Summary
Der Zebrafisch ist ein wichtiges Modell für das Verständnis der Nierenentwicklung. Hier wird ein In-situ-Hybridisierungsprotokoll optimiert, um die Genexpression in Zebrafischlarven und Juvenilen während der Mesonephrosentwicklung nachzuweisen.
Abstract
Der Zebrafisch bildet in seinem Leben zwei Nierenstrukturen. Der Pronephros (embryonale Niere) bildet sich während der Embryonalentwicklung und beginnt 2 Tage nach der Befruchtung zu funktionieren. Der pronephros besteht aus nur zwei Nephronen und dient während des Larvenlebens als einzige Niere, bis aufgrund der zunehmenden Körpermasse mehr Nierenfunktion erforderlich ist. Um diesem höheren Bedarf gerecht zu werden, beginnt sich während der Metamorphose der Mesonephros (erwachsene Niere) zu bilden. Die neuen primären Nephrone verschmelzen mit dem Pronephros und bilden verbundene Lumen. Dann verschmelzen sekundäre Nephrone mit primären (und so weiter), um ein verzweigtes Netzwerk im Mesonephros zu schaffen. Die überwiegende Mehrheit der Forschung konzentriert sich auf den Pronephros aufgrund der Leichtigkeit der Verwendung von Embryonen. Daher besteht die Notwendigkeit, Techniken zu entwickeln, um ältere und größere Larven und Jungfische zu untersuchen, um die Entwicklung von Mesonephrosen besser zu verstehen. Hier ist ein In-situ-Hybridisierungsprotokoll für die Genexpressionsanalyse für die Penetration von Sonden, das Waschen von Sonden und Antikörpern und das Bleichen von Pigmenten optimiert, um die Mesonephrose besser sichtbar zu machen. Die transgene Linie Tg(lhx1a-EGFP) wird verwendet, um Vorläuferzellen und die distalen Tubuli von naszierenden Nephronen zu markieren. Dieses Protokoll füllt eine Lücke in der Mesonephrosforschung. Es ist ein entscheidendes Modell, um zu verstehen, wie sich neues Nierengewebe bildet und in bestehende Nephrone integriert und Einblicke in regenerative Therapien gibt.
Introduction
Der Zebrafisch-Embryo ist aufgrund seiner geringen Größe, Transparenz, verfügbaren Werkzeuge und seines Überlebens ohne Fütterung für bis zu fünf Tage ein wichtiges Modell für die Untersuchung der Gewebeentwicklung1,2. Es hat wesentlich zum Verständnis der Nierenentwicklung und des Schutzes zwischen Zebrafischen und Säugetieren beigetragen3,4,5. Die Niere spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Flüssigkeitshomöostase, der Filterung des Blutes und der Ausscheidung von Abfällen6. Das Nephron, die funktionelle Einheit der Niere, besteht aus einem Blutfilter, der mit einem langen Tubulus verbunden ist. Im Zebrafisch bilden sich während seines gesamten Lebens zwei Nierenstrukturen. Der Pronephros (die temporäre embryonale Niere) bildet sich zuerst während der frühen Entwicklung. Es besteht aus zwei Nephronen, die entlang der anterior-posterioren Achse verlaufen und wird etwa 2 Tage nach der Befruchtung funktionsfähig (dpf). Der Nutzen des Pronephros liegt in seiner Einfachheit, da er nur zwei Nephrone hat, die meist linear und leicht zu visualisieren sind (obwohl sich der proximale gewundene Tubulus bei drei dpf zu winden beginnt)3. Dies hat nicht nur Studien seiner frühen Entwicklung aus dem intermediären Mesoderm ermöglicht, sondern auch das Segmentierungsmuster und die Tubulireparatur7,8.
