Summary
Le présent protocole décrit des détails expérimentaux concis sur l’évaluation et l’interprétation des données de couple in vivo obtenues par stimulation électrique du nerf péronier commun chez les porcs anesthésiés.
Abstract
Une évaluation fiable de la force musculaire squelettique est sans doute la mesure de résultat la plus importante dans les études sur les maladies et les blessures neuromusculaires et musculo-squelettiques, en particulier lors de l’évaluation de l’efficacité des thérapies régénératives. En outre, un aspect essentiel de la traduction de nombreuses thérapies régénératives est la démonstration de l’évolutivité et de l’efficacité dans un grand modèle animal. Diverses préparations physiologiques ont été établies pour évaluer les propriétés intrinsèques de la fonction musculaire dans des études scientifiques fondamentales, principalement dans de petits modèles animaux. Les pratiques peuvent être classées comme suit: in vitro (fibres isolées, faisceaux de fibres ou muscle entier), in situ (muscle avec vascularisation et innervation intactes mais tendon distal attaché à un transducteur de force) et in vivo (les structures du muscle ou de l’unité musculaire restent intactes). Il y a des forces et des faiblesses à chacune de ces préparations; cependant, un avantage évident des tests de résistance in vivo est la possibilité d’effectuer des mesures répétées sur le même animal. On y présente les matériaux et les méthodes permettant d’évaluer de manière fiable le couple isométrique produit par les muscles dorsiflexeurs des membres postérieurs in vivo en réponse à la stimulation électrique péronière standard chez les porcs anesthésimés.
Introduction
La fonction principale du muscle squelettique est de produire de la force, ce qui rend finalement possibles des activités telles que la respiration, l’alimentation et la déambulation. Les conditions qui réduisent la capacité fonctionnelle des muscles squelettiques peuvent entraîner une diminution des performances (professionnelles ou sportives), une invalidité ou la mort. Par exemple, le maintien de la masse musculaire et de la fonction dans les populations vieillissantes est positivement associé à la qualité de vie et à la capacité d’effectuer des activités de base et instrumentales de la vie quotidienne 1,2. De plus, la diminution de la force musculaire chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne entraîne l’incapacité de se déplacer et l’insuffisance respiratoire, contribuant finalement à la mortalité prématurée 3,4,5. Ainsi, la mesure de la force musculaire est une mesure de résultat critique dans les études impliquant une maladie ou une blessure neuromusculaire.
Le couple isométrique ou isocinétique volontaire maximal (et/ou l’indice de fatigue) est souvent utilisé comme indice de capacité fonctionnelle dans les études cliniques6. Dans les études animales, des mesures analogues peuvent être effectuées in vivo en utilisant la stimulation nerveuse électrique sous anesthésie. Notamment, les préparations in vivo sont peu invasives, la musculature, les tendons, le système vasculaire et l’innervation restant intacts et permettent donc des évaluations fonctionnelles répétées 7,8,9,10,11. Cette préparation est couramment utilisée dans les modèles de petits rongeurs et, dans une moindre mesure, dans les modèles animaux plus grands tels que les lapins12, les chiens 13,14, les moutons15 et les porcs 16,17. L’utilisation générale d’une telle méthodologie pourrait avoir un impact sur de nombreuses études de recherche translationnelle, comme dans les modèles génétiquement modifiés d’amyotrophie spinale porcine (porc) (SMA)18. On y présente des méthodes pour évaluer le couple isométrique maximal induit par la stimulation nerveuse du groupe musculaire dorsiflexeur porcin in vivo. Les techniques présentées ont d’abord été adaptées de celles développées à l’origine pour évaluer le couple du muscle crural antérieur de la souris19,20, puis affinées par l’expérience de l’étude de la capacité de production de couple après une blessure 17,21,22,23,24,25,26,27,28 et au cours du développement16 dans divers modèles porcins.
Ce protocole met en évidence la mesure isométrique du couple in vivo à l’aide d’une méthodologie qui nécessite un ordinateur intégré à un capteur de pesage et à un stimulateur électrique. Les méthodes présentées ici utilisent un appareil de test de plaque de pied isométrique porcin intégré disponible dans le commerce, un appareil de plate-forme et un logiciel correspondant (voir tableau des matériaux). Cependant, la méthodologie peut être adaptée pour utiliser d’autres logiciels disponibles dans le commerce ou sur mesure, des dispositifs d’acquisition de données et des stimulateurs. Ces méthodes sont destinées à être utilisées dans une suite chirurgicale dédiée aux grands animaux dotée d’équipements standard tels que: table chirurgicale de verrouillage, deuxième table de verrouillage de hauteur égale pour la plate-forme de test, ventilateur et dispositifs de surveillance, tapis chauffant ou autres dispositifs pour maintenir la température corporelle.
Les membres de l’équipe suivants sont nécessaires pour effectuer ces méthodes: un technicien en anesthésie qualifié et deux membres du personnel de l’étude pour effectuer les tests fonctionnels. Ces personnes travailleront ensemble pour la stabilisation initiale du membre sur l’appareil de plate-forme. Ensuite, l’un des deux membres du personnel sera responsable du placement/positionnement de l’électrode et l’autre des applications informatiques pendant les essais.
Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément à la Loi sur le bien-être des animaux, au Règlement sur le bien-être des animaux d’application et aux principes du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des tests antérieurs ont démontré que ces méthodes sont fiables26 et n’ont aucun effet néfaste sur la santé ou la fonction des membres du porc. Des tests ont été effectués aussi souvent qu’une fois par semaine sans aucun événement indésirable23. De plus, les tests d’interventions pré et post-chirurgicales au cours de la même journée peuvent être effectués sans exercer de stress fâcheux sur l’animal ou induire un dysfonctionnement neuromusculaire.
