Summary
Denna rapport beskriver metoderna för att generera en modell av temporallobsepilepsi baserad på elektrisk tändning av transgena VGAT-Cre-möss. Upptända VGAT-Cre-möss kan vara användbara för att bestämma vad som orsakar epilepsi och för screening av nya terapier.
Abstract
Det upptäcktes att elektrisk tändning av VGAT-Cre-möss ledde till spontana motoriska och elektrografiska anfall. En nyligen publicerad artikel fokuserade på hur unika VGAT-Cre-möss användes för att utveckla spontana återkommande anfall (SRS) efter tändning och en sannolik mekanism - införande av Cre i VGAT-genen - störde dess uttryck och minskade GABAergic ton. Den aktuella studien utvidgar dessa observationer till en större kohort av möss, med fokus på nyckelfrågor som hur länge SRS fortsätter efter tändning och effekten av djurets kön och ålder. Denna rapport beskriver protokollen för följande viktiga steg: göra headset med hippocampus djupelektroder för elektrisk stimulering och för läsning av elektroencefalogrammet; kirurgi för att fästa headsetet säkert på musens skalle så att det inte faller av; och viktiga detaljer i det elektriska tändningsprotokollet, såsom pulsens varaktighet, tågets frekvens, tågets varaktighet och mängden ström som injiceras. Tändningsprotokollet är robust genom att det på ett tillförlitligt sätt leder till epilepsi hos de flesta VGAT-Cre-möss, vilket ger en ny modell för att testa för nya antiepileptogena läkemedel.
Introduction
Epilepsi är en allvarlig neurologisk sjukdom med betydande ekonomiska och mänskliga bördor. NINDS uppskattar att det finns 3 miljoner amerikaner med epilepsi. Cirka 0,6 miljoner av dessa patienter har tinninglobsepilepsi (TLE)1. Tyvärr misslyckas medicinsk behandling av TLE hos en tredjedel av patienterna på grund av ineffektivitet, utveckling av läkemedelsresistens eller intolerans mot biverkningar2. Det är uppenbart att det finns ett betydande behov av att utveckla nya terapier för TLE, en slutsats som delas av American Epilepsy Society Basic Science Committee, International League Against Epilepsy Working Group for Preclinical Epilepsy Drug Discovery och National Advisory Neurological Disorders and Stroke Council 3,4.
Nuvarande djurmodeller av temporallobepilepsi använder antingen kemokonvulsiva medel (t.ex. kainat, pilokarpin) eller långvarig elektrisk stimulering för att inducera en långvarig status epilepticus 5,6,7. Många djur dör under proceduren (10% -30% hos råttor, upp till 90% hos möss8). Djur som överlever och utvecklar epilepsi visar omfattande neuronal död i hela hjärnan 9,10. Denna död utlöser en kaskad av svar, som börjar med aktivering av mikroglia, astrocyter och infiltrerande monocyter. Neuronala svar inkluderar kretsomorganisation (t.ex. mossig fiberspiring), födelse av nya neuroner som inte integreras ordentligt i kretsar (t.ex. ektopiska granulaceller) och inneboende förändringar som leder till hyperexcitabilitet (t.ex. uppreglering av Na + -kanaler). En epilepsimodell utan signifikant neuronal död kommer att underlätta sökandet efter nya antiepileptika.
När man testade GABA-hypotesen om epilepsi upptäcktes att behandling av VGAT-Cre-möss med ett milt elektriskt tändningsprotokoll ledde till spontana motoriska och elektrografiska anfall11. I allmänhet leder den elektriska tändningen av gnagare inte till spontana anfall som definierar epilepsi, även om det kan, i fall av övertändning11. VGAT-Cre-möss uttrycker Cre-rekombinas under kontroll av vesikulär GABA-transportörgen (VGAT), som uttrycks specifikt i GABAerga hämmande neuroner. Det visade sig att införandet av Cre störde uttrycket av VGAT vid mRNA- och proteinnivåerna, vilket försämrade GABAergisk synaptisk överföring i hippocampus. Man drog slutsatsen att tända VGAT-Cre-möss kan vara användbara för att studera mekanismerna som är involverade i epileptogenes och för screening av nya terapier11. I denna rapport beskrivs de metoder som används för att generera modellen i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djuranvändning följde ARRIVE12-riktlinjerna och godkändes av djurvårds- och användningskommittén vid University of Virginia.
