Summary
Aqui, um protocolo simples é apresentado para a produção de nanopartículas mRNA baseadas em polímeros poli (beta aminoester), fáceis de serem adaptados alterando o mRNA encapsulado. O fluxo de trabalho para sintetizar os polímeros, as nanopartículas e sua caracterização essencial in vitro também são descritos. Também é acrescentada uma prova de conceito em relação à imunização.
Abstract
A vacinação tem sido um dos maiores sucessos da sociedade moderna e é indispensável no controle e prevenção de doenças. As vacinas tradicionais eram compostas de inteira ou frações do agente infeccioso. No entanto, os desafios permanecem, e novas tecnologias de vacinação são obrigatórias. Nesse contexto, o uso do mRNA para fins de imunização mostrou um desempenho aprimorado, como demonstrado pela aprovação rápida de duas vacinas de mRNA que previnem a infecção pelo SARS-CoV-2. Além do sucesso na prevenção de infecções virais, as vacinas mRNA também podem ser usadas para aplicações terapêuticas de câncer.
No entanto, a instabilidade do mRNA e sua rápida liberação do corpo devido à presença de núcleos torna sua entrega nua não possível. Neste contexto, as nanomedicinas, e especificamente as nanopartículas poliméricas, são sistemas críticos de entrega de mRNA. Assim, o objetivo deste artigo é descrever o protocolo de formulação e teste de um candidato à vacina mRNA com base nas nanopartículas poliméricas proprietárias. A síntese e caracterização química dos polímeros poli(beta aminoesters) utilizados, sua complexidade com mRNA para formar nanopartículas, e sua metodologia de liofilização serão discutidas aqui. Este é um passo crucial para diminuir os custos de armazenamento e distribuição. Finalmente, serão indicados os testes necessários para demonstrar sua capacidade de transfetál de in vitro e células dendríticas de modelo maduros. Este protocolo beneficiará a comunidade científica que trabalha na vacinação devido à sua alta versatilidade que permite que essas vacinas previnem ou curem uma grande variedade de doenças.
Introduction
As doenças infecciosas têm representado uma grave ameaça a milhões de seres humanos em todo o mundo e ainda são uma das principais causas de morte em alguns países em desenvolvimento. A vacinação profilática tem sido uma das intervenções mais eficazes da sociedade moderna para prevenir e controlar doenças infecciosas1,2. Esses marcos críticos da ciênciana relevância do século 20 foram observados pela recente pandemia covid-19 mundial causada pelo vírus SARS-CoV-23. Reconhecendo a importância de ter vacinas eficientes para reduzir a disseminação da doença, os esforços cooperativos de todas as comunidades biomédicas resultaram com sucesso em muitas vacinas profiláticas no mercado em menos de um ano4.
Tradicionalmente, as vacinas eram compostas de vírus atenuados (virulência viva, reduzida) ou inativados (partículas de morte). No entanto, para algumas doenças sem margem para erros de segurança, partículas virais não são possíveis, e subunidades proteicas são usadas em vez disso. No entanto, as subunidades geralmente não permitem a combinação de mais de um epítope/antígeno, e os adjuvantes são necessários para aumentar a potência vacinal5,6. Portanto, a necessidade de novos tipos de vacinas é clara.
Como demonstrado durante a pandemia atual, novos candidatos à vacina com base em ácidos nucleicos podem ser vantajosos em termos de evitar processos longos de desenvolvimento e fornecer alta versatilidade ao produzir, ao mesmo tempo, uma imunização vital do paciente. É o caso das vacinas mRNA, que foram inicialmente projetadas como vacinas experimentais contra o câncer. Graças à sua capacidade natural de produzir respostas de células T específicas de antígeno3,5,6,7. Sendo mRNA a molécula que codifica a proteína antigênica, apenas mudando a mesma, a vacina pode ser rapidamente adaptada para imunizar outras variantes do mesmo microrganismo, cepas diferentes, outros microrganismos infecciosos, ou até mesmo se tornar um tratamento imunoterapêutico de câncer. Além disso, são vantajosos em termos de custos de produção em larga escala. No entanto, o mRNA tem um obstáculo significativo que dificulta sua administração nua: sua estabilidade e integridade estão comprometidas na mídia fisiológica, cheia de núcleos. Por essa razão, é necessário o uso de um portador nanométrico que o proteja e vetorize o mRNA para as células que apresentem antígeno2,8.
Neste contexto, os poli(aminoesters beta) (pBAE) são uma classe de polímeros biocompatíveis e biodegradáveis que demonstraram uma notável capacidade de complexo mRNA em partículas nanométricas, graças às suas cargas cationicas9,10,11. Estes polímeros são compostos de laços éster, o que facilita sua degradação por esterases em condições fisiológicas. Entre os candidatos à biblioteca do PBAE, aqueles funcionalizados com oligopeptídeos cáticos finais apresentaram maior capacidade de formar pequenas nanopartículas para penetrar eficientemente as células através da endocitose e transfectar o material genético encapsulado. Além disso, graças à sua capacidade de tampão, a acidificação do compartimento endosomo permite a fuga endossomal12,13. Ou seja, um tipo específico de pBAE, incluindo moieties hidrofóbicos em sua espinha dorsal (o chamado C6 pBAE) para aumentar sua estabilidade e combinação de oligopeptídeo final (60% de polímero modificado com uma tri-lysina e 40% do polímero com uma tri-histidina) que transfecta seletivamente células que apresentam antígenos após administração parenteral e produzem a apresentação de antígeno de encode mRNA seguido de imunização de camundongos foi publicado recentemente14 . Além disso, também foi demonstrado que essas formulações poderiam contornar uma das principais etapas de gargalo das formulações de nanomedicina: a possibilidade de congelá-las sem perder sua funcionalidade, o que permite a estabilidade a longo prazo em ambientes secos suaves15.
Nesse contexto, o objetivo do protocolo atual é disponibilizar o procedimento para a formação das nanopartículas de mRNA à comunidade científica, dando uma descrição das etapas críticas do protocolo e possibilitando a produção de vacinas eficientes para aplicações de prevenção de doenças infecciosas e tratamento de tumores.
