 एचटी2 ए-रिसेप्टर (5 एचटी 2एआर) सेरोटोनिन रिसेप्टर स्तर की सेलुलर उत्पत्ति का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है जो संभवतः एडी में बाधित होते हैं। यहां प्रस्तुत तकनीक रेडियोलिगैंड ट्रीटेड टिशू (एफएसीएस-आरटीटी) के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग है, जो विवो पीईटी या एसपीईसीटी या पूर्व विवो / इन विट्रो ऑटोरेडियोग्राफी तकनीकों में पूरक एक मात्रात्मक सेल-प्रकार-विशिष्ट तकनीक है। यह साइटोमेट्री सेल सॉर्टिंग के बाद एक γ काउंटर का उपयोग करके इमेजिंग के लिए पहले इस्तेमाल किए गए एक ही रेडियोलेबल ट्रेसर को मापता है। यह उच्च सेलुलर विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ रेडियोलेबल प्रोटीन की सेलुलर उत्पत्ति का निर्धारण करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, एफएसीएस-आरटीटी के साथ अध्ययन से पता चला है कि (i) टीएसपीओ बाइंडिंग में वृद्धि लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) -प्रेरित न्यूरोइन्फ्लेमेशन के चूहे मॉडल में माइक्रोग्लिया से जुड़ी हुई थी, (ii) 12- और 18-महीनों में टीएसपीओ बाइंडिंग में वृद्धि पहले एस्ट्रोसाइट्स से जुड़ी हुई थी, और फिर जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों की तुलना में टीजीएफ 344-एडी चूहों में माइक्रोग्लिया, और (iii) 5 एचटी2 ए के स्ट्रिएटल घनत्व एक ही चूहे एडी मॉडल में 18 महीने में एस्ट्रोसाइट्स में आर कम हो जाता है। दिलचस्प बात यह है कि इस तकनीक को लगभग सभी रेडियोट्रेसर्स तक बढ़ाया जा सकता है।
Introduction
न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, जैसे अल्जाइमर रोग (एडी), बढ़े हुए लक्षणों से जुड़े न्यूरोनल नुकसान की विशेषता है। एडी, मनोभ्रंश का सबसे आम कारण, 60% -70% मामलों में लेखांकन, दुनिया भर में लगभग 50 मिलियन लोगों को प्रभावित करताहै 1. एक न्यूरोपैथोलॉजिकल स्तर पर, एडी की दो प्रमुख विशेषताएं बाह्य अमाइलॉइड-β (ए) सजीले टुकड़े और इंट्रासेल्युलर ताऊ न्यूरोफिब्रिलरी टैंगल्स का संचय हैं। ग्लियल सेल परिवर्तन भी एडी2 और कई न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम 3,4 के संभावित व्यवधान के साथ जुड़े हुए हैं।
टीजीएफ 344-एडी चूहा लाइन को मानव एपीपी और पीएस 1ई 9 ट्रांसजेनेस को व्यक्त करके एडी मॉडल करने के लिए संशोधित किया गया है, जिससे घुलनशील और अघुलनशील ए -40 और ए -42 अभिव्यक्ति और अमाइलॉइड पट्टिका गठन5 हो जाता है। यह ताऊ प्रोटीन के हाइपरफॉस्फोरिलेटेड रूपों के संचय को भी प्रस्तुत करता है जो टौपैथी के लिए अग्रणी है। 9-24 महीने की उम्र से, चूहों ने उत्तरोत्तर एडी के पैथोलॉजिकल हॉलमार्क और एक संज्ञानात्मक हानि 5,6,7,8,9 विकसित की।
पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), एकल-फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (एसपीईसीटी), और ऑटोरेडियोग्राफी γ किरणों के उत्सर्जन और मात्रा का ठहराव के आधार पर तकनीकें हैं। रेडियोट्रेसर या तो विवो (पीईटी और एसपीईसीटी) या पूर्व विवो / इन विट्रो (ऑटोरेडियोग्राफी) में मात्रा निर्धारित किए जाते हैं। उन संवेदनशील तकनीकों ने एडी जैसे कई मस्तिष्क रोगों के तंत्र की समझ में योगदान दिया है। दरअसल, न्यूरोइन्फ्लेमेशन के संदर्भ में, 18 केडीए ट्रांसलोकेटर प्रोटीन (टीएसपीओ) का आकलन करने वाले बहुत सारे अध्ययन हैं, जो एक इन विवो न्यूरोइन्फ्लेमेशन मार्कर है, जिसमें रेडियोलेबल ट्रेसर्स जैसे [11सी] - (आर) -पीके 111 9 5 या [11सी] पीबीआर 28 (समीक्षा के लिए10 देखें)। इसके अलावा, न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम के परिवर्तन ों का अध्ययन रेडियोट्रेसर 11,12,13 का उपयोग करके किया गया है।
