In Vivo מדידת מומנט איזומטרי של הינדלימב דורסיפלקסור מחזיר

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פרטים ניסיוניים תמציתיים על הערכה ופרשנות של נתוני מומנט in vivo המתקבלים באמצעות גירוי חשמלי של העצב הפרונאלי הנפוץ בחזירים מורדמים.

Abstract

הערכה מהימנה של חוזק שרירי השלד היא ללא ספק מדד התוצאה החשוב ביותר במחקרי מחלות ופציעות נוירומוסקולריות ושלד,במיוחד בעת הערכת היעילות של טיפולים רגנרטיביים. בנוסף, היבט קריטי בתרגום טיפולים רגנרטיביים רבים הוא הפגנת מדרגיות ויעילות במודל גדול של בעלי חיים. תכשירים פיזיולוגיים שונים הוקמו כדי להעריך תכונות תפקוד שריר מהותיות במחקרים מדעיים בסיסיים, בעיקר במודלים של בעלי חיים קטנים. ניתן לסווג את התרגולים כ: in vitro (סיבים מבודדים, צרורות סיבים או שריר שלם), in situ (שריר עם כלי דם שלמים ו העצבנות אך גיד דיסטלי המחובר למתמר כוח), ו - in vivo (מבנים של השריר או יחידת השריר נשארים שלמים). יש חוזקות וחולשות לכל אחת מההכנות הללו; עם זאת, יתרון ברור של בדיקות חוזק in vivo הוא היכולת לבצע מדידות חוזרות ונשנות באותה חיה. כאן מוצגים החומרים והשיטות להערכה מהימנה של המומנט האיזומטרי המיוצר על ידי שרירי הדורסיפלקסור האחוריים in vivo בתגובה לגירוי חשמלי פרונאלי סטנדרטי בחזירים מורדמים.

Introduction

הפונקציה העיקרית של שרירי השלד היא לייצר כוח, שבסופו של דבר הופך פעילויות כגון נשימה, אכילה ואמבולציה לאפשריות. מצבים המפחיתים את יכולת התפקוד של שרירי השלד עלולים להוביל לירידה בביצועים (תעסוקתיים או ספורטיביים), לנכות או למוות. לדוגמה, שמירה על מסת שריר ותפקוד באוכלוסיות מזדקנות קשורה באופן חיובי לאיכות החיים וליכולת לבצע פעילויות בסיסיות ואינסטרומנטליות של חיי היומיום ^1,2. בנוסף, ירידה בכוח השרירים בחולי ניוון שרירים של דושן גורמת לחוסר יכולת לאמבולציה ולכשל נשימתי, ובסופו של דבר תורמת לתמותה מוקדמת^{של 3,4,5}. לפיכך, מדידת כוח השרירים היא מדד תוצאה קריטי במחקרים המערבים מחלה עצבית-שרירית או פציעה.

מומנט איזומטרי מרצון מקסימלי או איזוקינטי (ו/או מדד עייפות) משמש לעתים קרובות כמדד ליכולת תפקודית במחקרים קליניים⁶. במחקרים בבעלי חיים, ניתן לבצע מדידות אנלוגיות in vivo באמצעות גירוי עצבי חשמלי בזמן הרדמה. יש לציין כי תכשירי in vivo הם זעיר פולשניים עם שרירים, גידים, כלי דם ועיוורון שנותרו ללא פגע ולכן מאפשרים הערכות תפקודיות חוזרות ונשנות ^7,8,9,10,11. תכשיר זה נפוץ במודלים של מכרסמים קטנים ובמידה פחותה במודלים גדולים יותר של בעלי חיים כגון ארנבות¹², כלבים^13,14, כבשים¹⁵ וחזירים^16,17. השימוש הכללי במתודולוגיה כזו עשוי להיות בעל השפעה על מחקרים תרגומיים רבים, כגון במודלים מהונדסים גנטית של חזיר (חזיר) של ניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA)¹⁸. כאן מוצגות שיטות להערכת מומנט איזומטרי מקסימלי המושרה על ידי גירוי עצבי של קבוצת השרירים החזירית דורסיפלקסור in vivo. הטכניקות שהוצגו הותאמו בתחילה מאלו שפותחו במקור כדי להעריך את מומנט השריר הקדמי של העכבר^19,20 ולאחר מכן שוכללו באמצעות ניסיון בחקר כושר ייצור המומנט לאחר פציעה 17,21,22,23,24,25,26,27,28 ובמהלך פיתוח¹⁶ במודלים שונים של חזירים.

פרוטוקול זה מדגיש מדידת מומנט איזומטרי in vivo באמצעות מתודולוגיה הדורשת מחשב המשולב עם תא עומס וממריץ חשמלי. השיטות המוצגות כאן משתמשות במנגנון בדיקה משולב מסחרי של לוחית רגל איזומטרית של חזירים, מנגנון פלטפורמה ותוכנה מתאימה (ראו טבלת חומרים). עם זאת, ניתן להתאים את המתודולוגיה לשימוש בתוכנות אחרות הזמינות מסחרית או מותאמות אישית, בהתקני רכישת נתונים ובממריצים. שיטות אלה מיועדות לשימוש בסוויטה כירורגית ייעודית לבעלי חיים גדולים, הגדושה בציוד סטנדרטי כגון: נעילת שולחן כירורגי, שולחן נעילה שני בגובה שווה לפלטפורמת הבדיקה, מכשירי הנשמה וניטור, ומשטח חימום או מכשירים אחרים לשמירה על טמפרטורת הגוף.

חברי הצוות הבאים נדרשים לבצע שיטות אלה: טכנאי הרדמה מיומן אחד ושני אנשי מחקר לביצוע הבדיקה התפקודית. אנשים אלה יעבדו יחד לייצוב הראשוני של הגפה במנגנון הפלטפורמה. לאחר מכן, אחד משני אנשי הצוות יהיה אחראי על מיקום / מיקום האלקטרודה והשני על יישומי המחשב במהלך הבדיקה.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לחוק צער בעלי חיים, לתקנות צער בעלי חיים המיישמות ולעקרונות המדריך לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן. בדיקות קודמות הראו כי שיטות אלה הן אמינות²⁶ ואין להן השפעות שליליות על בריאותו או תפקוד הגפיים של החזיר. הבדיקות נערכו בתדירות גבוהה כמו בשבוע ללא תופעות לוואי²³. בנוסף, ניתן לבצע בדיקה של התערבויות לפני ואחרי ניתוח באותו יום מבלי להפעיל לחץ בלתי פוסק על החיה או לגרום לתפקוד עצבי-שרירי.