O protocolo a seguir descreve o exercício completo para sintetizar poli (aminoestores beta) modificados por oligopeptídeos - polímeros OM-pBAE que serão usados ainda para síntese de nanopartículas. No protocolo, a formulação de nanopartículas também está incluída. Além disso, etapas críticas para o sucesso do procedimento e resultados representativos também são fornecidas para garantir que as formulações resultantes realizem os recursos de caracterização de controle de qualidade necessários para definir um resultado positivo ou negativo. Este protocolo é resumido na Figura 1.
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Protocol
1. Síntese de polímero pBAE com oligopeptídeos finais (OM-pBAE)
- Polimerização de C6-pBAE
- Adicionar 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-hexilamina (38 mmol; MW = 101,19 Da) em frasco de vidro de fundo redondo (100 mL). Em seguida, adicione 1,4-butanediol diacrilato (82 mmol; MW = 198,22 Da).
- Pré-aqueça o banho de óleo de silicone a 90 °C, coloque o frasco de fundo redondo no banho de óleo e mexa a mistura com o auxílio de uma barra de agitação magnética durante a noite (~18 h). Em seguida, retire o produto do frasco de fundo redondo e coloque-o no congelador a -20 °C.
NOTA: O produto é na forma de um pó pegajoso e é retirado do frasco com a ajuda de uma espátula. É essencial validar a estrutura do polímero obtido através de 1H-NMR. Os espectros NMR foram registrados em um instrumento de 400 MHz (ver Tabela de Materiais) utilizando clorofórmio-d e D2O como solventes. Cerca de 10 mg de cada poli (β-amino ester) foram tomados e dissolvidos em 1 mL do solvente deuterado.
- Reação com peptídeos para obter OM-pBAE
- Adicione 25 mL de 0,1 M HCl aos peptídeos selecionados, por exemplo, peptídeo Cys-His-His-His com ácido trifluoroacético (TFA, 200 mgs), em um tubo de centrífuga de 50 mL anteriormente pesado que pode suportar a secagem congelante e mexer manualmente durante a noite para obter uma solução clara.
- Congele a solução a -80 °C por 1 h e seque o cloridrato de peptídeo resultante.
NOTA: Verifique se o peso final corresponde ao valor teórico. - Faça uma solução de C6-pBAE (0,031 mmol) em sulfóxido de dimetil. Além disso, faça uma solução do cloridrato de peptídeo (0,078 mmol) em sulfóxido de dimetil.
- Misture as duas soluções em um tubo de tampa de parafuso e aparafusar a tampa. Mexa a solução da mistura em um banho de água com uma temperatura controlada de 25 °C por 20 h com uma barra de agitação magnética.
- Adicione a mistura a 7:3 (v/v) ether/acetona. Centrifugar a suspensão resultante a 25.000 x g a 4 °C para remover o solvente. Em seguida, lave o sólido com 7:3 (v/v) éter/acetona diethyl/acetona duas vezes. Em seguida, seque o produto sob um vácuo (<0,2 atm).
- Faça uma solução de 100 mg/mL do produto em sulfóxido de dimetila. O produto resultante é chamado C6-peptídeo-pBAE. É essencial validar a estrutura do polímero obtido através de 1H-NMR para confirmar o desaparecimento dos sinais olefinas associados aos acrilatos terminais. Se não for usado, o polímero pode ser congelado a -20 °C.
2. Formação de poliplexes
NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados dentro de uma sala condicionada para manter uma temperatura constante.
- Descongele os polímeros C6-peptídeo-pBAE e o vórtice da solução.
- Pipeta o polímero misturar para cima e para baixo e preparar uma solução de 12,5 mM (V1) em acetato de sódio (NaAc). Em seguida, vórtice da mistura e esperar por 10 min.
- Prepare o mRNA a 0,5 mg/mL e misture por pipetação (V2).
NOTA: É crucial evitar o vórtice do mRNA. - Vórtice a mistura de polímero na concentração final para obter uma solução homogênea entre o estoque de polímero em DMSO e o tampão de acetato.
NOTA: A concentração final do polímero depende da razão N/P (nitrogênio para grupos fosfato) selecionada. A razão N/P depende de cada mRNA específico a ser utilizado. Para encapsulamento eGFP, por exemplo, foi utilizada uma razão de 25:1, conforme relatado anteriormente14. - Misture a solução de material genético e a solução C6-peptidepBAE (25x da concentração de mRNA) em uma razão de 1:1 (Vi = V1 + V2).
NOTA: C6-peptídeo-pBAE é carregado em um tubo de microcentrifuuge onde o mRNA é adicionado por pipetação para cima e para baixo para mistura. Uma vez preparado, as concentrações de poliplex, ácido nucleico e C6-peptídeo-pBAE são meio diluídas. - Incubar a 25 °C por 30 min em um termbloco. Precipitar com 1:2 RNase água livre adicionando a amostra a um tubo de microcentrifus de microcentruagem pré-carregado com água.
- Inclua os excipientes. Adicione o mesmo volume que a mistura de mRNA e pBAE (Vi) em HEPES 20 mM e sacarose 4% por pipetação para cima e para baixo. Neste ponto, a amostra foi diluída 3x.
3. Lyofilização de poliplexes
- Instantaneamente, congele a -80 °C congelador da solução poliplex anterior por 1 h.
- Realizar a secagem primária seguindo as etapas: (1) 1 h a -60 °C e 0,001 hPa; (2) 1h a -40 °C e 0,0001 hPa; (3) 4h a -20 °C e 0,0001 hPa; (4) 12 h a 5 °C e 0,0001 hPa.
- Armazene a -20 °C imediatamente para evitar a reidratação até o uso.
4. Ressuspensão poliplexa
NOTA: Este protocolo descreve o processo utilizado para reconstruir as nanopartículas lioofilizadas C6-peptídeo-pBAE para seu uso posterior, seja para caracterização, in vitro ou análise in vivo.
- Pegue as nanopartículas liofphilizadas a partir de -20 °C apenas no momento do uso e adicione rapidamente a quantidade correspondente de água despirada (DEPC) para redispersar o sólido para alcançar a concentração desejada.
NOTA: O volume será o mesmo que o volume inicial das nanopartículas se a mesma concentração for prevista, mas será indicado para cada experimento. - Pipeta suavemente até a ressuspensão total, acompanhando o líquido com a pipeta.
NOTA: Certifique-se de que não há material na parede do frasco. - Uma vez dissolvida, pipeta para cima e para baixo vigorosamente, evitando bolhas.