हालांकि, वे तकनीकें रेडियोधर्मी संकेत की सेलुलर उत्पत्ति को निर्धारित नहीं करती हैं। यह पीईटी / एसपीईसीटी में रेडियोलिगैंड के बंधन में परिवर्तन के जैविक आधार की व्याख्या में बाधा डाल सकता है। उदाहरण के लिए, न्यूरोइन्फ्लेमेशन के टीएसपीओ अध्ययनों के मामले में, यह समझना कि क्या टीएसपीओ की वृद्धि या कमी एस्ट्रोसाइटिक या माइक्रोग्लियल परिवर्तनों के कारण है, सर्वोपरि महत्व का है। रेडियोलिगैंड उपचारित ऊतक (एफएसीएस-आरटीटी) तकनीक के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग इन समस्याओं को प्राप्त करने के लिए विकसित की गई थी, जिससे प्रत्येक सेल प्रकार में रेडियोलिगैंड बाइंडिंग का मूल्यांकन अलग से किया जा सकता है और प्रति सेल लक्ष्य-प्रोटीन घनत्व का ठहराव होता है। यह अभिनव तकनीक परिणामस्वरूप पूरक और पीईटी और स्पेक्ट इमेजिंग के साथ अत्यधिक संगत है।
यहां, इस तकनीक को दो अक्षों के साथ लागू किया गया था: टीएसपीओ-विशिष्ट रेडियोलिगैंड्स का उपयोग करके न्यूरोइन्फ्लेमेशन का अध्ययन और सेरोटोनर्जिक सिस्टम का आकलन करना। पहली धुरी पर, उद्देश्य एक तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया के जवाब में टीएसपीओ सिग्नल की सेलुलर उत्पत्ति को समझना था। इसलिए, एफएसीएस-आरटीटी का उपयोग चूहों के मस्तिष्क के ऊतकों पर एक लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) इंजेक्शन के माध्यम से न्यूरोइन्फ्लेमेशन के प्रेरण के बाद और विवो [125आई] क्लिंडे स्पेक्ट इमेजिंग अध्ययन के बाद किया गया था। इसके अलावा, एक ही इमेजिंग और एफएसीएस-आरटीटी प्रोटोकॉल 12- और 24 महीने के टीजीएफ 344-एडी चूहों और जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों से मेल खाने पर लागू किए गए थे। दूसरी धुरी का उद्देश्य सेल प्रकार द्वारा पूर्व विवो 5-एचटी 2 ए आर घनत्व मूल्यांकन के माध्यम से इस चूहे मॉडल में सेरोटोनिनर्जिक सिस्टमपरिवर्तनोंकी उत्पत्ति निर्धारित करना है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को जिनेवा के कैंटन के मानव और पशु प्रयोग के लिए नैतिकता समिति, अनुसंधान नैतिकता के लिए कैंटोनल कमीशन (सीसीईआर), और जिनेवा (स्विट्जरलैंड) के कैंटन के स्वास्थ्य की सामान्य दिशा के साथ समझौते में आयोजित किया गया था। पशु अनुसंधान के बाद डेटा की सूचना दी जाती है: इन-विवो प्रयोगों (आगमन) दिशानिर्देशों की रिपोर्टिंग।
1. स्पेक्ट कैमरा तैयारी और अंशांकन
- कैमरे को चालू करें, ऑपरेटिंग सॉफ़्टवेयर लोड करें ( सामग्री की तालिका देखें)। होमिंग करने के लिए होम एक्सवाईजेड स्टेज बटन पर क्लिक करें।
- एक 10 मिनट स्कैन अधिग्रहण से बना प्रयोग सेट करें। चरण मोड को ठीक करने के लिए सेट करें और अधिग्रहण मोड लिस्टमोड (पूरे उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को रिकॉर्ड करने के लिए)।
- बिस्तर सेट करें और सुनिश्चित करें कि वार्मिंग सिस्टम, श्वास सेंसर और संज्ञाहरण कार्यात्मक और सुरक्षित हैं (चित्रा 1 ए-डी)। फिर, एक प्रेत रखें (यानी, 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 125आई की ज्ञात एकाग्रता के 2 एमएल) जहां जानवर का सिर तैनात किया जाएगा (क्षेत्र पर केंद्रित, चित्रा 1 ई)।
- स्क्रीन के निचले हिस्से में तीन छवियों की मदद से तीन आयामों के लिए कर्सर को स्लाइड करके स्कैन क्षेत्र सेट करें। सुनिश्चित करें कि प्रेत और जानवर की स्कैन मात्रा समान है।
- चरण 1.2-1.4 में स्थापित मापदंडों के साथ बाद के अंशांकन के लिए प्रेत स्कैन शुरू करें।
2. स्पेक्ट इमेजिंग के लिए कार्यक्षेत्र सेटअप
- कीटाणुनाशक विरुसाइड के साथ कार्यक्षेत्र को साफ करें और सभी सतहों पर नरम कागजात रखें।
- सुनिश्चित करें कि उनके संबंधित टैंकों में पर्याप्त आइसोफ्लुरेन और ऑक्सीजन है।
- चूहे पूंछ नस का एक स्पष्ट दृश्य है करने के लिए तितली कैथेटर के पंखों को काटकर एक 24 जी कैथेटर तैयार करें।
- सुई को हटाने के बाद हेपरिन समाधान (25000 यू / एमएल) के साथ इसे पूरी तरह से भरकर कैथेटर को कोट करें। फिर, कैथेटर सम्मिलन के बाद रक्त के थक्के के गठन से बचने के लिए सुई को इसमें वापस रखें।
3. [125मैं] क्लिंडे रेडियोट्रेसर संश्लेषण
चेतावनी: रेडियोधर्मिता में जीवित कोशिकाओं के परमाणुओं को प्रभावित करने और उनकी आनुवंशिक सामग्री (डीएनए) को नुकसान पहुंचाने के लिए पर्याप्त आयनकारी ऊर्जा हो सकती है।