1. הגדרת מחשב

1. ודא שההגדרה הראשונית והכיול של המנגנון והרכיבים מתבצעים תחת מפרטי הייצור (ראה טבלת חומרים). מוצע כיול באמצעות טווח משקלים של 0.2-2.5 ק"ג.
   הערה: המומנט נמדד על ידי דוושת רגל 140 מ"מ (0.14 מ') המחוברת לחיישן מומנט ליניארי עם קיבולת של 50 מטר ניוטון (N·m). הרווח של המכשיר צפוי להתרחב לקיבולת של 25 N·m כברירת מחדל כדי להתאים טוב יותר לייצור המומנט הצפוי. הכיול מתבצע על ידי הפעלת מסה ידועה (למשל, 1 ק"ג) על דוושת הרגל במרחק ידוע (למשל, 100 מ"מ מציר הסיבוב) וחישוב מומנט. לדוגמה, 1 ק"ג שווה ל-9.806 N שהוחל ב-0.1 מ' הוא מומנט של 0.9806 N·m. לאחר מכן ניתן ליצור קשר בין המומנט המופעל על חיישן המומנט לבין יציאת המתח המתאימה על ידי חיישן המומנט. חיישני המומנט של המחבר אישרו את הלינאריות של קשר זה בין 0.2-20 ק"ג שהוחלו על לוח כיול מסוים של 40 ס"מ. בשל אורך הדוושה הסטנדרטית, מומלץ טווח כיול של 0.2-2.5 ק"ג. זה מייצר מספיק אות כדי לחשב את גורם קנה המידה על ידי רגרסיה ליניארית.
2. הפעל את המחשב, את הממריץ, את מערכת המתמרים ואת הממשק האנלוגי-דיגיטלי כ-30 דקות לפני הבדיקה כדי לאפשר ייצוב של שינויים בחומרים הקשורים לחום שיכולים להשפיע על תכונות חשמליות. בחר את התקן רכישת הנתונים (DAQ) המתאים והמחובר.
3. הגדר פרמטרים ניסיוניים בתוכנה לפי הצורך; התוכנה מאפשרת תבנית לימוד שמורה. התכונן להגדרת הניסוי (כלומר, תבנית המחקר) ליצירת מחקר חדש באמצעות האפשרות יצירת חוברת עבודה של מחקר חדש .
   הערה: ניתן לטעון מראש פרמטרים ניסיוניים לפני תחילת המחקר, מה שיגרום להנחיות לכלול מידע ספציפי נוסף על הניסוי כגון מין, מסת גוף, תאריך לידה, נקודת הזמן של הבדיקה, קבוצת הטיפול או משתנים דומים לפי הצורך. ניתן לשמור את הפרמטרים של הגדרת המחקר ולהשתמש בהם לאורך הניסוי.
4. בחר את המחקר שנוצר בעבר בתחילת כל הערכה. הוסף חיה חדשה אם זהו המבחן הראשון לבדיקה של החזיר ופעל לפי ההנחיה להזנת המשתנים למחקר.
5. לחץ על הכן ניסוי ברגע שיהיה מוכן להתחיל את המחקר, אשר יהיה צורך כדי לייעל את מיקום האלקטרודות. ספקו עוויתות חוזרות לעצב תוך קביעת מיקום אופטימלי לאחר הצבת האלקטרודות (ראו שלב 3.6).
6. לחץ תחילה על הגדר סטים מיידיים ולאחר מכן התאם את תדירות הדופק, רוחב הדופק, מספר הפולסים, תדירות הרכבת וזמן הריצה.
7. לאחר מכן, לחץ על סים מיידי כדי לספק עוויתות חוזרות. לחלופין, לחץ על לחצן ההדק הידני ביחידת הממריץ כדי לתת עווית אחת באופן ידני.
8. פתח את צג הנתונים החיים במהלך פרוטוקול המחקר כאשר אתה מוכן להתחיל את הניסוי כולו כדי לאפשר חקירה/הדמיה בזמן אמת של הצירים. לחץ על הפעל ניסוי כאשר אתה מוכן להתחיל את הניסוי (לאחר הכנת בעלי חיים, ראה שלב 2).