Die Nützlichkeit von Zebrafischen wird nach fünf dpf begrenzt, wenn das Eigelb vermindert ist und die Larven auf die Fütterung im aquatischen System angewiesen sind9. Im Alter von etwa 2 Wochen durchlaufen die Larven eine Metamorphose zu Juvenilen, bei denen sich neues Gewebe bildet und alte Gewebe verloren gehen und / oder reorganisiert werden9. Dies ist auch der Zeitpunkt, an dem sich der Mesonephros (die permanente erwachsene Niere) bildet10,11,12. Das erste erwachsene Nephron bildet sich in der Nähe des sechsten Somites und verschmilzt mit dem distalen frühen Tubulus des Pronephros. Zusätzliche Nephrone werden zunächst posterior zu dieser Position hinzugefügt, später aber auch nach vorne. Die primären Nephrone in dieser ersten Welle verschmelzen mit den Tubuli des Pronephros und teilen sich ein gemeinsames Lumen, um ihren Abfall zu deponieren. Sekundäre Nephrone bilden sich in der nächsten Welle und verschmelzen zu primären Nephronen. Dieser wiederholte Prozess erzeugt einen Mesonephros, der verzweigt ist, ähnlich wie die Säugetierniere. Vermutlich verliert der Pronephros schließlich seine Tubulusidentität und wird zu zwei großen Sammelkanälen, in denen alle Nephrone ihren Abfall ablassen13.
Vor der Bildung des ersten adulten Nephrons beginnen einzelne Vorläuferzellen in ~ 4 mm (Gesamtlänge) Larven (~ 10 dpf) zu erscheinen. Diese Zellen, die in der transgenen Linie Tg(lhx1a-EGFP) markiert sind, haften am Pronephros und scheinen an zukünftige Stellen der Nephrogenese zu wandern. Die einzelnen Zellen verschmelzen zu Clustern, die sich zu neuen Nephronen differenzieren12. Es ist unklar, wo sich diese Zellen befinden oder welche Gene sie vor Beginn der Mesonephrogenese exprimieren.
Das Verständnis der Mesonephrosentwicklung liefert Einblicke in die Säugetierniere auf eine Weise, die der Pronephros nicht kann. Dazu gehören die Bildung nephrogener Aggregate aus einzelnen Vorläuferzellen, die funktionelle Integration neuer Nephrone mit bestehenden und die verzweigte Morphogenese. Es gibt jedoch Einschränkungen bei der Untersuchung der postembryonalen Entwicklung. Die Larven sind aufgrund ihrer größeren Größe und Pigmentierung weniger transparent. Die Entwicklungszeit ist zwischen den einzelnen Tieren nicht synchron und hängt stark von Umweltfaktoren wie Fütterung und Gedränge ab9,14. Obwohl Knockdown-Reagenzien existieren, sind sie bei Larven im Vergleich zu Embryonen weniger wirksam15. In diesem Protokoll wird eine In-situ-Hybridisierungsmethode zur Bestimmung der Genexpression während der Entwicklung von Zebrafisch-Mesonephrosen beschrieben. Mehrere Schritte werden optimiert, um die Visualisierung des Mesonephros und das Eindringen und Waschen der Sonde und des Antikörpers zu verbessern. Die transgene Linie Tg (lhx1a-EGFP) wird zusammen mit einer Sonde für EGFP verwendet, um einzelne Vorläuferzellen, nephrogene Aggregate und die distalen Tubuli von entstehenden Nephronen zu markieren. Diese Methode wird ein tieferes Verständnis der Mesonephrosentwicklung und Einblicke in regenerative Therapien ermöglichen.
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Protocol
Die Verwendung von Zebrafischlarven und Jungfischen ist von der IUP IACUC genehmigt (Protokoll #02-1920, #08-1920). Details zum Lösungsinhalt sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Aufzucht von Larven
HINWEIS: Es dauert bis zu 21 Tage oder länger, um Larven und Jungtiere in das Stadium des Interesses zu bringen.
- Richten Sie erwachsene Zebrafische ein, um sich zu paaren, indem Sie am späten Nachmittag nach ihrer letzten Mahlzeit 1 männlichen und 1 weiblichen Fisch in einem Paarungsbecken hinzufügen.
HINWEIS: Nicht alle Fischpaare paaren sich. Beginnen Sie mit der Einrichtung von 20 Paaren, um die Paarungsrate zu bestimmen und in zukünftigen Experimenten entsprechend anzupassen. - Am nächsten Tag, nachdem die Fische die Paarung beendet haben (gegen 13 Uhr), sammeln Sie die Embryonen mit E3-Medium in Petriplatten.
- Stellen Sie sicher, dass es nicht mehr als 30 Embryonen pro Platte gibt.
- Entfernen Sie Ablagerungen (z. B. Kot) von den Petriplatten und fügen Sie 20 ml E3-Medium hinzu.
- 1 Tag bei 28,5 °C inkubieren.
- Setzen Sie den erwachsenen Zebrafisch zurück in das aquatische System.