- एक उपयुक्त वातावरण में काम करना सुनिश्चित करें, रेडियोधर्मिता से जुड़े प्रयोगों के लिए अधिकृत।
नोट: उंगली और शरीर के डॉसिमीटर सहित रेडियोधर्मिता हैंडलिंग के लिए उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें। रेडियोधर्मिता के किसी भी स्रोत से सुरक्षित दूरी पर रहने की कोशिश करें। - सोडियम आयोडाइड (ना125आई) ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ एसिटिक एसिड के 100 μL में ट्राइब्यूटिलिन अग्रदूत के 100 μg सेते हैं और एक दस्ताने बॉक्स में स्थित थर्मोसाइकिलर में 20 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर 37% पेरासिटिक एसिड के 5 μL।
- 500 μL की मात्रा तक पहुंचने के लिए पानी में 50% एसिटोनिट्राइल (एसीएन) का उपयोग करके प्रतिक्रिया को पतला करें। एक रिवर्स-चरण कॉलम पर पतला प्रतिक्रिया के 500 μL को इंजेक्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- 10 मिनट के लिए 7 एमएम एच3पीओ4 में 5% -95% एसीएन से चलने वाले रैखिक ढाल एचपीएलसी के साथ [125आई] क्लिंडे को अलग करें। 10 एमएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए एच2ओ में अलग-थलग पतला करें, और फिर एक एकाग्रता कॉलम पर पतला प्रतिक्रिया इंजेक्ट करें (सामग्री की तालिका देखें)।
- पूर्ण इथेनॉल के 300 μL के साथ कॉलम से [125मैं] क्लिंडे को एल्यूट करें, और फिर 40 मिनट के लिए आरटी पर वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज में इसे इनक्यूबेट करके इथेनॉल को वाष्पित करें।
- एक स्टॉक समाधान बनाने के लिए बाँझ खारा के 300 μL में [125मैं] CLINDE युक्त अवशेषों को पतला करें।
- इसकी रेडियोधर्मिता को मापने के बाद, 500 μL में 0.037 MBq का समाधान प्राप्त करने के लिए बाँझ खारा में स्टॉक समाधान पतला।
- एचपीएलसी (उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी) द्वारा अनुरेखक को शुद्ध करें। 450 एनएम पर एक मानक अंशांकन का उपयोग करके क्षालन समय निर्धारित करें, और एकल रेडियोधर्मी चोटी को अलग करें। ठंड (गैर-रेडियोधर्मी) क्लिंडे (0.1 μg, 0.5 μg, 0.75 μg, 1 μg, 1.5 μg, 2 μg, और 5μg में 50% एसीएन के समाधान के 400 μL) के सात मानक सांद्रता का उपयोग करके मानक अंशांकन वक्र का प्रदर्शन करें। रेडियो टीएलसी (पतली परत क्रोमैटोग्राफी) में एक ही चोटी को मापकर रेडियोकेमिकल शुद्धता स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि रेडियोकेमिकल की शुद्धता 60% से ऊपर है।
- 450 एनएम पर पराबैंगनी अवशोषण को मापने वाले रेडियोलिगेंड की विशिष्ट गतिविधि और ठंडे संदर्भ यौगिकों के साथ स्थापित अंशांकन घटता की जांच करें। सुनिश्चित करें कि विशिष्ट गतिविधि 1000 जीबीक्यू /
4. [125मैं] आर 91150 रेडियोट्रैसर संश्लेषण
नोट:: CLINDE संश्लेषण अनुभाग में उल्लिखित के रूप में एक ही सुरक्षा नियमों का पालन करने के लिए सुनिश्चित करें।
- पूर्ण इथेनॉल के 3 μL, ग्लेशियल एसिटिक एसिड के 3 μL, वाहक मुक्त ना125मैं के 15 μL ( सामग्री की तालिका देखें) (सामग्री की तालिका देखें) (10 एमसीआई) के समाधान में पूर्ण इथेनॉल के 3 μL और 30% एच2ओ2 के 3 μL के समाधान में आर 91150 अग्रदूत के 300 μg मिलाएं। एक दस्ताने बॉक्स में 30 मिनट के लिए सेते हैं।
- पूरी प्रतिक्रिया को एक रिवर्स-चरण कॉलम में इंजेक्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- मिनट की प्रवाह दर के साथ आइसोक्रेटिक एचपीएलसी रन (एसीएन / पानी 50/50, 10 एमएम एसिटिक एसिड बफर) द्वारा अलग -थलग [125आई] आर 91150।
- 10एमएल की अंतिम मात्रा के लिए एच 2 ओ में पतला [125आई] आर 91150।
- एक एकाग्रता स्तंभ पर पतला प्रतिक्रिया के 10 एमएल इंजेक्ट ( सामग्री की तालिका देखें)।
- निरपेक्ष इथेनॉल के 300 μL के साथ कॉलम से एल्यूट [125आई] आर 91150।
- 40 मिनट के लिए आरटी पर एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में इसे इनक्यूबेट करके इथेनॉल को वाष्पित करें।
- [125आई] आर 91150 युक्त अवशेषों को खारा के 300 μL में पतला करें।
