Summary
본 프로토콜은 마취된 돼지에서 일반적인 비골 신경의 전기 자극을 통해 얻어진 생체내 토크 데이터의 평가 및 해석에 대한 간결한 실험 세부사항을 기술한다.
Abstract
골격근 강도의 신뢰할 수있는 평가는 신경 근육 및 근골격계 질환 및 부상 연구, 특히 재생 요법의 효능을 평가할 때 가장 중요한 결과 측정이라고 할 수 있습니다. 또한 많은 재생 요법을 번역하는 데 중요한 측면은 대형 동물 모델에서 확장 성과 효과를 입증하는 것입니다. 기초 과학 연구에서, 주로 작은 동물 모델에서 내재적 근육 기능 특성을 평가하기 위해 다양한 생리 학적 제제가 확립되었습니다. 상기 관행은 다음과 같이 분류될 수 있다: 시험관 내(단리된 섬유, 섬유 다발, 또는 전체 근육), 계내 (무손상 혈관화 및 신경과민을 갖는 근육이지만 힘 변환기에 부착된 원위 힘줄이 있는 근육), 및 생체내 (근육 또는 근육 유닛의 구조는 온전하게 유지됨). 이러한 각 준비에는 강점과 약점이 있습니다. 그러나, 생체내 강도 테스트의 분명한 이점은 동일한 동물에서 반복 측정을 수행할 수 있다는 것이다. 본원에서, 마취된 돼지에서 표준 회음부 전기 자극에 반응하여 생체 내에서 뒷다리 등쪽 굴곡기 근육에 의해 생성된 등각 토크를 신뢰성 있게 평가하기 위한 재료 및 방법이 제시된다.
Introduction
골격근의 주요 기능은 궁극적으로 호흡, 식사 및 외래와 같은 활동을 가능하게하는 힘을 생성하는 것입니다. 골격근 기능 능력을 감소시키는 조건은 성능 저하 (직업 또는 스포츠), 장애 또는 사망으로 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 고령화 인구에서 근육량과 기능의 유지는 삶의 질과 일상 생활의 기본 및 도구 활동을 수행 할 수있는 능력과 긍정적으로 관련이 있습니다 1,2. 그리고, Duchenne 근이영양증 환자에서 근력이 감소하면 외래 및 호흡 부전이 불가능 하여 궁극적으로 조기 사망률 3,4,5에 기여합니다. 따라서, 근력 측정은 신경근 질환 또는 손상과 관련된 연구에서 중요한 결과 측정이다.
최대 자발적 등각 또는 등동역학 토크 (및/또는 피로 지수)는 종종 임상 연구6에서 기능적 능력의 지표로 사용된다. 동물 연구에서, 유사한 측정은 마취 상태에서 전기 신경 자극을 사용하여 생체 내에서 수행 될 수 있습니다. 특히, 생체내 제제는 근육조직, 힘줄, 혈관조직 및 신경과민이 온전하게 남아 있는 최소 침습적이며, 따라서 반복적인 기능적 평가(7,8,9,10,11)를 허용한다. 이 제제는 일반적으로 작은 설치류 모델에서 사용되며 토끼 12, 개 13,14, 양15 및 돼지 16,17과 같은 더 큰 동물 모델에서는 덜 사용됩니다. 이러한 방법론의 일반적인 사용은 척추 근육 위축 (SMA)18의 유전자 조작 돼지 (돼지) 모델과 같은 많은 번역 연구 연구에 영향을 줄 수 있습니다. 본원에서, 생체내에서 돼지 등굴곡기 근육 그룹의 신경 자극-유도된 최대 등각 토크를 평가하는 방법이 제시된다. 제시된 기술은 처음에는 마우스 전방 crural 근육 토크19,20을 평가하기 위해 원래 개발 된 기술에서 채택되었으며 이후 부상 후 토크 생성 능력을 조사한 경험을 통해 정제되었습니다 17,21,22,23,24,25,26,27,28 그리고 다양한 돼지 모델에서 개발16 동안.
이 프로토콜은 로드셀 및 전기 자극기와 통합된 컴퓨터가 필요한 방법론을 사용한 생체 내 등각 토크 측정을 강조합니다. 여기에 제시된 방법은 상업적으로 이용 가능한 통합 돼지 아이소메트릭 풋플레이트 테스트 장치, 플랫폼 장치 및 해당 소프트웨어를 사용합니다( 재료 표 참조). 그러나, 방법론은 다른 상업적으로 이용가능하거나 맞춤형으로 만들어진 소프트웨어, 데이터-획득 장치, 및 자극기를 사용하도록 적응될 수 있다. 이러한 방법은 수술 테이블 잠금, 테스트 플랫폼을위한 동일한 높이의 두 번째 잠금 테이블, 인공 호흡기 및 모니터링 장치, 체온을 유지하기위한 가열 매트 또는 기타 장치와 같은 표준 장비로 가득 찬 전용 대형 동물 수술 스위트에서 사용하기위한 것입니다.
이러한 방법을 수행하려면 다음 팀원이 필요합니다 : 기능 테스트를 수행하기 위해 숙련 된 마취 기술자 한 명과 연구 인력 두 명. 이 사람들은 플랫폼 장치에서 사지의 초기 안정화를 위해 함께 일할 것입니다. 그런 다음 두 직원 중 한 명이 전극 배치 / 포지셔닝을 담당하고 다른 한 명은 테스트 중에 컴퓨터 응용 프로그램을 담당합니다.
Protocol
모든 동물 실험은 동물 복지법, 동물 복지 규정 시행 및 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드의 원칙에 따라 수행되었습니다. 이전 테스트에서 이러한 방법은 신뢰할 수 있으며26 돼지의 건강이나 사지 기능에 악영향을 미치지 않는다는 것이 입증되었습니다. 시험은 어떠한 부작용도 없이 매주 자주 수행되었다23. 또한, 같은 날 동안 수술 전후 중재 검사는 동물에게 과도한 스트레스를 가하거나 신경 근육 기능 장애를 유발하지 않고 수행 할 수 있습니다.