NOTA: A amostra deve ter um aspecto transparente a translúcido, que é mais evidente em concentrações mais altas - Armazene as amostras no gelo ou a 4 °C por um período máximo de 24 h, uma vez reconstituída. Evite congelar.
5. Caracterização de poliplex
- Dispersão dinâmica de luz
NOTA: O diâmetro hidrodinâmico (nm), o índice de polidispersidade (PDI) e a carga superficial de nanopartículas foram medidos a 25 °C, comprimento de onda laser de 633 nm e detector de sinal de 173°, utilizando um analisador potencial Zeta (ver Tabela de Materiais).- Diâmetro hidrodinâmico (nm)
- Prepare as nanopartículas que misturam mRNA e pBAE completamente, canalizando o material genético para a fração do polímero para uma concentração final de mRNA de 0,25 mg/mL como descrito anteriormente acima (passo 2).
- Pré-enxágue uma microcuvette com mídia de diluição filtrada para limpá-la completamente das impurezas. Em seguida, encha a cuvette com pelo menos 50 μL da solução amostral e tampe-a. Em seguida, introduza a amostra dentro do instrumento DLS, certifique-se de que a célula está corretamente inserida.
NOTA: A mídia de diluição é filtrada usando um filtro de seringa de 0,22 μm. - Abra o arquivo SOP (Standard Operation Procedure, procedimento de operação padrão) criado e introduza o nome da amostradesejado . Selecione a medição de tamanho.
NOTA: Todos os parâmetros para criar um SOP para medições de tamanho são fornecidos na Tabela 1. - Execute a medição do tamanho da partícula usando DLS clicando em Reproduzir.
NOTA: Após o sinal de bipe triplo, a análise é completa. - Selecione os resultados correspondentes à amostra na folha de medição para obter o tamanho médio da partícula, O IDB médio, desvio padrão e gráficos. Uma vez feito, remova a célula do equipamento DLS.
- Remova a amostra, guarde-a para análise potencial de zeta e limpe e enxágue a célula com água deionizada. Finalmente, seque a cuvette limpa sob um fluxo de gás de ar comprimido.
- Carga de superfície (mV)
- Prepare as nanopartículas que misturam mRNA e pBAE completamente, canalizando o material genético para a fração de polímero para uma concentração final de mRNA de 0,25 mg/mL como descrito anteriormente (passo 2, formação de poliplex). Em seguida, congele e seque a solução.
NOTA: Neste caso, para a medição da carga superficial, a secagem congelante da amostra é fortemente recomendada antes de realizar as medidas para redisperse a amostra no buffer apropriado, simulando condições corporais de pH e concentração de eletrólitos. - Resuspense a amostra liofilizada usando água. Diluir a amostra 1/10 em água (concentração final 0,025 mg/mL).
- Pré-enxágue uma célula capilar dobrada descartável (zeta potencial cuvette) com mídia de diluição filtrada para limpá-la completamente das impurezas. Em seguida, encha a cuvette com nanopartículas diluídas, usando uma seringa de 1 mL, e tampa ambos os lados dos enchimentos.
NOTA: A dispersão de nanopartículas deve preencher o volume disponível no cuvette (~1 mL), tendo especial atenção à formação da bolha, o que pode perturbar as medidas. - Introduzir a amostra dentro do DLS; certifique-se de que a célula está corretamente inserida.
- Abra o arquivo SOP criado para análise potencial zeta e introduza o nome da amostradesejado . Selecione a medição do potencial zeta.
NOTA: Parâmetros para criar um SOP para medidas potenciais de zeta são dados na Tabela 2. - Execute a medição potencial zeta usando DLS clicando em Reproduzir.
NOTA: Após o som do bipe triplo, a análise é completa. - Selecione os resultados correspondentes à amostra na folha de medição para obter o potencial zeta médio, desvio padrão e gráficos. Uma vez feito, remova a célula do equipamento DLS.
- Remova a amostra e guarde-a se for necessário. Em seguida, limpe e enxague a célula de cuvette com água deionizada, seguida de etanol e água novamente. Finalmente, seque a cuvette limpa sob um fluxo de gás de ar comprimido.
NOTA: Para analisar os dados, use o software recomendado.
- Prepare as nanopartículas que misturam mRNA e pBAE completamente, canalizando o material genético para a fração de polímero para uma concentração final de mRNA de 0,25 mg/mL como descrito anteriormente (passo 2, formação de poliplex). Em seguida, congele e seque a solução.
- Diâmetro hidrodinâmico (nm)
- Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
NOTA: O diâmetro hidrodinâmico (nm) e a concentração de nanopartículas foram medidos a 25 °C, comprimento de onda laser de 488 nm usando um Analisador de Rastreamento de Nanopartículas (ver Tabela de Materiais).- NTA e preparação de amostras
- Ligue o computador e o equipamento. Primeiro, verifique se todos os componentes estão conectados corretamente. Em seguida, abra o software recomendado. O software verificará se todos os acessórios estão conectados corretamente.
- Conecte a placa superior, aqui, a célula o-ring, no módulo laser.
NOTA: Não esvai essa peça. - Primeiro carregue a câmara com tampão e/ou água deionizada com uma seringa de 1 mL. Repita o procedimento pelo menos duas vezes. Evite introduzir bolhas na câmara.
- Prepare a amostra diluindo 1/1000 em água deionizada a partir da concentração utilizada na medição do tamanho do DLS. Prepare pelo menos 1 mL e carregue-o em uma seringa de 1 mL, evitando a introdução de bolhas.
- Coloque as amostras na câmara usando uma seringa. Em seguida, conecte o módulo laser na câmara grande da NTA.
NOTA: Câmara grande denota o espaço onde a câmara é colocada para a medição.
- Otimização de imagem
- Primeiro, no Hardware,verifique se a câmera e o laser adequado estão selecionados.
NOTA: Aqui, há apenas uma câmera e o Laser Azul 488 nm. - Comece com o nível da câmera em 0 e pressione a Câmera iniciar na janela Capturar.
NOTA: Neste ponto, ajuste os seguintes parâmetros. Posição do feixe (pode ser movido para cima e para baixo na tela). Nível da câmera: evite pixels supersaturados. Foco (roda lateral): tente se concentrar o melhor possível. É melhor ter partículas com um halo em vez de partículas desfocadas. Concentração: Ajuste a concentração para ter entre 10 a 100 partículas por campo.
- Primeiro, no Hardware,verifique se a câmera e o laser adequado estão selecionados.