1. Configuration de l’ordinateur
- S’assurer que le réglage initial et l’étalonnage de l’appareil et des composants sont effectués conformément aux spécifications de fabrication (voir tableau des matériaux). L’étalonnage à l’aide d’une plage de poids allant de 0,2 à 2,5 kg est suggéré.
REMARQUE: Le couple est mesuré par une pédale de 140 mm (0,14 m) fixée à un capteur de couple linéaire d’une capacité de 50 Newton-mètres (N·m). Le gain de l’instrument est réglé pour atteindre une capacité de 25 N·m par défaut afin de mieux correspondre à la production de couple prévue. L’étalonnage est effectué en appliquant une masse connue (p. ex., 1 kg) à la pédale à une distance connue (p. ex., 100 mm de l’axe de rotation) et en calculant le couple. Par exemple, 1 kg équivaut à 9,806 N appliqué à 0,1 m est un couple de 0,9806 N·m. Une relation peut alors être établie entre le couple appliqué au capteur de couple et la tension de sortie correspondante par le capteur de couple. Les capteurs de couple de l’auteur ont confirmé la linéarité de cette relation de 0,2 à 20 kg appliquée à une plaque d’étalonnage particulière de 40 cm. En raison de la longueur de la pédale standard, une plage d’étalonnage de 0,2 à 2,5 kg est recommandée. Cela produit suffisamment de signal pour calculer le facteur d’échelle par régression linéaire. - Allumez l’ordinateur, le stimulateur, le système de transducteur et l’interface analogique-numérique environ 30 minutes avant le test pour permettre la stabilisation des changements de matériaux liés à la chaleur qui peuvent avoir un impact sur les propriétés électriques. Sélectionnez le périphérique d’acquisition de données (DAQ) approprié et connecté.
- Configurer des paramètres expérimentaux dans le logiciel au besoin; le logiciel permet d’enregistrer un modèle d’étude. Préparez-vous à configurer l’expérience (c.-à-d. le modèle d’étude) pour créer une nouvelle étude à l’aide de l’option Créer un classeur d’étude .
REMARQUE: Les paramètres expérimentaux peuvent être préchargés avant de commencer l’étude, ce qui entraînera des invites à inclure des informations supplémentaires spécifiques à l’expérience telles que le sexe, la masse corporelle, la date de naissance, le moment du test, le groupe de traitement ou des variables similaires au besoin. Les paramètres de configuration de l’étude peuvent être enregistrés et utilisés tout au long de l’expérience. - Sélectionnez l’étude précédemment créée au début de chaque évaluation. Ajoutez un nouvel animal s’il s’agit du premier test pour le porc à tester et suivez l’invite pour les variables entrées dans l’étude.
- Cliquez sur Préparer l’expérience une fois prêt à commencer l’étude, ce qui sera nécessaire pour optimiser le placement des électrodes. Émettre des contractions répétées au nerf tout en déterminant le placement optimal une fois les électrodes placées (voir l’étape 3.6.).
- Cliquez d’abord sur Configurer Instant Stim , puis ajustez la fréquence d’impulsion, la largeur d’impulsion, le nombre d’impulsions, la fréquence de train et le temps d’exécution.
- Ensuite, cliquez sur Instant Sim pour émettre des contractions répétées. Vous pouvez également appuyer sur le bouton de déclenchement manuel de l’unité stimulateur pour donner manuellement une contraction.
- Ouvrez le Live Data Monitor pendant le protocole d’étude lorsque vous êtes prêt à démarrer toute l’expérience pour permettre une enquête / visualisation en temps réel des contractions. Cliquez sur Exécuter l’expérience lorsque vous êtes prêt à commencer l’expérience (après la préparation de l’animal, voir l’étape 2).
2. Préparation et entretien de l’anesthésie
- Les porcs mâles ou femelles rapides, de 40 à 90 kg, pendant la nuit avant l’anesthésie, laissent l’eau ad libitum. Obtenez et enregistrez le poids corporel correct du porc le jour de la procédure.
- Induire une anesthésie avec des injections intramusculaires de tilétamine/zolzépam (Telazol, 4-6 mg/kg), de xylazine (1-3 mg/kg) et de propofol (2,6 mg/kg). Maintenir initialement avec 5% d’isoflurane via un masque facial.
- Intuber le porc avec un tube endotrachéal et le placer sur un ventilateur automatique. Maintenir le porc à la pression maximale à 20 cm H2O, un volume courant initial de 10 mL/kg et des taux de respiration de 8 à 12 respirations/min.
- Réglez le réglage du ventilateur pour maintenir un PCO2 de 40 ± 5 mmHg en fin de marée. Maintenir l’anesthésie avec 1% -3% d’isoflurane dans 30%-37% O2.
- Maintenir la température corporelle du porc à 37 °C pendant toute la durée du protocole. Insérez des cathéters de veine auriculaire et de Foley pour l’administration de liquide et la collecte d’urine, au besoin.
REMARQUE: L’utilisation de l’anesthésie chirurgicale par plan empêchera les contractions secondaires pendant le test, en particulier des muscles fessiers. - Surveillez la profondeur de l’anesthésie par réflexe et position oculaire, le manque de tonus de la mâchoire, la fréquence cardiaque (plage 80-150 bpm), la pression artérielle systolique (plage 120-70 mmHg), ou une combinaison de tous ces signes.
