Summary
Dit protocol schetst de stappen voor het induceren van Primed Myco bacteriële Uveïtis (PMU) bij muizen. Deze methode schetst de stappen om betrouwbare en robuuste oogontsteking in het muismodelsysteem te helpen produceren. Met behulp van dit protocol genereerden we uveitische ogen en niet-ontstoken medeogen van afzonderlijke dieren voor verdere evaluatie met immunologische, transcriptomische en proteomische assays.
Abstract
De term 'uveïtis' beschrijft een heterogene reeks aandoeningen die allemaal intraoculaire ontsteking kenmerken. In grote lijnen wordt uveïtis gedefinieerd door etiologie: infectie of auto-immuniteit. Infectieuze uveïtis vereist behandeling met de juiste antimicrobiële middelen, terwijl auto-immune uveïtis behandeling met corticosteroïden of andere immunosuppressiva vereist. Post-infectieuze uveïtis is een vorm van chronische uveïtis die corticosteroïden vereist om immuunse gevolgen na de eerste infectie onder controle te houden. Uveïtis geassocieerd met Mycobacterium tuberculosis (Mtb) -infectie is een goed erkende vorm van post-infectieuze uveïtis, maar de mechanismen van ziekte zijn niet volledig begrepen. Om de rol te begrijpen die mycobacteriële antigenen en aangeboren liganden spelen bij het stimuleren van chronische oogontsteking na mTB-infectie, werd het model Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) ontwikkeld voor gebruik bij muizen. Dit manuscript schetst de methoden voor het genereren van PMU en het monitoren van het klinische verloop van ontsteking met behulp van kleurenfundus en optische coherentietomografie (OCT) beeldvorming. PMU wordt geïnduceerd door immunisatie met hitte-gedood mycobacteriële extract gevolgd door intravitreale injectie van hetzelfde extract in één oog zeven dagen later. Oculaire ontsteking wordt longitudinaal gemonitord met behulp van in vivo beeldvorming en gevolgd door monsterverzameling voor een breed scala aan testen, waaronder histologie, flowcytometrie, cytokine-analyse, qPCR of mRNA-sequencing. Het muismodel van PMU is een nuttig nieuw hulpmiddel voor het bestuderen van de oculaire reacties op mTB, het mechanisme van chronische uveïtis, en voor preklinische effectiviteitstests van nieuwe ontstekingsremmende therapieën.
Introduction
De term 'uveïtis' beschrijft een heterogene reeks aandoeningen die allemaal intraoculaire ontsteking kenmerken1. Diermodellen van uveïtis zijn belangrijk voor het begrijpen van ziektemechanismen en voor het preklinisch testen van nieuwe therapieën. Er zijn een aantal diermodellen van uveïtis vastgesteld2. De twee die het meest uitgebreid zijn bestudeerd, zijn experimentele auto-immune uveïtis (of uveoretinitis; EAU) en endotoxine-geïnduceerde uveïtis (EIU). EAU wordt meestal gegenereerd door immunisatie met oculaire antigenen of kan spontaan optreden wanneer de centrale tolerantie wordt verstoord in afwezigheid van het AIRE-gen 3,4. Andere varianten van het model zijn sindsdienontwikkeld 5,6,7 om verschillende uveitogene peptiden op te nemen; deze zijn uitgebreid beoordeeld 8,9,10. EAU is het primaire model voor vormen van T-celafhankelijke auto-immune uveïtis zoals de ziekte van Vogt-Koyanagi-Harada en birdshot chorioretinitis bij de mens. EIU wordt gegenereerd door systemische of lokale injectie van bacteriële lipopolysaccharide (LPS)10,11. EIU is gebruikt als een model van acute uveïtis gegenereerd door activering van aangeboren immuunsignaleringsroutes12. Beide modellen zijn instrumenteel geweest voor het huidige begrip van oculaire immunologie, maar geen van beide zijn effectieve modellen voor post-infectieuze chronische uveïtis. Onlangs vastgesteld bij muizen, biedt het Primed Myco bacteriële Uveitis (PMU) -model nu een benadering om klinische en cellulaire aspecten van deze vorm van uveïtis te ondervragen en te evalueren13.
Er is wereldwijd een hoge prevalentie van mycobacteriële infecties, met meer dan 10 miljoen nieuwe gevallen en meer dan 1,4 miljoen sterfgevallen gemeld door de Wereldgezondheidsorganisatie in 201914. Extrapulmonale manifestatie van actieve tuberculose (TB) infectie omvat uveïtis en is een goed erkende oorzaak van infectieuze uveïtis15,16. De manifestaties van tbc-geassocieerde uveïtis zijn proteaan, wat waarschijnlijk meerdere verschillende ziektemechanismen weerspiegelt, waaronder directe oculaire infectie en minder goed begrepen immuungemedieerde ontsteking 17,18,19. De voorgestelde mechanismen voor deze post-infectieuze sequelae omvatten een chronische ontstekingsreactie gestimuleerd door de persistentie van een pauci-bacillaire infectie in het retinale pigmentepitheel (RPE), een chronische ontstekingsreactie gestimuleerd door de aanwezigheid van residuele pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) van een succesvol geklaarde oculaire infectie, en ongepaste activering van de adaptieve immuunrespons tegen oculaire antigenen door een proces van moleculaire mimicry of antigeen verspreiding veroorzaakt door systemische tbc-infectie 20,21,22,23.
Om een beter mechanistisch begrip te krijgen van chronische post-infectieuze uveïtis en de rol van mycobacteriële antigenen bij het initiëren van de ziekte te bestuderen, werd het PMU-model ontwikkeld voor gebruik bij muizen13,24. Dienovereenkomstig, om ontstekingen op te wekken, krijgt de muis eerst een subcutane injectie van antigeen van de hitte-gedode Mycobacterium tuberculosis H37Ra-stam om systemische infectie na te bootsen, zeven dagen later door intravitreale injectie van hetzelfde antigeen toegediend aan het linker- of rechteroog om lokale oculaire infectie na te bootsen. De intensiteit en duur van de daaropvolgende uveïtis worden gemonitord door longitudinale in vivo Optical Coherence Tomography (OCT) en fundale beeldvorming van het oog25. PMU wordt gekenmerkt door een acute, myeloïde-dominante panuveitis die zich ontwikkelt tot een chronische T-cel-dominante posterieure uveïtis met vitritis, perivasculaire retinale ontsteking en focale gebieden van buitenste retinale schade26. De aanwezigheid van granulomateuze ontsteking in het achterste segment van het oog suggereert dat het PMU-model kan worden gebruikt om sommige vormen van anterieure (granulomateuze en niet-granulomateuze) en intermediaire uveïtis te bestuderen, gezien bij patiënten met immunologisch bewijs van mtb-infectie in het verleden27. Bovendien is gesuggereerd dat de componenten van hitte-gedode Mtb die in het PMU-model worden gebruikt, immuunresponsen veroorzaken die ten grondslag liggen aan de aspecten van terugkerende uveïtis bij patiënten met oculaire tuberculose die reageren op anti-tuberculaire therapie (ATT)28. Vanwege de verschillen in ziekte-initiatie en ontstekingsverloop in vergelijking met EAU en EIU, vertegenwoordigt PMU een nieuw diermodel van uveïtis dat niet afhankelijk is van immunisatie met oculaire antigenen en kan helpen bij het ophelderen van ziektemechanismen bij patiënten met chronische uveïtis. Dit protocol schetst de methoden voor het genereren van PMU, het monitoren van het klinische verloop van ontsteking en het verzamelen van oculaire monsters voor postmortemanalyse met flowcytometrie.
Protocol
Alle uitgevoerde procedures werden lokaal goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Washington (animal study protocol # 4481-02) of in overeenstemming met de United Kingdom Home Office-licentie (PPL 30/3281) en de University of Bristol Ethical Review Group. Experimenten uitgevoerd bij beide instellingen waren in overeenstemming met de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visueel onderzoek. PMU werd gegenereerd in 6-10 weken oude C57BL / 6J-muizen; alle muizen wogen ten minste 18 g op het moment van inductie van uveïtis en werden negatief bevonden voor de rd8-mutatie van het Crb1-gen29. Muizen werden onderhouden met standaard chow en gemedicineerd water (paracetamol 200-300 mg / kg / dag) ad libitum onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden. Dierlijke euthanasie werd uitgevoerd met behulp van een standaard kooldioxide-inhalatiemethode30.
1. Antigeenpreparaat voor subcutane injectie
- Voer alle procedures in deze sectie uit in een chemische zuurkast om inademing of huidcontact met het Mtb H37Ra-poeder te voorkomen. Handel volgens uw institutionele beleid voor Complete Freund's Adjuvant (meestal BSL-1). Dit omvat het gebruik van chemicaliënbestendige handschoenen, een veiligheidsbril en beschermende werkkleding (laboratoriumjas).
- Gebruik een goede steriele techniek om besmetting van reagentia die in proefdieren worden ingebracht te voorkomen.