- Gravação de vídeo
- No software, vá para a seleção de medição- janela SOP (à esquerda) e selecione Medição Padrão.
NOTA: Programa para executar três medidas de 30 s cada (para permitir que o software realize cálculos de média e desvio padrão). Forneça um nome e um caminho de pasta (no nome do arquivo base) para salvar os registros da amostra. Quando os parâmetros SOP estiverem configurados corretamente, pressione Criar e Executar script. Uma vez que a primeira réplica seja medida, o programa pedirá para adicionar uma nova amostra. Em seguida, outra fração da amostra deve ser introduzida na câmara empurrando o êmbolo da seringa. Por fim, repita uma terceira vez para analisar a terceira réplica.
- No software, vá para a seleção de medição- janela SOP (à esquerda) e selecione Medição Padrão.
- Processamento de vídeo
- Reajuste o limite de ganho e detecção da tela assim que as três medidas forem concluídas para analisar as partículas medidas. Neste momento, cerca de 100 partículas devem aparecer em cada quadro para realizar a análise (altas cruzes vermelhas e cruzes azuis baixas são esperadas).
- Exporte os resultados em um arquivo pdf após a análise ser concluída. Além disso, é possível exportar como vídeos e arquivos excel.
- Limpeza da NTA
NOTA: Feche todas as medidas abertas antes de estudar a seguinte amostra; uma vez que os arquivos gerados são enormes e dependendo do computador, não é fácil manter mais de um aberto.- Limpe a câmara NTA lavando água repetidamente antes de realizar a medição subsequente até que nenhuma partícula seja observada; posteriormente, limpe o tampão utilizado (PBS) para continuar com as medidas.
- Lave o ar dentro da câmara e seque-o com papel de grau microscópico assim que a última medição do dia estiver concluída.
- Caracterizar o tamanho e a forma por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM). Prepare as amostras. 30 μL do volume final é suficiente para caracterização TEM.
NOTA: Podem ser medidas tanto frescas quanto liofilizadas - após a ressuspensão- nanopartículas. - Solte 10 μL de amostra em uma rede de cobre revestida de carbono. Deixe secar por 10 minutos. Remova o excesso de líquido, se necessário, tocando suavemente no papel do filtro.
- Queda de 10 μL de acetato de util (2% c/v) solução para coloração negativa. Deixe secar por 1 min. Remova o excesso de líquido, se necessário, tocando suavemente no papel do filtro.
- Introduza a amostra no microscópio e scan (operação de tensão de 80 kV).
NOTA: O software apropriado pode ser usado para análise posterior das imagens.
- NTA e preparação de amostras
- Eficiência de encapsulamento
- Preparação da amostra
- Prepare as nanopartículas na concentração desejada e congele-as e seque-as. Em seguida, resuspenque as nanopartículas e dilui-as em uma concentração final de 6 μg/mL.
- Prepare o buffer 1x TE da solução de estoque de 20x.
NOTA: Vt (Volume total) = (número de amostras x 100 μL x 4) (número de amostras x 290 μL) + 2 mL. - Prepare o buffer TE com 3 μg/μL de Heparina a partir do estoque de 100 μg/μL.
NOTA: Vt = Número de amostras x 50 μL x 2. - Prepare os padrões
- Prepare um padrão RNA que varia de 0,2 μg/mL a 0,025 μg/mL no tampão 1x Tris-EDTA (TE)(Tabela S1A).
NOTA: Use mRNA no padrão RNA no caso de diferencie do RNA ribossômico. - Prepare o padrão RNA:pBAE com Heparin(Tabela S1B). Preparar o padrão Heparin(Tabela S1C).
- Prepare uma placa de 96 poços da seguinte forma.
- Carregar 295 μL de tampão de TE na primeira pista de uma placa de 96 poços (como muitos poços como amostras para analisar). Em seguida, carregue 50 μL de tampão 1x TE nas faixas B e C (duplicatas para cada amostra).
- Carregar 50 μL de tampão 1x TBE com 3 μg/μL de Heparina nas faixas D e E (duplicatas para cada amostra). Em seguida, carregue 100 μL de cada padrão nas faixas F, G e H (duplicatas para cada padrão).
- Carga 5 μL de cada amostra na faixa A (a concentração em cada poço é de 0,1 μg/mL). Misture corretamente por pipetação e carregue 50 μL de cada amostra nos quatro poços abaixo (dois deles contendo 50 μL de tampão 1x TE e mais dois contendo 1x te buffer com 3 μg/μL de Heparina).
- Incubar a amostra por 30 min a 37 °C. Prepare o reagente RiboGreen de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais) em 1x de buffer TE.
NOTA: Diluir 1:200 e vórtice. Proteja-se contra a luz. Vt = Número de poços completos x 100 μL. - Carregue 100 μL de solução RiboGreen em cada poço. Detecte fluorescência usando o leitor de microplaca com um comprimento de onda de excitação de 500 nm e um comprimento de onda de emissão de 525 nm.
- Análise de resultados
- Prepare as três curvas de calibração
NOTA: Primeiro, padrão RNA ribossômico. Interpolar nesta curva de calibração as amostras que não contêm Heparina. Segundo, mRNA:pBAE com Heparin. Interpolar nesta curva de calibração a amostra que tem Heparina. Terceiro, Heparin. Usado para garantir que a concentração de trabalho esteja na faixa linear. - Calcular a eficiência de encapsulamento (EE%) da seguinte forma:
- Prepare as três curvas de calibração
- Preparação da amostra
6. Caracterização in vitro
- Microscopia de fluorescência para avaliação qualitativa
- Coloque a placa de 96 poços no microscópio após 24 horas de transfecção. Comece a visualizar células com o objetivo de 10x.
NOTA: As células HeLa são usadas neste caso. As células são localizadas usando o modo de transmissão (campo brilhante), e o foco deve ser ajustado neste momento.- Primeiro, aplique um balanço de branco para referenciar o software sobre o fundo das amostras. Em seguida, adquira uma imagem para sobrepor-a com a imagem de fluorescência durante a análise.
- Altere o modo microscópio para o modo de reflexão (fluorescência) e mova a roda do filtro para o laser azul (488 nm) para visualizar o eGFP.