- एचपीएलसी द्वारा अनुरेखक को शुद्ध करें। 450 एनएम पर एक मानक अंशांकन का उपयोग कर क्षालन समय का निर्धारण और एकल रेडियोधर्मी चोटी को अलग। रेडियो टीएलसी में एक ही चोटी को मापकर रेडियोकेमिकल शुद्धता स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि रेडियोकेमिकल की शुद्धता 98% से ऊपर है।
5. पशु तैयारी
- 3% आइसोफ्लुरेन के साथ एक प्रेरण कक्ष में टीजीएफ 344-एडी चूहे (पुरुष या महिला, 2-24 महीने की उम्र से) का वजन और एनेस्थेटाइज़ करें। एक बार गहराई से एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद, चैम्बर में आइसोफ्लुरेन प्रवाह को 2% (0.4 एल / मिनट, 100% ओ 2) तक कम करें।
- एक संज्ञाहरण नाक के साथ सुसज्जित एक पूर्व गर्म बिस्तर पर पशु की स्थिति। 2% (0.4 एल / मिनट, 100% ओ2) पर आइसोफ्लुरेन बनाए रखें।
- जानवर की आंखों में आंखों के जेल स्नेहक को लागू करें और श्वसन निगरानी के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें; यदि आवश्यक हो तो संज्ञाहरण समायोजित करें।
- पूंछ नस में 24 जी कैथेटर सम्मिलन प्रदर्शन।
6. स्पेक्ट अधिग्रहण
- 38 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 ई) के लिए सेट एक तापमान नियंत्रित हीटिंग पैड से लैस कैमरा बिस्तर के लिए पशु स्थानांतरण।
- काटने की पट्टी पर जानवर के सिर को सुरक्षित करें और सिर का समर्थन ठीक करें।
- 1 मिनट के 60 फ्रेम का गठन एक 60 मिनट स्कैन पर प्रयोग सेट अप करें। चरण 1 में सेट किए गए अन्य सभी मापदंडों का पुन: उपयोग करें। पशु स्थिति को अपडेट करने के लिए अपडेट इमेज बटन पर क्लिक करें।
- तीन आयामों के लिए स्क्रीन के निचले हिस्से में तीन छवियों की मदद से कर्सर को स्लाइड करके स्कैन क्षेत्र सेट करें।
- रेडियोधर्मी रेडियोट्रैसर ([125 आई] क्लिंडे या [125आई] आर 91150) के 500 μL इंजेक्ट करें, और फिर बाँझ 0.9% एनएसीएल के 300 μL के साथ ट्यूब को फ्लश करें। साथ ही स्कैन शुरू करने के लिए अधिग्रहण शुरू करें पर क्लिक करें।
- स्कैन समय के दौरान, श्वसन दर की निगरानी के साथ निरंतर संज्ञाहरण के तहत जानवर को बनाए रखना सुनिश्चित करें। यदि आवश्यक हो तो आइसोफ्लुरेन के प्रवाह को समायोजित करें।
- एक बार स्कैन खत्म हो जाने के बाद, जल्दी से एनेस्थेटाइज्ड जानवर को डिकैपिटेशन द्वारा euthanize करें।
7. स्कैन पुनर्निर्माण
- स्कैन पुनर्निर्माण सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें), और फिर स्कैन के फ़ोल्डर में बनाई गई [फ़ाइल नाम]पैरामीटर फ़ाइल की तलाश में डेटा सेट खोलें।
- ब्याज के आइसोटोप का चयन करें। ध्यान दें कि लिस्टमोड पैरामीटर इस चरण में कई आइसोटोप चयन की अनुमति देता है।
- निम्नलिखित मापदंडों का चयन करें: 0.4 मिमी वोक्सेल आकार, 4 (पीओएस-ईएम) सबसेट, 6 पुनरावृत्तियों (24 एमई-ईएम समकक्ष), कोई पोस्ट-फ़िल्टर नहीं, और आइसोटोप संबंधित क्षय सुधार। NIfTI करने के लिए आउटपुट स्वरूप का चयन करें, और उसके बाद SPECT पुनर्निर्माण प्रारंभ करेंका चयन करें।
8. चूहा मस्तिष्क निष्कर्षण
- स्कैनिंग प्रक्रिया के रूप में एक ही संवेदनाहारी घटना में और इसकी श्वसन दर की निगरानी करके जानवर की गहरी संज्ञाहरण स्थिति सुनिश्चित करने के बाद, गिलोटिन द्वारा विच्छेदन के लिए आगे बढ़ें और जल्दी से सिर को विच्छेदन बेंच में स्थानांतरित करें।
- कैंची से सिर के ऊपर की त्वचा को पीछे से आगे की तरफ आंखों के बीच तक ध्यान से काट लें।
- खोपड़ी और ग्रीवा कशेरुकाओं के आधार के आसपास की अतिरिक्त मांसपेशियों को काट लें।
- इसके बाद, खोपड़ी के पीछे छेद में कैंची के एक ब्लेड को ध्यान से रखें, फोरमेन मैग्नम, और सर्जिकल सरौता के साथ खोपड़ी के पीछे के हिस्से को हटा दें।
- फिर, सर्जिकल सरौता के साथ, खोपड़ी के शीर्ष भाग को ध्यान से हटा दें। पुराने नर चूहों की खोपड़ी मोटी हो सकती है, मस्तिष्क को नुकसान से बचने के लिए छोटे टुकड़ों के रूप में हटा दें।
- ध्यान से कैंची के साथ मेनिंग्स काट लें। निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान मेनिंग्स मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा सकते हैं; एहतियात के तौर पर इसे हटा दें।