- Maak de Mtb-suspensie in PBS door 5 mg gelyofiliseerd, hittedode M. tuberculosis H37Ra-poeder te mengen met 2,5 ml koude PBS in een microcentrifugebuis van 5 ml. Vortex eenmaal voor 30 s en dan op ijs plaatsen.
- Om een fijne suspensie van de H37Ra in PBS te genereren, soniceert u de suspensie gedurende 5 minuten op ijs.
- Ontlamp de behuizing van de convertereenheid en reinig de sonde met een alcoholdoekje van 70% (v/v).
- Schakel de sonicator in, stel de stroominstelling in op 4 door aan de aan/uit-knop te draaien en dompel de punt van de sonde onder in het PBS-bevattende mycobacteriële poeder. Zorg ervoor dat de sondepunt wordt ondergedompeld tot ten minste de helft van de diepte van het monster en dat de sondepunt de wand van de microcentrifugebuis niet raakt.
- Soniceer het mengsel op ijs gedurende 30 s, pauzeer 30 s en herhaal gedurende een totaal van 5 minuten om het poeder volledig in een gelijkmatige suspensie te verspreiden zonder de vloeistof te verwarmen.
- Voeg 2,5 ml Freund's Incomplete Adjuvans toe aan het mengsel en herhaal het ultrasoonapparaatproces op ijs totdat de emulsie een tandpasta-achtige consistentie vormt.
- Stel de stroom in op 0 met behulp van de bedieningsknop en schakel het apparaat uit om het ultrasoonapparaat te beëindigen. Verwijder de punt van de suspensie en veeg de sonde af met een alcoholdoekje.
- Bewaar de antigeenemulsie bij 4 °C. Het maken van batches van de emulsie zal helpen zorgen voor consistentie tussen experimenten. De emulsie kan maximaal 3 maanden bij 4 °C worden bewaard.
2. Subcutane injectie
- Voer subcutane injectie uit een week voorafgaand aan de intravitreale injectie (aangeduid als dag -7).
- Laad een spuit van 1 ml (geen naald bevestigd) met de mycobacteriële emulsie. Vanwege de viscositeit en ondoorzichtigheid van de emulsie kunnen moeilijk te zien luchtbellen de spuit vullen.
- Om luchtbubbels in de spuit te voorkomen, keert u na het laden van 0,2-0,3 ml emulsie de spuit om (punt naar boven gericht) en tikt u de spuit voorzichtig herhaaldelijk op de rand van een aanrecht om de bubbels naar de oppervlakte te brengen.
- Verwijder de lucht uit de spuit en ga door met het vullen van de spuit. Keer om en tik af en toe totdat het gevuld is.
- Plaats een naald van 25 G op de spuit en plaats de emulsie om de naald te vullen. Bewaar de spuit op ijs tot gebruik.
- Om de subcutane injectie veilig uit te voeren, verdooft u de muis of gebruikt u humane beveiligingsmethoden die gemakkelijke toegang tot de achterhand van het dier mogelijk maken31.
- Om te verdoven voor subcutane injectie, plaatst u het dier in een isofluraan inductiekamer (3% -4% voor inductie en 1% -3% voor onderhoud). Eenmaal verdoofd, zorg ervoor dat de muis een langzame ademhalingsfrequentie heeft en geen tekenen van ademnood vertoont.
- Plaats de subcutane injecties op het dorsale oppervlak van de heupen of op het ventrale oppervlak van de benen proximaal aan het gebied van de inguinale lymfeklieren.
- Steek de naald voorzichtig in om te voorkomen dat deze in de spier wordt geïnjecteerd. Injecteer 0,05 ml van de Mtb-emulsie in de onderhuidse ruimte. Verwijder de naald niet onmiddellijk om de dikke emulsie volledig te kunnen injecteren.
- Herhaal de injectie aan zowel de linker- als rechterkant gedurende een totaal van 0,1 ml per dier.
- Indien verdoofd, plaats de muis op een warm verwarmingskussen tot volledig herstel. Laat de muis niet onbeheerd achter totdat deze weer voldoende bij bewustzijn is gekomen om de sternale lighouding te behouden.
- Breng de muis na volledig herstel terug naar zijn kooi en label de kooikaart met de datum van subcutane injectie.
- Zorg voor analgesie met orale paracetamol (200 mg / kg / dag), maar niet NSAID's als ontstekingsremmende middelen kunnen de inductie van uveïtis beïnvloeden.
3. Antigeen voorraadvoorbereiding voor intravitreale injectie
- Voer alle procedures in deze sectie uit onder geschikte steriele omstandigheden om besmetting van de intravitreale Mtb-suspensie te voorkomen.
- Maak de intravitreale suspensies.
- Voor inductie van milde tot matige panuveitis, maak de intravitreale suspensie in een concentratie van 5 mg / ml door 5 mg van het mycobacteriën-extract toe te voegen aan 1 ml 1x PBS.
- Voor inductie van matige tot ernstige panuveitis, maak de intravitreale suspensie in een concentratie van 10 mg / ml door 10 mg van het mycobacteriën-extract toe te voegen aan 1 ml 1x PBS.
- Vortex eenmaal voor 30 s en dan op ijs plaatsen.
- Om een fijne suspensie van de H37Ra in PBS te genereren, soniceert u de suspensie gedurende 10 minuten op ijs zoals beschreven in stap 1.4. Voer deze stamoplossing uit in volumes van 100 μL en bewaar bij -20 °C.
- Ontdooi voor gebruik bij kamertemperatuur en vortex op hoog gedurende 1 min. Bewaar de aliquots op ijs tijdens het transport naar de dierenfaciliteit.
4. Intravitreale injectieprocedure op dag 0
- Dierlijke bereiding
- Draag aangemeten onderzoekshandschoenen, plaats de muis op een weegbalans om zijn gewicht in grammen te verkrijgen.
- Geef een intraperitoneale injectie van 0,02 ml/g lichaamsgewicht van een oplossing die 100 mg/ml ketamine en 20 mg/ml xylazine bevat, gemengd met steriel water om het dier te verdoven. Een alternatieve benadering omvat inductie met ~1,5% isofluraan (geïnhaleerd).
- Wacht ongeveer 2 minuten tot de muis in slaap is gevallen en plaats de muis vervolgens in een opwarmdoos en bedek het deksel. Voer pijnreflextests uit zoals oor-, teen- en staartknijpen om de diepte van de anesthesie voor de procedurete beoordelen 32.
- Eenmaal in slaap, verdoof het hoornvlies met 1 druppel van 0,5% (v / v) tetracaïne. Vermijd het krijgen van tetracaïne in de buurt van de neus of mond van de muis. Dep na 10 s de overtollige vloeistof eraf.
OPMERKING: Er is waargenomen dat irisverwijding en anterieure kamer (AC) visualisatie worden verbeterd wanneer topische anesthesie wordt toegediend, mogelijk als gevolg van verbeterde corneareflexonderdrukking met de gecombineerde systemische en actuele anesthesie. Deze stap kan echter desgewenst worden weggelaten. - Verwijd de pupil met 1 druppel van 2,5% (v/v) fenylefrine. Wees voorzichtig om overtollige druppels te vermijden die de neus of mond kunnen binnendringen. Dep na 2-3 minuten de overtollige vloeistof eraf.
- Om het risico op endoftalmitis te verminderen, voegt u 1 druppel van 5% betadine toe aan het oogoppervlak en het omliggende haar. Laat 2-3 min op het oog staan.
OPMERKING: Voer alle procedures in deze sectie uit onder geschikte steriele omstandigheden om endoftalmitis te voorkomen. - Verwijder betadine en bedek het oog met hypromellose (0,3%) of carbomeer ooggel 0,2% w /w) om uitdroging onder anesthesie te voorkomen. Dit zal ook helpen bij het voorkomen van cataractvorming.
- Het micro-injectiesysteem instellen
- Voer de intravitreale injectie uit met behulp van een micropomp die is aangesloten op een microsyringepompregelaar en een injectiespuit (figuur 1A-C). U kunt ook injecteren met een naald van 33 G die is bevestigd aan een Hamilton-spuit zoals beschreven in subsectie 4.4.
- Sluit een naald van 34 G aan op de injectiehouder om de injector te monteren. Maak de zilveren schroefdop aan de voorkant van de injectiehouder los en schuif de naald ongeveer halverwege in het lichaam van de houder. Draai de zilveren schroefdop vingervast vast.
- Sluit de slang aan op de injectiehouder zoals vermeld in stap 4.2.4-4.2.5.
- Om de slang op de injectiehouder te plaatsen, maakt u de plastic schroef aan de achterkant van de houder los, schuift u de slang door de pakking naar binnen en draait u de schroef vast.
- Houd een kleine opening aan met het uiteinde van de slang om schade aan de slang tijdens de injectie te voorkomen. Zie figuur 1C.
- Ontdooi een aliquot van 100 μL van de mycobacterium stock suspensie.
- Voeg 3 μL van een 1% fluoresceïne natrium (AK-Fluor) oplossing en vortex goed toe.
- Laad een spuit van 10 μL met het antigeen- en fluoresceïnemengsel zonder luchtbellen op te nemen.