1. Tillverkning av headset med två bipolära elektroder (figur 1)
Bild 1: Viktiga steg i EEG-headsettillverkning. (A) Elektrodernas utseende vid de olika stegen i protokollet (siffror i vänster matchningssteg). (B) En bild av slutprodukten monterad i en hemmagjord hållare som passar den stereotaxiska ramen. Observera att hållaren slutar med en kragestift som passar in i headsetpiedestalen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Skär 3,5 cm rostfri ståltråd av rostfritt polytetrafluoretylen.
- Ta bort ca 1 mm av isoleringsbeläggningen från tråden i båda ändarna. Ha inte för mycket av tråden avskalad.
- Sätt två stift på en skruvstångshållare med den nedre delen av stiftet som har en längre slits nedåt.
- Applicera flussmedel på trådens avskalade ändar och på stiftens toppar.
- Tenn den avskalade delen av tråden med precis tillräckligt med löd för att belägga den.
- Lägg till en minimal mängd löd på toppen av stiftet utan att överflöda på sidorna.
- Placera ena änden av trådens avskalade ändar i stiftet så djupt som det tillåter medan lodet smälts.
OBS: Det finns ett sidohål där tråden kan komma ut - låt inte tråden komma ut ur stiftet. All strippad tråd måste stanna inom stiftet. - Upprepa steg 1.6-1.7 för den andra stiftet, nu med de andra avskalade ändarna av tråden.
- Låt stiften sitta i 30 sekunder för att stelna, ta bort dem från skruvstångshållaren och dra sedan i dem för att se till att anslutningen mellan tråden och stiften är stark och håller.
- Skölj stiften i kallt vatten och torka sedan.
- Kontrollera konduktansen mellan stift 1 och stift 2 med hjälp av en ohmmeter.
- För ihop stiften i trådens ändar; Håll dem parallella och nära. Kläm fast en hemostat i mitten av tråden. Rotera sedan hemostaten så att tråden vrider sig ganska hårt. Ta bort hemostaten.
- Kläm fast en pincett på den tvinnade tråden 2 mm under stiften och böj tråden i 90°.
- Tryck samma tråd igen 90 ° tillbaka över pincetten och skapa ytterligare en böjning 1 mm från den första.
- Klipp den tvinnade tråden i 45° vinkel under böjen vid 3,5 mm med en liten vass sax.
- Förbered två av dessa bipolära (dubbelstifts vridna) elektroder för varje headset (valfritt, andra är back-up vid elektriska problem med den första).
- Förbered en enda referenselektrod genom att klippa en tråd med stift lödda i båda ändarna i två (steg 1.1-1.17, figur 1A).
- Klipp tråden på 7 mm.
- Böj änden 1 mm under spetsen.
- Täck sedan den böjda 1 mm spetsen på tråden med pincett och rotera tråden tätt runt pincetten för att skapa en liten ögla (1 mm i diameter).
- Böj öglan vinkelrätt mot den raka delen av tråden så att trådspetsen pekar utåt igen.
- Montera de två bipolära elektroderna och den enda referenselektroden i den sexpoliga piedestalen på ett sådant sätt att de bipolära elektroderna är sida vid sida med 6 mm avstånd mellan dem och att referenselektroden placeras i det mellersta yttre hålet (figur 1B).
OBS: En alternativ metod är att implantera elektroderna, cementera dem på plats och sedan sätta in stiften i piedestalen.
2. Stereotaxisk elektrodimplantation
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg och den sexpoliga elektrodenheten genom autoklavering före operationen. Ett sterilt kirurgiskt fält måste upprätthållas under operationen och sterila kirurgiska handskar måste användas. Sterila draperier (t.ex. Press n' Seal) rekommenderas för att täcka djuret utom operationsområdet.
- Använd 8 veckor gamla VGAT-Cre-möss (åldersmatchade, både manliga och kvinnliga) för operationer 4 veckor efter avvänjning. Registrera djurets vikt före operationen för att möjliggöra mätning av postoperativ viktminskning.
- Använd en certifierad isofluranförångare eller ett lågflödesanestesisystem utrustat med en precisionssprutpump, integrerad digital vaporizer och återkopplingsvärmedyna.