2. הכנה ותחזוקת הרדמה

1. חזירים זכרים או נקבות מהירים, 40-90 ק"ג, לילה לפני אירוע ההרדמה, מאפשרים מים עד ליביטום. להשיג ולרשום את משקל הגוף הנכון של החזיר ביום ההליך.
2. לגרום להרדמה עם זריקות תוך שריריות של טילטמין/זולצפאם (טלזול, 4-6 מ"ג/ק"ג), קסילאזין (1-3 מ"ג/ק"ג) ופרופופול (2.6 מ"ג/ק"ג). בתחילה לשמור עם 5% isoflurane באמצעות מסכת פנים.
3. אינטובציה של החזיר עם צינור אנדוטרכאלי והניחו אותו על מכונת הנשמה אוטומטית. שמרו על החזיר בלחץ שיא של 20 ס"מ גובה₂O, נפח גאות ראשוני של 10 מ"ל/ק"ג, וקצבי נשימה של 8-12 נשימות לדקה.
4. התאם את הגדרת מכונת ההנשמה כדי לשמור על PCO₂ מקצה גאות ושפל של 40 ± 5 מ"מ כספית. שמור על הרדמה עם 1%-3% איזופלורן ב 30%-37% O₂.
5. שמור על טמפרטורת הגוף של החזיר ב 37 °C (84 °F) למשך הפרוטוקול. הכנס וריד אוזניים וצנתרי פולי להעברת נוזלים ואיסוף שתן, לפי הצורך.
   הערה: שימוש בהרדמה במישור הניתוח ימנע התכווצויות משניות במהלך הבדיקה, במיוחד משרירי העכוז.
6. עקוב אחר עומק ההרדמה באמצעות רפלקס עיניים ומיקום, חוסר גוון לסת, קצב לב (טווח 80-150 פעימות לדקה), לחץ דם סיסטולי (טווח 120-70 מ"מ כספית), או שילוב של כל הסימנים הללו.
7. מכינים גם את האחוריים הימניים וגם את האחוריים השמאליים לאחר שהחזיר מורדם באופן מלא ויציב על ידי ניקוי הגפיים תחילה במים וסבון כדי להסיר כל פסולת ולאחר מכן לגלח את השיער מהעור. שימו לב היטב לאזור הברך הצדדי, שישמש למיקום אלקטרודות בהמשך.
8. העבירו את החזיר לשולחן כירורגי והניחו אותו בבטחה בתנוחת השכיבה. מקם את החזיר לכיוון מרגלות השולחן עם שרירי העכוז בקצה השולחן או מעט מעליו.
   הערה: זה יאפשר לשולחן הניתוח ולשולחן האוחזים במנגנון הבדיקה לפעול.
9. הוציאו את החזיר לאחר הבדיקה ואפשרו לו להתאושש. יש להחליף מזון ומים סטנדרטיים לחזירים לאחר שהחזיר מתאושש לחלוטין ויכול לשקוע בחופשיות בתוך הכלוב.
   הערה: משכך כאבים לאחר ההליך אינו נחוץ לבדיקות in vivo בלבד; עם זאת, ניתן לספק קרפרופן ו/או בופרנורפין SR בהתאם להמלצה וטרינרית. מומלץ להתייעץ עם וטרינר מקומי. ההרדמה והתרופות המפורטות כאן מיועדות להדרכה בלבד ומאושרות כיום באוניברסיטת מינסוטה. תחזוקת ההרדמה עם איזופלורן נבחרה על סמך הופעתה המהירה וההסטה שלה והשפעתה המינימלית על גירוי עצבי in vivo עוררה מומנט²⁹. הקפידו על עקביות בפרמטרים של הרדמה במחקרים שונים. במהלך הפרוטוקול, הערכת הרדמה והקלטה מתבצעת במרווחים של 15 דקות; ההקלטה מתבצעת על סמך הנחיות ודרישות של הוועדה המוסדית המקומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ומשרד החקלאות של ארצות הברית (USDA).

3. הערכת מומנט איזומטרי in vivo

1. הניחו את כף הרגל על לוחית כף הרגל של מתמר הכוח. השתמשו בתחבושת מלוכדת וגמישה כדי לחבר את כף הרגל ללוח כף הרגל.
   הערה: יש צורך בתפקיד שלם לכל רגל; באופן אידיאלי, תפקיד 4 אינץ 'x 5 יארד הוא מספיק.
2. החזיקו את כף הרגל במקומה על לוחית כף הרגל עם הקרסול בניטרלי (A) והצמידו את כף הרגל לצלחת על ידי עטיפת התחבושת המגובשת סביב כף הרגל ולוחית הרגליים בסגנון של סל סגור לאריגת קרסול (B).
   הערה: שני אנשי המחקר יידרשו לבצע בו-זמנית את המשימות הבודדות (A) ו-(B).
3. מקם את הקרסול בזווית ישרה לאחר שהרגל מחוברת ללוח כף הרגל, המוגדר כ- 0° או נייטרלי להתייחסות לדרגות של פלנטר או דורסיפלקסיה.

איור 1: תמונות מנקודות תצפית שונות מראות את החיבור של החזיר ללוחית הרגליים ואת היישור האנטומי למסגרת. ציוני דרך אנטומיים לשרירי התא הקדמי, הראש הפיבולרי, הברך, הרמה הטיביאלית ועצם הירך מצוינים. שים לב למיקום של זוגות אלקטרודות תת-עוריות בצד הצדדי של הרגל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. ייצבו את הברך והקרסול בזוויות ישרות.
5. ראשית, מקם את מוטות הידוק הגפיים קרוב למיקומים הדרושים. כאשר אתה מוכן, החל מההיבט המדיאלי של הגפה, יישר את מוט הידוק הגפיים בערך ברמה הטיביאלית.
6. לאחר מכן, יישרו את מוט הידוק הגפיים הצדדיות בראש הדיסטלי של עצם הירך.
   הערה: בין הקצה של כל איבר, מוט ההידוק משתמש במשטח גזה מקופל בגודל 4 על 4 כדי להגן על העור הסמוך למוט.
7. ייצבו את הסורגים בחוזקה באמצעות אגודלי הנעילה.
   הערה: מוטות הידוק הגפיים לא יהיו בקו אחד עם השני אלא יתיישרו עם האנטומיה של החזיר.
8. נקו את העור סביב הראש הפיבולרי על ידי מריחת 70% אלכוהול באמצעות גזה נקייה במעגלים קונצנטריים המתחילים במרכז מיקום האלקטרודות המיועד ונעים החוצה. מקם את המחט המלעורית הסטרילית (50 מ"מ, 26 G מונופולר) ואלקטרודות בסגנון אלקטרומיוגרפיה (EMG) (ראה טבלת חומרים) על פני העצב הפרוניאלי. שתל אלקטרודות תת-עוריות, בערך 5-10 מ"מ.
9. מטב את מיקום האלקטרודות באמצעות הגדלת משרעת הזרם, כפי שהיא מותאמת על הגירוי. התחילו ב-100 mA והגדילו לפי הצורך.
   הערה: 300-500 mA נדרש בדרך כלל עבור מומנט עוויתות שיא.
10. דמיינו את גודל מומנט העוויתות בתצוגת הנתונים החיים ומעל התא הקדמי של החזיר; הפרסות עשויות לשחק ולנוע גם כלפי מעלה.
11. ודא שהתא האחורי, או עצב השוקה, אינו מופעל במהלך הגירוי. בחינה חזותית ומישוש התכווצות התא האחורי ותנועה כלפי מטה של פרסות במהלך הגירוי.
12. בדוק את אזור הרמה של התכווצות טטנית מהמעקב אחר זמן המומנט החי בשלבים הבאים להיעדר גיוס שרירים אנטגוניסטיים (כלומר, פלנטרפלקסיה לפרוטוקול זה).
13. עורר מומנט טטאני איזומטרי מקסימלי באמצעות פרמטרי הגירוי הבאים: 100 הרץ, רוחב פולס של 0.1 אלפיות השנייה, מעל רכבת של 800 אלפיות השנייה¹⁷, לאחר אופטימיזציה של מיקום האלקטרודה ואמפליטודות הגירוי.
    הערה: ניתן להשתמש בפרמטרים אלה להערכות חוזים שונות.