1. 컴퓨터 설정
- 장치 및 구성 요소의 초기 설정 및 교정이 제조 사양에 따라 수행되는지 확인하십시오 ( 재료 표 참조). 0.2-2.5kg의 무게 범위를 사용한 교정이 권장됩니다.
참고: 토크는 50뉴턴미터(N·m) 용량의 선형 토크 센서에 부착된 140mm 풋 페달(0.14m)로 측정됩니다. 계측기의 이득은 예상되는 토크 생산과 더 잘 일치하도록 기본적으로 25N·m 용량으로 확장되도록 설정됩니다. 교정은 알려진 거리 (예를 들어, 회전축으로부터 100 mm)에서 발 페달에 알려진 질량 (예를 들어, 1 kg)을 적용하고 토크를 계산함으로써 수행된다. 예를 들어, 1kg은 0.1m에서 적용된 9.806N과 같으며 0.9806N·m 토크입니다. 그런 다음 토크 센서에 인가되는 토크와 토크 센서에 의해 출력되는 해당 전압 사이의 관계를 설정할 수 있습니다. 저자의 토크 센서는 특정 40cm 교정판에 적용된 0.2-20kg에서이 관계의 선형성을 확인했습니다. 표준 페달의 길이로 인해 0.2-2.5kg의 교정 범위를 권장합니다. 이것은 선형 회귀에 의해 스케일 계수를 계산하기에 충분한 신호를 생성합니다. - 컴퓨터, 자극기, 트랜스듀서 시스템 및 아날로그-디지털 인터페이스를 테스트 약 30분 전에 켜서 전기적 특성에 영향을 줄 수 있는 열 관련 물질 변화를 안정화할 수 있습니다. 적절하고 연결된 데이터 수집(DAQ) 장치를 선택합니다.
- 필요에 따라 소프트웨어에 실험 매개 변수를 설정하십시오. 이 소프트웨어는 저장된 연구 템플릿을 허용합니다. 실험(예: 학습 템플릿)을 설정하여 새 연구 통합 문서 만들기 옵션을 사용하여 새 연구를 만들 준비를 합니다.
참고: 실험 파라미터는 연구를 시작하기 전에 미리 로드될 수 있으며, 이로 인해 성별, 체질량, 생년월일, 테스트 시점, 치료 그룹 또는 필요에 따라 유사한 변수와 같은 추가 특정 실험 정보를 포함하라는 메시지가 표시됩니다. 연구 설정 매개 변수를 저장하고 실험 전체에서 사용할 수 있습니다. - 각 평가의 시작 부분에 이전에 만든 연구를 선택합니다. 이것이 돼지가 테스트 할 첫 번째 테스트 인 경우 새 동물을 추가하고 연구에 입력 된 변수에 대한 프롬프트를 따르십시오.
- 연구를 시작할 준비가 되면 실험 준비를 클릭하면 전극 배치를 최적화하는 데 필요합니다. 전극이 배치되면 최적의 배치를 결정하면서 신경에 반복적 인 경련을 전달하십시오 (단계 3.6 참조).
- 인스턴트 스팀 구성을 먼저 클릭한 다음 펄스 주파수, 펄스 폭, 펄스 수, 훈련 주파수 및 실행 시간을 조정합니다.
- 그런 다음 인스턴트 심 (Instant Sim) 을 클릭하여 반복적 인 트위치를 전달하십시오. 또는 자극기 유닛의 수동 트리거 버튼을 눌러 수동으로 하나의 트위치를 제공합니다.
- 전체 실험을 시작할 준비가 되었을 때 연구 프로토콜 중에 라이브 데이터 모니터 를 열어 수축을 실시간으로 조사/시각화할 수 있습니다. 실험을 시작할 준비가 되면 실험 실행 을 클릭합니다(동물 준비에 따라 2단계 참조).
2. 마취 준비 및 유지 보수
- 빠른 수컷 또는 암컷 돼지 (40-90 kg)는 마취 사건 전에 하룻밤 사이에 물 광고 리비툼을 허용하십시오. 절차 당일에 돼지의 정확한 체중을 얻고 기록하십시오.
- 타일타민 / 졸제팜 (Telazol, 4-6 mg / kg), 자일라진 (1-3 mg / kg) 및 프로포폴 (2.6 mg / kg)의 근육 주사로 마취를 유도하십시오. 처음에는 안면 마스크를 통해 5 % 이소 플루란으로 유지하십시오.
- 기관내 튜브로 돼지를 삽관하고 자동 인공 호흡기에 놓습니다. 돼지를 20cmH2O, 초기 조수 부피 10 mL / kg, 호흡 속도를 8-12 호흡 / 분으로 유지하십시오.
- 인공 호흡기 설정을 조정하여 40 ± 5mmHg의 조수 끝 PCO2 를 유지하십시오. 30%-37%O2에서 1%-3% 이소플루란으로 마취를 유지한다.
- 프로토콜 기간 동안 돼지의 체온을 37 °C로 유지하십시오. 필요에 따라 귀 정맥과 폴리 카테터를 삽입하여 유체 전달 및 소변 수집을 수행하십시오.
참고 : 외과 용 비행기 마취를 사용하면 테스트 중, 특히 둔부 근육의 이차 수축을 예방할 수 있습니다. - 눈 반사 및 위치, 턱 톤 부족, 심박수 (범위 80-150 bpm), 수축기 혈압 (범위 120-70 mmHg) 또는 이러한 모든 징후의 조합을 통해 마취의 깊이를 모니터링하십시오.
