Summary
6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)モデルは、パーキンソン病の理解を進めるために何十年も使用されてきました。このプロトコルでは、内側前脳束に6-OHDAを注射することによってラットの片側黒質線条体病変を行う方法、運動欠損を評価する方法、およびステッピング試験を用いて病変を予測する方法を実証する。
Abstract
パーキンソン病(PD)の運動症状 - 徐脈、無動症、および安静時の振戦 - は、黒質パースコンパクト(SNc)およびドーパミン作動性線条体欠損におけるドーパミン作動性ニューロンの神経変性の結果である。動物モデルは、実験室でヒトの病理をシミュレートするために広く使用されている。げっ歯類は、取り扱いとメンテナンスの容易さのためにPDに最も使用される動物モデルです。さらに、PDの解剖学的および分子的、細胞的、および薬理学的メカニズムは、げっ歯類およびヒトにおいて類似している。神経毒である6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)をラットの内側前脳束(MFB)に注入すると、ドーパミン作動性ニューロンの重度の破壊が再現され、PD症状がシミュレートされる。このプロトコルは、PDのラットモデルにおいてMFBにおける6-OHDAの片側マイクロインジェクションを行う方法を示し、6-OHDAによって誘発される運動欠損を示し、ステッピング試験を通じてドーパミン作動性病変を予測した。6-OHDAは、対側前肢で実行されるステップ数に著しい障害を引き起こす。
Introduction
PDの主な神経病理学的特徴は、黒質パースコンパクタ(SNc)におけるドーパミン作動性ニューロンの慢性進行性神経変性およびα-シヌクレインタンパク質1を含むレビー小体の存在である。SNcドーパミン作動性ニューロンが黒質線条体経路を介して軸索を線条体に投影すると、SNcにおけるニューロンの神経変性は線条体にドーパミン作動性欠損をもたらす2。線条体にドーパミンがないと、PDの主な運動症状の原因となる直接的および間接的な運動制御経路の活動に不均衡が生じる:無動症(遅い動き)、徐脈(動きを開始することの困難さ)、筋肉のこわばり、および安静時の振戦3,4,5。
PDの発症に関与する分子的および生理学的メカニズムはまだ完全には理解されていないため、現在利用可能な主要な治療法は、薬物療法、深部脳刺激6,7、遺伝子治療8、および細胞移植を通じて運動症状を緩和することを目指しています9。したがって、PDの発症メカニズムを解明し、PD10の罹患神経細胞の変性を予防または停止するための早期診断のための新しい方法論および新しい治療法を発見するための前臨床研究は不可欠です。
動物モデルは、実験室でヒトの病理をシミュレートするために広く使用されており、医学と科学の進歩に貢献しています11,12,13,14。しかし、動物モデルの正しい選択が研究の成功にとって不可欠であることを強調することが不可欠です。したがって、動物モデルは、3つの主要な側面において検証されなければならない:i)動物モデルがヒト病理の特徴を有していなければならない顔の妥当性;ii)動物モデルが確固たる理論的根拠を持たなければならない建設的妥当性。iii)動物モデルが臨床的治療と同様の方法で治療に応答しなければならない予測的妥当性。
現在、PDの動物モデルとして数匹の動物が用いられている。主なグループには、げっ歯類、霊長類、ミニブタ、イヌ、ネコなどの哺乳類、およびショウジョウバエやゼブラフィッシュなどの他のグループが含まれます。げっ歯類はPDの最も古典的な動物モデルであり、取り扱いとメンテナンスの容易さのために最も使用されています。さらに、PDの解剖学的構造と分子的、細胞的、薬理学的メカニズムは、げっ歯類とヒトで類似しています15。
Kinらが2019年に発表したレビューでは、2000年代にPDに使用された主要な動物モデル方法論を分析し、最も使用された動物モデルには6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)や1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)などの神経毒が含まれていることが判明しました。どちらの神経毒も、黒質線条体経路のドーパミン作動性ニューロンにミトコンドリア調節不全を引き起こし、細胞死につながります16。もう1つの広く使用されているモデルは、PDの発症に関与する特定の遺伝子の変異による遺伝子操作を含み、ミトコンドリアの調節不全を引き起こす17。神経毒モデルは、治療薬の評価と比較に一般的に使用され、遺伝的モデルは予防療法および特発性PD15の開発を研究するために使用されます。