OBS: Lågflödessystem kan leverera anestesi vid låga flödeshastigheter i proportion till djurets storlek in i antingen en induktionskammare eller genom en noskon på den stereotaktiska ramen (70 ml / min, isoflurankoncentrationen i luft är 4% för induktion och 2% för kirurgi). Att använda mindre bedövning gynnar inte bara djuret under operationer utan minskar också risken för laboratoriepersonalens exponering för isofluran. - Placera det sövda djuret på en uppvärmd dyna uppvärmd till 37 °C för att hålla det varmt under operationen. Om du använder ett återkopplingsstyrt temperatursystem, sätt in den lätt smorda temperatursonden i djurets rektum för temperaturövervakning under operationen.
- Montera djuret på den stereotaxiska ramen genom att försiktigt placera öronstänger i öronen och de främre övre tänderna i snittstången. Placera näskonen över näsan för korrekt anestesileverans. Se till att huvudet är plant och centrerat och inte kan flyttas när det är något undersökt.
- Injicera subkutant 0,5 ml normosol för hydrering.
- Applicera okulärt smörjmedel för att förhindra torkning av hornhinnan.
- Övervaka anestesidjupet genom frånvaro av abstinensreflexen efter att ha klämt en bakbenstomme och minska sedan isofluran till 1,5% -2,0% under operationen.
- Ta bort hår vid och runt det kirurgiska området genom att plocka eller använda klippare (rakning) eller hårborttagningskräm och desinficera huden med tre cykler av alternerande applicering av jod och etanol, avsluta med jod. Att ta bort hår från operationsområdet rekommenderas endast om det finns medel för att upprätthålla anestesi på den platsen. Använd vid behov alkoholdoppade bomullsspetsapplikatorer för att ta bort hår från det omedelbara området som omger huvudet. Injicera 0,05 ml av det lokala smärtstillande bupivakainet (0,25%) subkutant.
- Gör ett snitt på skallen med en skalpell och skär sedan ut en del av huden med skarpa kirurgiska saxar och exponera skallen. Tryck huden åt sidan, med hjälp av en bomullspinne, rengör skallen från alla muskler och underliggande vävnader som hindrar utsikten.
OBS: För att stoppa oavsiktlig blödning, tryck över blödningsstället med en steril bomullspinne tills den stannar. - Rengör skallen med väteperoxid med sterila bomullspinnar för att göra skallsuturerna och både bregma och lambda synliga.
- Torka skallen noggrant och applicera sedan en droppe självetsande tandlim med applikatorn. Borsta in den i skallen, vänta 60 sekunder och härda med ett tandUV-ljus i 40 sekunder. En blank yta indikerar att limet effektivt har tvärbundits med skallen.
Det här steget är viktigt för säker fastsättning av headsetet. - Använd en 0,031" borr (0,79 mm) för att borra två borrhål bilateralt för implantation av hippocampus djupelektroder (cirka 5 000 rpm). Borra ett extra gradhål för referenselektroden ovanför lillhjärnan bakom lambdan.
OBS: När du borrar, var noga med att sänka borren långsamt och undvik att borra i hjärnan. - Koordinaterna för elektroderna är följande (från bregma i mm): hippocampus elektroder vid 3 mm bakre, 3 mm laterala och 3 mm djup; och cerebellär referenselektrod vid 6 mm bakre, 0 mm lateralt och 0 mm djup (subdural).
- För att öka noggrannheten, använd en stereotaxiskt monterad borr, nollställ den stereotaktiska manipulatorns X / Y-axel när du rör bregma - detta är referenspunkten för koordinaterna.
- Montera ett headset genom att sätta in alla elektroder i den sexstifts piedestalen och se till att stiften skjuts hela vägen in i piedestalen. Montera piedestalen i elektrodhållaren på en stereotaxisk ram (figur 1B).
- Rikta in elektroderna ovanför motsvarande borrhål. Stereotaxiskt implantera tvinnade bipolära trådelektroder av rostfritt stål i höger och vänster hippocampus och referenselektrod i lillhjärnan genom att långsamt sänka headsetet och styra elektroderna in i borrhålen.
- När hippocampus vridelektroden är precis ovanför hålet, noll Z-axeln och sänk långsamt till -3,0 mm.