- Préparez les membres postérieurs droit et gauche une fois que le porc est complètement anesthésié et stable en nettoyant d’abord les membres avec de l’eau et du savon pour enlever les débris, puis rasez les poils de la peau. Portez une attention particulière à la zone latérale du genou, qui sera utilisée pour le placement de l’électrode plus tard.
- Transportez le porc jusqu’à une table chirurgicale et placez-le solidement en position couchée. Placez le cochon vers le pied de la table avec les muscles fessiers à l’extrémité de la table ou légèrement au-dessus.
REMARQUE: Cela permettra à la table chirurgicale et à la table contenant l’appareil de test de s’écarter. - Extubez le porc après le test et laissez-le récupérer. La nourriture et l’eau standard pour porcs doivent être remplacées une fois que le porc est complètement rétabli et peut se déplacer librement dans la cage.
REMARQUE: L’analgésie post-opératoire n’est pas nécessaire pour les tests in vivo seuls; cependant, le carprofène et/ou la buprénorphine SR peuvent être fournis selon la recommandation vétérinaire. La consultation d’un vétérinaire local est encouragée. L’anesthésie et les médicaments énumérés ici sont à titre indicatif seulement et sont actuellement approuvés à l’Université du Minnesota. Le maintien de l’anesthésie par isoflurane a été choisi en fonction de son apparition et de son décalage rapides et de son impact minimal sur la stimulation nerveuse in vivo évoqué couple29. Veillez à ce que les paramètres d’anesthésie soient cohérents entre les études. Au cours du protocole, l’évaluation et l’enregistrement de l’anesthésie sont effectués à des intervalles de 15 minutes; L’enregistrement est effectué sur la base des lignes directrices et des exigences locales du Comité institutionnel pour la protection et l’utilisation des animaux (IACUC) et du département de l’Agriculture des États-Unis (USDA).
3. Évaluation du couple isométrique in vivo
- Placez le pied sur la plaque de pied du capteur de force. Utilisez un pansement souple et cohésif pour attacher le pied à la plaque de pied.
NOTE: Un rôle entier par pied est nécessaire; idéalement, le rôle de 4 pouces x 5 verges est adéquat. - Maintenez le pied en position sur la plaque de pied avec la cheville au neutre (A) et fixez le pied à la plaque en enroulant le bandage cohésif autour du pied et de la plaque de pied dans le style d’un ruban adhésif de cheville tissé à panier fermé (B).
REMARQUE : Les deux membres du personnel de l’étude devront effectuer simultanément les tâches individuelles (A) et (B). - Positionner la cheville à angle droit une fois que le pied est fixé à la plaque du pied, définie comme 0° ou neutre pour référence des degrés de flexion plantaire ou dorsale.
Figure 1 : Des images de différents points de vue montrent l’attachement du cochon à la plaque de pied et l’alignement anatomique sur le cadre. Des repères anatomiques pour les muscles du compartiment antérieur, la tête fibulaire, le genou, le plateau tibial et le fémur sont notés. Notez le placement des paires d’électrodes sous-dermiques sur le côté latéral de la jambe. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Stabilisez le genou et la cheville à angle droit.
- Tout d’abord, placez les barres de serrage des membres près des emplacements nécessaires. Lorsque vous êtes prêt, en commençant par l’aspect médian du membre, alignez la barre de serrage du membre à environ le plateau tibial.
- Ensuite, alignez la barre de serrage latérale du membre à la tête distale du fémur.
REMARQUE: Entre l’extrémité de chaque membre, la barre de serrage utilise un tampon de gaze plié 4 x 4 pour protéger la peau adjacente à la barre. - Stabilisez fermement les barres à l’aide des vis à molette de verrouillage.
REMARQUE: Les barres de serrage des membres ne seront pas alignées les unes avec les autres, mais s’aligneront sur l’anatomie du porc. - Nettoyez la peau autour de la tête fibulaire en appliquant 70% d’alcool via une gaze propre en cercles concentriques en commençant au centre du placement prévu de l’électrode et en se déplaçant vers l’extérieur. Placez l’aiguille percutanée stérile (50 mm, 26 G monopolaire) et les électrodes de type électromyographie (EMG) (voir tableau des matériaux) sur le nerf péronier. Électrodes implantaires sous-cutanées, environ 5-10 mm.
- Optimisez le placement de l’électrode en augmentant les amplitudes de courant, ajustées sur le stimulateur. Commencez à 100 mA et augmentez au besoin.
REMARQUE: 300-500 mA est généralement nécessaire pour le couple de contraction maximal. - Visualisez l’amplitude du couple de contraction sur la vue des données en direct et sur le compartiment antérieur du porc; les sabots peuvent jouer et se déplacer vers le haut aussi.
- Assurez-vous que le compartiment postérieur, ou nerf tibia, n’est pas activé pendant la stimulation. Inspecter visuellement et palper la contraction du compartiment postérieur et le mouvement vers le bas des sabots pendant la stimulation.
- Inspectez la région du plateau de contraction tétanique à partir du traçage couple-temps vivant dans les étapes suivantes pour détecter l’absence de recrutement musculaire antagoniste (c.-à-d. la flexion plantaire pour ce protocole).
- Obtenir un couple tétanique isométrique maximal en utilisant les paramètres de stimulation suivants : 100 Hz, largeur d’impulsion de 0,1 ms, sur un train de 800 ms17, une fois le placement de l’électrode et les amplitudes de stimulation optimisés.
REMARQUE: Ces paramètres peuvent être utilisés pour diverses évaluations contractiles.