神経毒MPTPは、7人の患者がこの物質を使用し、重度のPD症状を示した後、1980年代半ばにパーキンソニズムを引き起こすことが発見された。症状に加えて、患者はL-DOPAによる治療に反応し、研究者らは分子をPDに直接リンクさせた。この症例が1986年に発表された後、何人かの研究者が前臨床PD研究でMPTPを使用し始めました18。研究者らは、MPTPが親油性分子であるため、血液脳関門(BBB)を通過してMPP + 19に変換されることを発見しました。この有毒物質はニューロン内部に蓄積し、ミトコンドリア呼吸鎖の複合体1に損傷を与え、ドーパミン作動性ニューロンの死につながります20。
6-OHDA神経毒モデルは、196821年に黒質線条体経路のモノアミンニューロンの変性を誘導するために初めて使用された。6-OHDAモデルは、ドーパミン類似体であり、カテコールアミン含有細胞に対して毒性であるため、黒質線条体経路において神経変性を引き起こすために一般的に使用される。6-OHDAは、脳に入った後、ドーパミン作動性ニューロンにおいてドーパミントランスポーター(DAT)に取り込まれ、黒質線条体経路の変性につながる22。6-OHDAはBBBに浸透しないため、脳内定位注射によって直接投与されなければならない23。ノルアドレナリン再取り込み阻害剤は、しばしば6-OHDAマイクロインジェクションと組み合わされ、ノルアドレナリン作動性線維を保存し、ドーパミン作動性ニューロンのより選択的な変性を提供する24。
DATが6-OHDAを取り込んだ後、それはニューロンの細胞質ゾルに蓄積し、活性酸素種(ROS)を産生し、細胞死につながります15。6-OHDAの3つの異なる病変モデルが頻繁に使用される:i)SNc25,26に対する病変;ii)線条体への病変27,28;iii)MFB29、30に対する病変。線条体に引き起こされた病変は、SNpcにおけるドーパミン作動性ニューロンのゆっくりとした逆行性変性をもたらす。対照的に、SNpcおよびMFBで引き起こされた病変は、ニューロンの急速かつ全的な変性をもたらし、より進行したパーキンソン病症状をもたらす31。
6-OHDAの片側または両側注射は、ドーパミン作動性ニューロンにおいて神経変性を引き起こし得る。6-OHDAは、必ずしもニューロンに重度の損傷を引き起こすとは限らない。時には、注入は部分的な損傷をもたらし、PD32の初期段階をシミュレートするためにも使用される。一方的注射は、動物の運動障害を評価し、アンフェタミン/アポモルヒネ誘発回転およびステッピング試験などの試験を通じて細胞損失を予測するモデルの能力のために、より一般的に使用される29。バイラテラルインジェクションは、空間記憶と認識を評価するために最も使用されます33。
アンフェタミン/アポモルヒネ誘導回転試験は、黒質線条体経路における細胞喪失を予測するために一般的に使用される行動試験である。これは、ドーパミンアゴニストを繰り返し投与すると、6-OHDA病変動物における回転行動の激化をもたらすプロセスとして定義される34。回転挙動は、一方的に病変したげっ歯類におけるアンフェタミン誘発同側回転またはアポモルヒネ誘発対側回転を定量化することからなる。薬物誘発性の回転行動は、回転がヒトのPD症状に対応しておらず、耐性、感作、および「プライミング」などの変数によって影響を受ける可能性があるため、批判されている35。
プライミングは、これらの行動テストにおいて最も重要な要因の1つです。L-DOPAの単回投与が回転行動の失敗につながったいくつかの症例が報告されている36。さらに、アンフェタミン誘発試験とアポモルヒネ誘発試験の並行使用のための併用に関連するもう1つの重要な要因は、異なるシグナル伝達機構および経路の不活性化を反映して、異なる作用機序のために異なるエンドポイントを測定することである。さらに、アンフェタミン誘発試験は、50〜60%を超える黒質線条体病変を測定する方がより正確であるのに対し、アポモルヒネ誘発試験は80%を超える病変に対してより正確である37。
ステッピングテストは、ドーパミン作動性ニューロン変性および治療効果に関連する欠損を示す行動テストとして浮上している。これは、薬物誘発処置なしでドーパミン作動性ニューロンにおける6-OHDA病変によって引き起こされる無覚症の分析を可能にする。さらに、この試験は、Olssonらによって最初に記載された1995年以来、十分に確立され、一般的に使用されている。1999年、Chang et al.38 はまた、ステッピング試験におけるラットの性能を6-OHDAによって引き起こされる変性のレベルと分析および比較し、ステッピング試験でより悪いパフォーマンスを示した動物もドーパミン作動性ニューロンのより有意な変性を有することを見出した。