4. פרוטוקול לניתוח זווית מומנט-מפרק

1. מדוד את המומנט הטטאני האיזומטרי המרבי על פני טווח של תנוחות קרסול, החל מנייטרלי ועד לטווחי הקצה הקרובים של פלנטרפלקסיה, או 0-50° של פלנטרפלקסיה.
   הערה: שימוש במרווחים של 10° ידרוש שישה צירים, וניתן להתאים את השינוי המצטבר לשאלות ניסיוניות ספציפיות.
2. התחילו לשחרר את שני ברגי הנעילה של שלב הגוניומטר כדי לנוע בין זוויות המפרקים. ודא ששני בורגי הנעילה מהודקים לפני ההתכווצות הבאה.
   הערה: הגוניומטר כתוב עם סימוני מעלות כדי לאפשר יישור מדויק. ככל הנראה מדובר ב-0° של כיפוף פלנטרי, אשר מוסט על ידי 180° על הגוניומטר. יש לנקוט משנה זהירות כדי להבטיח את המיקום המיועד.
3. לקבוע את הזמן בין הצירים באופן ניסיוני; עם זאת, 2 דקות מספיק כדי למנוע עייפות.
   הערה: כאשר זווית מפרק הקרסול משתנה בהדרגה, אלקטרודות המחט עשויות לזוז. ייתכן שיהיה צורך לאשר את מיקום האלקטרודות עם התכווצויות עוויתות, כפי שצוין לעיל (ראה שלב 3.8).

5. פרוטוקול לניתוח תדר מומנט

1. מקם את הקרסול בזווית המפרק הרצויה. הקפידו, באופן ניסיוני, לבצע בדיקות באותה זווית מפרק בכל פעם.
   הערה: בדרך כלל, ניתוחי תדר מומנט מבוצעים בזווית מפרק אחת המתאימה למומנט איזומטרי שיא הנגזר מניתוח זווית מומנט-מפרק. מומנט שיא מיוצר ב ~30-35° של plantarflexion.
2. מדוד מומנט איזומטרי מקסימלי על פני טווח של תדרי גירוי הגורמים לרכבות לא מפוספסות של עוויתות עד ומעבר לאלה הגורמות לטטאני שהתמזגו במלואן.
   הערה: ניתן להשיג זאת על ידי גירוי ב- 10, 20, 40, 60 ו- 100 הרץ (רוחב דופק של 0.1 אלפיות השנייה; רכבת של 800 אלפיות השנייה) עם 2 דקות בין כל התכווצות כדי למנוע עייפות. בהתאם לשאלות ניסיוניות מדויקות ולמודלים ספציפיים של חזירים, ניתן להתאים תדרים. המצע הביו-אנרגטי המשמש ככל הנראה במהלך התכווצות של 800 אלפיות השנייה לשמירה על ATP תוך-תאי הוא פוספוקריאטין³⁰, והסינתזה של פוספוקריאטין מסתמכת על מעבורת פוספוקריאטין³¹. קינטיקה של התאוששות פוספוקריאטין מצביעה על התאוששות מרשימה של 90% או יותר בין 90-120 שניות לאחר שההתכווצות מסתיימת^ב-30. לכן, מרווחי המנוחה המומלצים בין התכווצויות הם 90-120 שניות. אמנם, זה עשוי להיות מושפע מתכנון ניסיוני, כולל מחלות שרירים, פציעה ו / או הזדקנות.

6. ניתוח נתונים

1. לחץ על נתח תוצאות אם עדיין נמצא בתוכנה כדי לפתוח את החלון ניתוח. לחלופין, פתח את תוכנית הניתוח ישירות.
2. בין אם באמצעות פלטפורמת נתונים אוטומטית או ניתוח ידני, חשב את המשתנים השונים בניתוח צורות גל איזומטריות בודדות.
   הערה: משתנים אלה כוללים: מומנט עווית מקסימלי, מומנט טטאני מקסימלי ותכונות התכווצות הקשורות לעוויתות וטטאני, למשל, זמן לשיא וחצי הרפיה. משתנים ניסיוניים רבים יכולים לנרמל את הכוח, לדוגמה, משקל הגוף, נפח השריר שנקבע מ-MRI (הדמיית תהודה מגנטית) או CT (טומוגרפיה ממוחשבת), או משקל שריר סופני. מוצגים גם מומנט מוחלט (N·m) וגם מומנט מנורמל למסת הגוף (N·m/kg). מומנט המנוחה המונח על לוחית הרגליים יהיה שונה בניסויים. יש ליישם תיקון בסיסי למומנט המנוחה כדי להבטיח תירשם עווית מקסימלית ומומנטים טטניים אמיתיים. מומנט הבסיס בכל זווית מפרק נרשם ויכול להצביע על שינויים במומנט הפסיבי.

Representative Results

אמינות ואופטימיזציה של פרמטרי הבדיקה in vivo של התא הקדמי של החזיר דווחו בעבר²⁶. כמו כן דווח על נתונים השוואתיים על פני מכרסמים וחזירים לתדר מומנט²⁷.

במהלך הערכת in vivo , יש צורך בהדמיה של צורת גל המומנט בזמן אמת כדי להבטיח הפעלה מתאימה של התא הקדמי. צורות הגל צריכות לשקף רק דורסיפלקסיה. צורות הגל צריכות להיות בעלות מראה חלק ומעוגל ומישור טטאני לכאורה (איור 2A). חוסר עקביות או הפרעות של צורת הגל מצביעים על מגבלות ניסיוניות שונות, כגון גירוי לא מספק, מיקום לא תקין של אלקטרודות או עומק הרדמה לא הולם (איור 2B).