- 돼지가 완전히 마취되고 안정되면 먼저 비누와 물로 팔다리를 청소하여 파편을 제거한 다음 피부에서 머리카락을 면도하여 오른쪽과 왼쪽 뒷다리를 모두 준비하십시오. 나중에 전극 배치에 사용될 측면 무릎 영역에 세심한주의를 기울이십시오.
- 돼지를 수술 테이블로 운반하고 수핀 위치에 안전하게 놓습니다. 돼지를 테이블 끝 또는 약간 위에 둔부 근육이있는 테이블 발 쪽으로 놓습니다.
참고 : 이렇게하면 테스트 장치를 고정하는 수술대와 테이블이 맞닿을 수 있습니다. - 시험 후 돼지를 삽관하고 회복 할 수있게하십시오. 표준 돼지 사료와 물은 돼지가 완전히 회복되고 새장 내에서 자유롭게 외출 할 수있게되면 교체해야합니다.
참고 : 시술 후 진통제는 생체 내 검사 만으로는 필요하지 않습니다. 그러나, 카르프로펜 및/또는 부프레노르핀 SR은 수의학 권고에 따라 제공될 수 있다. 현지 수의사와의 상담이 권장됩니다. 여기에 나열된 마취 및 약물은 지침을위한 것이며 현재 미네소타 대학에서 승인되었습니다. 이소플루란을 이용한 마취의 유지는 그것의 빠른 발병 및 상쇄 및 생체내 신경 자극에 대한 그것의 최소한의 영향 유발 토크29에 기초하여 선택되었다. 연구 전반에 걸쳐 마취 매개 변수의 일관성을 유지하도록주의하십시오. 프로토콜 동안, 마취 평가 및 기록은 15 분 간격으로 수행됩니다. 녹음은 지역 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 및 미국 농무부 (USDA) 지침 및 요구 사항에 따라 수행됩니다.
3. 생체 내 아이소메트릭 토크의 평가
- 힘 변환기의 풋 플레이트에 발을 놓습니다. 유연한 응집력있는 붕대를 사용하여 발을 발판에 부착하십시오.
참고 : 발 당 전체 역할이 필요합니다. 이상적으로는 4 인치 x 5 야드 역할이 적절합니다. - 발목을 중립(A)으로 발판에 위치시키고 발목을 잡은 후 발목을 감싸는 밀폐된 바스켓 직조 발목 테이핑(B)의 스타일로 발과 발판 주위에 응집력 있는 붕대를 감싸서 발을 판에 고정시킨다.
참고 : 두 명의 연구 인력은 개별 (A) 및 (B) 작업을 동시에 수행해야합니다. - 발이 발판에 고정되면 발목을 직각으로 배치하십시오.이 판은 발바닥 또는 등굴곡의 정도를 참조하기 위해 0 ° 또는 중성으로 정의됩니다.
그림 1 : 다양한 유리한 지점의 사진은 발판에 돼지를 부착하고 프레임에 해부학 적으로 정렬하는 것을 보여줍니다. 전방 구획 근육, 경골 머리, 무릎, 경골 고원 및 대퇴골에 대한 해부학 적 랜드 마크가 주목됩니다. 다리의 측면 측면에 피하 전극 쌍의 배치에 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 무릎과 발목을 직각으로 안정시킵니다.
- 먼저 팔다리 클램핑 바를 필요한 위치에 가깝게 배치하십시오. 준비가되면, 사지의 내측 측면에서 시작하여 경골 고원 부근에서 사지 클램핑 바를 정렬하십시오.
- 그런 다음 대퇴골의 원위 머리에 측면 사지 클램핑 바를 정렬하십시오.
참고: 각 팔다리의 끝 사이에, 클램핑 바는 접힌 4 x 4 거즈 패드를 사용하여 바에 인접한 피부를 보호합니다. - 잠금 손잡이 나사를 사용하여 막대를 단단히 고정시킵니다.
참고 : 사지 클램핑 바는 서로 일치하지 않지만 돼지의 해부학과 일치합니다. - 의도 한 전극 배치의 중심에서 시작하여 바깥쪽으로 움직이는 동심원에서 깨끗한 거즈를 통해 70 % 알코올을 적용하여 비골 머리 주위의 피부를 닦으십시오. 멸균된 경피 바늘 (50 mm, 26 G 단극성) 및 전기 근전도 (EMG) 스타일 전극 ( 재료 표 참조)을 비골 신경에 걸쳐 놓습니다. 임플란트 전극 피하, 약 5-10 mm.
- 자극기에서 조정된 대로 증가하는 전류 진폭을 사용하여 전극 배치를 최적화합니다. 100mA에서 시작하여 필요에 따라 증가시킵니다.
참고: 피크 트위치 토크에는 일반적으로 300-500mA가 필요합니다. - 라이브 데이터보기와 돼지의 전방 구획에서 트위치 토크 크기를 시각화하십시오. 발굽이 뛰고 위쪽으로 움직일 수도 있습니다.
- 자극 중에 후부 구획 또는 경골 신경이 활성화되지 않았는지 확인하십시오. 자극 중에 발굽의 후부 구획 수축 및 하향 움직임을 시각적으로 검사하고 촉지합니다.
- 다음 단계에서 살아있는 토크 시간 추적으로부터 파상성 수축의 고원 영역을 검사하여 길항제 근육 모집 (즉,이 프로토콜에 대한 질경부 굴곡)이 부족한지 검사하십시오.
- 전극 배치 및 자극 진폭이 최적화되면 100Hz, 0.1ms 펄스 폭, 800ms 트레인(17)에 걸쳐 전극 배치 및 자극 진폭이 최적화되면 최대 등각 파타닉 토크를 유도합니다.
참고: 이러한 매개변수는 다양한 수축성 평가에 사용될 수 있습니다.