ステッピング試験は、6-OHDA病変ラットにおける重度のドーパミン作動性黒質線条体損傷を予測するための優れた方法である。証拠は、SNcにおけるドーパミン作動性喪失の程度が>90%である場合、ステッピング試験中に6-OHDA注入の対側前肢に運動欠損が現れることを示唆している39。本稿では、ラットのMFBへの6-OHDAの片側注入のための定位手術を行うために使用されるプロトコル、方法論、および材料、およびステッピング試験を介して毒素によって引き起こされるドーパミン作動性病変を予測する方法を説明する。
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Protocol
動物を含むすべての手順は、動物実験管理のための全国評議会(CONCEA)およびアルーカ法(法律11.794/2008)の倫理原則に従い、地元の倫理委員会(CEUA-FFCLRP/USP(18.5.35.59.5)によって承認されました。
1.薬物の調製
- ケタミン/キシラジンによる麻酔
注:使用されるケタミンの用量は70mg / kgであり、キシラジンの用量は10mg / kgである。- ケタミン100mg/mL溶液およびキシラジン20mg/mL溶液を用いて麻酔薬1mLを調製するには、0.35mLのケタミン溶液、0.25mLのキシラジン溶液、および0.4mLの0.9%滅菌生理食塩水を組み合わせる。麻酔薬溶液を最終容量2mL/kgで投与する。
注:ケタミンはキシラジンと一緒に60〜80分間鎮静剤を生成することができます。動物がまだ反射(例えば、後肢のピッチングおよび/またはまばたき反射)を有する場合、個々の用量の10%を追加投与する。
- ケタミン100mg/mL溶液およびキシラジン20mg/mL溶液を用いて麻酔薬1mLを調製するには、0.35mLのケタミン溶液、0.25mLのキシラジン溶液、および0.4mLの0.9%滅菌生理食塩水を組み合わせる。麻酔薬溶液を最終容量2mL/kgで投与する。
- イミプラミン
注:使用されるイミプラミンの個々の用量は20mg / kgである。- 1mLのイミプラミン20mg/mL溶液を調製するには、20mgのイミプラミンと1mLの0.9%滅菌生理食塩水を組み合わせる。イミプラミン溶液を最終容量1mL/kgで投与する。
- メロキシカム
注:使用されるメロキシカムの個々の用量は1mg / kgである。- 1 mLのメロキシカム1 mg/mL溶液を調製するには、0.05 mLのメロキシカム2%および0.95 mLの0.9%滅菌生理食塩水を組み合わせる。メロキシカム溶液を1日1回、最終容量1mL / kgで2日間投与する。
- アスコルビン酸 0.1%
- 1mLの0.1%アスコルビン酸を調製するために、1mgのアスコルビン酸および1mLの0.9%滅菌生理食塩水を組み合わせる。
- 6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)
注:6-OHDAは、脳内のドーパミン作動性およびノルアドレナリン作動性ニューロンを選択的に破壊するために使用される神経毒である。目、鼻、口の皮膚や粘膜に直接触れないでください。6-OHDAを取り扱うときは、ダブルニトリル手袋、白衣、使い捨てガウン、目の保護具、サージカルマスクまたはフェイスシールドを着用してください。毒素の総注入量は4μL/匹であり、個体量は6-OHDA/匹の10μgである。- 終濃度2.5mg/mLで1mLの6-OHDAを調製するには、2.5mgの6-OHDAと1mLの0.1%アスコルビン酸を含む0.9%生理食塩水を混合する(上記)。
注:6-OHDAは光に敏感で、明るい光にさらされるとより速く劣化します。適切に取り扱い、光から保護された環境に保管する必要があります。溶液の色が赤みを帯びている場合は、それを捨ててください。
- 終濃度2.5mg/mLで1mLの6-OHDAを調製するには、2.5mgの6-OHDAと1mLの0.1%アスコルビン酸を含む0.9%生理食塩水を混合する(上記)。
- 塩酸リドカイン(2%)
- 動物への局所適用のために2%リドカイン溶液を調製する。
注:適用できる最大用量は7mg / kgです。
- 動物への局所適用のために2%リドカイン溶液を調製する。
- ポリ抗生物質懸濁液
注:ストレプトマイシンおよびペニシリンを含むポリ抗生物質懸濁液( 材料表を参照)は、適用時に、アンプルが粉末とともにバイアルに付随する希釈剤の全量で調製されなければならない。- ゴム栓の金属製ディスクを取り外します。ゴム栓をアルコールで消毒します。
- 23Gの針を備えたシリンジを使用して、希釈剤をバイアルに注入する。針を外し、懸濁液が完全に均質になるまでバイアルを激しく振る。バイアルに少量の空気を注入し、所望の量の懸濁液を撤回する。
- 深い筋肉内注射を投与し、薬物を注入する前にプランジャーを引っ張って、血管に達しないようにする。
注:適用する懸濁液の最終容量は0.5mL / kgです。
2. 材料の準備
メモ: 化学物質を取り扱うときは、必ず製品安全データシートに記載されている指示に従ってください。