- Täck skallytan och elektroderna med tandcement och fyll i utrymmet mellan skalleytan och botten av piedestalen. Hudkanterna kommer att ligga intill tandcementet så att ingen underliggande vävnad förblir exponerad. Vänta tills cementet torkar och härdar. Lossa sedan elektrodhållaren från den stereotaxiska armen och ta bort hållaren från piedestalen.
- Injicera 0,1 ml ketoprofen (1 mg / ml, SC) för analgesi och en andra dos av 0,5 ml normosol (SC) för hydrering och ta bort djuret från den stereotaxiska ramen.
- Placera en isotermisk dyna som förvärmts till 37 °C i en tom vivariumbur täckt med en pappershandduk. När det är helt vaken, placera djuret i en ren bur med sängkläder och mjuk mat och återför den till vivarium. Djur hålls ensamma från och med nu för att förhindra tuggning på varandras headset. Trådstångstrattar används inte för att undvika att headset fastnar, och istället är vattenflaskor bundna till undersidan av burtopparna och chow finns i sängkläderna.
- Mata djuret lite mjuk mat i 72 timmar efter operationen och övervaka för viktminskning och kroppskondition. Dehydrerade djur kan administreras 0,5 ml normosol subkutant om de är dehydrerade (viktminskning, ökad hudturgor, insjunkna ögon). Ketoprofen kan ges subkutant en gång dagligen i ytterligare 2 dagar efter operationen (följ analgesiregimen enligt de lokala IACUC-riktlinjerna). Låt djuren återhämta sig helt i sina burar i 4-7 dagar innan de överförs till EEG-registreringssystemet.
3. Elektriskt tändningsprotokoll
- Anslut mössen till EEG-inspelningssystemet med en flexibel kabel som passar uttagen på mushuvudet och kommutatorn (se listan över material ). Låt djuren acklimatisera sig i en dag innan du fortsätter med protokollet för elektrisk stimulering nedan. Övervaka deras allmänna hälsa och acklimatisering dagligen och ta bort dem från systemet när det finns tecken på sjukdom, nöd och / eller kontinuerlig viktminskning som överstiger 25%
- Anslut båda ledningarna från den stimulerande elektroden till utgången från en konstant strömstimulator.
OBS: Det är till stor hjälp att ha ett kretskort som växlar dessa elektroder bort från EEG-inspelaren och till stimulatorn. - Ställ in stimulatorn så att den levererar 1 ms pulser vid 50 Hz under en tågtid på 2 s.
- Ställ in stimulatorns utgång på 20 mikroampere (μA) och leverera 1:a pulsen.
- Övervaka EEG för en karakteristisk efterurladdning av högfrekventa spikar som överlever den elektriska stimuleringspulsen.
- Om ingen urladdning observeras, öka sedan mängden ström som injiceras i steg om 20 μA tills en efterurladdning utlöses. Mängden ström som krävs är tröskelvärdet för efter urladdning (ADT).
- Typiska ADT är 20-50 μA. Om ingen urladdning observeras även efter ökning till 200 μA krävs felsökning av elektriska anslutningar och headsetledningar med en högkänslig ohmmeter. Om problemet ligger i den stimulerande elektroden, försök sedan stimulera med de andra djupelektroderna.
- Djur tänds genom att stimulera antingen 2x eller 6x per dag med en ström som är 1,5x ADT-värdet för den musen.