- खोपड़ी के शीर्ष भाग को हटाने के बाद, जानवर के सिर को चारों ओर घुमाएं, और एक छोटे से फ्लैट स्पैटुला के साथ, ऑप्टिक और ट्राइजेमिनल नसों को काटकर मस्तिष्क को सावधानीपूर्वक बाहर खींचें।
- बर्फ पर विच्छेदन के लिए मस्तिष्क को एक सपाट, साफ कांच की सतह पर ध्यान से स्थानांतरित करें।
- मस्तिष्क के हित के क्षेत्रों को विच्छेदित करने के लिए एक फ्लैट धातु स्पैटुला और एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। एक 2 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में ऊतकों प्लेस और प्राप्त ऊतक वजन। सेल अलगाव के लिए सीधे मस्तिष्क अनुभाग का उपयोग करें या बाद में उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में इसे जल्दी से फ्रीज करें।
9. सेल अलगाव
- साफ-सुथरे और बाँझ वातावरण में काम करना सुनिश्चित करें। कक्षा -2 जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) के तहत काम करने की सलाह दी जाती है। सुनिश्चित करें कि बीएससी में पेश किए गए दस्ताने और उपकरण ों का हर टुकड़ा बाँझ है।
- सेल सॉर्टिंग के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, जैकलिन एम श्वार्ज़14 से प्रोटोकॉल का पालन करें।
नोट: इस प्रयोग में, सेल तैयारी के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तंत्रिका पृथक्करण किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया गया था।- नमूनों को एचबीएसएस (सीए- और एमजी-मुक्त) के 1 एमएल के साथ 2 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखो, और फिर अपकेंद्रित्र (300 एक्स जी, 2 मिनट, कमरे का तापमान = आरटी) और गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
- एंजाइम मिश्रण -1 के 1900 μL जोड़ें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं, जबकि हर 5 मिनट उलटा द्वारा ट्यूबों आंदोलन।
- एंजाइम मिश्रण -2 के 30 μL जोड़ें, विंदुक 1 के साथ धीरे-धीरे उत्तेजित करें ( सामग्री की तालिका देखें) 30 बार आगे और पीछे। फिर, हर 5 मिनट में उलटा द्वारा ट्यूबों को उत्तेजित करते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
- विंदुक 2 के साथ धीरे-धीरे आगे और पीछे मिलाएं, और फिर ऊतकों को अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने से पहले विंदुक 3 विंदुक।
- 80 μm सेल छलनी के साथ कोशिकाओं को फ़िल्टर करें, एचबीएसएस (सीए- और एमजी-मुक्त) के 10 एमएल जोड़ें। अपकेंद्रित्र (300 एक्स जी, 10 मिनट, आरटी) और गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
- माइलिन की कमी के लिए, माइलिन हटाने बफर ( सामग्री की तालिका देखें) के 400 μL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने से पहले माइलिन हटाने के मोतियों ( सामग्री की तालिका देखें) के 100 μL जोड़ें।
- माइलिन हटाने बफर, अपकेंद्रित्र (300 एक्स जी, 10 मिनट, आरटी) के 5 एमएल जोड़ें, और गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
- माइलिन हटाने बफर के 500 μL जोड़ें और चुंबकीय क्षेत्र स्तंभ में ट्यूब जगह है। चार बार माइलिन हटाने बफर के 1 एमएल के साथ कॉलम धोलें।
- अपकेंद्रित्र (300 एक्स जी, 2 मिनट, आरटी) और गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। भंवर संक्षेप में (2 एस) कोशिकाओं को अलग करने और एफसी ब्लॉक सीडी 32 के 5 μL जोड़ने के लिए। भंवर फिर से और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
- ब्याज के प्राथमिक एंटीबॉडी के मिश्रण के 100 μL जोड़ें; 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
- अपकेंद्रित्र (350 एक्स जी, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। नरम कागज पर ट्यूबों को उल्टा धब्बा दें।
- एक संक्षिप्त भंवर (2 एस) के बाद, माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के 100 μL जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
- माइलिन हटाने बफर, अपकेंद्रित्र (350 एक्स जी, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) के 2 एमएल जोड़ें और गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। नरम कागज पर ट्यूबों को उल्टा धब्बा दें। बाँझ पीबीएस के 250 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और सीधे सेल सॉर्टिंग के लिए आगे बढ़ें।