- Verwijder de laadnaald uit de spuit en schuif de slang door de pakking van de zilveren schroefdop totdat de punt de nulmarkering in het spuitlichaam bereikt.
- Zodra de punt van de buis correct is uitgelijnd op de gewenste positie, draait u de schroefdop vingervast vast.
- Spoel de oplossing in de spuit door de injectieslang om het systeem volledig te laden. Herhaal vervolgens stap 4.2.8-4.2.11 om de spuit opnieuw te laden voor injectie.
- Om de geladen spuit op de micropomp te installeren, drukt u op de klemontgrendelingsknop aan het einde van de micropomp om de spuitklemmen te openen.
- Plaats de dop van de zuiger in de zuigerdophouder aan de achterkant van de micropomp.
- Schuif vervolgens de kraag van de spuit op de kraagstop en het spuitlichaam in de spuitklem.
- Laat de klemknop los en draai de zuigerbevestigingsschroef vast. Zie figuur 1D.
- Schuif de injectiehouder en de naald door de o-klem op het stereotactische injectieapparaat. Dit is een aangepast platform; als alternatief kan de spuit handmatig worden vastgehouden en geplaatst.
- Stel het infusievolume en de snelheid van het infusievolume op de microsyringepompregelaar in om respectievelijk 500 nL per cyclus te injecteren met een snelheid van 40 nL/s.
OPMERKING: Snellere injectiesnelheden kunnen worden gebruikt, maar er kan meer reflux worden ervaren voordat naaldherpositionering kan worden bereikt. - Test het systeem om ervoor te zorgen dat het correct functioneert voordat u een intravitreale injectie uitvoert.
OPMERKING: Wanneer het injectiesysteem correct functioneert, zal activering van een injectiecyclus met behulp van het voetpedaal of het bedieningskussen zichtbare beweging van de zuigerdophouder produceren en een klein druppeltje groenachtige vloeistof zal worden gezien aan de punt van de naald. In het geval dat er geen vloeistof wordt geproduceerd, activeert u extra cycli of spoelt en herlaadt u de spuit. - Voordat u het oog injecteert, veegt u de naald voorzichtig af met een 95% ethanolpad.
- Intravitreale injectieprocedure
- De muis wordt op een stereotaxisch apparaat geplaatst om de injectieprocedure uit te voeren.
- Houd het podium/platform waarop de muis rust warm door 2-3 papieren handdoekjes op het oppervlak te bevestigen.
- Plaats de muis in een buikligging op het platform. Gebruik de rechter- en linkeroorbalken om het hoofd van het dier voorzichtig te fixeren. Zie figuur 1E.
- Plaats de muis en oriënteer onder de scoop zodat het superieure nasale aspect van het rechteroog zichtbaar is.
- Gebruik een naald van 30 G om de wimpers te verplaatsen en de sclera bloot te leggen. Visualiseer de limbus en het radiale bloedvat.
- Gebruik een steriele naald van 30 G om een geleidingsgat in de sclera te maken 1-2 mm achter de limbus.
- Steek de naald van 34 G die aan de injectiehouder is bevestigd in het oog door het geleidingsgat onder een hoek die de lens vermijdt, maar plaats de naaldpunt in de glasvochtholte.
- Injecteer met behulp van de microsyringe pompregelaar voorzichtig 1 μL van het Mtb-extract in de glasvochtholte. In geval van consistente reflux, verhoog het injectievolume tot 1,5 μL om een adequate dosisafgifte te garanderen.
OPMERKING: Injecteer voor schijncontroles 1 μL PBS in het oog van het dier. - Controleer de intravitreale plaatsing door visualisatie van een groenachtige reflex in het oog. Zie figuur 1F.
- Trek na 10 s de naald uit het oog. Let op eventuele reflux.
- Verwijder de muis van het platform, plaats 0,3% hypromellose of 0,2% w / w / w carbomeer oogzalf op beide ogen voor bescherming van het hoornvlies en ga naar de herstelverwarmingsdoos.
- Laat de muis niet onbeheerd achter totdat deze weer voldoende bij bewustzijn is gekomen om de sternale lighouding te behouden. Keer niet terug naar het gezelschap van andere dieren totdat ze volledig zijn hersteld.
- Wanneer de muis volledig wakker is, keert u terug naar de kooi en voegt u paracetamol (200-300 mg / kg / dag) medicinale waterfles toe. Label de kooikaart met de datum van ivt-injectie.
- Intravitreale injecties worden over het algemeen goed verdragen. Klinische symptomen die kunnen wijzen op pijn en de noodzaak van verwijdering uit de studie omvatten perioculaire alopecia (indicatief voor zelftrauma), hoornvlieszweren, gewichtsverlies en gebogen houding.
- Alternatieve methode voor intravitreale injectie
OPMERKING: Deze procedure wordt uitgevoerd met behulp van een operatiemicroscoop en een naald van 33 G op een microsyringe.- Proptoseer het oog en houd het in positie met een tang.
- Breng vervolgens carbomeer ooggel 0,2% g/m of 0,3% hypromellose ooggel aan en plaats een cirkelvormige coverslip (7 mm diameter) over het oog.
- Monteer een hypodermische naald van 33 G op een Hamilton-spuit van 5 μL en steek deze ongeveer 2 mm omtrek in de cornea limbus met een injectiehoek van ~ 45 °.
- Leid de naald schuin in het glasvocht, stop tussen de lens en de optische schijf (vanuit het relatieve oogpunt van de chirurg is dit boven / bedekt de optische schijf - ongeveer 1,5 mm van de plaats van inbrenging) en injecteer 2 μL Mtb (bij 2,5 ug / μL in PBS) langzaam.
- Houd de naald kort op zijn plaats (om de hoeveelheid reflux van injectaat te verminderen) en verwijder deze vervolgens.
- Na de injectie moet u de wereldbol opnieuw in beslag nemen door de tang los te laten. Een druppel van 1% w / w chlooramfenicol zalf kan op dit moment aan het oog worden toegediend om extra bescherming te bieden tegen endoftalmitis na injectie.
- Ga na de injectie naar de herstelverwarmingsbox zoals vermeld in stap 4.3.11-4.3.13.
5. OCT-beeldvorming om uveïtis op te sporen en te kwantificeren
- Dierlijke bereiding
- Verdoof de muis zoals beschreven in stap 4.1.2-4.1.4
- Verwijd de pupil met 1 druppel van 2,5% fenylefrine. Wees voorzichtig om overtollige druppels te vermijden die de neus of mond kunnen binnendringen. Dep na 2-3 minuten de overtollige vloeistof eraf.
- Plaats 0,3% hypromellose of 0,2% w /w carbomeergel op het oog om uitdroging tijdens anesthesie te voorkomen. Dit zal ook helpen om cataractvorming te voorkomen.
- Wikkel de muis in een laag chirurgisch gaas om de lichaamswarmte te behouden en plaats deze op de dierencassette. Plaats het hoofd met de bijtbalk.
- Verkrijg de OCT-afbeeldingen van de voorste en achterste kamers.
OPMERKING: Als u beelden van de voorste en achterste kamer verkrijgt, moet u eerst de beelden van de achterste kamer (PC) verkrijgen om beelddegradatie na cataractvorming te voorkomen. Cataractvorming kan worden voorkomen met frequente smering en het aanbrengen van 0,3% hypromellose of 0,2% w / w carbomeer ooggel. Voor uitgebreide beeldvorming (>10 min) helpt het ook om de muis warm te houden (door het gebruik van een warmtekussen).- Nadat u het OCT-beeldvormingssysteem hebt ingeschakeld, bevestigt u de juiste beeldlens en past u de positie van de referentiearm indien nodig aan.
- Open de imaging-software, maak de unieke muis-ID en begin met imaging volgens het oct-protocol van de fabrikant.
- Gebruik de Free Run-optie met het snelle scanprotocol en plaats het oog met de oogzenuw gecentreerd op beelden van de achterste kamer of de top van het hoornvlies op afbeeldingen van de voorste kamer.
OPMERKING: Tabel 1 bevat beeldprotocolparameters voor twee in de handel verkrijgbare beeldvormingssystemen voor kleine dieren. Raadpleeg de tabel met materialen voor productspecificaties. - Voor beeldvorming van de achterste kamer brengt u de OCT dicht bij het oppervlak van het oog. Wees voorzichtig om te voorkomen dat u het oppervlak van de lens in contact brengt met het oog.
- Zodra het oog correct is gepositioneerd, stopt u de snelle scan en selecteert u het volumescanprotocol en activeert u de scan met de optie Doel .
- Pas voor beelden van het achterste segment aan totdat de oogzenuw is gecentreerd in de horizontale B-scanuitlijningsafbeelding en dat het netvlies is uitgelijnd met de verticale uitlijningsas
- Voor afbeeldingen van het voorste segment past u de positie aan om de top van het hoornvlies te centreren in zowel de afbeelding Horizontale B-Scanuitlijning als verticale uitlijning B-Scan uitlijning. De aanwezigheid van een reflectieartefact in beide afbeeldingen zal de juiste uitlijning bevestigen. Verschuif vervolgens de horizontale afbeelding voldoende om het reflectieartefact te verwijderen. Zie figuur 2.