4. Protocole d’analyse de l’angle couple-articulation
- Mesurez le couple tétanique isométrique maximal sur une plage de positions de cheville allant du neutre à l’extrémité proche de la flexion plantaire, ou de 0 à 50 ° de la flexion plantaire.
REMARQUE: L’utilisation d’incréments de 10 ° nécessitera six contractions, et le changement incrémentiel peut être ajusté pour des questions expérimentales spécifiques. - Commencez à desserrer les deux vis de verrouillage de l’étage du goniomètre pour vous déplacer entre les angles de joint. Assurez-vous que les deux vis de verrouillage sont serrées avant la prochaine contraction.
REMARQUE: Le goniomètre est marqué avec des marques de degré pour permettre un alignement précis. Il s’agit probablement de 0° de flexion plantaire, qui est décalée de 180° sur le goniomètre. Soyez prudent pour assurer le positionnement prévu. - Déterminer expérimentalement le temps entre les contractions; cependant, 2 min suffisent pour éviter la fatigue.
REMARQUE: Comme l’angle de l’articulation de la cheville est modifié progressivement, les électrodes de l’aiguille peuvent se déplacer. Il peut être nécessaire de confirmer le placement des électrodes avec des contractions de contraction, comme indiqué ci-dessus (voir étape 3.8).
5. Protocole d’analyse couple-fréquence
- Positionnez la cheville à l’angle articulaire souhaité. Prenez soin, expérimentalement, d’effectuer des tests au même angle articulaire à chaque fois.
REMARQUE: En règle générale, les analyses couple-fréquence sont effectuées à un angle de joint unique correspondant au couple isométrique maximal dérivé de l’analyse de l’angle couple-joint. Le couple maximal est produit à ~30-35° de la flexion plantaire. - Mesurez le couple isométrique maximal sur une gamme de fréquences de stimulation qui induisent des trains de contractions non fusionnés jusqu’à et au-delà de ceux qui induisent des tetani entièrement fusionnés.
REMARQUE: Ceci peut être réalisé en stimulant à 10, 20, 40, 60 et 100 Hz (largeur d’impulsion de 0,1 ms; train de 800 ms) avec 2 min entre chaque contraction pour éviter la fatigue. En fonction de questions expérimentales exactes et de modèles de porcs spécifiques, les fréquences peuvent être adaptées. Le substrat bioénergétique le plus probablement utilisé lors d’une contraction de 800 ms pour maintenir l’ATP intracellulaire est la phosphocréatine30, et la resynthèse de la phosphocréatine repose sur la navette31 de la phosphocréatine. La cinétique de récupération de la phosphocréatine indique une récupération remarquable de 90% ou plus entre 90 et 120 s après la fin de la contraction30. Par conséquent, les intervalles de repos recommandés entre les contractions sont de 90 à 120 s. Bien que cela puisse être influencé par des conceptions expérimentales, y compris les maladies musculaires, les blessures et / ou le vieillissement.
6. Analyse des données
- Cliquez sur Analyser les résultats si vous êtes toujours dans le logiciel pour ouvrir la fenêtre Analyse. Vous pouvez également ouvrir directement le programme d’analyse.
- Que ce soit à l’aide d’une plate-forme de données automatisée ou d’une analyse manuelle, calculez les différentes variables dans l’analyse des formes d’onde isométriques individuelles.
REMARQUE: Ces variables comprennent: le couple de contraction maximal, le couple tétanique maximal et les propriétés contractiles liées aux contractions et au tetani, par exemple, le temps de pointe et la demi-relaxation. De nombreuses variables expérimentales peuvent normaliser la force, par exemple, le poids corporel, le volume musculaire déterminé par IRM (imagerie par résonance magnétique) ou CT (tomodensitométrie), ou le poids musculaire terminal. Le couple absolu (N·m) et le couple normalisé à la masse corporelle (N·m/kg) sont présentés. Le couple de repos placé sur la plaque de pied diffère d’une expérience à l’autre. Une correction de base pour le couple au repos doit être appliquée pour s’assurer que les couples maximal réels et tetanic sont enregistrés. Le couple de base à chaque angle de joint est enregistré et peut indiquer des changements de couple passif.
Representative Results
La fiabilité et l’optimisation des paramètres d’essai in vivo du compartiment antérieur du porc ont déjà été rapportées26. Des données comparatives entre rongeurs et porcs pour la fréquence du couple ont également été rapportées27.
Lors de l’évaluation in vivo , la visualisation de la forme d’onde du couple est nécessaire en temps réel pour assurer une activation appropriée du compartiment antérieur. Les formes d’onde ne doivent refléter que la dorsiflexion. Les formes d’onde doivent avoir un aspect lisse et arrondi et un plateau tétanique apparent (figure 2A). Les incohérences ou les perturbations de la forme d’onde indiquent diverses limites expérimentales, telles qu’une stimulation inadéquate, un mauvais placement des électrodes ou une profondeur d’anesthésie inadéquate (figure 2B).