- 定位装置
- 定位装置を適切な照明を備えた安定したクリーンベンチに置き、手術を行います。装置を70%エタノールで消毒する。
- デバイスのイヤーバーと切歯バーが正しく揃っているかどうかを確認します。手術中に動物が置かれる場所にサーマルブランケットを置き、処置中に暖かく保ちます。正確な直腸プローブで動物の体温を監視します。
注:動物が37°Cの体温を維持するように、サーマルブランケットは37.5°Cにする必要があります。
- マイクロインフュージョンシステム
- 医療グレードのポリエチレンマイクロチューブと針に取り付けられたハミルトンシリンジ(50 μLまたは必要に応じて)に二重蒸留水(ddH2O)を充填し、システムからの漏れを確認します。
- 単一の気泡がシリンジ内のddH2Oをマイクロチューブ内の6-OHDA溶液から分離するように、システムを通して空気を引っ張ります。
注:この手順は、ハミルトンシリンジを6-OHDAで汚染することを回避し、同じ実験日に複数のラットを使用することを可能にする。 - ハミルトンシリンジを輸液ポンプにしっかりと取り付け、シリンジのプランジャーがそれを押すために移動するフレームと平行になるように置きます。注入ポンプを0.5 μL/minの速度に設定して、4 μLの6-OHDAの総塗布が8分間持続するようにします。漏れがなく、以前に設定された時間と量に従って注入が行われることを確認して、輸液システムをテストします。
- マイクロチューブに取り付けられた輸液針を定位アームの端にある装置に取り付け、針が表面に対して180°の角度で配置されていることを確認します。針がまっすぐで、曲がっていないことを確認します。
注:輸液システム内の項目のいずれかが正しく機能しない場合、手術の成功を危険にさらす可能性があるため、記載されているすべての手順を慎重に確認してください。
- 縫合
- 手術後の切開部を縫合するために、3/8円針を有する滅菌ナイロン非吸収性縫合糸を使用する。
- 術後回復部位
- 清潔で滅菌されたハウジングボックスを配置し、完全に回復するまで動物を監視できます(タッチや操作に反応します)。体温調節のために箱にサーマルブランケットを入れてください。
注:体温調節は重要であるため、必要に応じて体温を維持するために追加の熱源を含めてください。
- 清潔で滅菌されたハウジングボックスを配置し、完全に回復するまで動物を監視できます(タッチや操作に反応します)。体温調節のために箱にサーマルブランケットを入れてください。
3. 外科的処置
注:このプロトコルでは、成体雄のSprague-Dawleyラット(200-250 g)を、温度(22±2°C)、空気交換(15-20交換/時間)、および明暗サイクル(12時間/ 12時間)の制御された条件下で飼育し、3匹または4匹の動物を入れた箱にグループ化し、食物と水に自由にアクセスできる。
- 手術後の数日間の体重変化を監視するために動物の体重を量る。投与する薬物の用量を計算する。
- イミプラミンを手術の30分前(麻酔を投与する前〜10〜15分)に、27G針および1mLシリンジを用いて腹腔内に投与する。
注:イミプラミンはノルアドレナリントランスポーター(NAT)をブロックし、ノルアドレナリン作動性ニューロンによる6-OHDAの取り込みを防ぎ、病変をドーパミン作動性ニューロンに対してより選択的にします40。 - イミプラミンの投与の10〜15分後、27G針および1mLシリンジを用いて腹腔内ケタミン/キシラジン麻酔を投与する。動物が完全に麻酔されるまで待ちます。動物が後ろ足の挟み込みに反応しず、まばたき反射を示さない場合、動物が深い麻酔下にあることを確認します。
- 切開が起こる頭の領域でラットの毛皮を剃る。
- ラットを定位装置内に配置します。
- 切歯バーの上に頭を置き、バーを耳間線の3.3mm下に固定します。
- イヤーバーを片側ずつ配置します。頭蓋骨の上部がまっすぐで表面に平行になるように切歯バーとイヤーバーを置きます。
- ノーズクランプを調整し、ヘッドがしっかりしていて、どちらの側にも動かないことをテストします。
- 角膜が乾燥するのを防ぐために、ラットの目に滅菌眼科軟膏を塗布する。
- 部位を消毒するために切開する領域にポビドンヨードを塗布する。
- 切開領域の鎮痛のために局所リドカインを適用する。7 mg / kgを超えないでください。
- メロキシカムを皮下投与するには、27G針および1mLシリンジを用いて投与する。
注:メロキシカムは、動物が手術後に回復するのを助ける非ステロイド性抗炎症鎮痛薬です。 - ポリ抗生物質懸濁液を23G針および1mLシリンジを用いて筋肉内に投与する。
注:ポリ抗生物質懸濁液は、術後の回復における細菌感染の可能性を回避するための予防的処置として投与される。 - ピンセットで後足をつまんでまばたき反射や後肢反射をチェックして、動物が深い麻酔状態にあることを確認してください。