10. सेल सॉर्टिंग
- सॉर्ट की गई कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए बाँझ पीबीएस के 500 μL के साथ माइक्रोफ्यूज ट्यूब तैयार करें।
- जीवित कोशिकाओं के नाभिक को रंगने और उन्हें मृत कोशिकाओं से अलग करने के लिए सेल समाधान के प्रति 1000 μL होचस्ट के 10 μL जोड़ें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल सॉर्टिंग मशीन के लिए जितनी जल्दी हो सके कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
- सबसे पहले, आगे और साइड स्कैटर द्वारा कोशिकाओं को सॉर्ट करें, और फिर होचस्ट पॉजिटिव कोशिकाओं को सॉर्ट करें। इसके बाद, ब्याज के एंटीबॉडी के आधार पर कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें। सकारात्मक दाग कोशिकाओं को अलग से इकट्ठा करें। ऑटोफ्लोरोसेंट लोगों से सकारात्मक कोशिकाओं को अलग करना सुनिश्चित करें।
- रुचि के प्रत्येक पूल के लिए सॉर्ट किए गए कक्षों की संख्या की गणना करें।
11. गामा गिनती
- एसपीईसीटी अंशांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही प्रेत समाधान के 10 μL के साथ γ गिनती प्रणाली को कैलिब्रेट करें लेकिन इसे 1 एमएल पानी में पतला करें।
नोट: प्रेत समाधान γ गिनती प्रणाली की बढ़ी हुई परिशुद्धता के कारण पतला है। - γ गिनती प्रणाली में क्रमबद्ध कोशिकाओं की ट्यूब रखें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार गिनती γ के साथ आगे बढ़ें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
डब्ल्यूटी चूहों ने एक एकतरफा एलपीएस इंजेक्शन (चित्रा 2) के बाद [125आई] क्लिंडे रेडियोट्रेसर के साथ विवो स्पेक्ट स्कैन में अनुभव किया। यह स्कैन (45-60 मिनट पोस्ट रेडियोट्रैसर इंजेक्शन की छवियों से अभिव्यक्त डेटा का उपयोग करके) ने मस्तिष्क के प्रतिपक्षी क्षेत्र (चित्रा 2 बी) की तुलना में एलपीएस इंजेक्शन (चित्रा 2 ए) की साइट में [125आई] क्लिंडे के उच्च बंधन को दिखाया। एफएसीएस-आरटीटी से गुजरने वाले पूर्व विवो नमूनों ने उन परिणामों की पुष्टि की और केवल माइक्रोग्लिया में [125आई] क्लिंडे बाध्यकारी साइटों की उच्च संख्या की उपस्थिति का खुलासा किया, यह दर्शाता है कि मस्तिष्क के इप्सिलेटरल पक्ष में [125आई] क्लिंड सिग्नल की सेलुलर उत्पत्ति माइक्रोग्लियल (चित्रा 3 ए) 15 थी।
उसी [125आई] क्लिंडे रेडियोट्रेसर का उपयोग करते हुए, प्रोटोकॉल को तब पुराने टीजीएफ 344-एडी चूहों (12- और 24 महीने के) के हिप्पोकैम्पस पर किया गया था और 24 महीने के डब्ल्यूटी के साथ तुलना की गई थी। परिणामों से पता चला कि टीजीएफ 344-एडी चूहों में 12 महीनों में टीएसपीओ बाध्यकारी में वृद्धि एस्ट्रोसाइट्स तक सीमित थी। 24 महीने के चूहों में, टीएसपीओ बाध्यकारी में वृद्धि एस्ट्रोसाइटिक और माइक्रोग्लियल परिवर्तन (चित्रा 3 बी) दोनों के कारण हुई थी। परिणामों से पता चला है कि एस्ट्रोसाइट्स में टीएसपीओ अतिअभिव्यक्ति शायद माइक्रोग्लियल से पहले देखी जाती है। स्वतंत्र रूप से, रेडियोट्रैसर [125आई] आर 9 1150 का उपयोग करके, इस तकनीक का उपयोग सेलुलर पैमाने पर यह दिखाने के लिए किया गया था कि पुराने टीजीएफ 344-एडी चूहों में, डब्ल्यूटी (चित्रा 3 सी) 16 की तुलना में स्ट्रिएटल एस्ट्रोसाइट्स ने 5 एचटी2 एआर घनत्व में कमी प्रदर्शित की।
अंत में, एफएसीएस-आरटीटी मानव एडी पोस्टमार्टम नमूनों पर किया गया था। पृथक्करण के बाद, कोशिकाओं को धुंधला होने और एफएसीएस प्रक्रिया से पहले [125आई] क्लिंडे के साथ इनक्यूबेट किया गया था। इसने उम्र-मिलान नियंत्रण (चित्रा 3 डी) की तुलना में एडी विषयों के एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया दोनों में टीएसपीओ के कॉर्टिकल ओवरएक्सप्रेशन की खोज की अनुमति दी।