- Ersetzen Sie bei 1 dpf das E3-Medium durch ein frisches E3.
- Bei 28,5 °C für weitere 4 Tage bis 5 dpf inkubieren.
- Legen Sie ein 400 μm Sieb in einen 2,8 l Tank und füllen Sie es mit 2 cm Systemwasser.
- Fügen Sie die 5 dpf Larven von 1 Platte (bis zu 30 Larven insgesamt) hinzu.
- Stellen Sie den Tank in das Wassersystem, aber starten Sie nicht den Wasserfluss.
- Füttern Sie die Larven zweimal täglich mit 4 ml Pulverfutter bis 14 dpf.
- Bei 6 dpf starten Sie den Wasserfluss mit 1 Tropf pro Sekunde.
HINWEIS: Überprüfen Sie den Wasserdurchfluss täglich und passen Sie ihn entsprechend an. - Erhöhen Sie bei 8 dpf den Wasserfluss auf einen langsamen, stetigen Strom.
- Bei 14 dpf zusätzlich zum Pulverfutter lebende Salzgarnelen füttern.
2. Tag 1 - 2: Larven fixieren
- Entfernen Sie einen Larventank zum gewünschten Zeitpunkt.
- Füllen Sie eine Petriplatte mit 20 ml Systemwasser.
- Verwenden Sie ein feinmaschiges Netz, um die Larven vorsichtig zu schöpfen und an die Wasseroberfläche zu bringen.
- Schneiden Sie die Spitze einer Transferpipette ab, um eine breitere Öffnung zu erhalten, und übertragen Sie die Larven auf die Petriplatte. Der größere Pipettenmund ermöglicht den Transfer mehrerer kleiner Larven oder einiger größerer auf einmal.
- Fügen Sie 2 ml Tricain (2%, pH 7-Stamm) hinzu, um die Larven zu immobilisieren.
- Nachdem sich die Larven nicht mehr bewegen, entfernen Sie den größten Teil des Wassers und fügen Sie 10 ml Tricain hinzu. Warten Sie 15 Minuten, bis die Larven eingeschläfert sind.
- Optional: Bei Jungtieren, die länger als 8 mm sind, schneiden Sie die Köpfe und Schwänze mit einer Rasierklinge (nach der Euthanasie) unter einem Seziermikroskop ab, um das Eindringen der Fixierlösung zu verbessern. Stellen Sie sicher, dass Sie die Gesamtlänge jedes Tieres aufzeichnen, bevor Sie Kopf und Schwanz abschneiden und jedes in seiner eigenen Petriplatte isolieren. In Schritt 3 erfahren Sie, wie Sie die Tiere messen.
- Ersetzen Sie das Tricain durch 20 ml Fixierlösung (4% Paraformaldehyd, 1% DMSO). Setzen Sie den Deckel wieder auf die Petriplatte und schaukeln Sie langsam in einem Abzug.
HINWEIS: Es ist wichtig, eine Schaukelplattform zu verwenden. Eine Schüttelplattform mit einer kreisförmigen Bewegung bewirkt, dass die Tierachse gekrümmt wird. Verwenden Sie nur frische (nicht vorgefertigte gefrorene) Fixierlösung.
VORSICHT: Die Fixierlösung enthält Paraformaldehyd, das ein wahrscheinliches Karzinogen ist. Verwenden Sie Abzug (oder Maske) und Handschuhe, um das Pulver zu messen. - Ersetzen Sie nach 30 Minuten die Fixierlösung durch eine frische Fixierlösung.
- Sammeln Sie die gebrauchte Fixierlösung in einem separaten Abfallbehälter zur ordnungsgemäßen Entsorgung.
- Die Larven werden in ein 50-ml-Röhrchen mit 25 ml frischer Fixierlösung überführt.
- Stellen Sie sicher, dass die Kappe fest sitzt und schaukeln Sie 2 Tage lang langsam bei 4 ° C. Es ist möglich, aus Bequemlichkeit länger zu inkubieren.
3. Tag 3: Larven messen
- Ersetzen Sie in einem Abzug die Befestigungslösung durch 20 ml PBST.
- Übertragen Sie die Larven in eine Petriplatte.
- Legen Sie ein flaches Lineal auf ein Seziermikroskop und legen Sie die Petriplatte auf das Lineal.