NOTA: Neste ponto, o tempo de exposição e ganho deve ser ajustado. O ganho deve ser ajustado em valores entre 3 e 5 para evitar artefatos e excesso no sinal de fundo. O ajuste do tempo de exposição depende da eficiência de transfecção (de ms para 1 s). - Adquira imagens para todas as condições ou poços que empregam o mesmo tempo de exposição para comparar todas as amostras.
- Coloque a placa de 96 poços no microscópio após 24 horas de transfecção. Comece a visualizar células com o objetivo de 10x.
- Citometria de fluxo (FC) para avaliação quantitativa
- Use uma pipeta multicanal para preparar a placa de 96 poços para o experimento de citometria de fluxo.
NOTA: Ao trabalhar com células semi-aderentes, como na linha celular JAWSII, recupere todo o volume de mídia e armazene-o em outra placa de 96 poços. Não aspire a esta mídia, pois pode conter um número significativo de células transfeinadas. - Limpe as células (as células HeLa são usadas aqui) com 100 μL/well de 1x PBS e aspire-a. Em seguida, adicione 25 μL/bem de trippsina e incuba-o a 37 °C por 5 min.
- Uma vez que as células são separadas, adicione mídia recuperada anteriormente para parar a ação de trippsina e corrigir as células, adicionando 31,25 μL/bem de formalina 10% para 20 min (concentração final 2,5%).
NOTA: Neste ponto, é crucial visualizar o estado das células por microscopia para garantir o descolamento das células. É altamente recomendado para pipeta para cima e para baixo várias vezes para ajudar as células a se desprender e evitar sua aglomeração. Isso produzirá um resultado confiável. - Ligue o citômetro de fluxo e o software. No software, configure as condições adequadas para o experimento (tipo de placa, volume de amostra e outros parâmetros, como agitação, lavagem entre amostras.
NOTA: Para a etapa 6.2.5, a vazão deve ser de 120 μL/min. Misture um ciclo a cada 1 minuto e enxágue um ciclo a cada um bem. A mistura é essencial para manter as células dispersas na mídia e permitir uma melhor análise das células individuais. Além disso, a lavagem é necessária para limpar os microfluidos do citómetro entre as amostras. Finalmente, verifique se há buffers suficientes e se todos os componentes estão conectados corretamente. - Configure os parâmetros apropriados para quantificar a porcentagem de células positivamente transfeinadas.
- Primeiro, visualize os dados de fluxo sobre (Luz dispersa dianteira) FSC versus SCC (Luz dispersa lateral) para distinguir as células dos detritos. Em seguida, outro gráfico de dispersão comparando a amplitude (FSC-A) versus altura (FSC-H) é plotado para gate e discriminar células individuais.
NOTA: A população não tratada permite fechar as populações correspondentes a células transfectadas positivamente. Em seguida, a quantificação das células positivamente transfectadas é realizada no canal adequado em uma trama de histograma. Portanto, as células positivamente transfectadas devem ser representadas como um contínuo dos eventos no histograma.
- Primeiro, visualize os dados de fluxo sobre (Luz dispersa dianteira) FSC versus SCC (Luz dispersa lateral) para distinguir as células dos detritos. Em seguida, outro gráfico de dispersão comparando a amplitude (FSC-A) versus altura (FSC-H) é plotado para gate e discriminar células individuais.
- Use uma pipeta multicanal para preparar a placa de 96 poços para o experimento de citometria de fluxo.
7. Testes de funcionalidade in vitro: capacidade de ativar células imunes modelo usando ovalbumina (OVA) como modelo antigênico mRNA
- Placa 10.000 células/poço (as células JAWSII são usadas aqui) em uma placa de 96 poços um dia antes da transfecção.
NOTA: Placa tantos poços quanto necessário para ter triplicados para cada condição. Deixe as células anexarem à placa pelo menos por 12 h (recomenda-se uma incubação durante a noite). - Prepare os NPs pBAEs, conforme descrito na NOTA abaixo para transfetá-lo 0,6 μg mRNA por poço.
NOTA: Como um controle positivo, transfete as células usando um reagente de transfecção. Aqui, utilizamos 0,1 μg mRNA por poço e 0,25 μL do reagente de transfecção por poço. foi adquirido o codificador de mRNA para OVA (ver Tabela de Materiais). É poliadenylated, modificado com 5-metoxiuridina, e otimizado para sistemas mamíferos, e é protegido através de um capping final com estrutura Cap1, um método proprietário do fornecedor. - Incubar a placa de 96 poços por 24 h em uma incubadora de ar seco a 37 °C e 5% de CO2.
NOTA: Após este tempo, não aspire a mídia, pois pode conter um certo número de células. Recupere as células e salve-as em outro poço ou placa. - Lave as células remanescentes no poço com 25 μL de 1x PBS. Em seguida, aspire e adicione 25 μL de trippsina e incubar a placa por 5 min a 37 °C para desprender as células. Pare a reação de trypsin adicionando a mídia recuperada anteriormente no correspondente bem.
- Centrifugar a placa a 400 x g por 5 min a 4 °C. Aspirar a mídia. Adicione 50 μL/poço de um PBS 1x e 2,5% de formalina. Incuba-o a 4 °C por 20 min para fixar as células.
- Repetir as etapas 7.5 e 7.5.1. Em seguida, adicione 50 μL/well de 1x PBS e 3% BSA (Tampão de bloqueio) e incubar por 30 min a 4 °C. Novamente, repita as etapas 7.5 e 7.5.1, e depois adicione 50 μL/bem do anticorpo primário (mouse α-OVA) em 1x PBS e 3% BSA e incubar por 30 min a 4 °C.
- Repita as etapas 7.5 e 7.5.1, e depois lave as células com 50 μL/bem de 1x PBS. Aspire mídia e, em seguida, adicione a solução de anticorpos secundários (α-mouse-AlexaFluor488/PerCP e Cy5.5-CD11b/APC-CD86) em 1x PBS e 3% BSA. Incubar por 1h a 4 °C.
- Centrifugar a placa a 400 x g por 5 min. Em seguida, lave as células com 50 μL/bem de 1x PBS. Em seguida, centrífuga (400 x g por 5 min), aspira e, em seguida, resuspensa as células em 100 μL/well de 1x PBS e 2,5% Formalina.
- Analise-o por citometria de fluxo, conforme descrito acima (passo 6.2).