- Klik op Snapshot om de volumescanafbeelding vast te leggen en klik vervolgens op Opslaan.
- Verkrijg vervolgens de gemiddelde centrale lijnscan. Open het scanprotocol en klik op Doel gevolgd door Snapshot. Klik met de rechtermuisknop op hetzelfde paneel en klik vervolgens op Gemiddelde.
- Herhaal stap 5.2.1-5.2.9 voor elk oog met beide lenzen.
- Nadat alle beelden zijn verzameld, verwijdert u de muis van de cassette en biedt u hoornvliesbescherming tijdens herstel zoals vermeld in de stappen 4.3.11-4.3.13.
6. Ontsteking scoren door OCT
- Scoor de OCT-beelden met behulp van graders die gemaskeerd zijn voor de behandelingsconditie.
OPMERKING: Voor PMU in het muismodel wordt het scoresysteem in tabel 2 aanbevolen. - Als zowel anterieure kamer (AC) als posterieure kamer (PC) beelden werden verkregen, combineer deze scores om de eindscore voor elk oog te verkrijgen.
OPMERKING: Anterieure kamerontsteking verdwijnt vóór de ontsteking van de achterste kamer.
7. Ontsteking scoren door postmortale histologie
- Verzamel aan het einde van het experiment individuele ogen door enucleatie, fixeer 's nachts in 4% formaldehyde en ga verder met paraffine-inbedding, sectie en H &E-kleuring33.
OPMERKING: Meerdere secties van 4-8 μm langs de pupil-optische zenuwas worden aanbevolen.
OPMERKING: Drie secties per oog worden gescoord door een gemaskerde grader met behulp van het scoresysteem in tabel 3, en de gemiddelde score van de drie secties wordt gerapporteerd als de uiteindelijke histologische ontstekingsscore.
Representative Results
Dit protocol demonstreert de inductie van uveïtis bij muizen met behulp van het geprimeerde mycobacteriële uveïtismodel (PMU). Het waarborgen van consistentie in de subcutane injectie en nauwkeurigheid van de intravitreale injectie zijn belangrijke stappen in de ontwikkeling van het geprimeerde mycobacteriële uveïtismodel (PMU). Figuur 1 toont de intravitreale injectieprocedure van de muis met behulp van een stereotaxisch apparaat. Oorstaven helpen om het hoofd voorzichtig op dezelfde locatie onder de microscoop te plaatsen (figuur 1E). Ze houden ook het hoofd stabiel tijdens de intravitreale injectieprocedure, wat het risico op injectietrauma vermindert. Na een succesvolle injectie produceert fluoresceïne in de injectieoplossing een groenachtige reflectie vanuit het oog die onder de microscoop of vanuit een zijaanzicht kan worden gezien, zoals afgebeeld in figuur 1F.
Wanneer het wordt uitgevoerd zoals geschetst, genereert het protocol robuuste acute uveïtis die kan worden gedetecteerd met behulp van OCT- en fundusbeeldvorming al 10 uur na intravitreale injectie. Figuur 2 toont de juiste uitlijning van het oog voor OCT-beeldvorming. Tabel 1A geeft een overzicht van de parameters die in het OCT-protocol worden gebruikt. Een systematische aanpak voor het verkrijgen van afbeeldingen zal beelden van hoge kwaliteit opleveren die in de loop van de tijd kunnen worden vergeleken. Afbeeldingen van de voorste kamer worden gecentreerd op de top van het hoornvlies met behulp van de en-face SLO-afbeelding (figuur 2A) met de iris parallel aan zowel het horizontale als het verticale vlak (figuur 2B, C). Volume- en lijnscans worden vastgelegd met een verticale uitlijning, zodat inferieure en superieure regio's tegelijkertijd kunnen worden bekeken. Posterieure segmentafbeeldingen worden gecentreerd op de oogzenuw met behulp van het EN FACE SLO-beeld (figuur 2D) en de heldere band van de RPE wordt gebruikt om het netvlies parallel aan zowel de horizontale als verticale vlakken uit te lijnen (figuur 2E, F).
Figuur 3 toont typische bevindingen van PMU-oogontsteking met behulp van OCT-beeldvorming. Vierentwintig uur na intravitreale injectie worden ontstekingscellen gezien in het waterige en glasvocht (figuur 3B). In aanwezigheid van matige of ernstige ontsteking zal een hypopyon worden gezien in de inferieure hoek in de AC. De mate van oogontsteking kan op deze OCT-beelden worden gescoord aan de hand van de criteria in tabel 2. Representatieve voorbeelden van afbeeldingen die de ontstekingskenmerken aantonen die typisch zijn voor elke score, worden weergegeven in figuur 4. AC- en PC-kamerscores kunnen bij elkaar worden opgeteld om de gecombineerde OCT-score te genereren. Gecombineerde scores >0 maar ≤2,5 vertegenwoordigen milde ontsteking. Matige ontsteking wordt bepaald door scores >2,5 maar ≤4,5. Scores >4,5 identificeren ernstige ontstekingen. Ontsteking piekt meestal 48 uur na intravitreale injectie met OCT-scores in de AC en PC tussen 1 en 3 (gecombineerde scores tussen 2 en 6). AC- en pc-scores van 0,5 of 4 komen minder vaak voor. In het geval dat scores buiten het typische bereik vaak worden aangetroffen, kan probleemoplossing nodig zijn om de factoren te identificeren die bijdragen aan uitschietersscores (zie discussiesectie). Ontstekingsscores in de voorste kamer hebben de neiging om binnen een week na intravitreale injectie terug te keren naar nul. Daarentegen keren posterieure scores niet terug naar nul; in plaats daarvan blijft chronische ontsteking op laag niveau bestaan in de vorm van vitritis en perivasculaire lymfocyten infiltreren in het netvlies gedurende 1-2 maanden na intravitreale injectie.
Ontstekingsscore in PMU kan ook worden bepaald met behulp van histologie. Figuur 5 toont representatieve H&E-secties voor gebruik bij het scoren van de ernst van PMU door histologie. Het aantal ontstekingscellen in het waterige en glasvocht wordt geteld en gebruikt om de ernst te bepalen aan de hand van de scorecriteria in tabel 3. Inflammatoire celinfiltratie van het ciliaire lichaam wordt vaak gezien aan één kant van de histologiesectie (unilaterale betrokkenheid) bij milde of matige ontsteking. Wanneer de ontsteking ernstig is, wordt dit weerspiegeld door de aanwezigheid van een ontstekingscelinfiltraat in het ciliaire lichaam aan beide zijden van de lens (bilaterale betrokkenheid genoemd). Tijdens latere tijdstippen na intravitreale injectie kunnen chronische ontstekingsverschijnselen, waaronder de aanwezigheid van perivasculaire en intraretinale leukocyten en buitenste retinale plooien, ook worden geïdentificeerd. Histologie kan ook nuttig zijn bij het identificeren van ogen die worden beïnvloed door slechte injectietechnieken. Trauma aan de lens tijdens de intravitreale injectie kan worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van amorfe eosine-gekleurde (roze) lenseiwitten buiten de lenscapsule grenzend aan het gebied van trauma. Reflux van de intravitreale mTB in de subconjunctivale ruimte zal ontstekingen buiten het oog genereren die kunnen worden geïdentificeerd door een zorgvuldige beoordeling van perioculaire structuren die op de secties aanwezig zijn. Vanwege het niet behouden van mTB-extract in de ogen, zullen deze ogen meestal lage OCT-scores van ontsteking hebben.
Brightfield fundus imaging kan ook worden gebruikt om klinisch relevante aspecten van PMU te identificeren, waaronder de ontwikkeling van een hypopyon, vitritis en retinale of perivasculaire inflammatoire celinfiltratie. Figuur 6 toont twee voorbeelden waarbij retinale en perivasculaire ontsteking te zien zijn op fundusbeelden. Deze twee ogen tonen ook het bereik van ontstekingen dat veel voorkomt in het PMU-model. Tabel 1B geeft een overzicht van de parameters die worden gebruikt in het fundus/retinale OCT-beeldvormingssysteem. Let op de impact die ernstige ontstekingen hebben op de beeldkwaliteit (figuur 6, dag 2, OCT- en fundusbeelden in de bovenste rij) en de omvang van de ziekte die aanwezig is op dag 21. Cornea-oedeem kan ook de beeldkwaliteit verminderen tijdens acute ontsteking; het is echter ongebruikelijk dat cornea-oedeem ernstig is door ontsteking alleen. Vaker zal de beeldkwaliteit worden aangetast door epitheliale schade als gevolg van onvolledige oppervlaktebescherming tijdens beeldvorming en anesthesiegebeurtenissen.