איור 3A הוא מעקב אחר מומנט עוויתות עם חץ המציין מומנט מרבי של 50%. התכווצות מזמן לשיא צריכה להתחיל בהתנעת הממריץ ולהסתיים כאשר מושג מומנט עווית מקסימלי (פסי זמן מייצגים מוצגים מתחת למעקב). חצי הרפיה עבור עווית אמורה להתחיל במומנט העוויתות המקסימלי ולהסתיים במומנט עווית מקסימלי של 50% (פסי זמן מייצגים מוצגים מתחת למעקב). איור 3B הוא מעקב מומנט טטאני אחר זמן עם חץ המציין מומנט מרבי של 50%. שלא כמו עוויתות שהן אידיאליות במונחים של מומנט מקסימלי סופי ומתוזמן, להתכווצויות טטניות יש שונות רבה יותר בתזמון המומנט המקסימלי לגבי מתי הגירוי מתחיל ומסתיים, ודורשות גישה ניואנסית יותר לניתוח תכונות התכווצות. התכווצות מזמן לשיא צריכה להתחיל עם ייזום הממריץ ולעצור איפשהו בין 90%-100% מהמומנט המרבי. פסי הזמן באיור 3B מראים ניתוק של 95% מומנט מקסימלי. זה מועיל במקרים כגון הנתונים המייצגים שנבחרו מכיוון שהמומנט המרבי לא מגיע עד שלב הרמה המאוחר. ניתוח משלים לזמן עד לשיא הוא קצב ההתכווצות הממוצע. המוטות המקווקווים על הגפה העולה של מעקב זמן המומנט מייצגים טווח של 30%-70% מומנט מקסימלי. יש להתחיל את שיעור ההתכווצות הממוצע בתחילת הגירוי ולתפוס את שינוי הקצב הממוצע בין 30%-70% מומנט מקסימלי. אלה הם טווחים מומלצים, וקבוצות מחקר בודדות יכולות לקבוע את הטווח האידיאלי סביב 50% (למשל, ±10%). החלק החשוב הוא להיות עקביים בתוך המחקרים ולרוחבם. בניגוד לעווית, חצי הרפיה של התכווצות טטנית צריכה להתחיל בסוף הגירוי במקום במומנט מקסימלי מאותה סיבה שהוזכרה לעיל עם זמן לשיא. סרגלי הזמן באיור 3B מייצגים את הזמן שבין סוף הגירוי לבין ההגעה ל-50% רגיעה. ניתוח משלים לחצי הרפיה הוא שיעור הרגיעה הממוצע. המוטות המקווקווים על הגפה היורדת של מעקב המומנט מייצגים את אותו טווח מומנט מקסימלי של 30%-70% כמו הגפה העולה. שיעור ההרפיה הממוצע צריך להתחיל בסוף הגירוי ולתפוס את קצב השינוי הממוצע בין 30%-70% מומנט מקסימלי. שוב, אלה הם טווחים מומלצים. הערה קריטית אחת: אל תבלבלו את הקצב הממוצע של התכווצות/הרפיה עם הקצב המקסימלי של התכווצות/הרפיה. הקצב המקסימלי מייצג את שינוי הקצב המדהים ביותר בין שתי נקודות נתונים סמוכות ויכול להיות משתנה באופן נרחב.

ניתן לנתח מספר תכונות עוויתות והתכווצויות כדי לקבל תובנה לגבי סוג הסיבים ותכונות צימוד העירור-כיווץ של שרירי השלד^10,32. פרשנות יתר של עוויתות ותכונות התכווצות מוזהרות; הם מייצגים הצעות ורציונל להמשך חקירה ברמה התאית ואינם מעידים בהכרח. באופן כללי, שיעורי התכווצות יכולים לשקף את שחרור הסידן של הרשתית הסרקופלסמית ואת קצב האיזופורם האיזופורמי של שרשרת כבדה של מיוזין. לעומת זאת, קצבי הרפיה יכולים לשקף את קצב האנזים רטיקולום פלסמי של סרקו(אנדו)סידן ATPase ואיזופורם. תכונות אלה יכולות להיות מושפעות מעייפות, נזק לשרירים, אימון גופני ופתולוגיות רבות (למשל, ניוון שימוש לרעה).

איור 4 מתאר ערכים מייצגים עבור יחסי זווית מומנט-תדר ומומנט-מפרק עבור גפיים לא מכוונות. נתונים אלה מייצגים מגוון רחב של גדלי חזירים.

ניתוח מייצג וניסיוני של EMG על פני השטח נערך במהלך ניתוח שרירים in vivo (איור 5) כדי להדגים שליטה ניסיונית בקידוד קצב ובפעילות השרירים הכוללת. אלקטרודות EMG דביקות הונחו במרכז הבטן של הפרונוס טרטיוס. אלקטרודה קרקעית הונחה על הברך כדי למזער את ממצאי הגירוי, ומחטי אלקטרודות גירוי הונחו סביב העצב הפרוקסימלי הפרוקסימלי למיקום השריר. הקלטות מומנט ו-EMG סימולטניות נעשו בתדרי גירוי של 20, 60 ו-100 הרץ. מספר הפולסים הממריצים (פסים אדומים באיור 5) משקף את מנת משך הגירוי ואת הזמן שבין הפולסים. לדוגמה, תדר גירוי של 20 הרץ פירושו דופק כל 50 אלפיות השנייה; לכן, משך הגירוי של 400 אלפיות השנייה חלקי 50 אלפיות השנייה בין הפולסים שווה לשמונה פולסים שנמסרו (איור 5A). פולסים ממריץ מועברים לאקסון העצבי באמצעות מיקום אלקטרודות מחט מלעורית ומייצרים מספר דומה של פולסים חשמליים של שרירים (כלומר, 20 הרץ שווה ל-8 הקלטות EMG), מה שמדגים את השליטה הניסיונית בתדר פוטנציאל הפעולה של קבוצת השרירים המעניינת. ניתן להמיר את הקלטות ה-EMG הגולמיות באמצעות ניתוח שורש-ממוצע-ריבועי (EMG RMS) כדי להמחיש את פעילות השריר הכוללת עם תדירות גירוי גוברת. האזור שמתחת לניתוח העקומה (AUC) הוא אחת הדרכים לכמת את ה-EMG RMS כדי לקבוע שינויים בפעילות השרירים כולה. מסופקים AUCs מייצגים עבור כל תדר גירוי EMG RMS (איור 5A-C).