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Representative Results
Síntese e caracterização do polímero
O procedimento de síntese OM-pBAE é dado na Figura 2. Como mostra a Figura 2A, o primeiro passo para obter o OM-pBAE é sintetizar o C6-pBAE adicionando as aminas (1-hexilamina e 5-amino-1-pentanol, razão 1:1) ao diacrilato (1,4-diacrilate butanediol). Esta reação é realizada a 90 °C por 20 h e com agitação constante. Posteriormente, uma solução de oligopeptídeos é adicionada a uma solução de polímero C6 obtido a partir da reação anterior(Figura 2B). Por fim, a síntese é realizada utilizando-se dMSO como solvente a 25 °C com agitação contínua por 20 h. A Figura 2C mostra a estrutura do OM-pBAE, que é o produto resultante da polimerização. Os polímeros resultantes são caracterizados por 1H-NMR (ver Figura Suplementar S2). Na caracterização, um resultado positivo é aquele com várias unidades monômeras (n + m nas figuras) compostas entre 7-10; distribuído meio tipo de unidade e metade da outra; enquanto qualquer outro número fora deste intervalo é um resultado negativo.
Síntese de nanopartículas e caracterização físicoquímica
A Tabela 3 mostra os resultados da caracterização físico-química do GFP mRNA encapsulando nanopartículas como prova de conceito. Foi demonstrado anteriormente que o tamanho e a carga superficial não apresentam diferenças significativas, independentemente do tipo mRNA encapsulado14. A caracterização tem sido realizada tanto em nanopartículas recém-preparadas quanto liofilizadas para comprovar a estabilidade de suas propriedades físico-químicas e demonstrar que, conforme publicado anteriormente, o processo de secagem congelante foi ajustado a essas formulações15. O raio hidrodinâmico dos poliplexos é considerado correto quando varia em torno de 150-220 nm. Além disso, o PDI deve ser constante, aproximadamente 0,2, mas é aceito até 0,3. Portanto, nem o tamanho nem o PDI apresentaram diferenças significativas antes e depois da liofilização, como mostrado aqui utilizando resultados representativos. Além disso, o dimensionamento de nanopartículas foi realizado com a NTA, para confirmar os resultados obtidos anteriormente. Qualquer valor fora das faixas especificadas acima é considerado um resultado negativo, e as partículas devem ser descartadas para uso posterior.
Durante a caracterização físico-química deste tipo de amostra, é conveniente comparar os resultados obtidos pelo DLS com os resultados obtidos pela NTA. Ambas as técnicas determinam o raio hidrodinâmico das partículas medindo o coeficiente de difusão. O número de nanopartículas contadas por quadro na NTA está entre 80 e 100 para rastrear com precisão as partículas. A carga superficial também foi caracterizada para garantir a carga positiva das nanopartículas, facilitando a interação eletrostática com a membrana celular. Por fim, a morfologia dos poliplexes foi caracterizada pela Transmissão de Microscopia Eletrônica (TEM). A Figura 3 confirma a formação de nanopartículas esféricas e monodispersas de um tamanho aproximado de 50 nm de diâmetro. Diâmetros menores foram obtidos através da análise de imagens TEM, uma vez que tanto a NTA quanto a DLS medem os diâmetros hidrodinâmicos. Embora um tamanho menor seja sempre esperado ao realizar medições de microscopia eletrônica16,17, em comparação com medições de dispersão, é essencial destacar aqui que a diferença é de quase 100 nm, o que normalmente não é esperado. Isso é atribuído ao alto caráter higroscópico dessas nanopartículas, dado tanto pelo mRNA encapsulado quanto pelos oligopeptídeos terminais finais que compõem o polímero.
determinação de eficiência de encapsulamento mRNA
Outro parâmetro crítico a ser medido é a capacidade das nanopartículas de encapsular o mRNA, que é o princípio ativo e precisa ser encapsulado para alcançar sua proteção contra nucelases18,19,20. O protocolo foi desenvolvido para analisar a eficiência de encapsulamento (EE; em %) da armadilha nucleico de ácido seguindo as instruções do fornecedor. O valor obtido dá uma ideia sobre a porcentagem de ácido nucleico que é presa com sucesso nas nanopartículas. O corante ribogreen, uma mancha de ácido nucleico fluorescente, é usado para este fim. O protocolo consiste em quantificar qualquer RNA que permaneça acessível ao corante fluorescente. Para quantificar o RNA total, as nanopartículas precisam ser desmontadas, e heparina é usada para este fim.
A Tabela 4 mostra a eficiência de encapsulamento (EE%) dos poliplexes OM-pBAE encapsulando tanto o GFP quanto o OVA mRNA, como prova de conceito. O ensaio de fluorescência ribogreen permite calcular a quantidade de mRNA preso nas nanopartículas após a desmontagem por heparina além de liberar seu conteúdo. Os valores de eficiência obtidos devem ser superiores a 80% e, como demonstrado aqui, não apresentam diferenças significativas dependendo do tipo de mRNA. Valores de eficiência de encapsulamento mais baixos representam um resultado negativo e constituem um sinal para descartar essas formulações. Esses resultados confirmam a alta capacidade de encapsulamento do mRNA de OM-pBAE, sua versatilidade e sua aplicação promissora na entrega de genes.
Resultados representativos in vitro
É essencial determinar a capacidade dos poliplexes pBAEs. Primeiro, transfetá e, segundo, ativar células imunes14. A eficiência da transfecção é avaliada por duas técnicas diferentes, utilizando o eGFP como repórter mRNA: microscopia de fluorescência para determinar visualmente a expressão da proteína repórter e da citometria de fluxo para quantificar a eficiência da transfecção. Um microscópio fluorescente equipado com uma câmera CCD, 5x, 10x, 20x e 40x objetivos e lasers de filtro UV, azul e verde foram empregados para determinar qualitativamente a expressão da proteína eGFP na linha celular JAWSII, uma linha de células dendrítica murina. A proteína eGFP tem um máximo de excitação de 488 nm, correspondente ao laser azul, e um máximo de emissão em torno de 510 nm, correspondente à cor verde. Para quantificar a expressão de eficiência de transfecção da proteína alvo, a análise de citometria de fluxo das células transfeccionadas é realizada após 24 horas da transfecção com poliplexes pBAEs com eGFP mRNA. Uma etapa de fixação é útil quando as células foram transfeinadas com repórteres fluorescentes como GFP ou RFP.