Het PMU-model kan worden gebruikt om uveïtis te induceren bij elk muizenras of genotype. In albino-ogen kan OCT nog steeds worden gebruikt om ontstekingen te scoren, maar de afwezigheid van funduspigment maakt visualisatie van ontsteking uitdagend door brightfield imaging13,34. Post mortem studies kunnen worden uitgevoerd op oculaire weefsels, regionale lymfeklieren of de milt. Enkele voorbeelden zijn testen voor de aanwezigheid van immuuncellen zoals flowcytometrie en immunohistochemie en meting van inflammatoire cytokines. Op alle tijdstippen getest na aanvang van ontsteking met PMU (dag 1 tot dag 56), zijn er voldoende CD45+ ontstekingscellen aanwezig in individuele ogen om veel belangrijke leukocytenpopulaties in het oog te detecteren door multi-parameter flowanalyse12,35. Waterige (2-5 μL) en glasvochtige (5-10 μL) humor kan worden verzameld uit ontstoken ogen voor bepaling van de eiwitconcentratie, proteomische studies of cytokineconcentratiebepaling36.
Figuur 1: Intravitreale injectie-instelling van de muis. De intravitreale injectie wordt uitgevoerd op het muizenoog met behulp van (A) een microsyringe pompregelaar aangesloten op de (B) Micropump en (C) een injectiespuit. De spuit wordt geladen en gemonteerd op de (D) Micropomp. De muiskop wordt geplaatst met behulp van (E) oorbalken om stabiliteit en consistentie te garanderen tijdens de intravitreale injectieprocedure. (F) Fluoresceïne in de injectieoplossing produceert een groenachtige reflectie vanuit het oog na een succesvolle procedure. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Juiste uitlijning van het oog voor OCT-beeldvorming. (A) Met behulp van het en-face scanning laser oftalmoscoop (SLO) beeld, wordt het oog gecentreerd voor anterieure kamer beeldvorming. De groene lijn geeft de positie aan van de horizontale lijnscan die in deelvenster (B) wordt weergegeven. Merk op dat het centrale hoornvlies wordt vermeden om reflectieartefacten te verminderen. (C) Verticale B-Scan door de paracentrale voorste kamer. Deze scan wordt verkregen op 90° van de horizontale scan. Merk op dat de uitlijning van de irissecties aan elke kant van de lens vlak is in de horizontale scan (paneel B) en boven elkaar is gerangschikt in de verticale scan (paneel C). (D) Met behulp van het SLO-beeld wordt het beeld van de achterste kamer gecentreerd op de oogzenuw. (E) Horizontale B-Scan uitlijning, (F) Verticale B-Scan uitlijning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Inductie van PMU genereert panuveitis die kan worden gevolgd door longitudinale OCT-beeldvorming. De bovenste rij toont de voorste kamer (AC); de onderste rij toont OCT-afbeeldingen (posterieure kamer) (PC) om pathologische veranderingen in het ziekteverloop te markeren. (A) Baseline OCT-afbeelding van de AC (boven) en PC (onder) voorafgaand aan inductie van uveïtis, beide score 0. (B) Dag 1 na intravitreale injectie die de aanwezigheid van cornea-oedeem (zwarte pijl), een hypopyon (*) meerdere vrij zwevende ontstekingscellen in de AC (witte pijlen) en vitritis (witte pijlpunten) in de PC aantoont. (C) Dag 7 na intravitreale injectie met weinig AC-cellen op de voorste lenscapsule (witte pijl) en verminderde vitritis (witte pijlpunt). (D) Dag 28 na intravitreale injectie anterieure kamer met opgeloste AC-ontsteking en milde vitritis. Afkortingen: C- cornea, L - lens, I - iris, Aq - waterig, V glasachtig, RGC - retinale ganglioncellen, PR - fotoreceptoren, Ch- vaatvlies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: OCT score voorbeelden. Een OCT-score tussen 0 en 4 wordt toegewezen aan elk AC-beeld en pc-image met behulp van het categorische systeem in tabel 2. De AC- en PC-scores worden gecombineerd voor de uiteindelijke OCT-score voor het oog. (A,D) Voorbeelden van een score van nul. (B,E) Voorbeelden van een score van 0,5. (C,F) Voorbeelden van een score van 1. (G,J) Voorbeelden van een score van 2. (H,K) Voorbeelden van een score van 3. (I,L) Voorbeelden van een score van 4 worden getoond in de panelen I en L. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Histologie score voorbeelden. De histologiescore wordt bepaald op basis van vijf kenmerken die zichtbaar zijn in H &E-secties: eiwitdichtheid van de voorste kamer, het aantal voorste kamercellen, infiltratie van immuuncellen van het ciliaire lichaam, glasvochtceldichtheid, retinale vasculaire ontsteking en structurele retinale veranderingen. Voor elk kenmerk wordt een score van 0-2 toegekend. De beschrijving van elke score is te vinden in tabel 3. Een representatieve voorbeeldscore van 0-2 voor elk kenmerk wordt weergegeven in deze figuur. De linkerkolom toont de score van nul. De middelste kolom toont voorbeelden van score 1. De rechterkolom toont voorbeelden van score 2. Een score van 2 voor ciliaire lichaamsscore wordt toegewezen als het ciliaire lichaam aan weerszijden van de lens in hetzelfde gedeelte cellulaire ontsteking vertoont. De uiteindelijke histologiescore is de som van de score voor elk van de vijf criteria (max. score 10). De pijl in het rechteronderpaneel geeft perivasculaire leukocyten aan die geassocieerd zijn met een oppervlakkig netvliesvat. Zwarte schaalbalk geeft 500 μm aan. Ciliaire schaalbalken geven 100 μm aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Longitudinale fundusbeeldvorming in PMU identificeerde een reeks ernst van de ziekte. (A) Ernstig ontstoken ogen vertonen meerdere witte infiltraten in het netvlies en vasculaire tortuositeit op kleuren fundus beeldvorming (bovenste rij) evenals dichte vitritis en retinaal oedeem op OCT (onderste rij) op dag 2. Progressie in het aantal retinale laesies kan in de loop van de tijd worden gezien, terwijl de vitritis verbetert. Groene lijn geeft de positie van de OCT-afbeelding aan. (B) Licht ontstoken ogen vertonen minder en meer discrete lineaire laesies in de fundus en een aantal infiltrerende cellen in de glasvochtruimte. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Een | |||
| Muis Voorste Kamer | Snelle scan | Volumescan | Lineaire scan |
| Lengte x Breedte | 4,0 mm x 4,0 mm | 3,6 mm x 3,6 mm | 3,6 mm |
| Hoek | 0 | 90 | 90 |
| A-scan/B-scan | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-scans | 50 | 400 | 1 |
| Frames/ B-scan | 1 | 3 | 20 |
| Muis Achterkamer | Snelle scan | Volumescan | Lineaire scan |
| Lengte x Breedte | 1,6 mm x 1,6 mm | 1,6 mm x 1,6 mm | 1,6 mm |
| Hoek | 0 | 0 | 0 |
| A-scan/B-scan | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-scans | 50 | 200 | 1 |
| Frames/ B-scan | 1 | 3 | 20 |
| B | |||
| Muis Achterkamer | Volumescan | Lineaire scan | |
| Lengte x Breedte | 0,9 mm x 0,9 mm | 1,8 mm | |
| Hoek | 0 | Elke (meestal 0 of 90) | |
| A-scan/B-scan | 1024 | 1024 | |
| # B-scans | 512 | 1 | |
| Frames/ B-scan | 1 | 30 |
Tabel 1: Scanparameters. (A) OCT-scanparameters. (B) Fundus/retinale OCT-scanparameters
| OCT Score beschrijvingen | ||||||
| Partituur | Voorste Kamer | Achterste Kamer | ||||
| NA | Geen zicht voorbij voorste hoornvlies | Geen zicht op het achterste segment | ||||
| 0 | Geen ontsteking | Geen ontsteking | ||||
| 0.5 | 1-5 cellen in het waterige | Weinig cellen die minder dan 10% van het glasvochtgebied bezetten | ||||
| OF cornea oedeem | Geen subretinale of intraretinale infiltraten of verstoring van de retinale architectuur | |||||
| 1 | 6-20 cellen in het water | Diffuse cellen (geen dichte klonten) die tussen de 10 en 50% van het glasvochtgebied bezetten. | ||||
| OF een enkele laag cellen op de voorste lenscapsule | Geen subretinale of intraretinale infiltraten of verstoring van de retinale architectuur | |||||
| 2 | 20-100 cellen in het water | Diffuse cellen (geen dichte klonten) die > 50% van het glasvochtoppervlak innemen | ||||
| OF minder dan 20 cellen en een hypopyon aanwezig | Geen subretinale of intraretinale infiltraten of verstoring van de retinale architectuur | |||||
| 3 | 20-100 cellen in het water | Diffuse cellen gelijk aan graad 2 en 1 | ||||
| EN een hypopyon OF een pupilmembraan | EN ten minste één dichte glasvochtopaciteit die 10%-20% van het glasvochtgebied beslaat OF de aanwezigheid van glasvochtcellen gelijk aan graad 2 en zeldzame (≤ 2) subretinale of ntraretinale opaciteiten | |||||
| 4 | Een willekeurig aantal waterige cellen | Dichte glasvochtopaciteit die > 20% van het glasvochtgebied in beslag neemt. | ||||
| EN een groot hypopyon- en pupilmembraan OF anterieur structuurverlies als gevolg van ernstige ontsteking | OF diffuse glasachtige cellen met grote subretinale of intraretinale opaciteiten | |||||
Tabel 2: PMU OCT score criteria: OCT-afbeeldingen worden gescoord volgens de criteria in de tabel. AC- en PC-scores worden toegevoegd om de eindscore van het oog te verkrijgen. In gevallen waarin geen duidelijk zicht op het oog werd verkregen, werd een score van NA toegewezen aan de beelden, en deze werden uitgesloten van het onderzoek.