איור 2: צורות גל מייצגות באיכות גבוהה ונמוכה. (B) צורות גל באיכות נמוכה יכולות לנבוע מגירוי לקוי או ממיקום לא תקין של אלקטרודות. במקרים אלה, יש צורך במיקום מחדש של האלקטרודות. גם עבור A וגם עבור B, פולסים מגרים (פסים אדומים) מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: עוויתות וניתוח תכונות התכווצות טטניות. (A) עוויתות מייצגות (1 הרץ) ו-(B) מעקבי מומנט טטניים (100 הרץ) משתנים כדי לפרט את תכונות ההתכווצות. החץ האדום בכל גרף מראה מומנט מקסימלי של 50%. פסים כחולים ושחורים מתחת למעקבים מראים משכי זמן של זמן עד שיא וחצי הרפיה, בהתאמה. מוטות מקווקווים על הגפיים העולות והיורדות של מעקב המומנט הטטאני אחר זמן מייצגים טווח של 30%-70% מומנט מקסימלי שניתן להשתמש בו כדי לקבוע את הקצב הממוצע של התכווצות או הרפיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: נתונים לדוגמה של זווית מפרק המומנט ותדר המומנט. הנתונים שסופקו הם ממגוון של נקבות חזירי צלב יורקשייר ב 2.9-6.3 חודשים; 39.4-75.4 ק"ג מסת גוף; כולם נחשבים לשליטה בריאה בזמן ההערכה. במהלך כל הבדיקות, טמפרטורת הליבה של הגוף נשמרה על 37 °C. (A) מומנט מנורמל למסת הגוף מוערך במפרקי הקרסול של 0-50° של plantarflexion; שימו לב שמומנט השיא נקבע ב-30 מעלות. (B) מומנט מנורמל למסת הגוף מוערך בתדרי גירוי שונים מ-10 עד 100 הרץ; שים לב שהערכות אלה נערכו עם מפרק הקרסול ב 30° של plantarflexion. (C) הוערכו מעקבי מומנט בודדים עבור כל אחד מתדרי הגירוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: מומנט איזומטרי in vivo בו-זמני ומדידות EMG. הקלטות EMG ומומנט סימולטניות בתדרי גירוי מייצגים של (A) 20, (B) 60 ו-(C) 100 הרץ שנאספו מנקבת חזיר יורקשייר (כ-90 ק"ג מסת גוף). פולסים מגרים (פסים אדומים) נמסרו על פי תדירות הגירוי שנקבעה. הקלטות EMG גולמיות הומרו לריבוע שורש-ממוצע (EMG RMS) כדי לדמיין את פעילות השרירים הכוללת עם תדירות גירוי גוברת. עקומות EMG RMS מייצגות נותחו עבור האזור שמתחת לעקומה (AUC), ו- AUCs מסופקים עבור כל תדר גירוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

שלבים קריטיים, שינויים ופתרון בעיות
כדי למזער את השתנות הנתונים ולמקסם את הצלחת הגישה, מודגשים השלבים הקריטיים הבאים.

גירוי עצבי אופטימלי
גישה ניסיונית זו מתחילה בדה-פולריזציה של אקסון העצבים ומסתמכת על מיקום נכון של האלקטרודות ועל גירוי חשמלי אופטימלי. ניתוח לאחר המוות של אנטומיה עצבית הקשורה לציוני דרך בוניים יכול לעזור לדמיין מיקום נכון של אלקטרודות במהלך הבדיקה. רכישת מומנט עוויתות מקסימלי מסייעת בקביעת זרם מתאים (במיליאמפרות; mA) המועבר לאקסון העצבי. ישנם שני ערכים שיש לזכור בעת אופטימיזציה של גירוי עצבי בתחילת הבדיקה: (1) היחס בין עווית לטטניקה הוא ~1:5, למשל, מומנט עוויתות של ~2 N·m מתאים למומנט טטאני של 10 N·m (איור 3); ו-(2) המומנט האופייני למסת הגוף הוא ~0.3 N·m לכל מסת גוף של ק"ג (איור 4). אם מומנטי השיא של עוויתות נראים נמוכים, הסר את האלקטרודות ונסה מיקום אחר. הקפד לבדוק הגדרות מגרה, חיבורי BNC וחיבורי אלקטרודות. ייתכן שיהיה צורך במיקום מחדש של האלקטרודה בין התכווצויות אם יש יותר מדי תנועה במהלך מיקום הגפה בין זוויות המפרקים, כפי שצוין לעיל (איור 2). שים לב שגישות ניסיוניות והתערבותיות עשויות להשפיע על ערכים אלה.

יישור ביומכני תקין
אורך השריר ההתחלתי משפיע על כוח התכווצות השריר (הקשר בין אורך למתח), ואורך השריר יכול להשתנות בהתאם ליישור מפרק הירך, הברך והקרסול. זוויות המפרק חייבות להיות סטנדרטיות בין הגפיים ובין חזירים. זווית מפרק קרסול 90° מומלצת בחום לירך ולברך. תנוחת קרסול מעט פלנטרית (כ-30° מזווית מפרק הקרסול הנייטרלית של 0° ) אופטימלית לחוזק שיא. הוא משקף את המיקום האנטומי הטבעי של מפרק הקרסול הן בחזירים והן בכלבים בזמן העמידה. כל המפרקים צריכים להיות מקבילים גם עם מתמרים של דוושת כף הרגל והמומנט כדי למנוע אובדן מומנט מדיד בשל התרומה של וקטור מומנט מאונך. מומלץ מאוד לבחון את זוויות מפרק הירך-ברך-קרסול ואת יישור מפרק הדוושה-כף-רגל לאחר הצמדת כף הרגל לדוושת כף הרגל ואבטחת מפרק הברך באמצעות מוטות הידוק הגפיים (איור 1). אם יש חוסר התאמה, לפתוח ולהסיר את הסורגים ולמקם מחדש את החזיר על שולחן הניתוח. בעוד שסטנדרטיזציה של זוויות משותפות בין מחקרים היא קריטית למזעור השונות בנתונים, ישנן מגבלות ליישור ביומכני בולטות, שיידונו להלן.