चित्रा 1: स्पेक्ट कैमरा सेट-अप (ए) स्पेक्ट कैमरा समग्र प्रस्तुति। (बी) हीटर और श्वसन दर की निगरानी के साथ बिस्तर प्रस्तुति। (सी) संज्ञाहरण ट्यूब प्लग। (डी) हीटिंग बेड और श्वसन जांच सॉकेट। (ई) सॉफ्टवेयर से प्रेत स्थिति निगरानी दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: [125आई] क्लिंड रेडियोट्रैसर के साथ स्पेक्ट का उपयोग करके टीएसपीओ मस्तिष्क इमेजिंग। (ए) एलपीएस या (बी) मस्तिष्क के इप्सिलेटरल (सफेद) और कॉन्ट्रालेटरल (लाल) पक्ष में खारा इंजेक्शन के बाद हिप्पोकैम्पस के प्रतिनिधि छवियां ([125आई] सीआईएनडीई के 45-60 मिनट के बाद इंजेक्शन)। विवो समय-गतिविधि घटता में ब्याज की मात्रा में मापा जाता है सही पैनल में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. एसपीईसीटी: एकल-फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी; टीएसपीओ: ट्रांसलोकेटर प्रोटीन; एलपीएस: लिपोपॉलीसेकेराइड। एन = 7 जानवर प्रति शर्त। इस आंकड़े को टूर्नियर एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: टीएसपीओ और 5 एचटी2 एआर (ए) एलपीएस के एकतरफा मस्तिष्क इंजेक्शन के बाद टीएसपीओ अतिअभिव्यक्ति की सेलुलर उत्पत्ति का परिमाणीकरण। रेडियोधर्मिता को प्रत्येक सेल आबादी में कॉन्ट्रालेटरल (ग्रे, एन = 7) और इंजेक्शन के इप्सिलेटरल (हरा, एन = 7) पक्ष में मापा गया था (% इंजेक्शन खुराक / सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग किया जाता है: युग्मित टी-परीक्षण। (बी) पुराने टीजीएफ 344-एडी चूहे में टीएसपीओ। [125आई] क्लिंड सांद्रता (ऊतक के% इंजेक्शन खुराक / जी) 24 महीने के जंगली प्रकार के जानवरों (ग्रे, एन = 9) और 12- (हरे, एन = 8) और 24 महीने के (बैंगनी, एन = 7) टीजीएफ 344- एडी चूहों में निर्धारित किए गए थे। सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग किया जाता है: दो-तरफ़ा एनोवा। (सी) 5 एचटी2 एआर पुराने टीजीएफ 344-एडी चूहों में स्ट्रिएटम के एस्ट्रोसाइट्स में कम हो जाता है। [125आई] आर 91150 एकाग्रता डब्ल्यूटी (ग्रे, एन = 7) और पुराने टीजीएफ 344-एडी (हरा, एन = 11) चूहों में सेलुलर स्तर (% इंजेक्शन खुराक / सेल) पर एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया में निर्धारित की गई थी। सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग किया गया: एक तरफा एनोवा। (डी) अल्जाइमर रोग (एडी) में ललाट प्रांतस्था में टीएसपीओ अतिअभिव्यक्ति की सेल उत्पत्ति। प्रत्येक सेल आबादी में, रेडियोधर्मिता को एडी विषयों (हरा, एन = 9) और नियंत्रण (ग्रे, एन = 9) में मापा जाता है (% इंजेक्शन खुराक / सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग किया जाता है: अनपेक्षित टी-टेस्ट। सभी डेटा को निम्नलिखित एनोटेशन के साथ 95% सीआई ± माध्य के रूप में दर्शाया गया है: * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हमारे ज्ञान के लिए, यह तकनीक एक दृष्टिकोण का वर्णन करने वाली पहली थी जो सेलुलर स्तर पर एक रेडियोट्रेसर के विवो बाध्यकारी परिवर्तनों में बेहतर समझ की अनुमति देती है। प्रोटोकॉल उदाहरण के रूप में [125 आई] क्लिंडे (टीएसपीओ) या [125 आई] आर 91150(5 एचटी 2ए आर) का उपयोग करके सेलुलर स्तर पर रेडियोट्रेसर बाइंडिंग को मापने के लिए एक मल्टीस्केल विधिकावर्णन करता है।
यह तकनीक एलपीएस द्वारा प्रेरित एक तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया से लेकर एडी के चूहे के मॉडल में देखे गए अधिक सूक्ष्म ग्लियल सेल परिवर्तनों तक ग्लियल सेल परिवर्तनों के व्यापक स्पेक्ट्रम की सेलुलर उत्पत्ति का सटीक पता लगाने के लिए पर्याप्त मजबूत और संवेदनशील है, जो महत्वपूर्ण पूरक जानकारी लाती है विवो परमाणु न्यूरोइमेजिंग, एसपीईसीटी के साथ प्राप्त सिग्नल की माइक्रोग्लियल उत्पत्ति के रूप में जो निर्धारित किया गया था। अध्ययन से आगे पता चला है कि एफएसीएस-आरटीटी 5 एचटी2 एआर (चित्रा 3 सी) के उदाहरण के साथ सेलुलर पैमाने पर न्यूरोरिसेप्टर घनत्व परिवर्तनों को समझने में भी सक्षम था। अंत में, मानव पोस्टमार्टम ऊतकों में तकनीक का उपयोग करने के लिए सबूत प्रदान किए गए थे, जो एडी विषयों के एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया में बढ़ी हुई टीएसपीओ एकाग्रता दिखाते थे।