| Histologie Score Beschrijving | |||
| Karakteristiek | 0 | 1 | 2 |
| Anterieure Kamer (AC) Eiwit | Schaarse acellulaire deeltjes die kleuren met eosine in de AC | Matige, maar niet confluente, extracellulaire eosinekleuring overal in de AC | Confluente of bijna confluente extracellulaire eosinekleuring door de ac |
| Voorste Kamer (AC) Cel | Geen cellen | 1-100 cellen, maar geen dichte aggregaties van cellen | > 100 cellen of dichte aggregaties van cellen |
| Ciliaire lichaamsontsteking | Geen leukocyteninfiltratie van het ciliaire lichaam of het omringende glasvocht | Eenzijdige aanwezigheid van leukocyten die het ciliaire lichaam en/of het omringende glasvocht infiltreren. | Bilaterale aanwezigheid van leukocyten die het ciliaire lichaam en/of het omringende glasvocht infiltreren. |
| Retinale vasculaire ontsteking | Geen retinale vaten met perivasculaire leukocyten | Eén vat per sectie met perivasculaire leukocyten | >1 vat per sectie met perivasculaire leukocyten |
| Retinale vouw of beschadiging | Geen schade aan het netvlies | 1-3 retinale plooien per sectie | >3 retinale plooien per sectie, of een andere retinale laagvernietiging of intraretinale bloeding |
Tabel 3: PMU histologie score criteria: H&E-delen van het oog werden gescoord op basis van de criteria in de tabel. Drie secties van hetzelfde oog werden gescoord en gemiddeld om de uiteindelijke histologische score van het oog te verkrijgen.
Discussion
Diermodellen van uveïtis hebben een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van de mechanismen van oogontsteking en homeostase en bij het mogelijk maken van preklinische evaluatie van medische en chirurgische therapieën voor patiënten met uveïtis37. Zowel konijnen- als rattenvarianten van het PMU-model hebben hun waarde in preklinische therapie aangetoond via proof of concept-studies 38,39,40. Vanwege de beschikbaarheid van een breed scala aan transgene stammen bij muizen, maakt het opzetten van het PMU-modelsysteem van de muis nu meer gedetailleerde mechanistische studies mogelijk om specifieke celtypen, paden en genen te identificeren die bijdragen aan de pathologie van deze ziekte.
Diermodellen van uveïtis kunnen de variabiliteit van dier tot dier aantonen in de incidentie en intensiteit van ontsteking41. In de C57BL/6-muizenstam wordt PMU betrouwbaar gegenereerd met behulp van het hier beschreven protocol. Stamspecifieke variaties in het verloop en de intensiteit van uveïtis zijn gemeld voor zowel EAU als EIU42,43. Hoewel stamspecifieke effecten op de ernst en het verloop van PMU niet experimenteel zijn gemeten, is dit model gebruikt in wild-type C57BL / 6J en in albino-muizen (B6 (Cg) - Tyrc-2J / J) en produceerde vergelijkbare ontstekingsreacties. Bij het genereren van het PMU-model kan het beheersen van de onderstaande overwegingen nieuwe onderzoekers helpen de variabiliteit te beperken en de meest consistente en reproduceerbare uveïtis te produceren.
Zorg voor consistentie in de subcutane injecties:
Om een consistente subcutane injectie te bieden, moet u ervoor zorgen dat alle luchtbellen uit de emulsie worden verwijderd. Overwegingen omvatten een korte centrifuge (30 s bij 400 x g) van de vooraf gemaakte emulsie voorafgaand aan het laden van de spuit. Dit verwijdert lucht die vastzit in de emulsie. Keer bij het laden van de spuit ook regelmatig om (tip-up) en tik op de spuit om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats de spuit tijdens het injecteren niet te diep om intramusculaire injectie te voorkomen. Omgekeerd kan een ondiepe (intradermale) injectie leiden tot erosie van de emulsie door de huid. Vergeet niet om even te pauzeren voordat u de spuit van de injectieplaats verwijdert om volledige injectie van de dikke viskeuze emulsie te garanderen en om reflux van de huid te voorkomen.
Bevestig zeven dagen na het plaatsen van de subcutane injectie de aanwezigheid van voelbare knobbeltjes aan weerszijden van de achterpoten. Als er geen knobbeltjes kunnen worden geïdentificeerd, is het mogelijk dat lucht werd geïnjecteerd in plaats van emulsie. In dit geval is acute ontsteking mogelijk niet zo robuust en ontwikkelt chronische ontsteking zich mogelijk niet.
Voorkom de ontwikkeling van infectieuze endoftalmitis:
Bacteriële of schimmelendoftalmitis zal een verstorende variabele genereren als deze niet wordt voorkomen44. Om bacteriële endoftalmitis te voorkomen, moet u altijd een goede aseptische techniek toepassen bij het maken van de intravitreale suspensie, het hanteren en reinigen van alle herbruikbare hulpmiddelen die in contact komen met het oog. Het gebruik van steriele items voor eenmalig gebruik, autoclaveren of schoonmaken met 95% alcoholwasbeurten of doekjes is belangrijk. Gepast gebruik van betadine aangebracht op het oculaire oppervlak, deksels en perioculaire vacht zal ook helpen voorkomen dat endoftalmitis45. Het is eenvoudig om een oog met infectie te herkennen, omdat de oculaire structuren tijdens de post-injectiekuur worden uitgewist door extreme ontsteking. Dit is niet typisch voor PMU. De aanwezigheid van intraoculaire bloedingen kan ook wijzen op endoftalmitis of trauma van de injectie. Sluit in dergelijke gevallen deze dieren uit van het onderzoek.
Zorg voor consistentie in de intravitreale injectie:
De intravitreale injectie is een cruciale stap in de inductie van betrouwbare en reproduceerbare ontstekingen bij PMU. Het verstrekken van een consistente hoeveelheid Mtb-suspensie bij elke injectie, het vermijden van trauma en het voorkomen van reflux van de suspensie zijn allemaal factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het uitvoeren van de injecties. Om een consistente suspensie te garanderen, vortex de stocksuspensie grondig bij het ontdooien en voordat deze in de spuit wordt geladen. Omdat dit gebruikte Mtb-extract geen oplossing vormt, kan de suspensie na verloop van tijd sedimentatie ondergaan. Om een uniforme concentratie van het Mtb-extract in elke injectie te garanderen, gebruikt of verwijdert u de spuit en laadt u deze binnen 15 minuten na het laden opnieuw. Fenylefrine wordt gebruikt voor verwijding om een groter gezichtsveld naar het achterste oog te bieden en het risico op trauma aan het oog tijdens de injectie te verminderen. Deze druppel genereert natuurlijke terugtrekking van het ooglid en lichte proptose van de wereldbol, waardoor een goede visualisatie van het gebied 1-2 mm achter de limbus mogelijk is zonder dat het oog met een tang hoeft te worden vastgepakt. Het gebruik van een tang om het oog te beteugelen kan potentieel trauma veroorzaken en de intraoculaire druk en het risico op reflux van de Mtb-suspensie tijdelijk verhogen. Trauma kan ook worden veroorzaakt door te proberen te veel volume in het oog te injecteren. Het injectievolume is beperkt tot 2 μL om significante en langdurige verhoging van de intraoculaire druk en trauma aan het oog te voorkomen. Bovendien zullen jongere dieren ogen hebben die kleiner zijn dan volwassen muizen. Typisch 6-8 weken muizen (20-25 g) zorgen voor een uniforme ooggrootte en zorgen voor een grotere consistentie in de ontsteking na injectie van Mtb. Een hogere frequentie van reflux na injectie van de mycobacteriële suspensie werd waargenomen bij kleinere muizen. Dit leidt op zijn beurt tot een minder dan verwachte acute ontsteking. Een verdunde fluoresceïneoplossing wordt gebruikt om de beginnende injector visuele feedback te geven over het succes van hun injectietechniek. Verwijding op het moment van injectie zorgt voor directe visualisatie van het geïnjecteerde materiaal in de glasvochtholte en de mogelijkheid om enig bewijs van lenstrauma op te merken. In het geval van lenstrauma kan het een verandering in de helderheid van de lens veroorzaken die een cataract veroorzaakt die op OCT kan worden gevisualiseerd. In het geval van oculair trauma moeten de ogen worden uitgesloten van het onderzoek vanwege de mogelijkheid van lensgeïnduceerde uveïtis46. We raden aan om 10 s te pauzeren voordat u de spuit uit het oog verwijdert om dispersie van de Mtb-suspensie in het oog mogelijk te maken en reflux te verminderen.