משמעות ביחס לשיטות קיימות או חלופיות
דוגמאות מתחלפות להערכות רלוונטיות מבחינה קלינית ולא פולשניות של תפקוד השרירים שיכולות לשמש למודלים של חזירים כוללות מרחק הליכה של הליכון, EMG ואלקטרוגרפיה פעילה של גלי גזירה בשרירים. כמבחן הליכה של 6 דקות בבני אדם, מבחן הליכה על הליכון יכול להעריך את התקדמות המחלה ואת הצלחת ההתערבות בבעלי חיים גדולים 33,34,35. בדרך כלל, לאחר תקופת התאקלמות, בעלי חיים הולכים עד סוף הציות במהירויות הליכון שונות ו/או ברמות שיפוע שונות. תגמולי מזון נחוצים לעתים קרובות כדי להשיג מוטיבציה מקסימלית. עם זאת, תוצאות הליכה בהליכון מציעות רק פרשנויות עקיפות לתפקוד התכווצות השרירים בשל מגבלות כגון מוטיבציה של הנושא, גיוס יחידות מוטוריות לא מקסימליות ותלות משותפת מובנית במערכות גוף אחרות כגון מערכות הלב וכלי הדם, השלד והנשימה.

מצד שני, EMG מציע הערכה ישירה מעט טובה יותר של מערכת שרירי השלד, שכן אלקטרודות EMG ממוקמות ישירות על קבוצת השרירים המעניינת 36,37,38. אלקטרודות EMG מודדות את פעילות השרירים הקולקטיבית (סיבי שריר דה-קוטביים). פעילות שרירים זו מבוססת על גיוס יחידות מוטוריות וקידוד קצב (תדירות פוטנציאל הפעולה הנשלח ליחידות מוטוריות מגויסות). עם זאת, הפרדת התרומות היחסיות של גיוס יחידות מוטוריות לעומת קידוד שיעור אינה אפשרית עם EMG פני השטח. יתר על כן, EMG מסתמך על נכונות הנושא ליצור התכווצויות מקסימליות, ורמה זו של שיתוף פעולה אינה סבירה במודלים של בעלי חיים גדולים. בעוד שזה יכול להיות אינפורמטיבי להעריך שינויים ב- EMG במהלך מחזור ההליכה, נתונים אלה אינם מייצגים יכולת תפקודית מקסימלית של קבוצת שרירי השלד המעניינת. הדמיה מבוססת אולטרסאונד המשתמשת במצב B ואלסטוגרפיה של גלי גזירה היא שיטה לא פולשנית נוספת המשמשת להערכת תפקוד השרירים. יש מתאם טוב בין המודולוס של יאנג שנמדד על ידי אלסטוגרפיה לבין הגדלת עומסי השרירים^39,40. אלסטוגרפיה של גלי גזירה אומתה ושימשה כמדד כמותי לנוקשות רקמות פסיבית 41,42,43,44,45, כולל במודל פגיעה באובדן שרירים נפחיים חזיריים ²³. זה יכול לשמש גם כמדידה עקיפה של ייצור כוח שריר פעיל³⁹. עם זאת, עדיין קיימות מגבלות הדומות ל- EMG לנכונות הנושא ולשיתוף פעולה לביצוע התכווצויות.

פרוטוקול in vivo המתואר כאן, בניגוד למרחק הליכה של הליכון ו- EMG, מספק הערכה אמינה, ניתנת לשחזור ומקסימלית של תפקוד השרירים. פרוטוקול זה מעורר התכווצויות שרירים באופן מבוקר וניתן לכימות שאינו תלוי במוטיבציה. באופן ספציפי, אלקטרודות מלעוריות משמשות כדי לעורר אקסונים עצבים לעקוף את מערכת העצבים המרכזית. דה-פולריזציה של האקסונים העצביים מפעילה את כל היחידות המוטוריות ומבטלת את השונות הקשורה לגיוס יחידות מוטוריות. בנוסף, החוקר שולט בקידוד קצב (תדירות גירוי). הפיזיולוגיה הנוירומוסקולרית המתקבלת החלה על גישה זו מתחילה בהפעלת תעלת נתרן מגודרת מתח בצמתים של Ranvier. כל הפיזיולוגיה הבאה (או במורד הזרם) עוסקת, כולל צימוד עירור-התכווצות ורכיבה על אופניים חוצי גשרים. יתרון משמעותי של ניתוח השרירים הלא פולשניים in vivo הוא שניתן למדוד את תפקוד השרירים המתכווצים שוב ושוב, למשל, מדי שבוע, כדי לעקוב אחר חוזק השרירים לאחר פציעה, התערבות או על התקדמות המחלה.

מגבלות השיטה
ציוד in vivo המתואר בפרוטוקול זה מאפשר מומנט איזומטרי פסיבי ואקטיבי כפונקציה של זווית המפרקים ותדירות הגירוי. מנגנון הבדיקה שבו נעשה שימוש אינו תומך במדידת התכווצויות דינמיות (למשל, התכווצויות אקסצנטריות איזוקינטיות או קונצנטריות קונצנטריות). המנגנון מאפשר טווח תנועה של 105° כדי לאפיין את יחסי זווית המומנט-מפרק ומשתמש בתא עומס עם טווח מומנט מרבי של כ-50 N·m. שאלות ניסיוניות ספציפיות עשויות לדרוש מאפייני ביצועים מחוץ למפרטים אלה. יש לציין כי תא ההעמסה במנגנון המתואר הזה עשוי להיות מוחלף בטווחי מומנט גדולים יותר במידת הצורך.

לפרוטוקול המתואר כאן למדידת חוזק עצבי-שרירי מקסימלי in vivo יש מגבלות בולטות. ראשית, שיטה זו דורשת הרדמה, אשר עשויה להתבצע באופן שונה לפי פרוטוקולים ומשאבים של מתקן בעלי חיים. ידוע כי להרדמה יש השפעות שונות על תפקוד הנוירומוסקולרי והוכח כי הן משנות את ייצור מומנט ה-in vivo dorsiflexor של עכבר באופן מסוג הרדמה^{ותלוי מינון 29}. ההשפעות הדיפרנציאליות של חומרי הרדמה על מומנט ה-in vivo של בעלי החיים הגדולים אינן ברורות; לכן, קבוצות בקרה וניסויים חייבות להיות בעלות אותם חומרי הרדמה (למשל, כל הקבוצות שקיבלו קטמין) כדי לשלוט בשונות זו. שנית, ההסתמכות על דפוסי דיפוזיה in vivo מגבילה את חקר המנגנונים התאיים של אין-אונות-אונות של אין-אונות-תפקוד של תרופות מתכווצות ורעילות חריפה של תרופות. לדוגמה, ניתן להשתמש בקפאין במהלך בדיקת אמבטיית איברים במבחנה של שריר מבודד כדי לעורר שחרור סידן של רשתית סרקופלסמית, תוך עקיפת צימוד עירור-התכווצות⁴⁶ ישירות. כמות הקפאין כדי לגרום לאפקט זה (mM) היא קטלנית בסביבה in vivo . יהיה צורך לקחת בחשבון את השפעות התרופות על כל הגוף (למשל, סטרס בכליות/כבד) ובגורמים הבאים המופרשים למחזור הדם אם גישה זו משמשת לבדיקת תרופות על חוזק שרירים חריף²³. שלישית, השימוש בגירוי עצבי חשמלי מקסימלי חורג מאסטרטגיות גיוס וולונטריות, כפי שפורט לעיל, ולכן אינו משקף שינויים בחוזק שעשויים לנבוע מהתאמות גיוס נוירומוסקולריות.