La figure 3A est un traçage du temps de couple de contraction avec une flèche indiquant un couple maximal de 50 %. La contraction du temps jusqu’au pic doit commencer à l’initiation du stimulateur et se terminer lorsque le couple de contraction maximal est atteint (des barres de temps représentatives sont indiquées sous le traçage). La demi-relaxation pour une contraction doit commencer au couple de contraction maximal et se terminer à un couple de contraction maximal de 50% (des barres de temps représentatives sont indiquées sous le traçage). La figure 3B est un traçage du temps de couple tétanique avec une flèche indiquant un couple maximal de 50 %. Contrairement aux secousses qui sont idéales en termes de couple maximal définitif et opportun, les contractions tétaniques ont une plus grande variabilité dans le moment du couple maximal en ce qui concerne le moment où le stimulateur commence et se termine, nécessitant une approche plus nuancée de l’analyse de la propriété contractile. La contraction du temps jusqu’au pic devrait commencer par l’initiation du stimulateur et s’arrêter quelque part entre 90% et 100% du couple maximal. Les barres de temps de la figure 3B montrent une coupure de couple maximal de 95 %. Ceci est utile dans des cas tels que les données représentatives sélectionnées, car le couple maximal n’est atteint que tard dans la phase de plateau. Une analyse complémentaire au temps jusqu’au pic est le taux moyen de contraction. Les barres pointillées sur le membre ascendant du traçage du temps de couple représentent une plage de couple maximal de 30% à 70%. Le taux moyen de contraction doit être commencé au début de la stimulation et capturer le changement de taux moyen entre 30% et 70% de couple maximal. Ce sont des fourchettes recommandées, et les groupes de recherche individuels peuvent déterminer la fourchette idéale autour de 50% (par exemple, ±10%). L’important est d’être cohérent au sein et entre les études. Contrairement à la contraction, la contraction tétanique demi-relaxation devrait commencer à la fin de la stimulation au lieu du couple maximal pour la même raison mentionnée ci-dessus avec le temps de pointe. Les barres de temps de la figure 3B représentent le temps entre la fin de la stimulation et l’atteinte de 50% de relaxation. Une analyse complémentaire à la demi-relaxation est le taux moyen de relaxation. Les barres pointillées sur le membre descendant du couple représentent la même plage de couple maximale de 30% à 70% que le membre ascendant. Le taux de relaxation moyen doit commencer à la fin de la stimulation et capturer le taux moyen de changement entre 30% et 70% de couple maximal. Encore une fois, ce sont des plages recommandées. Une remarque critique : ne confondez pas le taux moyen de contraction/relaxation avec le taux maximal de contraction/relaxation. Le taux maximal représente le changement de taux le plus remarquable entre deux points de données adjacents et peut être très variable.
Plusieurs propriétés de contraction et de contractile peuvent être analysées pour mieux comprendre le type de fibre et les attributs de couplage excitation-contraction des muscles squelettiques10,32. La surinterprétation des propriétés de contraction et de contractile est mise en garde; ils représentent des suggestions et des justifications pour d’autres interrogatoires au niveau cellulaire et ne sont pas nécessairement indicatifs. En général, les taux de contractilité peuvent refléter la libération de calcium du réticulum sarcoplasmique et le taux enzymatique isoforme de la chaîne lourde de la myosine. En revanche, les taux de relaxation peuvent refléter le taux d’enzyme atPase de calcium du réticulum sarco(endo)plasmique et l’isoforme. Ces propriétés peuvent être influencées par la fatigue, les lésions musculaires, l’entraînement physique et de nombreuses pathologies (par exemple, l’atrophie de la désuétude).
La figure 4 illustre des valeurs représentatives des relations couple-fréquence et couple-angle articulaire pour les membres non blessés. Ces données sont représentatives d’un large éventail de tailles de porcs.
Une analyse expérimentale représentative de l’EMG de surface a été menée au cours d’une analyse musculaire in vivo (figure 5) pour démontrer le contrôle expérimental du codage de la vitesse et de l’activité musculaire totale. Des électrodes EMG adhésives ont été placées au milieu du ventre du péronére tertius. Une électrode de masse a été placée sur le genou pour minimiser l’artefact de stimulation, et des aiguilles d’électrode de stimulation ont été placées autour du nerf péronier proximal à l’emplacement musculaire. Des enregistrements simultanés de couple et d’EMG ont été effectués à des fréquences de stimulation de 20, 60 et 100 Hz. Le nombre d’impulsions du stimulateur (barres rouges sur la figure 5) reflète le quotient de la durée de la stimulation et du temps entre les impulsions. Par exemple, une fréquence de stimulation de 20 Hz signifie une impulsion toutes les 50 ms; par conséquent, une durée de stimulation de 400 ms divisée par 50 ms entre les impulsions équivaut à huit impulsions délivrées (figure 5A). Les impulsions du stimulateur sont délivrées à l’axone nerveux par le placement percutané de l’électrode de l’aiguille et produisent un nombre similaire d’impulsions musculaires électriques (c.-à-d. 20 Hz équivaut à 8 enregistrements EMG), démontrant le contrôle expérimental de la fréquence du potentiel d’action du groupe musculaire d’intérêt. Les enregistrements EMG bruts peuvent être convertis via l’analyse racine-moyenne-carrée (EMG RMS) pour visualiser l’activité musculaire totale avec une fréquence de stimulation croissante. L’analyse de l’aire sous la courbe (ASC) est un moyen de quantifier l’EMG RMS pour déterminer les changements dans l’activité musculaire entière. Des ASC représentatives pour chaque fréquence de stimulation EMG RMS sont fournies (Figure 5A-C).