- Övervaka beteendesvaret på stimuleringen, som stiger från tillståndsförändringen till bilaterala tonisk-kloniska anfall med fallande. Poäng med hjälp av ett modifierat Racine-klasssystem11. För att undvika framkallade dödliga toniska anfall bör tändningen pausas om successiva stimuli leder till eskalerande svårighetsgrad och längd av anfall upp till modifierad Racine poäng 6 (löpning och hoppning)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Djur
Modellen utvecklades ursprungligen med VGAT-Cre-möss (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)13 på en blandad bakgrund. Det har emellertid också tillämpats på VGAT-Cre-stammen som är kongenisk med C57BL / 6J. Ingen skillnad har observerats i epilepsi som utvecklas mellan stammarna. Båda stammarna uttrycker Cre-rekombinas under kontroll av den vesikulära GABA-transportörpromotorn. Dessa möss genererades genom att knacka i en IRES-Cre-kassett efter stoppkodonet i Vgat-genen . Dessa möss föder upp normalt, så de hålls som homozygoter. För att förhindra genetisk drift av kolonin, köp uppfödare och använd endast F1-generationsmöss för experiment. Alla möss var inrymda i ett AAALAC-ackrediterat vivarium. Möss fick fri tillgång till mat och vatten, 12 timmars ljusa/mörka cykler och en berikad miljö. För elektroencefalografisk (EEG) inspelning var möss individuellt inrymda i klara plastburar (hemlagad), vilket möjliggjorde samtidig videoövervakning. Använd både manliga och kvinnliga möss för experiment. Ingen skillnad i tändfrekvens eller anfallsfrekvens har observerats mellan könen. Majoriteten av dessa studier använde 8 veckor gamla möss vid tidpunkten för headsetkirurgi. Men man kan också använda möss som är mellan 4-20 veckor gamla. Vid 4 veckor är musskallen ~ 90% av sin slutliga storlek14, så att fästa ett headset har minimal effekt på tillväxten. Tiden mellan operationen och påbörjandet av tändprotokollet är inte kritisk, även om möss måste observeras noggrant under återhämtning från operationen i 72 timmar.
Tändning parametrar
Det elektriska stimuleringsprotokollet utvecklades av Lothman och medarbetare och beskrivs i detalj i deras 1989-papper15. I korthet är hippocampuselektroden ansluten till en konstant strömstimulator och en 1 ms bifasisk fyrkantvågspuls levereras vid 50 Hz över 2 s. Olika parametrar i tändningsprotokollet har testats16. Använd en strömintensitet som är 1,5 gånger den minsta mängd ström som krävs för att utlösa ett elektrografiskt anfall för den musen (tröskelvärde efter urladdning, ADT). Möss stimuleras elektriskt två gånger om dagen varannan dag (2x, mitt på morgonen och tidigt på eftermiddagen). Figur 2A visar en översikt över tändningsprotokollet och nyckelbeslagsegenskaperna. Men ett snabbtändningsprotokoll är också effektivt, här stimuleras möss sex gånger om dagen som levereras varannan dag (6x, en timme mellan stimuleringarna). Intressant nog är tändningshastigheterna liknande mellan 2x och 6x protokoll när det gäller antalet stimuleringar som krävs för att uppnå det tända tillståndet (Figur 2B: 2x, 15 ± 1, n = 46; 6x, 13 ± 1, n = 12, medelvärde ± SEM, P = 0,3). Mössen anses vara helt tända när totalt fem stimuleringar framkallar tonisk-kloniska anfall med förlust av postural kontroll, vilket är en beteendepoäng på 5 på en modifierad Racine-skala17. Tändning utöver denna nivå, så kallad övertändning, kan utföras men medför risk för ett dödligt toniskt anfall eller SUDEP18. Dödligheten i detta VGAT-Cre-protokoll är ~ 13% (15 av 119 möss); Detta inkluderar möss av båda könen som dog efter antingen framkallade eller spontana anfall (8 män, 7 kvinnor).
Beslag egenskaper
Registreringssystemet som användes i dessa studier har upphört. Alternativa leverantörer av EEG-inspelningsuppsättningar som används vid University of Virginia Rodent Epilepsy Monitoring Unit finns i materialtabellen. Figur 2A visar en översikt över tändningsprotokollet och nyckelbeslagsegenskaperna.
Figur 2: Anfallsegenskaper hos tända VGAT-Cre-möss. (A) Schematiskt diagram över tidsförloppet för ett experiment. (B) Fördelningen av antalet elektriska stimuleringar som krävs för att nå det helt tända tillståndet. Det tända tillståndet uppnås när stimuleringar framkallar fem bilaterala tonisk-kloniska motoriska anfall. (C) Fördelningen av latens till första spontana anfall efter den sista elektriska stimuleringen. D) Fördelningen av observerade anfallsfrekvenser, som beräknas som det totala antalet anfall dividerat med antalet registrerade dagar. (E) Fördelningen av hur länge möss var epileptiska enligt definitionen av spontana anfall som inträffade med ett anfallsintervall mellan anfall under 5 dagar. Alla grafer använder fioldiagram där medianen visas med en mörk linje och 25: e och 75: e kvartiler visas med ljusa linjer. Antalet djur i varje område visas på X-axeln. Klicka här för att se en större version av denna figur.