מדידות מומנט In vivo עשויות להיות מוגבלות גם בכל הנוגע להקמת מנגנון ספציפי לתצפיות ניסיוניות. לדוגמה, המומנט על מפרק הקרסול תלוי לא רק בייצור כוח השריר אלא גם בתכונות הגיד והמפרק ורקמות החיבור. יתר על כן, הכוח נוצר על ידי קבוצות של שרירים, במיוחד הפלקסורים הכפיים (שרירי הגסטרוקנמיוס, הסולאוס והפלנטריס) והדורסיפלקסורים (פרונוס טרטיוס, טיביאליס ושרירי דיגיטורום) בחזירים. לכן, פרשנויות של נתוני מומנט in vivo מקסימליים דורשות התייחסות לשינויים פוטנציאליים בשרירים ואנטומיים, והן מוגבלות לקבוצות שרירים, ולא לשרירים בודדים. באופן דומה, קבוצות שרירים מורכבות לעתים קרובות מתערובת של סיבי שריר מהירים ואיטיים בעיקר, כגון שרירי הגסטרוקנמיוס והסולאוס, בהתאמה, של הפלקסורים הכפיים. תכונות התכווצות כגון קצב התכווצות והרפיה (או התכווצות מזמן לשיא וזמן הרפיה למחצה) אינן אינדיקטורים אמינים לפיזיולוגיה של סוג הסיבים באמצעות תכשירי in vivo לעומת שרירים מבודדים, כגון פרוטוקולי בדיקת in vitro או in situ ⁴⁷. תכשירי שרירים מבודדים עדיפים גם בהבנת ההשפעה של פרמטרים ביומכניים על תפקוד השריר מכיוון שניתן לשלוט במדויק בתכונות כגון אורך השריר; חשוב להדגיש כי יחסי הזווית-מומנט של המפרק אינם שווים באופן ישיר ליחסי אורך-כוח שריר, שכן תכונות הגיד (למשל, רפיון), השריר (למשל, זווית ההצמדה, חפיפת הסרקומר) והמפרק (למשל, זרוע המומנט) התורמים לייצור מומנט תלויים בזווית המפרק. לשם כך, ניסויים פונקציונליים גדולים של בעלי חיים באתרם ⁴⁸ יכולים להיות תוספת רבת ערך לבדיקות in vivo, תוך התחשבות בכך שבדיקת in situ היא ניסוי סופני. חידושים אחרים לפרוטוקול הנוכחי שעשויים להיחקר בעתיד כדי לשפר את התובנה המכניסטית של ממצאי הניסוי כוללים שימוש בהדמיית מצב B של אולטרסאונד למדידת תכונות אדריכליות של שרירים וגידים והשתלת מתמר כוח גיד למדידת כוח שריר במהלך התכווצויות רצוניות ומעוררות חשמלית⁴⁹.

חשיבות ויישומים פוטנציאליים של השיטה
פרוטוקול זה מעריך את יכולת ייצור המומנט in vivo של קבוצת השרירים החזירית דורסיפלקסור, ומדגים שיטה לא פולשנית להערכת רווח או אובדן תפקוד שרירים בסביבה פיזיולוגית. מכיוון שהמתודולוגיה אינה סופנית לחזיר, ניתן להשתמש בה גם כדי להעריך את תפקוד השרירים באותם נושאים לאורך במהלך התקדמות המחלה, או לפני, במהלך ובעקבות אסטרטגיית טיפול. ככזה, תכנון ניסויי מדידות חוזרות ונשנות עשוי לאפשר השוואות סטטיסטיות חזקות עם כוח רב יותר ופחות בעלי חיים בהשוואה למדדים בלתי תלויים. בנוסף, תפקוד לקוי של שרירי השלד הוא מרכיב בולט בתהליכי מחלה ומצבים שונים, כגון בזבוז שרירים הקשור למחלות כרוניות (למשל, אי ספיקת לב, אי ספיקת כליות, איידס, סרטן וכו '), ניוון שרירים, מחלות נוירודגנרטיביות (למשל, SMA או טרשת אמיוטרופית צידית; ALS), הזדקנות (כלומר, סרקופניה), ורעילות לסמים. היכולת התפקודית של שרירי השלד היא מדד תוצאה ראשוני קריטי להתערבויות כגון פעילות גופנית, תזונה וטיפולים תרופתיים ותרופות רגנרטיביות. לפיכך, הפרוטוקול המתואר כאן כדי להעריך באופן מהימן את כושר ייצור המומנט החזירי in vivo עשוי לשמש ביישומי מחקר רבים. זה עשוי להיות חיוני ברכישת נתונים נרחבים על בעלי חיים לתרגום של טיפולים מתפתחים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite	Aurora Scientific Inc.	615A	Compatible Win Vista/7/10
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus	Aurora Scientific Inc.	892A	Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners
Calibration Weights	Ohaus or similar	80850116
Computer	Aurora Scientific or any vendor	601A	Computer must include data acquisition card and interface for software
Gauze pad	Various vendors		4 by 4 squares or similar
Monopolar Needle Electrodes	Chalgren, Electrode Store,  or similar vendor	242-550-24TP, or DTM-2.00SAF
Non-adhesive Flexiable Tape	3M, Coflex, or similar		4 inch by 5 yard role
Stimulator	Aurora Scientific or comparable	701C	Must include constant current stimulation mode