इस तकनीक का मुख्य लाभ पीईटी और स्पेक्ट इमेजिंग के साथ इसकी पूरकता है। दरअसल, परमाणु इमेजिंग एक शक्तिशाली तकनीक है जो मस्तिष्क क्षेत्र या वोक्सेल स्तर से जानकारी निकाल सकती है। हालांकि, इसकी सीमा सेलुलर पैमाने पर रहती है; सिग्नल में प्रत्येक सेल प्रकार के योगदान को अलग करना असंभव है। एफएसीएस-आरटीटी प्रत्येक सेल प्रकार में एक रेडियोट्रेसर एकाग्रता का खुलासा करके आगे बढ़ने की अनुमति देता है। दिलचस्प बात यह है कि सिद्धांत रूप में, इस तकनीक के साथ लक्ष्यों के एक असीमित सेट का आकलन किया जा सकता है, सीमा ब्याज के लक्ष्य के लिए रेडियोट्रेसर की उपलब्धता है।
प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में रेडियोधर्मिता का उपयोग शामिल है जिसे योग्य कर्मियों के साथ एक सुरक्षित वातावरण में किया जाना चाहिए। इसके अलावा, रेडियोधर्मी क्षय पर विचार करना महत्वपूर्ण है। एफएसीएस तैयारी के लिए, किसी को एंटीबॉडी विशिष्टता, तरंग दैर्ध्य, प्रकाश तीव्रता सुनिश्चित करनी चाहिए जो सेल प्रकार के आधार पर भिन्न होती है और कुशल सेल सॉर्टिंग के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है।
यहां प्रस्तुत अध्ययनों में रेखांकित इस तकनीक की सीमाओं में से एक ऑटोफ्लोरोसेंट कोशिकाओं के कारण वृद्ध जानवरों और मानव पोस्टमार्टम मस्तिष्क के नमूनों का उपयोग करने में निहित है। लिपोफुसिन, यानी, लाइसोसोमल पाचन का एक अवशेष, फ्लोरोसेंट है और उम्र बढ़ने वाले न्यूरॉन्स, माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स में जमा होता है। एफएसीएस, पूर्व अनुकूलन के साथ, सकारात्मक लेबल वाले लोगों से ऑटोफ्लोरोसेंट कोशिकाओं को अलग कर सकता है, जो एक आवश्यक कदम है यदि पुराने जानवरों का अध्ययन किया जाता है। तकनीक की एक और सीमा विभिन्न जानवरों में विभिन्न सॉर्ट किए गए सेल प्रकारों के बीच रेडियोट्रेसर एकाग्रता की सीधे तुलना करने की असंभवता है। यह तब किया जा सकता है जब रक्त में गैर-चयापचय, गैर-प्रोटीन बाध्य रेडियोट्रेसर की एकाग्रता को जानवरों में सामान्यीकरण के लिए माना जाता था।
एक अंतिम सीमा उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए, साइक्लोट्रॉन, पीईटी / एसपीईसीटी कैमरा, एफएसीएस, और γ काउंटर, एक-दूसरे के करीब भौतिक निकटता में होने के लिए, खासकर यदि विवो इमेजिंग और एफएसीएस-आरटीटी में छोटे आधे जीवन आइसोटोप का उपयोग किया जाता है।
एफएसीएस-आरटीटी का उपयोग स्टैंडअलोन दृष्टिकोण के रूप में भी किया जा सकता है, यानी, जरूरी नहीं कि विवो परमाणु इमेजिंग अध्ययन15 में पालन किया जाए। मस्तिष्क रोग की जटिलता के लिए सेलुलर स्तर या एकल-सेल पैमाने पर तंत्र का अध्ययन करने की आवश्यकता होती है। एफएसीएस-आरटीटी पूर्व विवो या इन विट्रो सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान दृष्टिकोण ों के विशाल स्पेक्ट्रम के साथ विवो इमेजिंग दृष्टिकोण में एक ट्रांसलेशनल टूल ब्रिजिंग हो सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 320030-184713) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक बीबीटी और केसी को वेलक्स फाउंडेशन (परियोजना एन 1123) द्वारा समर्थित किया जाता है। लेखक एसटी को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अर्ली पोस्ट-डॉक मोबिलिटी स्कॉलरशिप, नं। P2GEP3_191446), प्रोफेसर डॉ मैक्स क्लोएटा फाउंडेशन (क्लिनिकल मेडिसिन प्लस छात्रवृत्ति), और जीन और मैडेलीन वाचोक्स फाउंडेशन।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).
- D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
- D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
- Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).
- Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).
- Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Cells. 9 (9), (2020).
- Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346 (2020).
- Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
- Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).