VGAT-Cre-möss når vanligtvis kriteriet för tänd tillstånd efter 15 stimuleringar (poolade 2x och 6x protokoll, medelvärde ± SD på 7,4 stimuleringar, figur 2B). Som framgår av fioldiagrammet i data kräver många djur färre stimuleringar (10) och många kräver mer (18). Det har inte varit möjligt att hitta en faktor som bestämmer skillnaden, exklusive kön, ålder, ADT-värde eller elektrodplacering. Inom några veckor efter att de tänds utvecklar de flesta möss flera spontana anfall (90%), vilket definierar epilepsi. Latensen till spontana återkommande anfall (SRS) är 10,7 ± 6,3 dagar (figur 2C). En bråkdel av mössen utvecklar SRS innan de når det tända tillståndet. Som tidigare nämnts11 är VGAT-Cre-möss inte spontant epileptiska och kräver elektrisk stimulering för att utveckla epilepsi. När anfallen börjar uppträder de med en frekvens av 1,3 ± 0,6 anfall per dag (figur 2D). Alla elektrografiska anfall åtföljs av tonisk-kloniska motoranfall. De initiala studierna var kortvariga (spontan anfallsfrekvens mätt 1-2 veckor), men när registreringsperioden förlängdes upptäcktes att anfallsfrekvensen minskade med tiden. Med hjälp av en godtycklig cut-off på 5 på varandra följande dagar utan anfall uppträder tillförlitliga anfall i 23 ± 11 dagar. Sammantaget definierar detta den period som tända VGAT-Cre-möss är användbara för drogscreeningkampanjer. Effektanalys med hjälp av dessa SD och en effektstorlek på 50% reduktion visar att 16 möss per grupp krävs för statistiskt signifikanta effekter på stimulering till tändning, anfallsfrekvens och epilepsivaraktighet.
En egenskap hos den tända VGAT-Cre-modellen som skiljer den från epilepticusmodeller efter status är frånvaron av neuronal död. Detta analyserades med hjälp av två accepterade metoder (figur 3): en, genom att räkna kärnor i CA1-skiktet färgat med anti-NeuN-antikropp; och två, genom att mäta mängden fluor-Jade C-färgning i hippocampus delfält som är sårbara för kemokonvulsivt inducerad celldöd (dentat, CA1 och entorhinal cortex).
Figur 3: Neuronal död som analyseras genom antingen anti-NeuN-färgning eller fluor-Jade C-färgning . (A) Diagram över anti-NeuN-positiva neuroner i olika delfält av hippocampus och entorhinal cortex. Förkortningar är följande: DGC, dentat granulat cellskikt; hilus hänvisar till dentate hilus, CA1, cornus ammonis pyramidala lager I; och EC, entorhinal cortex; L2, skikt 2; och L3, lager 3. Två horisontella hjärnskivor motsvarande -4 mm under bregma färgades från varje djur (kontrollnaiva möss, n = 7; epileptiska VGAT-Cre, n = 13; se Straub et al. för detaljer11). Data normaliserades till genomsnittliga neuronala räkningar bestämda hos naiva VGAT-Cre-möss i respektive underfält. Bilder av Fluoro-Jade C-färgning från en epileptisk VGAT-Cre-mus (B) och från en poststatusråtta (C) (Li/pilokarpinmodell, se Dey et al. för detaljer och analys10). Analys av Fluoro-Jade C-färgning av VGAT-Cre-möss presenterades i Straub et al.11). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna rapport beskriver ett protokoll där elektrisk tändning av möss leder till epilepsi. Eftersom den stimulerande elektroden placeras i hippocampus är detta en fokal limbisk epilepsi som modellerar temporallobepilepsi (TLE) hos patienter. Ett kritiskt steg i detta protokoll är att använda VGAT-Cre-möss, som på grund av införandet av en IRES-Cre-rekombinaskassett i Vgat-genen visar försämrade hämmande GABA-strömmar11. C57BL/6 utvecklar inte epilepsi efter tändning med detta protokoll, även om det är möjligt att andra musstammar kommer att göra det.