- メスで、マイクロインジェクションが起こる領域に〜1.5cmの切開を行います。
注:滅菌技術は、この時点から創傷閉鎖まで適用される。 - ブレグマとラムダが見えるまで、綿棒と綿棒で頭蓋骨領域をきれいにします。ブレグマとラムダに滅菌された細いペンで印を付けます。
- ブレグマとラムダの背腹側(DV)座標が類似していることを確認します。それらが異なる場合は、ラットの頭が正しく配置されていないため、定位装置でラットを再調整します。
- ブレグマの前後(AP)座標と中側座標(ML)を書き留めます。
- 41: AP: -4.3 mm、ML: 1.6 mm に従って、ブレグマから右 MFB の AP 座標と ML 座標に移動します。
- トレパネーションの領域を滅菌した細いペンでマークします。
- 滅菌ドリルで、硬膜を傷つけないように注意しながら、動物の頭蓋骨をゆっくりと突き刺します。
- マイクロインジェクション針を硬膜の上に置き、DV座標を書き留めます。細い針を取り、硬膜を優しく破裂させます。マイクロインジェクションが行われるMFBのDV座標(腹側8.3mm)に針を挿入します。
- マイクロインジェクションポンプを操作して、6-OHDA溶液をMFBに放出します。マイクロインジェクションが終了したら、ハミルトンシリンジをチェックして、4μLの6-OHDAが注入されたかどうかを確認します。
注:マイクロインジェクションは8分間続くはずです。 - 6-OHDAの投与後、薬物の逆流を避けるために針を抜く前に10分間待つ。マイクロインジェクション針を動物の脳からゆっくりと外します。
- 切開領域をポビドンヨードで再度消毒する。
- 切開部を〜3〜4個の外科用結び目で縫合する。
メモ: 結び目は強すぎたり緩すぎたりしないでください。 - ラットを定位装置から取り出し、動物が麻酔から完全に回復するまで、サーマルブランケット上の回復のためにクリーンボックスに入れます。動物が麻酔から完全に目覚めるまで、15分ごとに動物を観察してください。
4. 術後の処置
- 手術後4日間、動物の体重を監視します。メロキシカムで1日1回、術後2日間皮下治療し、毎日の体重の用量を調整します。
注:すべての動物は、手術後3日目に鎮痛薬の必要性について評価されるべきです。 - 切開部を毎日少なくとも4日間チェックして、感染していないことを確認してください。切開部が治癒するまで、熱、腫れ、痛み、排出、および発赤を探してください。
- 動物の体重を監視することによって食欲と水の消費量を確認してください。動物に食べるように促すために湿った飼料を与えます。手術後少なくとも4日間、全身の状態、姿勢、可動性を毎日観察してください。手術後7〜10日で縫合糸を除去してください。
注:動物は、倫理的手順で定義されたエンドポイントに達した場合、安楽死させる必要があります。
5. ステッピングテスト
- 訓練
注:動物は試験の3日前に訓練されるべきです。以下に説明するプロトコルによると、トレーニングは1日2回、午前1回と午後1回、またはセッション間に少なくとも2時間の間隔で行う必要があります。タイマーを使用して時刻を追跡します。- 1日目
- 最初のセッションでは、ラットがハンドラー/実験者に慣れ親しむことができるように、ラットを手袋で約1〜2分間保持してラットを扱います。
- 2番目のセッションでは、ラットを20秒間保持することと、プロトコルテーブルに20秒間置くこととを交互に行う。このトレーニングステップを3分間繰り返して、ラットにステッピングテストの実験セットアップに慣れさせます。
- 2日目
- 最初のセッションでは、片手で後足と背中を持って、ラットの両方の前足をプロトコルテーブルに置きます。ラットをプロトコルテーブルの平らな面に45°の角度で頭から下方に傾けます。テーブル上で端から端まで水平に移動し、ラットが両足でテーブルを踏むことができるようにします(4秒で90cmをカバーします)。ラットを手袋で10秒間保持し、休ませます。このパターンを3分間繰り返します。
- 2番目のセッションでは、もう片方の前足を片手で後ろに持ち、もう片方の手でラットの背中と後ろ足を持って、ラットの前足をプロトコルテーブルに置きます(ステップ5.1.2.1を参照)。テーブル上で端から端まで4秒で水平に移動し、ラットが自由な足で歩けるようにします。ラットを手袋で10秒間保持し、休ませ、別の前足で繰り返し、その後に休息期間を続けます。このパターンを繰り返し、2つの前足を交互に繰り返し、3分間休ませます。
- トレーニング手順を3回、それぞれ1分間繰り返します。
- 3日目
- 最初のセッションでは、片方の前足についてステップ 5.1.2.2 で説明されている手順に従います。別の前足で繰り返し、その後に休息期間を続けます。このパターンを繰り返し、2つの前足を交互に繰り返し、3分間休ませます。