4. 토크 조인트 각도 분석을 위한 프로토콜
- 중립에서 발바닥굴곡의 근단 범위 또는 0-50°의 질경굴곡에 이르는 발목 위치 범위에서 최대 등각 파타닉 토크를 측정합니다.
참고: 10° 증분을 사용하려면 여섯 번의 수축이 필요하며 특정 실험 질문에 맞게 증분 변경을 조정할 수 있습니다. - 고니오미터 단계의 두 잠금 나사를 모두 풀어 조인트 각도 사이를 이동하십시오. 다음 수축 전에 두 잠금 나사가 모두 조여졌는지 확인하십시오.
참고: 고니오미터는 정확한 정렬을 위해 각도 표시로 기록되어 있습니다. 발바닥 굴곡의 0 ° 가능성이 높으며 고니오미터에서 180 ° 오프셋됩니다. 의도 된 위치를 보장하기 위해주의하십시오. - 실험적으로 수축 사이의 시간을 결정하고; 그러나 피로를 피하기 위해 2 분이면 충분합니다.
참고: 발목 관절 각도가 점진적으로 변경되면 바늘 전극이 변할 수 있습니다. 위에서 언급한 바와 같이 트위치 수축이 있는 전극의 배치를 확인해야 할 수도 있다(단계 3.8 참조).
5. 토크 주파수 분석을 위한 프로토콜
- 발목을 원하는 관절 각도로 배치합니다. 매번 동일한 관절 각도로 테스트를 수행하도록 실험적으로 주의하십시오.
참고: 일반적으로 토크-주파수 분석은 토크-조인트 각도 분석에서 파생된 피크 아이소메트릭 토크에 해당하는 단일 조인트 각도에서 수행됩니다. 피크 토크는 ~ 30-35 °의 질경이 굴곡에서 생성됩니다. - 완전히 융합된 테타니를 유도하는 것 이상으로 트위치의 융합되지 않은 트레인을 유도하는 다양한 자극 주파수에 걸쳐 최대 등각 토크를 측정합니다.
참고: 피로를 피하기 위해 각 수축 사이에 2분으로 10, 20, 40, 60 및 100Hz(0.1ms 펄스 폭, 800ms 트레인)에서 자극하여 이를 달성할 수 있습니다. 정확한 실험 질문 및 특정 돼지 모델에 따라 주파수가 조정 될 수 있습니다. 세포내 ATP를 유지하기 위해 800ms 수축 동안 가장 많이 활용될 가능성이 높은 생물에너지 기질은 포스포크레아틴(30)이고, 포스포크레아틴의 재합성은 포스포크레아틴 셔틀(31)에 의존한다. 포스포크레아틴 회복 동역학은 수축 종료후 30 초 후에 90-120 s 사이에서 90% 이상의 현저한 회복을 나타낸다. 따라서 수축 사이의 권장 휴식 간격은 90-120 초입니다. 그러나 이것은 근육 질환, 부상 및 / 또는 노화를 포함한 실험 설계의 영향을받을 수 있습니다.
6. 데이터 분석
- 아직 소프트웨어에 있는 경우 결과 분석을 클릭하여 분석 창을 엽니다. 또는 분석 프로그램을 직접 엽니다.
- 자동화된 데이터 플랫폼을 사용하든 수동 분석을 사용하든 개별 아이소메트릭 파형을 분석할 때 다양한 변수를 계산합니다.
참고: 이러한 변수에는 최대 트위치 토크, 최대 파타닉 토크, 트위치 및 테타니와 관련된 수축 특성(예: 피크 시간 및 절반 이완)이 포함됩니다. 많은 실험 변수들이 힘을 정규화할 수 있는데, 예를 들어, 체중, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(컴퓨터 단층 촬영) 또는 말단 근육 체중으로부터 결정된 근육량. 절대 토크(N·m)와 체질량(N·m/kg)으로 정규화된 토크가 모두 표시됩니다. 풋 플레이트에 놓인 휴식 토크는 실험에 따라 다릅니다. 휴식 토크에 대한 기준 보정을 적용하여 진정한 최대 트위치 및 파타닉 토크를 기록해야합니다. 각 조인트 각도의 베이스라인 토크가 기록되며 수동 토크의 변화를 나타낼 수 있습니다.
Representative Results
돼지의 전방 구획 의 생체내 시험 파라미터의 신뢰성 및 최적화는 이전에 보고된 바 있다(26). 토크 주파수에 대한 설치류와 돼지의 비교 데이터도27보고되었습니다.
생체내 평가 동안, 토크 파형의 시각화는 적절한 전방 구획 활성화를 보장하기 위해 실시간으로 필요하다. 파형은 등굴곡만 반영해야 합니다. 파형은 매끄럽고 둥근 모양과 겉보기 파타닉 고원을 가져야합니다 (그림 2A). 파형의 불일치 또는 혼란은 부적절한 자극, 부적절한 전극 배치 또는 부적절한 마취 깊이와 같은 다양한 실험적 한계를 나타냅니다 (그림 2B).