A Figura 4 mostra a análise qualitativa da expressão eGFP após 24 h de transfecção na linha celular JAWSII. Novamente, em comparação com o controle negativo, o sinal do repórter eGFP é significativamente maior. Além disso, a Tabela 5 mostra a eficiência de transfecção exibida pelas nanopartículas OM-pBAE na linha celular JAWSII. Mais uma vez, os valores de eficiência são comparáveis ao controle positivo realizado com um reagente de transfecção clássica.
A capacidade de PBAEs NPs carregados com OVA mRNA para ativar células imunes modelo foi avaliada transfectando a linha celular JAWSII, uma linha celular dendrítica imatura murina. Para determinar a ativação das células imunes, foram utilizados dois marcadores diferentes: CD11b e CD86. Primeiro, selecione os fluoroforos adequados para a configuração do citômetro de fluxo. Aqui, são utilizados PerCP-Cy5.5 (CD11b) e PE (CD86). As linhas celulares imaturas e não ativadas devem apresentar um perfil CD11b/CD86, enquanto as células ativadas devem apresentar um perfil CD11b+/CD86+. O laser azul a 488 nm é usado para determinar a expressão proteica alvo, e um anticorpo anti-OVA mais um anticorpo anti-mouse-Alexa488 secundário foi empregado. A Tabela 6 mostra o painel final empregado neste experimento. A Figura 5 mostra a capacidade das nanopartículas OM-pBAE carregadas de OVA mRNA para ativar DCs, o que é indicativo da ativação da resposta imune celular. As células não transfectadas mostram um baixo número de células expressando os marcadores de membrana CD11b e CD86, enquanto as células tratadas mRNA OVA OM-pBAEs mostram uma expressão significativamente aumentada dos marcadores CD11b e CD86. Este resultado sugere que as nanopartículas OM-pBAE promovem a maturação. Ao todo, esses resultados confirmam a capacidade das nanopartículas OM-pBAEs de transfectar eficientemente células dendríticas e mediar a ativação da resposta imune promovendo o amadurecimento de DCs imaturos.
Figura 1: Representação esquemática de todo o protocolo sintético. Nesta figura, as etapas de síntese da vacina mRNA são detalhadas, incluindo os parâmetros críticos de caracterização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Síntese de C6-pBAE oligopeptídeo end-modified (OM-pBAE). (A) Produtos químicos crus para realizar a adição de Michael. (B) pBAE + oligopeptídeo. (C) OM-pBAE. R pode ser Histidine (H) ou Lysine (K). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens TEM de nanopartículas OM-pBAE de GFP frescas encapsulando. Os poliplexes foram manchados negativamente para caracterização de microscopia eletrônica. Partículas monodispersas de aproximadamente 60 nm de diâmetro são mostradas. (A) e(B)as imagens representam duas microscopias diferentes da mesma amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens de microscopia de fluorescência de células transfeminadas JAWSII com nanopartículas OM-pBAE/eGFP mRNA. (A) Imagem de campo brilhante. (B) Fluorescência GFP (em verde). (C) Composto das duas imagens anteriores. Barras de escala = 100 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Ativação do JAWSII após transfecção com nanopartículas OM-pBAE/OVA mRNA. Os valores de controle negativo (CN) correspondem à etiqueta preta. As células transfeinadas correspondem ao rótulo cinza. As barras correspondem ao desvio padrão (SD) de três réplicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Material | Material | Microvesículos |
| Índice refrativo | 1.4 | |
| Absorção | 0.01 | |
| Dispersante | Dispersante | Água |
| Temperatura (°C) | 25 | |
| Viscosidade (cP) | 0.8872 | |
| Índice refrativo | 1.33 | |
| Temperatura | Temperatura (°C) | 25 |
| Tempo de equilíbrio (s) | 10 | |
| Célula | Tipo de célula | ZEN0040 |
Tabela 1: Parâmetros para criar um SOP para medições de tamanho.
| Material | Material | Microvesículos |
| Índice refrativo | 1.4 | |
| Absorção | 0.01 | |
| Dispersante | Dispersante | Água |
| Temperatura (°C) | 25 | |
| Viscosidade (cP) | 0.8872 | |
| Índice refrativo | 1.33 | |
| Temperatura | Temperatura (°C) | 25 |
| Tempo de equilíbrio | 10 | |
| Célula | Tipo de célula | DTS1070 |
Tabela 2: Parâmetros para criar um SOP para medidas potenciais de zeta.
| GFP mRNA/OM-pBAE | T (oC) | Diâmetro hidrodinâmico (nm) | PDI | Carga de superfície (mV) | |
| NTA | DLS | ||||
| Fresco | 25 | 124 ± 32 | 134 ± 8 | 0.2 ± 0.04 | 32 ± 0,7 |
| Liofilizado | 25 | 135 ± 35 | 138 ± 2 | 0.17 ± 0.02 | 34 ± 0,7 |
Tabela 3: Caracterização fiicoquímica de nanopartículas OM-pBAE encapsulando OM-pBAE. Os poliplexes OM-pBAE foram caracterizados imediatamente após a preparação - processo de liofilização fresco e pós-liofilização para garantir a estabilidade das partículas. O dimensionamento DLS e NTA e os dados de carga de superfície são mostrados.
| EE% | |
| GFP mRNA/OM-pBAE | 82,3 ± 1,5 |
| OVA mRNA/OM-pBAE | 83,1 ± 1,5 |
Tabela 4: Dados de eficiência de encapsulamento (EE%) de nanopartículas OM-pBAE encapsulando OM-pBAE. Percentuais de eficiência de encapsulamento de nanopartículas OM-pBAE de encapsulamento de GFP e OVA. Oensaio de fluorescência ribogreen foi realizado em amostras liofilizadas para avaliar a quantidade de mRNA preso nos poliplexes.
| Amostra | % células positivas GFP | SD |
| Controle Negativo | 1.85% | 0.21% |
| OM-pBAE/eGFP mRNA células transfectadas | 57.79% | 5.28% |
Tabela 5: Eficiência de transfecção de nanopartículas OM-pBAE/eGFP mRNA na linha celular JAWSII. A eficiência da transfecção foi rastreada pela citometria de fluxo.
| Anticorpo | Células manchadas | Rótulo fluorescente |
| CD11b | DCs ativados | PerCP-Cy 5.5 |
| CD86 | DCs ativados | PE |
| AlexaFluor488 de α-mouse | Células positivas de OVA | AlexaFluor 488 |
Tabela 6: Painel de citometria de fluxo. Este painel foi utilizado para estudos de citometria de fluxo para determinar a funcionalidade in vitro da vacina mRNA.