- 2 番目のセッションでは、ステップ 5.1.2.2 で説明されている手順に従います。
- 1日目
- 試験
注:ステッピングテストは、手術前、定位手術の2週間後および4週間後に行われ、対側前肢の無呼吸および6-OHDAによって引き起こされる可能性のある傷害を評価する。- ラットを表面に対して45°の角度で保持し、後肢を固定し、上記のように、トレーニングの3日目に前肢の1つだけをプラットフォーム上に休ませます。
- ラットを4秒で90cmの距離にわたって前方にドラッグし、右足または左足を表面に置きます。
- メモを取り、各足で各方向に取られたフォアハンド調整ステップの数を定量化します。
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Representative Results
ドーパミン作動性病変評価
ステッピング試験により、病変に対する対側前肢の無動症の評価と、6-OHDA注入によって誘導される黒質線条体経路の病変の可能性のある動物の選択が可能になります(図1)。術前と術後2週間および4週間の対側前肢ステッピングテストの性能の比較により、時間(術前、術後2、および4 週間)と治療(偽手術および6-OHDA病変)との間の相互作用(F2,74 = 93.63;p<0.0001;双方向反復測定ANOVA)が明らかになった。ボンフェローニの事後検定では、手術 後 2週目および4週目の偽手術動物と比較して、右MFBで6-OHDAを投与された動物の病変に対抗するステップ数が有意に減少した(p<0.0001)(図1)。結果は以前の研究の結果と一致した35。
ドーパミン作動性病変が完了していない場合、ステッピング試験の結果は、この研究で提示された結果の成功の程度に達しないことに注意することが重要です。以前に発表された研究は、この研究で使用されたのと同じプロトコールに従って、6-OHDAのマイクロインジェクションの手術を行った後、部分的なドーパミン作動性病変を有する動物を用いてチロシンヒドロキシラーゼ(TH)のステッピング試験および免疫組織化学を実施した。ステッピング試験(4〜8ステップ)における部分的な欠損のそれらの発見は、ニューロンの〜60%の部分ドーパミン作動性病変の結果である39。
図1:右MFBへの6-OHDAまたはビヒクルの片側注入のための手術前および術後の対側ステッピング試験の評価。 データは、6-OHDAを投与された動物が、術後2週目および4週目に病変に対して前前肢対側を有するステップ数において有意に減少したことを示している(****p<0.0001対偽術後;双方向反復測定ANOVA、ボンフェローニ ポストホック)。データは平均±平均の標準誤差で表した。ビヒクルは、0.1%アスコルビン酸を含む0.9%生理食塩水である。結果は、偽群の14匹および6-OHDA群の25匹に基づいている。略語:P =手術前。2 = 手術後2週間。4 = 手術後4週間;6-OHDA=6-ヒドロキシドーパミン;MFB = 内側前脳バンドル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
手術前および手術後2週間および4週間の同側前肢ステッピングテストの性能の比較は、時間(手術前、手術後2週間、および4週間)と治療(偽手術および6-OHDA病変)との間の相互作用(F2,74 = 0.4492;p = 0.6399;双方向反復測定ANOVA)を明らかにしなかった。ボンフェローニの 事後 検定では、偽動物と比較して、右MFBで6-OHDAを投与された動物における病変に対する同側側のステップ数に有意差は示されなかった(図2)。
図2:右MFBへの6-OHDAまたはビヒクルの片側注入のための手術前および手術後の同側ステッピングテストの評価。 データは、6-OHDAを投与された動物が、術後2週目および4週目に病変に対する前前肢同側側のステップ数を有意に減少させなかったことを示している(p>0.05対偽術後;双方向反復測定ANOVA、ボンフェローニ ポストホック)。データは平均±平均の標準誤差で表した。ビヒクルは、0.1%アスコルビン酸を含む0.9%生理食塩水である。結果は、偽群の14匹および6-OHDA群の25匹に基づいている。略語:P =手術前。2 = 手術後2週間。4 = 手術後4週間;6-OHDA=6-ヒドロキシドーパミン;MFB = 内側前脳バンドル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
6-OHDA病変動物に関する以前の研究と一致して42、両半球の線条体のTHを比較する組織学的分析(図3)は、線条体におけるDA欠損の信頼できる評価を可能にする。したがって、この行動プロトコルは、PDの実験モデルを含む研究において免疫組織化学的方法と組み合わせて使用することができる。