도 3A 는 최대 토크 50%를 나타내는 화살표가 있는 트위치 토크 시간 추적이다. 피크 간 수축 시간은 자극기의 시작에서 시작하여 최대 트위치 토크가 달성 될 때 끝나야합니다 (대표 시간 막대는 추적 아래에 표시됨). 트위치의 절반 이완은 최대 트위치 토크에서 시작하여 50% 최대 트위치 토크에서 끝나야 합니다(대표 시간 막대는 추적 아래에 표시됨). 도 3B 는 최대 토크 50%를 나타내는 화살표가 있는 파타닉 토크 시간 추적이다. 결정적이고 시기 적절한 최대 토크의 측면에서 이상적인 트위치 와는 달리, 파타닉 수축은 자극기가 언제 시작되고 끝나는지에 관한 최대 토크의 타이밍에 더 큰 변동성을 가지며, 수축 특성 분석에 대한 미묘한 접근이 필요합니다. 피크까지의 시간 수축은 자극기의 시작으로 시작하여 최대 토크의 90 % -100 % 사이에서 멈춰야합니다. 그림 3B 의 시간 막대는 95%의 최대 토크의 컷오프를 보여줍니다. 이는 고원 단계에서 늦게까지 최대 토크에 도달하지 못하기 때문에 선택된 대표 데이터와 같은 경우에 유용합니다. 피크까지의 시간에 대한 보완적인 분석은 평균 수축률입니다. 토크 시간 추적의 오름차순 사지에 있는 파선 막대는 최대 토크 30%-70%의 범위를 나타냅니다. 평균 수축 속도는 자극 시작시 시작되어야하며 최대 토크 30 % -70 % 사이의 평균 속도 변화를 포착해야합니다. 이들은 권장 범위이며, 개별 연구 그룹은 약 50 % (예 : ±10 %)의 이상적인 범위를 결정할 수 있습니다. 중요한 부분은 연구 내외에서 일관성을 유지하는 것입니다. 트위치와는 달리, 파타닉 수축 하프 이완은 피크 투 피크와 함께 위에서 언급 한 것과 같은 이유로 최대 토크 대신 자극의 끝에서 시작되어야합니다. 도 3B 의 시간 막대는 자극의 종료와 50% 이완에 도달하는 사이의 시간을 나타낸다. 절반 이완에 대한 보완적인 분석은 평균 이완 속도입니다. 토크 추적의 내림차순 사지에 있는 파선 막대는 오름차순 사지와 동일한 30%-70% 최대 토크 범위를 나타냅니다. 평균 이완 속도는 자극의 끝에서 시작되어야하며 30 % -70 % 최대 토크 사이의 평균 변화율을 포착해야합니다. 다시 말하지만, 이러한 범위는 권장 범위입니다. 한 가지 중요한 참고 사항 : 수축 / 이완의 평균 속도를 최대 수축 / 이완 속도와 혼동하지 마십시오. 최대 속도는 인접한 두 데이터 포인트 간의 가장 놀라운 단일 속도 변화를 나타내며 광범위하게 가변적일 수 있습니다.
몇몇 트위치 및 수축성 특성이 분석되어 골격근(10,32)의 섬유 유형 및 여기-수축 결합 속성에 대한 통찰력을 얻을 수 있다. 트위치 및 수축 특성에 대한 과도한 해석은주의해야합니다. 그들은 추가 세포 수준의 심문을위한 제안과 근거를 나타내며 반드시 지시 적이지는 않습니다. 일반적으로, 수축성의 속도는 사르코플라스마 망상체 칼슘 방출 및 미오신 중쇄 이소폼 효소적 속도를 반영할 수 있다. 대조적으로, 이완 속도는 사르코(endo)플라스마 칼슘 ATPase 효소 속도 및 이소형을 반영할 수 있다. 이러한 특성은 피로, 근육 손상, 운동 훈련 및 수많은 병리학 (예 : 위축을 사용하지 않음)에 의해 영향을받을 수 있습니다.
그림 4는 부상을 입지 않은 팔다리에 대한 토크-주파수 및 토크-관절 각도 관계에 대한 대표 값을 보여줍니다. 이 데이터는 광범위한 돼지 크기를 나타냅니다.
대표적인, 표면 EMG의 실험적 분석은 속도 코딩 및 총 근육 활성의 실험적 조절을 입증하기 위해 생체내 근육 분석(도 5) 동안 수행되었다. 접착성 EMG 전극은 페로네우스 테르티우스의 중간 배에 배치되었다. 자극 아티팩트를 최소화하기 위해 접지 전극을 무릎 위에 놓았고, 자극 전극 바늘을 근육 위치에 근접한 비골 신경 주위에 배치하였다. 동시 토크 및 EMG 기록은 20, 60 및 100Hz의 자극 주파수에서 이루어졌습니다. 자극기 펄스의 수(그림 5의 빨간색 막대)는 펄스 사이의 자극 지속 시간과 시간의 몫을 반영합니다. 예를 들어, 20Hz 자극 주파수는 매 50ms마다 펄스를 의미한다; 따라서, 400ms 자극 지속 시간을 펄스 간에 50ms로 나눈 값은 전달되는 8개의 펄스와 같다(그림 5A). 자극기 펄스는 경피 바늘 전극 배치를 통해 신경 축삭에 전달되고 유사한 수의 전기 근육 펄스 (즉, 20Hz는 8 EMG 기록과 같음)를 생성하여 관심 근육 그룹의 활동 전위 주파수의 실험적 제어를 보여줍니다. 원시 근전도 기록은 근평균 제곱 분석(EMG RMS)을 통해 변환하여 자극 빈도 증가와 함께 총 근육 활동을 시각화할 수 있습니다. 곡선 아래 면적 (AUC) 분석은 전체 근육 활동의 변화를 결정하기 위해 EMG RMS를 정량화하는 한 가지 방법입니다. 각 EMG RMS 자극 주파수에 대한 대표적인 AUC가 제공된다(도 5A-C).