Protokollet utvecklades med hjälp av placering av de stimulerande djupelektroderna i hippocampus. Koordinaterna försåg målet med perforantbaneprojektionerna från entorhinal cortex när de kommer in i CA1-underfältet. Det elektriska fältet som induceras av elektrisk stimulering har inte definierats, därför är elektrodernas exakta placering inte kritisk. Faktum är att gnagare kan tändas elektriskt var som helst i den limbiska kretsen, t.ex. amygdala och piriform cortex19. Följande är kritiska steg i protokollet: en, korrekt lödning av EEG-headseten för att säkerställa låg resistans mot stimuleringsströmmen; två, med hjälp av ett tandlim som används i tandkliniker för att binda till skallen och ge en yta för vidhäftning av tandcementet; och tre, användningen av en konstant strömförstärkare för att leverera de beskrivna elektriska pulserna.
Felsökning är vanligtvis begränsad till att kontrollera elektriska anslutningar, som inkluderar anslutningarna i headsetet, headsetet till kabeln, kabeln till kommutatorn och kommutatorn till inspelningsenheten. Att använda en ohmmeter med hög känslighet är kritisk.
Begränsningar av tekniken inkluderar kravet på lämplig expertis och utrustning för att utföra operationerna och registrera EEG.
En fördel med modellen jämfört med befintliga djurmodeller av TLE är att det finns minimal död av neuroner11. De andra TLE-modellerna är epilepticusmodeller efter status, som utlöser omfattande neuronal död10. Denna död leder till omfattande aktivering av mikroglia, astrocyter och infiltration av cirkulerande monocyter. Sammantaget blir det svårt att skilja mekanismer som orsakar epilepsi från mekanismer som utlöses av långvarig status epilepticus. Det förväntas att tända VGAT-Cre-möss kommer att vara användbara för att utveckla nya terapier som är både anti-anfall och anti-epileptiska. Denna rapport ger nyckeltal och kraftanalys som kan vägleda framtida läkemedelsutvecklingsinsatser med hjälp av dessa möss.
En annan fördel med den tända VGAT-Cre-modellen är den höga andelen djur som utvecklar epilepsi (90%) och regelbundenheten hos de spontana anfallen. Nackdelar med modellen är en relativt låg anfallsfrekvens (1,5/dag) och att anfallsfrekvensen avtar efter 3 veckor, och i vissa fall verkar anfallen upphöra. Ansträngningar pågår för att ta itu med dessa frågor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar John Williamson för hjälpsamma diskussioner om detta protokoll. Detta arbete stöddes av NIH / NINDS bidrag NS112549.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM - 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
- Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014. Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).
- Hauser, W. A., Hesdorffer, D. C. Epilepsy: Frequency, Causes, and Consequences. Epilepsy Foundation of America. , (1990).
- Galanopoulou, A. S., et al. Identification of new epilepsy treatments: issues in preclinical methodology. Epilepsia. 53 (3), 571-582 (2012).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Buckmaster, P. S. Laboratory animal models of temporal lobe epilepsy. Comparative Medicine. 54 (5), 473-485 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 45-52 (2016).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Dey, D., et al. A potassium leak channel silences hyperactive neurons and ameliorates status epilepticus. Epilepsia. 55 (2), 203-213 (2014).
- Straub, J., et al. Characterization of kindled VGAT-Cre mice as a new animal model of temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 61 (10), 11 (2020).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Vong, L., et al. Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons. Neuron. 71 (1), 142-154 (2011).
- Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, (2016).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Bekenstein, J. W., Perlin, J. B. Self-sustaining limbic status epilepticus induced by 'continuous' hippocampal stimulation: electrographic and behavioral characteristics. Epilepsy Research. 3 (2), 107-119 (1989).
- Lothman, E. W., Williamson, J. M. Influence of electrical stimulus parameters on afterdischarge thresholds in the rat hippocampus. Epilepsy Research. 13 (3), 205-213 (1992).
- Lewczuk, E., et al. Electroencephalography and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2018).
- Wenker, I. C., et al. Postictal death is associated with tonic phase apnea in a mouse model of sudden unexpected death in epilepsy. Annals of Neurology. 89 (5), 1023-1035 (2021).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).