- Verwenden Sie einen Wimpernmanipulator, um jede Larve auf das Lineal zu bewegen, um ihre Gesamtlänge (von der Schnauze bis zur Spitze der Schwanzflosse) zu messen (Abbildung 1).
- Kombinieren Sie mehrere Larven ähnlicher Länge (z. B. 5,0 mm und 5,1 mm) zu einem 5,5 ml großen Glasfläschchen, bis zu 10 Larven pro Durchstechflasche.
4. Tag 3 - 4: Austrocknung
- Ersetzen Sie das PBST durch 4 ml 100% Methanol. Die Durchstechflasche 5 Minuten bei Raumtemperatur schaukeln.
- Ersetzen Sie das Methanol durch frisches Methanol und Gestein für 5 min. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Lagern Sie die Durchstechflasche bei -20 °C für 2 Tage. Es ist möglich, aus Bequemlichkeit länger zu inkubieren.
5. Tag 5: Rehydratation
- Erwärmen Sie die Durchstechflasche auf Raumtemperatur.
- Ersetzen Sie das Methanol durch 4 ml 75% Methanol / 25% PBST. 5 min bei Raumtemperatur rocken.
- Ersetzen Sie die Lösung in Schritt 5.2 durch 4 ml 50% Methanol/50% PBST und Gestein für 5 min.
- Ersetzen Sie die Lösung in Schritt 5.3 durch 4 ml 25% Methanol/75% PBST und Gestein für 5 min.
- Ersetzen Sie die Lösung in Schritt 5.4 durch 4 ml PBST und Gestein für 10 min.
- Ersetzen Sie das PBST durch 4 ml frisches PBST und Gestein für 10 min. Wiederholen Sie dies noch einmal.
6. Tag 5: Proteinase K verdauen
- Ersetzen Sie das PBST durch 2 ml der Proteinase-K-Lösung (20 μg/ml, 1% DMSO-Endkonzentration in PBST) und Gestein bei Raumtemperatur für 30 min.
HINWEIS: Larven, die länger als 6 mm sind, benötigen eine längere Inkubationszeit und/oder eine höhere Proteinase-K-Konzentration. Der genaue Zeitpunkt und die Konzentration müssen empirisch bestimmt werden. Beginnen Sie mit einer Erhöhung der Inkubationszeit um 10 Minuten pro 0,5 mm länger als 6 mm. - Ersetzen Sie die Proteinase-K-Lösung durch 4 ml PBST und Gestein für 10 min.
- Ersetzen Sie das PBST durch 4 ml frisches PBST und Gestein für 10 min. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Ersetzen Sie das PBST durch 4 ml frische Fixierlösung und Gestein für 1 h. Es ist möglich, länger bei 4 ° C zu inkubieren, um die Bequemlichkeit zu erhöhen.
7. Tag 5: Bleichen
- Ersetzen Sie die Fixierlösung durch 4 ml PBST und Gestein bei Raumtemperatur für 10 min.
- Ersetzen Sie das PBST durch 4 ml frisches PBST und Gestein für 10 min. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Übertragen Sie die Larven auf eine 6-Well-Platte (bis zu 10 Larven pro Well).
- Ersetzen Sie das PBST durch 3 ml frische Bleichlösung.
- Bei Raumtemperatur rocken und die Pigmentierung unter einem Seziermikroskop alle 5 min überwachen. Suchen Sie nach dem Verschwinden der Pigmentierung entlang des Mesonephros (dorsal zur Schwimmblase und zum Darm).
HINWEIS: Bei Larven mit einer Länge von bis zu 6 mm dauert es bis zu 20 Minuten, um die Pigmentierung um den Mesonephros herum zu bleichen. Bleichen Sie nicht länger als nötig, um die Integrität der Larven zu erhalten. - Die Larven zurück in ein Glasfläschchen geben.
- Ersetzen Sie die Bleichlösung durch 4 ml PBST. Rock für 10 min.
- Ersetzen Sie das PBST durch 4 ml frisches PBST und Gestein für 10 min. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Ersetzen Sie das PBST durch 4 ml frische Fixierlösung und Gestein für 1 h. Es ist möglich, länger bei 4 ° C zu inkubieren, um die Bequemlichkeit zu erhöhen.
8. Tag 5: Vorhybridisierung
HINWEIS: Bei Schritten, die bei 70 °C durchgeführt werden, ist es wichtig, schnell zu arbeiten, um das Abkühlen der Durchstechflasche zu minimieren.