그림 2: 대표적인 고품질 및 저품질 파형 . (A) 눈에 띄는 유체 고원과 함께 구형파 모양으로 존재하는 아이소메트릭 파형. (B) 저품질 파형은 부적절한 자극 또는 부적절한 전극 배치로 인한 것일 수 있습니다. 이러한 경우, 전극의 재배치가 필요하다. A 및 B 모두에 대해, 자극기 펄스(적색 막대)가 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Twitch 및 파타닉 수축 특성 분석. (A) 대표적인 트위치 (1 Hz) 및 (B) 파타닉 (100 Hz) 토크 타임 트레이싱은 상세한 수축 특성으로 수정됩니다. 각 그래프의 빨간색 화살표는 50%의 최대 토크를 보여줍니다. 추적 아래의 파란색 막대와 검은색 막대는 각각 피크 시간 및 절반 휴식 시간을 보여줍니다. 파타닉 토크 시간 추적의 오름차순 및 하강 팔다리의 파선 막대는 평균 수축 또는 이완 속도를 결정하는 데 사용할 수있는 30 % -70 % 최대 토크 범위를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 토크-조인트 각도 및 토크-주파수의 예제 데이터. 제공된 데이터는 2.9-6.3 개월의 여성 요크셔 크로스 돼지의 범위에서이다; 39.4-75.4 kg 체질량; 모두 평가 시간에 건강한 대조군으로 간주되었습니다. 모든 시험 동안, 코어 체온은 37°C로 유지되었다. (A) 체질량으로 정규화된 토크는 0-50°의 발바닥굴곡의 발목 관절에서 평가되고; 피크 토크는 30°에서 결정됩니다. (b) 체질량으로 정규화된 토크는 10-100Hz의 다양한 자극 주파수에서 평가된다; 이러한 평가는 30°의 발바닥굴곡에서 발목 관절을 사용하여 수행되었다. (c) 각각의 자극 주파수에 대한 개별 토크 트레이싱을 평가하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 생체 내 등각 토크 및 EMG 측정의 동시 암컷 요크셔 돼지(~90kg 체질량)로부터 수집된 (A) 20, (B) 60 및 (C) 100Hz의 대표적인 자극 주파수에서 동시 EMG 및 토크 기록. 자극기 펄스(적색 막대)는 설정된 자극 주파수에 따라 전달되었다. 원시 근전도 기록은 근평균 제곱근(EMG RMS)으로 변환되어 자극 빈도가 증가함에 따라 총 근육 활동을 시각화했습니다. 대표적인 EMG RMS 곡선을 곡선 아래 면적(AUC)에 대해 분석하고, AUCs가 각 자극 주파수에 대해 제공된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
중요한 단계, 수정 및 문제 해결
데이터 변동성을 최소화하고 접근 방식의 성공을 극대화하기 위해 다음과 같은 중요한 단계가 강조 표시됩니다.
최적의 신경 자극
이 실험적 접근법은 신경 축삭 탈분극으로 시작하여 올바른 전극 배치와 최적화 된 전기 자극에 의존합니다. 뼈가 많은 랜드 마크와 관련된 신경 해부학의 사후 분석은 테스트 중에 적절한 전극 배치를 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 최대 트위치 토크를 획득하면 신경 축삭에 전달되는 적절한 전류(밀리암페어 단위; mA)를 결정하는 데 도움이 됩니다. 테스트 시작시 신경 자극을 최적화할 때 명심해야 할 두 가지 값이 있습니다: (1) 트위치 대 파타닉 비율은 ~1:5, 예를 들어, ~2 N·m 트위치 토크는 10 N·m 파타닉 토크에 해당합니다 (그림 3); (2) 체질량에 대한 일반적인 토크는 체질량 kg 당 ~0.3N·m이다(그림 4). 피크 트위치 토크가 낮게 나타나면 전극을 제거하고 다른 배치를 시도하십시오. 자극기 설정, BNC 연결 및 전극 연결을 확인하십시오. 위에서 언급한 바와 같이 관절 각도 사이의 사지를 위치시키는 동안 너무 많은 움직임이 있는 경우 수축 사이에 전극 재배치가 필요할 수 있습니다(그림 2). 실험적 및 중재적 접근법이 이러한 값에 영향을 줄 수 있다는 점에 유의하십시오.
적절한 생체 역학적 정렬
시작 근육 길이는 근육 수축력 (길이 - 긴장 관계)에 영향을 미치며 근육 길이는 엉덩이, 무릎 및 발목 관절 정렬에 따라 변경 될 수 있습니다. 관절 각도는 팔다리와 돼지 사이에서 표준화되어야합니다. 90 ° 발목 관절 각도는 엉덩이와 무릎에 강력히 권장됩니다. 약간 발바닥 굴곡 발목 위치 (중립 0 ° 발목 관절 각도에서 ~ 30 °)는 피크 강도에 최적입니다. 그것은 서있는 동안 돼지와 개 모두에서 발목 관절의 자연 해부학 적 위치를 반영합니다. 또한 모든 조인트는 수직 토크 벡터의 기여로 인한 측정 가능한 토크의 손실을 피하기 위해 풋 페달 및 토크 트랜스듀서와 평행해야 합니다. 엉덩이-무릎-발목 관절 각도와 발-페달-관절 정렬을 검사하는 것은 발을 발 페달로 고정하고 사지 클램핑 막대로 무릎 관절을 고정한 후에 강력하게 권장됩니다(그림 1). 정렬이 잘못되면 막대를 잠금 해제하고 제거하고 수술 테이블에 돼지를 재배치하십시오. 연구 전반에 걸쳐 관절 각도를 표준화하는 것이 데이터 분산을 최소화하는 데 중요하지만, 아래에서 논의되는 생체 역학적 정렬에는 한계가 있습니다.