Informações complementares: Consulte o Arquivo Suplementar com todas as informações complementares incluídas. Clique aqui para baixar abaixo Files.
Tabela S1A: Padrão RNA ribossômico.
Tabela S1B: RNA:pBAE com padrão heparina.
Tabela S1C: Padrão heparina.
Figura S2: 1espectro de proton h-NMR de C6-pBAE e OM-pBAE. (A) 1H-NMR do C6-pBAE. O clorofórmio-d foi usado como solvente (δ = 7,25 ppm). (B) 1H-NMR do C6CH3. D2O foi utilizado como solvente (δ = 4,64 ppm).
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Discussion
Após o surto da pandemia Covid-19 no ano passado, a importância das vacinas em termos de controle de doenças infecciosas tem se manifestado como um componente crítico8. Os esforços de cientistas em todo o mundo permitiram a liberação para o mercado de muitas vacinas. Pela primeira vez na história, as vacinas mRNA demonstraram seu sucesso anteriormente hipótese, graças ao seu rápido design devido à sua capacidade de se adaptar a qualquer novo antígeno dentro de algunsmeses 5,6,21. mRNA, ou ácido ribonucleico mensageiro, refere-se aos ácidos nucleicos que impulsionam a síntese proteica a partir de informações codificadas no DNA. Aqui, para fins de vacinação, o mRNA codifica para uma proteína antigênica pertencente ao microrganismo infeccioso (ou a um antígeno tumoral em caso de vacinação de tumor terapêutico)8,22. Nesse contexto, é fundamental que a comunidade científica tenha protocolos claros para a sintetização das vacinas mRNA.
Com essa ideia em mente, um procedimento simples para sintetizar vacinas mRNA com base nas nanopartículas poliméricas proprietárias foi descrito24. Como descrito na seção de protocolo, primeiro, os polímeros são sintetizados usando um procedimento de duas etapas baseado em uma adição de Michael de aminas primárias a grupos de acrilato para sintetizar espinhas polímeras, seguida pela adição de oligopeptídeos terminais para dar o caráter cônico aprimorado e capacidade de escapar de endossários para os polímeros resultantes12,13,14 . Em seguida, em mais um passo, as nanopartículas são preparadas misturando os polímeros com o mRNA para alcançar sua interação eletrostática para formar pequenas partículas nanométricas.
Embora a síntese dos polímeros seja um protocolo simples, o mesmo não pode ser dito para a formulação de nanopartículas. Muitos colaboradores em todo o mundo têm usado esses polímeros e encontraram passos críticos comuns ao se referir à preparação e uso das partículas. Levando-se em conta que a síntese é por mixagem manual, as habilidades do usuário desempenham um papel crucial. O passo mais complicado é misturar o polímero e o mRNA, que deve ocorrer de forma controlada, pois deve ser feito para o passo de precipitação adicional da mistura à água e à adição do tampão. Qualquer modificação na mecânica da mistura dos dois componentes resultará em micropartículas (em vez de nanopartículas), que não podem ser usadas para humanos. Portanto, a mistura é uma das etapas de solução de problemas que precisa de alguma prática para ser alcançada corretamente.
Outro ponto marcante é a secagem congelante. Como é amplamente conhecido, representa um dos passos de gargalo das nanoformulações. Neste caso específico, levou alguns anos para ajustar todos os parâmetros e descrever um protocolo que teve sucesso15. Mesmo tendo esse ajuste, outra etapa crítica do protocolo é a redispersão das formulações, que, se não realizadas corretamente, trazem agregação de nanopartículas e perdem sua funcionalidade. Neste caso, é impubrável colocar rapidamente as formulações em um ambiente seco e levemente frio para evitar sua reidratação descontrolada. Devido à sua alta natureza higroscópica, deve-se dar atenção especial para reidratá-los de forma controlada, escoando cuidadosamente todo o pó pegajoso formado pela liofilização. Se as amostras se reidratarem de forma não controlada, elas se agregarão imediatamente formando uma translucida à dispersão opaca.
Embora as etapas críticas sejam mencionadas aqui, o protocolo para sintetizar poliplexes pBAE é fácil e rápido, o que é vantajoso entre outros métodos de síntese dos sistemas de entrega de genes. Aqui, a aplicação específica da vacinação mRNA foi fornecida em detalhes. No entanto, representa uma metodologia versátil que também pode ser aplicada para encapsular outros tipos de ácidos nucleicos e uso não vacinal, como em oncologia e campos cardiovasculares, conforme publicado anteriormente13,23,24.
Em conclusão, este protocolo permitirá que esses polímeros proprietários estejam disponíveis para a comunidade científica para projetar novas vacinas mRNA, evitando toda essa solução de problemas. Esses polímeros são vantajosos em comparação com outras formulações lipídicas mRNA em relação à possibilidade de secagem congelante, estabilidade a longo prazo e diminuição dos custos de armazenamento e distribuição por não exigir temperaturas ultra-frias. Portanto, espera-se que as vacinas OM-pBAE desempenham um papel vital no campo de vacinação para aplicações profiláticas e terapêuticas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar nem conflitos de interesse.
Acknowledgments
O apoio financeiro da MINECO/FEDER (subvenções SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 e COV20/01100) é reconhecido. A CGF reconheceu sua Bolsa de Doutorado em QI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
References
- Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
- Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
- Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year. Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).
- Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
- Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines. Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).
- Ulmer, J. B., Geall, A. J. Recent innovations in mRNA vaccines. Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).
- Kranz, L. M., et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).
- Milane, L., Amiji, M. Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine. Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).
- Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).
- Guerrero-Cázares, H., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo. ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).
- Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells. ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).
- Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).
- Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs). Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).
- Fornaguera, C., et al. mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo. Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).
- Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. Á, Cascante, A., Borrós, S. Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes. International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).
- Fornaguera, C., Solans, C. Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles. International Journal of Polymer Science. , (2018).
- Fornaguera, C., Solans, C. Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability. Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Fan, Y. N., et al. Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine. Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).
- Le Moignic, A., et al. Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells. Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).
- Banerji, A., et al. mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach. Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).
- Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).
- Dosta, P., et al. Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide. Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).
- Segovia, N., et al. Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer. Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).