Het PMU-model kan worden aangepast om de intensiteit van acute ontsteking te veranderen door de concentratie van de Mtb in de intravitreale injectie te variëren. Verschillende doseringen variërend van 2,5 μg/μL tot 15 μg/μL zijn eerder getest in ons lab. Doses hoger dan 10 μg/μL bleken echter ernstige oogschade te veroorzaken, waaronder spontane lensruptuur, ernstig cornea-oedeem en littekens, en hyphema. Deze mate van ernst is niet typisch bij menselijke patiënten met post-infectieuze uveïtis en daarom worden deze concentraties niet aanbevolen. Een dosis van 5 μg/μL bleek op betrouwbare wijze milde tot matige acute ontsteking en milde chronische uveïtis te produceren; de dosis van 10 μg/μL produceert een betrouwbaar matige tot ernstige acute ziekte en een meer opvallende chronische ziekte. Het variëren van de intravitreale concentratie kan dus alternatieve ernst van de ziekte bieden voor gebruik indien nodig op basis van de experimentele vraag. Controles moeten worden geselecteerd om ervoor te zorgen dat de resultaten te wijten zijn aan de respons op mTB en niet aan trauma geassocieerd met de subcutane of intravitreale injecties. In de schijninjectiecontroles kan PBS worden gebruikt in plaats van het mTB-extract. Voor vergelijkingen met onbelichte dieren moeten echte naïeve monsters worden beschouwd als medeogen zijn niet altijd gelijkwaardig.
Vanwege de kleine omvang van het muisoog kan OCT een gevoeligere test zijn om ontstekingen in de voorste kamer te detecteren dan directe visualisatie of microscopische heldere veldfotografie. Eerder werk met PMU bij ratten25 bepaalde dat er meer cellen kunnen worden gedetecteerd door histologie dan door OCT, maar dat er een goede correlatie is tussen de twee modaliteiten. OCT heeft als bijkomend voordeel dat het kan worden gebruikt om de ontsteking longitudinaal bij hetzelfde dier te monitoren. Andere belangrijke muismodellen van uveïtis, zoals EAU en EIU, hebben ook OCT gebruikt voor kwantitatieve analyse 12,47,48. In het PMU-model van muizen zijn voorste kamercellen alleen zichtbaar op OCT en kunnen ze niet worden gezien op klinische onderzoeken tenzij er een groot hypopyon aanwezig is. Glasvochtontsteking (vitritis) kan worden waargenomen met color fundus imaging, maar het detecteren van kwantitatieve verandering is alleen mogelijk met OCT-beeldvorming. Andere aspecten van het model, zoals retinale vasculaire ontsteking en retinale schade, kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd met OCT- en microscopische brightfield fundusfotografie.
Bij het gebruik van OCT is het belangrijk om te overwegen hoe gelokaliseerde beeldvorming kan worden beïnvloed door regionale verschillen in de mate van ontsteking. Eerdere rapporten hebben een ongelijke verdeling van cellen in de voorste kamer van mensen geïdentificeerd, met meer cellen inferieur49. Bij muizen komt een vergelijkbare aanleg vaak voor. Verticale of radiale scans door de AC zullen dus helpen zorgen voor beelden die het bereik van ontsteking vastleggen. Bovendien zal het uitvoeren van beeldvorming op dezelfde plaats ook consistentie bieden aan beelden die in de lengterichting van hetzelfde oog zijn verzameld. Om beelden in hetzelfde deel van het oog te verkrijgen, gebruikt u stabiele oriëntatiepunten en een systematische aanpak. Voor beelden van de voorste kamer wordt het beeld direct naast de top van het hoornvlies gecentreerd en verticaal georiënteerd, zodat de aanwezigheid van een hypopyon in de inferieure hoek kan worden gedetecteerd. Voor posterieure segmentafbeeldingen is het beeld gecentreerd op de oogzenuw. Het wordt aanbevolen om te overwegen om ten minste 3 lijnscans te gebruiken voor het scoren om ervoor te zorgen dat regionale variabiliteit wordt vastgelegd. In gevallen waarin ontsteking beperkt is tot perifere locaties, kan het verkrijgen van volumescans nuttig zijn. Het verzamelen van volumescans kan ook helpen bij het vastleggen van regionale variaties, maar zal de vereisten voor gegevensopslag verhogen.
Andere in vivo assays die kunnen worden gebruikt om ontstekingen in het PMU-muismodel te karakteriseren, zijn bioluminescentiebeeldvorming13,35. Postmortale assays zoals multi-parameter flowcytometrische analyse kunnen worden uitgevoerd om infiltrerende immuunceltypepopulaties in de waterige en achterste oogkamer te identificeren en te kwantificeren12,26. In het PMU-model wordt acute ontsteking gekenmerkt door een aangeboren respons met een overheersend neutrofiel infiltraat, gevolgd door een chronische en aanhoudende adaptieve T-cel dominante respons die langer dan een maand aanhoudt35. Andere testen van de immuunfunctie die kunnen worden uitgevoerd op post-mortem weefsels omvatten oculaire vloeistof cytokine analyse. Bovendien kunnen andere downstream-testen zoals mRNA-sequencing en immunofluorescentiebeeldvorming worden gebruikt om gen- en eiwitexpressiepatronen van retinale immuuncelpopulaties bij uveïtiste beoordelen 50,51.
Het PMU-model kan worden gerepliceerd in andere knaagdiersystemen met behulp van aanpassingen die geschikt zijn voor de verschillende soorten. PMU-model is eerder gebruikt bij ratten en konijnen 38,39,40. Bij ratten ontwikkelt acute panuveitis zich na intravitreale injectie die spontaan verdwijnt gedurende 14 dagen zonder tekenen van chronische ontsteking te ontwikkelen door histologie24. Bij konijnen maakt inductie van uveïtis gebruik van twee rondes subcutane injectie voorafgaand aan intravitreale injectie, maar genereert ook een robuuste panuveitis. Een van de voordelen van het gebruik van het muismodel is de beschikbaarheid van talrijke transgene en knock-out stammen die kunnen helpen het basismechanisme van uveïtiste begrijpen 52. Alle knaagdiermodellen kunnen worden gebruikt voor preklinische therapietests als het middel systemisch of als een actuele druppel wordt toegediend. Vanwege hun grotere omvang zijn ratten- en konijnenogen echter betere modellen voor gebruik in preklinische studies van implanteerbare of lokale injectiebehandelingsopties voor uveïtis.
Samenvattend biedt dit protocol onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de mechanismen van chronische oogontsteking een nieuw hulpmiddel dat niet afhankelijk is van eerdere immunisatie met oculaire antigenen.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële conflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door financiering van de National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Verenigde Staten (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW vision research core grant (NEI P30EY01730), giften van de Mark Daily, MD Research Fund en het Christopher and Alida Latham Research fund, een onbeperkte departementale subsidie van Research to Prevent Blindness en een carrièreontwikkelingsprijs van Research to Prevent Blindness (KP). Het werk in Bristol werd ondersteund door aanvullende financiering van Sight Research UK en The Underwood Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-FLUOR | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial | |
| AnaSed | Akorn Animal Health, IL, USA | NDC 59399-110-20 | Xylazine 20 mg/mL |
| Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution | Alcon, TX, USA | 8007-1 | |
| B-D Precision Glide Needles -25 G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305122 | |
| B-D Precision Glide needle -30-G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305106 | |
| Bond MAX, Bond Rx | Leica Biosystems, IL,USA | Automated IHC staining system | |
| Chloramphenicol ointment | Martindale Pharma, Romford, UK | 1% w/w Chloramphenicol | |
| EG1150H | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Embedding | |
| Envisu R2300 | Bioptigen/Leica | OCT Machine | |
| Freund's Incomplete Adjuvant | BD Difco, NJ, USA | 263910 | |
| GenTeal lubricant eye ointment | Alcon, TX, USA | --- | |
| GenTeal lubricant eye gel | Alcon, TX, USA | --- | |
| H37Ra lyophilized Mycobacteria extract | BD Difco, NJ, USA | 231141 | |
| Hamilton RN Needle (33/12/2)S | Hamilton, Reno, NV | 7803-05(33/12/2) | 33 G |
| Hamilton syringe | Hamilton, Reno, NV | CAL7633-01 | 5 µL |
| Insulin needle | Exel International, USA | 26029 | 1 mL |
| Isoflurane | |||
| Ketaset | Zoetis, USA | 377341 | Ketamine HCL 100 mg/mL |
| Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller | World Precision Instruments, FL, USA | UMP3 | |
| Micron IV | Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA | Alternative Imaging/OCT Machine | |
| Nanofil 10 µL syringe | World Precision Instruments, FL, USA | NANOFIL | |
| Nanofil Intraocular Injection Kit | World Precision Instruments, FL, USA | IO-KIT | |
| Olympus SZX10 | Olympus | Dissection scope | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 17478020115 | |
| RM2255 | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Sectioning | |
| TB Syringe | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 309602 | 1 mL |
| Tetracaine 0.5% | Alcon, TX, USA | 1041544 | |
| Tissue Tek VIP series | Sakura Finetek USA, Inc.,CA. | Histology Tissue Processing | |
| Tropicamide 1% | Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK | Minims | |
| Tylenol | Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA | NDC 50580-614-01 | Acetaminophen |
| Viscotears | Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK | Carbomer eye gel 0.2% w/w |
References
- American Academy of Ophthalmology. Aao 2019-2020 Basic and Clinical Science Course, Section 09: Uveitis and Ocular Inflammation. American Academy of Ophthalmology. , (2019).