図3:PDの6-OHDA実験モデルにおけるTH標識の代表的な画像は、前線条体および黒質コンパクトを含む。 パノラマ画像は病変の拡張を示し、そして差し込みズームは免疫染色された細胞体の神経支配eを描写する。(a)右半球における6-OHDAにより誘発される部分的な損傷を示す線条体冠状動脈切片の画像。(b)同じ動物由来の黒質黒質と腹側被蓋領域冠状部の画像も病変伸展を示す。(c)右半球における6-OHDAによる完全な誘導傷害を示す線条体冠状動脈切片の画像。(d)同じ動物由来の黒質と腹側被蓋領域冠状部の画像も病変伸展を示す。スケールバー = パノラマビューで 1.3 mm、差し込みズームで 65 μm。略語:6-OHDA=6-ヒドロキシドーパミン;TH=チロシンヒドロキシラーゼ;PD = パーキンソン病;NL = 非病変;L = 病変。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この論文は、MFB中の6-OHDAの片側微量注入のための手術を行うためのプロトコルを記載しており、黒質線条体経路のニューロンに堅牢な病変を引き起こし、動物に無動症を発生させることができる。また、ステッピング試験を実行するためのプロトコルは、病変の成功を証明し、前肢の無呼吸を評価するために使用することができる、容易に適用可能で非侵襲的な試験である。代表的な結果に提示されるように、6-OHDAを投与された動物は、傷害に対して対極的な調整ステップ数の減少を示し、これは、6-OHDA損傷動物が輸液手術後2週間から強い無動症を示すことを意味する。無動症 - この疾患のいくつかの治療法の焦点 - は、PDの主な運動症状の1つです。動物モデルにおける無動症の発症は、PDの前臨床試験にとって重要である。さらに、これらの結果は、Chang et al.37によって報告されたものと似ており、より少ないステップ数を提示する動物は、免疫組織化学によるドーパミン作動性ニューロン死の割合が高いことを確認した。したがって、より少ない数の対側調整ステップを提示した動物は、ドーパミン作動性傷害を有する可能性がより高い。
手術の成功と病変の評価は、アンフェタミン/アポモルヒネ誘発回転43、上昇体スイング試験(EBST)、回廊試験、シリンダー試験、TH免疫組織化学などの組織標識技術、またはHPLC42による線条体中のドーパミンの定量などの他の行動試験によっても確認することができます。他の方法論は、6-OHDAの注射用量および行動評価のための術後の時間間隔において異なる。最近のレビュー43 は、この方法論を使用した最新の記事と、それらの間の用量、行動テスト、および術後の間隔の違いを要約しています。6-OHDAによって誘導されるPDのモデルは、レビー小体の蓄積など、この疾患に関連するすべての病理学的プロセスを模倣するわけではないが、線条体 - 黒質経路のドーパミン作動性ニューロンの死をシミュレートする。これにより、この疾患の症状に対する新しい治療法の研究が可能になり、この疾患に罹患した患者の生活の質の向上につながる可能性があります。
最も広く使用されているモデルであるにもかかわらず、6-OHDAモデルには、現在のすべてのPDモデルと同様に限界があります。このモデルは、アルファ - シヌクレインタンパク質の蓄積やレビー小体の形成など、疾患の病理に関与する分子メカニズムを完全には表現していないという欠点を有する。このモデルは、疾患の後期段階に対応し、運動症状のみの発症につながる黒質線条体経路のドーパミン作動性ニューロンの死をシミュレートする。これは、その自然な発達を研究するのに不向きになります15,32。この記事で説明する6-OHDAモデルは、通常、死亡率が低いという特徴があります。術後の回復は、侵襲的処置と神経変性病変の結合による高い死亡率を防ぐために極めて重要である44。術後の回復期には、栄養補給、水分補給、外部温度制御など、特別な注意を払えば死亡率を減らすことができます45。このような措置の組み合わせは、死亡率を大幅に低下させるか、さらには排除することが示されています30,46。一般的な死因は、脳内の間違った座標に針を挿入することです。この繊細な外科的処置の間に座標を慎重にチェックすることが重要です。これにより、針による他の脳構造(視床下部など)の損傷を回避し、動物の飲食行動を損なう可能性があり、栄養失調や脱水につながります47。