Figure 2: Formes d’onde représentatives de haute et de basse qualité. (A) Formes d’onde isométriques présentes dans un aspect d’onde carrée, avec un plateau fluide notable. (B) Les formes d’onde de mauvaise qualité peuvent être dues à une stimulation inadéquate ou à un mauvais placement des électrodes. Dans ces cas, un repositionnement des électrodes est nécessaire. Pour A et B, les impulsions du stimulateur (barres rouges) sont indiquées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse de la propriété contractile twitch et tétanique. (A) Les tracés de couple-temps de contraction représentative (1 Hz) et (B) tétanique (100 Hz) sont modifiés pour détailler les propriétés contractiles. La flèche rouge sur chaque graphique indique un couple maximal de 50 %. Les barres bleues et noires sous les tracés indiquent respectivement les durées de temps de pointe et de demi-relaxation. Les barres pointillées sur les membres ascendants et descendants du traçage du temps de couple tétanique représentent une plage de couple maximal de 30% à 70% qui peut être utilisée pour déterminer le taux moyen de contraction ou de relaxation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Exemples de données d’angle couple-joint et de couple-fréquence. Les données fournies proviennent d’une gamme de porcs femelles yorkshire Cross âgés de 2,9 à 6,3 mois; 39,4-75,4 kg de masse corporelle; tous considérés comme un contrôle sain au moment de l’évaluation. Pendant tous les essais, la température corporelle centrale a été maintenue à 37 °C. (A) Le couple normalisé à la masse corporelle est évalué aux articulations de la cheville de 0 à 50 ° de flexion plantaire; notez que le couple maximal est déterminé à 30°. (B) Le couple normalisé à la masse corporelle est évalué à diverses fréquences de stimulation de 10 à 100 Hz; Notez que ces évaluations ont été réalisées avec l’articulation de la cheville à 30° de la flexion plantaire. (C) Des traçages de couple individuels pour chacune des fréquences de stimulation ont été évalués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Mesures simultanées du couple isométrique in vivo et de l’EMG. Enregistrements simultanés de l’EMG et du couple à des fréquences de stimulation représentatives de (A) 20, (B) 60 et (C) 100 Hz recueillies sur une femelle cochon du Yorkshire (~ 90 kg de masse corporelle). Des impulsions de stimulateur (barres rouges) ont été délivrées en fonction de la fréquence de stimulation définie. Les enregistrements EMG bruts ont été convertis en racine-moyenne-carrée (EMG RMS) pour visualiser l’activité musculaire totale avec une fréquence de stimulation croissante. Des courbes EMG RMS représentatives ont été analysées pour l’aire sous la courbe (ASC), et des ASC sont fournies pour chaque fréquence de stimulation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Étapes critiques, modifications et dépannage
Pour minimiser la variabilité des données et maximiser le succès de l’approche, les étapes critiques suivantes sont mises en évidence.
Stimulation nerveuse optimale
Cette approche expérimentale commence par la dépolarisation des axones nerveux et repose sur un placement correct des électrodes et une stimulation électrique optimisée. Une analyse post-mortem de l’anatomie nerveuse liée aux repères osseux peut aider à visualiser le placement approprié des électrodes pendant les tests. L’acquisition d’un couple de contraction maximal aide à déterminer le courant approprié (en milliampères; mA) délivré à l’axone nerveux. Il y a deux valeurs à garder à l’esprit lors de l’optimisation de la stimulation nerveuse au début des tests : (1) le rapport contraction/tétanique est d’environ 1:5, par exemple, ~2 N·m de couple de contraction correspond à un couple tétanique de 10 N·m (Figure 3) ; et (2) le couple typique par rapport à la masse corporelle est d’environ 0,3 N·m par kg de masse corporelle (figure 4). Si les couples de contraction de crête semblent faibles, retirez les électrodes et tentez un autre placement. Assurez-vous de vérifier les paramètres du stimulateur, les connexions BNC et les connexions d’électrodes. Le remplacement de l’électrode peut être nécessaire entre les contractions s’il y a trop de mouvement lors du positionnement du membre entre les angles articulaires, comme indiqué ci-dessus (Figure 2). Veuillez noter que les approches expérimentales et interventionnelles pourraient avoir une incidence sur ces valeurs.
Alignement biomécanique approprié
La longueur musculaire de départ influence la force contractile musculaire (la relation longueur-tension), et la longueur musculaire peut changer en fonction de l’alignement des articulations de la hanche, du genou et de la cheville. Les angles articulaires doivent être normalisés entre les membres et entre les porcs. Un angle d’articulation de la cheville de 90° est fortement recommandé pour la hanche et le genou. Une position de cheville légèrement plantaire (~ 30 ° de l’angle neutre de l’articulation de la cheville de 0 °) est optimale pour une force maximale. Il reflète la position anatomique naturelle de l’articulation de la cheville chez les porcs et les chiens debout. Toutes les articulations doivent également être parallèles à la pédale et aux capteurs de couple afin d’éviter toute perte de couple mesurable due à la contribution d’un vecteur de couple perpendiculaire. Il est fortement recommandé d’inspecter les angles articulaires hanche-genou-cheville et l’alignement pied-pédale-articulation après avoir fixé le pied à la pédale et fixé l’articulation du genou avec les barres de serrage des membres (Figure 1). En cas de désalignement, déverrouillez et retirez les barres et repositionnez le cochon sur la table chirurgicale. Bien que la normalisation des angles communs entre les études soit essentielle pour minimiser la variance des données, il existe des limites à l’alignement biomécanique qui sont notables, discutées ci-dessous.