- Caspi, R. R. Animal models of autoimmune and immune-mediated uveitis. Drug Discovery today. Disease Models. 3 (1), 3-9 (2006).
- DeVoss, J., et al. Spontaneous autoimmunity prevented by thymic expression of a single self-antigen. The Journal of Experimental Medicine. 203 (12), 2727-2735 (2006).
- Caspi, R. R., et al. A new model of autoimmune disease. Experimental autoimmune uveoretinitis induced in mice with two different retinal antigens. Journal of Immunology. 140 (5), 1490-1495 (1988).
- Tang, J., Zhu, W., Silver, P. B., Su, S. -B., Chan, C. -C., Caspi, R. R. Autoimmune uveitis elicited with antigen-pulsed dendritic cells has a distinct clinical signature and is driven by unique effector mechanisms: Initial encounter with autoantigen defines disease phenotype. The Journal of Immunology. 178 (9), 5578-5587 (2007).
- Broekhuyse, R. M., Kuhlmann, E. D., Winkens, H. J. Experimental melanin-protein induced uveitis (EMIU) is the sole type of uveitis evoked by a diversity of ocular melanin preparations and melanin-derived soluble polypeptides. Japanese Journal of Ophthalmology. 40 (4), 459-468 (1996).
- Pennesi, G., et al. A humanized model of experimental autoimmune uveitis in HLA class II transgenic mice. The Journal of Clinical Investigation. 111 (8), 1171-1180 (2003).
- Caspi, R. R. Understanding autoimmune uveitis through animal models. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (3), 1872-1879 (2011).
- Bansal, S., Barathi, V. A., Iwata, D., Agrawal, R. Experimental autoimmune uveitis and other animal models of uveitis: An update. Indian Journal of Ophthalmology. 63 (3), 211-218 (2015).
- Smith, J. R., Hart, P. H., Williams, K. A. Basic pathogenic mechanisms operating in experimental models of acute anterior uveitis. Immunology and Cell Biology. 76 (6), 497-512 (1998).
- Rosenbaum, J. T., McDevitt, H. O., Guss, R. B., Egbert, P. R. Endotoxin-induced uveitis in rats as a model for human disease. Nature. 286 (5773), 611-613 (1980).
- Chu, C. J., et al. Multimodal analysis of ocular inflammation using the endotoxin-induced uveitis mouse model. Disease Models & Mechanisms. 9 (4), 473-481 (2016).
- Gutowski, M. B., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. In vivo bioluminescence imaging for longitudinal monitoring of inflammation in animal models of uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1521-1528 (2017).
- World Health Organization.
- Biswas, J., Badrinath, S. S. Ocular morbidity in patients with active systemic tuberculosis. International Ophthalmology. 19 (5), 293-298 (1995).
- Donahue, H. C. Ophthalmologic experience in a tuberculosis sanatorium. American Journal of Ophthalmology. 64 (4), 742-748 (1967).
- El-Asrar, M. A., Abouammoh, M., Al-Mezaine, H. S.
- Bodaghi, B., et al. Chronic severe uveitis: etiology and visual outcome in 927 patients from a single center. Medicine. 80 (4), 263-270 (2001).
- Cunningham, E. T., Forrester, J. V., Rao, N. A., Zierhut, M.
- Wroblewski, K. J., Hidayat, A. A., Neafie, R. C., Rao, N. A., Zapor, M. Ocular tuberculosis: a clinicopathologic and molecular study. Ophthalmology. 118 (4), 772-777 (2011).
- Yeh, S., Sen, H. N., Colyer, M., Zapor, M., Wroblewski, K.
- Tagirasa, R., Parmar, S., Barik, M. R., Devadas, S., Basu, S. Autoreactive T cells in immunopathogenesis of TB-associated uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (13), 5682-5691 (2017).
- Agrawal, R., et al. Insights into the molecular pathogenesis of ocular tuberculosis. Tuberculosis. 126, 102018 (2021).
- Pepple, K. L., et al. Primed mycobacterial uveitis (PMU): Histologic and cytokine characterization of a model of uveitis in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8438-8448 (2015).
- Pepple, K. L., Choi, W. J., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Wang, R. K. Quantitative assessment of anterior segment inflammation in a rat model of uveitis using spectral-domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (8), 3567-3575 (2016).
- Pepple, K. L., Wilson, L., Van Gelder, R. N. Comparison of aqueous and vitreous Lymphocyte populations from two rat models of experimental uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (6), 2504-2511 (2018).
- Basu, S., Elkington, P., Rao, N. A. Pathogenesis of ocular tuberculosis: New observations and future directions. Tuberculosis. 124, 101961 (2020).
- Basu, S., Rao, N., Elkington, P. Animal models of ocular tuberculosis: Implications for diagnosis and treatment. Ocular Immunology and Inflammation. , 1-7 (2020).
- Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2921-2927 (2012).
- Underwood, W., Anthony, R. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. 2013 (30), 2020-2021 (2020).
- Donovan, J., Brown, P., et al. Handling and restraint. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. Chapter 1, Unit 1.3 (2006).
- Tremoleda, J. L., Kerton, A., Gsell, W. Anaesthesia and physiological monitoring during in vivo imaging of laboratory rodents: considerations on experimental outcomes and animal welfare. EJNMMI Research. 2 (1), 44 (2012).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
- John, S., Rolnick, K., Wilson, L., Wong, S., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. Bioluminescence for in vivo detection of cell-type-specific inflammation in a mouse model of uveitis. Scientific Reports. 10 (1), 11377 (2020).
- Fortmann, S. D., Lorenc, V. E., Hackett, S., Campochiaro, P. A. Murine Vitreous Tap (MurViTap): a novel technique to extract uncontaminated mouse vitreous humor, quantify retinal vascular permeability, and compare proteins secreted by diseased and normal retina. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (8), 5978 (2017).
- Caspi, R. R. Understanding autoimmunity in the eye: from animal models to novel therapies. Discovery Medicine. 17 (93), 155-162 (2014).
- Mruthyunjaya, P., et al. Efficacy of low-release-rate fluocinolone acetonide intravitreal implants to treat experimental uveitis. Archives of Ophthalmology. 124 (7), 1012-1018 (2006).
- Jaffe, G. J., Yang, C. S., Wang, X. C., Cousins, S. W., Gallemore, R. P., Ashton, P. Intravitreal sustained-release cyclosporine in the treatment of experimental uveitis. Ophthalmology. 105 (1), 46-56 (1998).
- Pepple, K. L., et al. Uveitis therapy with shark variable novel antigen receptor domains targeting tumor necrosis factor alpha or inducible t-cell costimulatory ligand. Translational Vision Science & Technology. 8 (5), 11 (2019).
- Mattapallil, M. J., et al. Characterization of a New epitope of IRBP that induces moderate to severe uveoretinitis in mice with H-2b haplotype. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5439-5449 (2015).
- Silver, P. B., Chan, C. C., Wiggert, B., Caspi, R. R. The requirement for pertussis to induce EAU is strain-dependent: B10.RIII, but not B10.A mice, develop EAU and Th1 responses to IRBP without pertussis treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2898-2905 (1999).
- Li, Q., Peng, B., Whitcup, S. M., Jang, S. U., Chan, C. C. Endotoxin induced uveitis in the mouse: susceptibility and genetic control. Experimental Eye Research. 61 (5), 629-632 (1995).
- Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C.
- Lau, P. E., Jenkins, K. S., Layton, C. J. Current evidence for the prevention of endophthalmitis in anti-VEGF intravitreal injections. Journal of Ophthalmology. 2018, 8567912 (2018).
- Nche, E. N., Amer, R.
- Chu, C. J., et al. Assessment and in vivo scoring of murine experimental autoimmune uveoretinitis using optical coherence tomography. PLoS ONE. 8 (5), 63002 (2013).
- Harimoto, K., Ito, M., Karasawa, Y., Sakurai, Y., Takeuchi, M. Evaluation of mouse experimental autoimmune uveoretinitis by spectral domain optical coherence tomography. The British Journal of Ophthalmology. 98 (6), 808-812 (2014).
- Li, Y., Lowder, C., Zhang, X., Huang, D. Anterior chamber cell grading by optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 258-265 (2013).
- Bell, O. H., et al. Single eye mRNA-seq reveals normalisation of the retinal microglial transcriptome following acute inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3033 (2019).
- Lipski, D. A., et al. Retinal endothelial cell phenotypic modifications during experimental autoimmune uveitis: a transcriptomic approach. BMC Ophthalmology. 20 (1), 106 (2020).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent Models of Experimental Autoimmune Uveitis. Autoimmunity. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Perl, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 443-469 (2012).