기존 또는 대체 방법과 관련된 중요성
돼지 모델에 사용될 수 있는 근육 기능에 대한 임상적으로 관련성이 높고 비침습적인 평가의 변경적인 예에는 디딜방아 보행 거리, EMG 및 활성 근육 전단파 전기가 포함된다. 인간에서 6 분 도보 테스트로서, 러닝 머신 보행 테스트는 대형 동물 33,34,35에서 질병 진행 및 개입 성공을 평가할 수 있습니다. 전형적으로, 순응 기간 후에, 동물들은 상이한 디딜방아 속도 및/또는 경사 수준에서 순응이 끝날 때까지 걸을 수 있다. 음식 보상은 종종 최대한의 동기 부여를 달성하는 데 필요합니다. 그러나 러닝 머신 보행 결과는 피험자 동기 부여, 비 최대 운동 유닛 모집 및 심혈관, 골격 및 호흡기와 같은 다른 신체 시스템에 대한 고유 한 공동 의존성과 같은 제한으로 인해 근육 수축 기능에 대한 간접적 인 해석 만 제공합니다.
반면에, EMG 전극은 관심 근육 그룹(36,37,38)에 직접 배치되기 때문에 골격근 시스템에 대한 약간 더 나은 직접 평가를 제공한다. 그런 다음 EMG 전극은 집단 근육 활동 (탈분극 된 근육 섬유)을 측정합니다. 이 근육 활동은 모터 유닛 모집 및 속도 코딩 (모집 된 모터 유닛으로 전송 된 행동 잠재력의 빈도)을 기반으로합니다. 그러나 모터 유닛 모집과 속도 코딩의 상대적 기여도를 분리하는 것은 표면 EMG에서는 불가능합니다. 또한, EMG는 최대한의 수축을 일으키려는 피험자의 의지에 의존하며, 이러한 수준의 협력은 대형 동물 모델에서는 거의 불가능합니다. 보행주기 동안 근전도의 변화를 평가하는 것이 유익 할 수 있지만, 이러한 데이터는 관심있는 골격근 그룹의 최대 기능 능력을 나타내지 않습니다. B 모드 및 전단파 엘라스토그래피를 활용한 초음파 기반 이미징은 근육 기능을 평가하는 데 사용되는 또 다른 비침습적 방식입니다. 엘라스토그래피에 의해 측정된 영 모듈러스와 증가 근육 부하39,40 사이에는 좋은 상관관계가 있다. 전단파 엘라스토그래피는 돼지 용적 근육 손실 손상 모델23을 포함하는 수동 조직 강성 41,42,43,44,45의 정량적 척도로서 검증되고 사용되었다. 이는 또한 활성 근력 생산(39)의 간접 측정으로서 사용될 수 있다. 그러나 수축을 수행하기위한 피험자 의지와 협력에 대한 EMG와 유사한 한계는 여전히 존재합니다.
여기에 기술 된 생체내 프로토콜은, 러닝머신 보행 거리 및 EMG와는 대조적으로, 근육 기능의 신뢰성, 재현성, 및 최대한의 평가를 제공한다. 이 프로토콜은 동기 부여와 독립적 인 통제되고 정량화 가능한 방식으로 근육 수축을 유발합니다. 구체적으로, 경피 전극은 중추 신경계를 우회하는 신경 축삭을 자극하기 위해 사용된다. 신경 축삭의 탈분극은 모든 운동 유닛을 참여시켜 운동 유닛 모집과 관련된 가변성을 제거합니다. 추가적으로, 조사자는 속도 코딩(자극 주파수)을 제어한다. 이 접근법에 적용되는 결과 신경 근육 생리학은 Ranvier의 노드에서 전압 게이트 된 나트륨 채널 활성화로 시작됩니다. 모든 후속 (또는 하류) 생리학은 여기 수축 결합 및 교차 브리지 사이클링을 포함하여 참여됩니다. 생체내 비침습적 근육 분석의 중요한 이점은 수축성 근육 기능이 반복적으로 측정될 수 있다는 것이다, 예를 들어, 매주, 손상, 개입, 또는 질병 진행에 걸친 후 근력을 모니터링한다.
방법의 제한 사항
이 프로토콜 에 설명된 생체내 장비는 관절 각도 및 자극 주파수의 함수로서 수동 및 능동 등각 토크를 허용한다. 사용된 시험 장치는 동적 수축(예를 들어, 동동역학적 편심 또는 동심 수축)의 측정을 지원하지 않는다. 이 장치는 토크-조인트 각도 관계를 특성화하기 위해 105° 범위의 움직임을 허용하며 최대 토크 범위가 ~50N·m인 로드셀을 사용합니다. 특정 실험 질문에는 이러한 사양 이외의 성능 특성이 필요할 수 있습니다. 주목할 만하게, 이러한 설명된 장치 상의 로드 셀은 필요하다면 더 큰 토크 범위로 교환될 수 있다.
생체내에서 최대한의 신경근 강도를 측정하기 위해 본원에 기재된 프로토콜은 주목할 만한 한계를 갖는다. 첫째,이 방법은 마취가 필요하며, 이는 동물 시설 프로토콜 및 자원에 따라 다르게 수행 될 수 있습니다. 마취제는 신경근 기능에 다양한 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 마우스의 생체내 등융곡기 토크 생성을 마취형 및 -용량-의존적 방식으로 변화시키는 것으로 나타났다(29). 큰 동물의 생체 내 토크에 대한 마취제의 차별적 인 효과는 불분명하다. 따라서, 대조군 및 실험군은 이러한 가변성을 조절하기 위해 동일한 마취제(예를 들어, 케타민을 투여한 모든 그룹)를 가져야 한다. 둘째, 생체 내 확산 패턴에 대한 의존은 수축성 기능 장애 및 급성 약물 독성의 세포 메커니즘의 탐구를 제한합니다. 예를 들어, 카페인은 단리된 근육의 시험관내 장기 목욕 시험 중에 유육종 망상 칼슘 방출을 자극하고, 여기-수축 커플링(46)을 직접 우회하여 사용될 수 있다. 이러한 효과를 유도하는 카페인의 양(mM)은 생체내 환경에서 치명적이다. 전신에 대한 약물 영향 (예를 들어, 신장 / 간 스트레스) 및 순환으로 분비되는 후속 인자는 이 접근법이 급성 근력에 대한 약물 스크리닝에 사용되는 경우 고려될 필요가 있을 것이다23. 셋째, 최대한의 전기 신경 자극의 사용은 위에서 논의 된 바와 같이 자발적인 모집 전략에서 벗어나므로 신경 근육 모집 적응으로 인한 힘의 변화를 반영하지 않습니다.