Importance par rapport aux méthodes existantes ou alternatives
Des exemples alternatifs d’évaluations cliniquement pertinentes et non invasives de la fonction musculaire qui pourraient être utilisées pour les modèles porcins comprennent la distance de marche sur tapis roulant, l’EMG et l’électrographie active des ondes de cisaillement musculaire. Comme le test de marche de 6 minutes chez l’homme, un test de marche sur tapis roulant peut évaluer la progression de la maladie et le succès de l’intervention chez les grands animaux 33,34,35. En règle générale, après une période d’acclimatation, les animaux sont promenés jusqu’à la fin de la conformité à différentes vitesses de tapis roulant et / ou niveaux d’inclinaison. Les récompenses alimentaires sont souvent nécessaires pour atteindre une motivation maximale. Cependant, les résultats de la marche sur tapis roulant n’offrent que des interprétations indirectes de la fonction contractile musculaire en raison de limitations telles que la motivation du sujet, le recrutement non maximal de l’unité motrice et la co-dépendance inhérente à d’autres systèmes corporels tels que les systèmes cardiovasculaire, squelettique et respiratoire.
D’autre part, l’EMG offre une évaluation directe légèrement meilleure du système musculaire squelettique, car les électrodes EMG sont placées directement sur le groupe musculaire d’intérêt 36,37,38. Les électrodes EMG mesurent ensuite l’activité musculaire collective (fibres musculaires dépolarisées). Cette activité musculaire est basée sur le recrutement des unités motrices et le codage des taux (la fréquence des potentiels d’action envoyés aux unités motrices recrutées). Cependant, il est impossible de séparer les contributions relatives du recrutement des unités motrices par rapport au codage du taux avec l’EMG de surface. En outre, EMG repose sur la volonté du sujet de générer des contractions maximales, et ce niveau de coopération est peu probable dans les modèles de gros animaux. Bien qu’il puisse être instructif d’évaluer les changements dans l’EMG au cours du cycle de marche, ces données ne représentent pas une capacité fonctionnelle maximale du groupe musculaire squelettique d’intérêt. L’imagerie par ultrasons utilisant le mode B et l’élastographie par ondes de cisaillement est une autre modalité non invasive utilisée pour évaluer la fonction musculaire. Il existe une bonne corrélation entre le module de Young mesuré par élastographie et l’augmentation de la charge musculaire39,40. L’élastographie par ondes de cisaillement a été validée et utilisée comme mesure quantitative de la rigidité passive des tissus 41,42,43,44,45, y compris dans un modèle de lésion de perte musculaire volumétrique porcinemodèle 23. Il peut également être utilisé comme mesure indirecte de la production de force musculaire active39. Cependant, des limitations similaires à l’EMG pour la volonté et la coopération du sujet d’effectuer des contractions sont toujours présentes.
Le protocole in vivo décrit ici, contrairement à la distance de marche sur tapis roulant et à l’EMG, fournit une évaluation fiable, reproductible et maximale de la fonction musculaire. Ce protocole évoque les contractions musculaires d’une manière contrôlée, quantifiable et indépendante de la motivation. Plus précisément, les électrodes percutanées sont utilisées pour stimuler les axones nerveux en contournant le système nerveux central. La dépolarisation des axones nerveux engage toutes les unités motrices en éliminant la variabilité associée au recrutement des unités motrices. De plus, l’investigateur contrôle le codage de la vitesse (fréquence de stimulation). La physiologie neuromusculaire résultante qui s’applique à cette approche commence par l’activation du canal sodique voltage-dépendant aux nœuds de Ranvier. Toute la physiologie ultérieure (ou en aval) est engagée, y compris le couplage excitation-contraction et le cycle de pont transversal. Un avantage significatif de l’analyse musculaire non invasive in vivo est que la fonction musculaire contractile peut être mesurée à plusieurs reprises, par exemple chaque semaine, pour surveiller la force musculaire après une blessure, une intervention ou une progression de la maladie.
Limites de la méthode
L’équipement in vivo décrit dans ce protocole permet un couple isométrique passif et actif en fonction de l’angle articulaire et de la fréquence de stimulation. L’appareil d’essai utilisé ne permet pas de mesurer les contractions dynamiques (p. ex. contractions isocinétiques excentriques ou concentriques). L’appareil permet une amplitude de mouvement de 105 ° pour caractériser la relation couple-angle d’articulation et utilise un capteur de charge avec une plage de couple maximale d’environ 50 N·m. Des questions expérimentales spécifiques peuvent nécessiter des caractéristiques de performance en dehors de ces spécifications. Notamment, le capteur de pesage de cet appareil décrit peut être remplacé par des plages de couple plus élevées si nécessaire.
Le protocole décrit ici pour mesurer la force neuromusculaire maximale in vivo présente des limites notables. Tout d’abord, cette méthode nécessite une anesthésie, qui peut être menée différemment selon les protocoles et les ressources de l’animalerie. Les anesthésiques sont connus pour avoir des effets variables sur la fonction neuromusculaire et il a été démontré qu’ils modifient la production de couple dorsiflexeur in vivo chez la souris de manière anesthésique et dose-dépendante29. Les effets différentiels des anesthésiques sur le couple in vivo des gros animaux ne sont pas clairs; par conséquent, les groupes témoins et expérimentaux doivent avoir les mêmes agents anesthésiques (p. ex., tous les groupes ayant reçu de la kétamine) pour contrôler cette variabilité. Deuxièmement, le recours à des modèles de diffusion in vivo limite l’exploration des mécanismes cellulaires de la dysfonction contractile et des toxicités aiguës des médicaments. Par exemple, la caféine peut être utilisée lors de tests in vitro de bain d’organes sur un muscle isolé pour stimuler la libération de calcium du réticulum sarcoplasmique, en contournant directement le couplage excitation-contraction46 . La quantité de caféine pour induire cet effet (mM) est mortelle dans un contexte in vivo . Les influences des médicaments sur l’ensemble du corps (p. ex., le stress rénal et hépatique) et les facteurs subséquents sécrétés dans la circulation devront être pris en compte si cette approche est utilisée pour le dépistage des médicaments sur la force musculaire aiguë23. Troisièmement, l’utilisation de la stimulation nerveuse électrique maximale s’écarte des stratégies de recrutement volontaire, comme indiqué ci-dessus, et ne reflète donc pas les changements de force qui peuvent être dus à des adaptations du recrutement neuromusculaire.