最後に、ケタミン-キシラジン麻酔プロトコルは十分に確立されており、げっ歯類の実験で使用されていますが48、これらの麻酔薬の組み合わせは長期間の手術には不十分である可能性があることを示唆するいくつかの証拠があることを強調することが不可欠です。さらに、ケタミン-キシラジン感受性は、マウスおよびラットの異なる系統に応じて異なる可能性がある49,50。代替手段は、イソフルラン吸入によって麻酔を誘導することであり得る。ある研究では、イソフルラン誘発麻酔による右反射の喪失がケタミン-キシラジンよりも速いことが実証された。さらに、ケタミン - キシラジンで麻酔をかけられたラットの60%は、用量補給があっても、外科的処置中に連続したつま先ピンチ反射を示した。対照的に、イソフルランで麻酔をかけられた動物は、体積調整後に消失した尾挟み反射の孤立した症例を示した51。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、サンパウロ研究財団(FAPESP、助成金2017/00003-0)の支援を受けました。我々は、高等教育職員の改善のための調整(CAPES)に感謝する。アンソニー・R・ウェスト博士、ハインツ・シュタイナー博士、クエイ・Y・ツェン博士の支援とメンタリングに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-OHDA | Sigma Aldrich | H4381 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt®ion=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel _6-ohda-_-srpRecs3-1 |
| 70% Alcohol | |||
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | 795437 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt®ion=BR&gclid= Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 _kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 6yicaAot6EALw_wcB |
| Cotton | |||
| Drill or tap | |||
| Gauze | |||
| Hamilton syringe 50 uL | Hamilton | 80539 | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539 |
| Imipramine | Alfa Aeser | J63723 | https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/ |
| Infusion pump | Insight | EFF-311 | https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/ |
| Ketamine (Dopalen) | Ceva | https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN | |
| Machine for trichotomy | |||
| Meloxicam (Maxicam 2% Ourofino) | Ourofino | https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/ | |
| Metal Disposal | |||
| Paper towels | |||
| Pentabiotic | Zoetis | https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx | |
| Plastic waste garbage can | |||
| Poly-antibiotic | Pentabiotic (Wealth) | ||
| Povidone-iodine | |||
| Scalpel and blades | |||
| Scissors | |||
| Scraper | |||
| Stereotaxic apparatus | Insight | EFF-331 | https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/ |
| Sterile saline solution | |||
| Swabs | |||
| Temperature probe | |||
| Timer | |||
| Tweezers | |||
| Xylazine (Anasedan) | Ceva | https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN |
References
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