생체내 토크 측정은 또한 실험적 관찰을 위한 특정 메카니즘을 확립하는 것과 관련하여 제한될 수 있다. 예를 들어, 발목 관절에 대한 토크는 근육력 생산뿐만 아니라 힘줄과 관절 및 결합 조직 특성에도 달려 있습니다. 또한, 힘은 근육 그룹, 특히 돼지의 발바닥 굴곡기 (위장병, 발바닥 및 질경이 근육)와 등쪽 굴곡기 (peroneus tertius, tibialis 및 digitorum muscles)에 의해 생성됩니다. 따라서 최대한의 생체 내 토크 데이터의 해석은 잠재적 인 근육 및 해부학 적 변화를 고려해야하며 개별 근육이 아닌 근육 그룹으로 제한됩니다. 이와 관련하여, 근육 그룹은 종종 발바닥 굴곡기의 위장관 및 발바닥 근육과 같은 우세하게 빠른 근육 섬유와 느린 근육 섬유의 혼합물로 구성됩니다. 수축 및 이완의 속도 (또는 피크 수축 시간 및 반-이완 시간)와 같은 수축 특성은 시험관내 또는 현장 테스트 프로토콜47과 같은 단리된 근육 제제 대 생체내 사용을 사용하는 섬유 유형 생리학의 신뢰할 수있는 지표가 아닙니다. 분리 된 근육 제제는 또한 근육 길이와 같은 특성을 정확하게 제어 할 수 있기 때문에 생체 역학 매개 변수가 근육 기능에 미치는 영향을 이해하는 데 탁월합니다. 관절 각도-토크 관계는 힘줄(예를 들어, 슬랙), 근육(예를 들어, 페네이션 각도, 사르코머 오버랩) 및 관절(예를 들어, 모멘트 암) 특성이 관절 각도에 의존하기 때문에 근육 길이-힘 관계와 직접적으로 동등하지 않다는 것을 강조하는 것이 중요하다. 이를 위해, 계내 기능성 시험(48)에 있는 대형 동물은 생체내 시험이 말단 실험이라는 것을 명심하면서, 생체내 시험에 귀중한 추가가 될 수 있다. 실험 발견의 기계론적 통찰력을 향상시키기 위해 미래에 탐구될 수 있는 현재 프로토콜에 대한 다른 발전은 초음파 B 모드 이미징을 사용하여 근육 및 힘줄 구조적 특성을 측정하고, 자발적이고 전기적으로 자극된 수축 동안 근육력을 측정하기 위해 힘줄 힘 변환기를 이식하는 것을 포함한다(49).
방법의 중요성과 잠재적 인 적용
이 프로토콜은 돼지 등굴곡기 근육 그룹의 생체 내 토크 생성 능력을 평가하여 생리적 환경에서 근육 기능의 이득 또는 손실을 평가하는 비침습적 방법을 시연합니다. 상기 방법론은 돼지에게 비말단이기 때문에, 질병의 진행 동안, 또는 치료 전략의 전, 도중, 및 따르는 동안 종방향으로 동일한 피험자에서 근육 기능을 평가하는데 사용될 수도 있다. 따라서 반복적 인 측정 실험 설계는 독립적 인 측정에 비해 더 큰 힘과 더 적은 동물로 강력한 통계적 비교를 허용 할 수 있습니다. 추가적으로, 골격근 기능장애는 다양한 질환 과정 및 상태의 두드러진 성분, 예컨대 만성 질환-관련 근육 소모성 (예를 들어, 심부전, 신부전, AIDS, 암 등), 근이영양증, 신경퇴행성 질환 (예를 들어, SMA 또는 근위축성 측삭 경화증; ALS), 노화 (즉, 유육종증) 및 약물 독성. 골격근 기능 능력은 운동, 영양, 약물 및 재생 의학 요법과 같은 중재에 대한 중요한 주요 결과 척도입니다. 따라서, 생체내에서 돼지 토크 생성 능력을 신뢰성 있게 평가하기 위해 본원에 기재된 프로토콜은 수많은 연구 응용에 걸쳐 사용될 수 있다. 그것은 치료법 개발의 번역을 위해 광범위한 동물 데이터를 획득하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Disclosures
여기에 포함 된 의견이나 주장은 저자의 사적인 견해입니다. 그들은 공식적이거나 육군부, 국방부 또는 미국 정부의 견해를 반영하는 것으로 해석되어서는 안됩니다.
비디오 기사의 제작 및 오픈 액세스 가용성은 오로라 사이언티픽, Inc.에 의해 후원되었다. 매튜 보르코프스키는 오로라 사이언티픽 Inc.에 의해 고용된다. 이 회사는 잠재적으로 연구 결과로부터 이익을 얻을 수 있습니다.
Acknowledgments
제시된 작업과 데이터는 BTC 및 SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR)에 대한 미 육군 의학 연구 및 재료 사령부에 의해 광범위하게 지원되었습니다. 재향 군인 업무부, 재향 군인 건강 관리국, 연구 개발 사무소 (I21 RX003188)와 JAC 및 Luke Brewster 박사. 저자들은 USAISR 수의학 서비스 및 비교 병리학 지부 및 UMN Advanced Preclinical Imaging Center가 이러한 연구를 완료하는 데 기술적 도움을 준 것에 대해 감사하게 생각합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
| 892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
| Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
| Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
| Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
| Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
| Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
| Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |
References
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