Les mesures de couple in vivo peuvent également être limitées en ce qui concerne l’établissement d’un mécanisme spécifique pour les observations expérimentales. Par exemple, le couple autour de l’articulation de la cheville dépend non seulement de la production de force musculaire, mais aussi des propriétés du tendon et de l’articulation et du tissu conjonctif. De plus, la force est générée par des groupes de muscles, en particulier les fléchisseurs plantaires (muscles gastrocnémius, soleus et plantaris) et les muscles dorsiflexeurs (peroneus tertius, tibialis et digitorum muscles) chez les porcs. Par conséquent, les interprétations des données de couple maximal in vivo nécessitent la prise en compte des changements musculo-tendineux et anatomiques potentiels et sont limitées aux groupes musculaires, et non aux muscles individuels. Dans le même ordre d’idées, les groupes musculaires sont souvent constitués d’un mélange de fibres musculaires principalement rapides et lentes, telles que le muscle gastrocnémien et le muscle soléaire, respectivement, des fléchisseurs plantaires. Les propriétés contractiles telles que le taux de contraction et de relaxation (ou le temps de contraction jusqu’au pic et le temps de demi-relaxation) ne sont pas des indicateurs fiables de la physiologie de type fibre utilisant des préparations musculaires in vivo par rapport à des préparations musculaires isolées, telles que les protocoles de test in vitro ou in situ 47. Les préparations musculaires isolées sont également supérieures pour comprendre l’influence des paramètres biomécaniques sur la fonction musculaire, car des propriétés telles que la longueur musculaire peuvent être contrôlées avec précision; il est important de souligner que la relation angle-couple articulaire n’est pas directement équivalente à la relation longueur-force musculaire, car les propriétés tendineuses (p. ex., relâchement), musculaire (p. ex., angle de pennation, chevauchement du sarcomère) et articulaire (p. ex., bras moment) qui contribuent à la production de couple dépendent de l’angle articulaire. À cette fin, les tests fonctionnels in situ sur de grands animaux48 pourraient être un ajout précieux aux tests in vivo, en gardant à l’esprit que les tests in situ sont une expérience terminale. D’autres avancées du protocole actuel qui pourraient être explorées à l’avenir pour améliorer la vision mécaniste des résultats expérimentaux comprennent l’utilisation de l’imagerie par ultrasons en mode B pour mesurer les propriétés architecturales des muscles et des tendons et l’implantation d’un transducteur de force tendineuse pour mesurer la force musculaire pendant les contractions volontaires et stimulées électriquement49.
Importance et applications potentielles de la méthode
Ce protocole évalue la capacité de production de couple in vivo du groupe musculaire dorsiflexeur porcin, démontrant une méthode non invasive pour évaluer le gain ou la perte de la fonction musculaire dans un cadre physiologique. Parce que la méthodologie n’est pas terminale pour le porc, elle peut également être utilisée pour évaluer la fonction musculaire chez les mêmes sujets longitudinalement pendant la progression d’une maladie, ou avant, pendant et après une stratégie de traitement. En tant que tel, une conception expérimentale de mesures répétées peut permettre des comparaisons statistiques robustes avec une plus grande puissance et moins d’animaux par rapport à des mesures indépendantes. De plus, le dysfonctionnement des muscles squelettiques est une composante saillante de divers processus et affections pathologiques, tels que l’atrophie musculaire associée à une maladie chronique (p. ex., insuffisance cardiaque, insuffisance rénale, sida, cancer, etc.), la dystrophie musculaire, les maladies neurodégénératives (p. ex., SMA ou sclérose latérale amyotrophique; SLA), le vieillissement (c.-à-d. sarcopénie) et les toxicités médicamenteuses. La capacité fonctionnelle des muscles squelettiques est une mesure de critère de jugement primaire essentielle pour des interventions telles que l’exercice, la nutrition et les thérapies médicamenteuses et régénératives. Ainsi, le protocole décrit ici pour évaluer de manière fiable la capacité de production de couple porcin in vivo peut être utilisé dans de nombreuses applications d’étude. Il peut jouer un rôle déterminant dans l’acquisition de nombreuses données animales pour la traduction de thérapies en développement.
Disclosures
Les opinions ou affirmations contenues ici sont les opinions privées des auteurs. Ils ne doivent pas être interprétés comme officiels ou comme reflétant les points de vue du ministère de l’Armée, du ministère de la Défense ou du gouvernement des États-Unis.
La production de l’article vidéo et la disponibilité en libre accès ont été parrainées par Aurora Scientific, Inc. Matthew Borkowski est employé par Aurora Scientific Inc. Cette entreprise pourrait potentiellement bénéficier des résultats de la recherche.
Acknowledgments
Les travaux et les données présentés ont été largement soutenus par le US Army Medical Research and Material Command à BTC et SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR); et le ministère des Anciens Combattants, l’Administration de la santé des anciens combattants, le Bureau de la recherche et du développement (I21 RX003188) au JAC et au Dr Luke Brewster. Les auteurs remercient les branches du service vétérinaire et de pathologie comparative de l’USAISR et le centre d’imagerie préclinique avancée de l’UMN pour leur assistance technique dans la réalisation de ces études.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
| 892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
| Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
| Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
| Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
| Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
| Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
| Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |
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