- Ersetzen Sie die Fixierlösung durch 4 ml PBST und Gestein bei Raumtemperatur für 10 min.
- Ersetzen Sie das PBST durch 4 ml frisches PBST und Gestein für 10 min. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Ersetzen Sie das PBST durch 4 ml der Hyb- Lösung und rocken Sie bei Raumtemperatur für 10 min.
ACHTUNG: Die Hyb-, Hyb+- und Sondenlösungen enthalten Formamid, das die Haut reizen kann. Verwenden Sie Handschuhe, um diese Lösungen zu handhaben. - Ersetzen Sie das Hyb- durch 4 ml frisches Hyb- und Gestein für 10 min. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Sammeln Sie die gebrauchten Hyb-, Hyb+- und Sondenlösungen in einem separaten Abfallbehälter zur fachgerechten Entsorgung.
- Ersetzen Sie die Hyb- durch 4 ml der Hyb+ Lösung.
- Die Durchstechflasche über Nacht bei 70 °C inkubieren.
- Verdünnen Sie die EGFP-Fluorescein-Sonde 1:100 in 500 μL Hyb+ und inkubieren Sie sie O/N bei 70 °C.
HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Sondensynthese.
9. Tag 6: Sondenhybridisierung
- Ersetzen Sie die Hyb+-Lösung in der Durchstechflasche durch die vorgewärmte Sonde und inkubieren Sie sie über Nacht bei 70 °C.
HINWEIS: Larven, die länger als 6 mm sind, benötigen 2 Tage Inkubation. - Waschpuffer, 2x SSCT und 0,2x SSCT Lösungen bei 70 °C über Nacht vorheizen.
10. Tag 7: Sondenwäsche
- Ersetzen Sie die Sonde durch 4 mL des vorgewärmten Waschpuffers und inkubieren Sie bei 70 °C für 30 min.
- Sammeln Sie die gebrauchte Sonde in einem separaten Abfallbehälter zur ordnungsgemäßen Entsorgung.
- Ersetzen Sie den Waschpuffer durch 4 ml Frischwaschpuffer und inkubieren Sie bei 70 °C für 30 min.
- Ersetzen Sie den Waschpuffer durch 4 mL der vorgewärmten 2x SSCT-Lösung und inkubieren Sie ihn bei 70 °C für 15 min.
- Fügen Sie 50 ml vorgewärmtes 0,2x SSCT in ein 50 ml Rohr hinzu.
- Führen Sie ein Zellsieb (100 μm) in die Oberseite des Röhrchens ein. Stellen Sie sicher, dass das Zellsieb ganz nach unten gedrückt wird, bis es aufhört.
- Übertragen Sie die Larven aus der Glasfläschchen in das Zellsieb. Stellen Sie sicher, dass die Larven in den Puffer eingetaucht sind und 2 h bei 70 °C inkubieren.
- Bereiten Sie ein neues Röhrchen mit 50 ml vorgewärmtem 0,2x SSCT vor.
- Das Zellsieb aus Schritt 10.4.2 in das neue Röhrchen aus 0,2x SSCT überführen und bei 70 °C für 2 h inkubieren.
- Wiederholen Sie Schritt 10.5 noch einmal.
11. Tag 7: Blockieren
- Die Larven in ein neues Glasfläschchen geben und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Ersetzen Sie den 0,2x SSCT durch 4 ml 67% 0,2x SSCT/33% MABT und Gestein bei Raumtemperatur für 10 min.
- Ersetzen Sie die Lösung in Schritt 11.2 durch 4 ml 33% 0,2x SSCT/67% MABT und Gestein für 10 min.
- Ersetzen Sie die Lösung in Schritt 11.3 durch 4 ml MABT und Gestein für 10 min.
- Ersetzen Sie den MABT durch 4 ml frischen MABT und Gestein für 10 min. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Ersetzen Sie den MABT durch 4 ml der Blockierlösung und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 4 °C. Es ist möglich, aus Bequemlichkeit länger zu inkubieren.
12. Tag 8 - 9: Antikörper-Inkubation
- Verdünnen Sie den Anti-Fluorescein-Antikörper 1:5.000 in 500 μL Blockierender Lösung.
- Ersetzen Sie die Blockierende Lösung durch die Antikörperlösung und inkubieren Sie bei 4 °C für 2 Tage. Es ist möglich, aus Bequemlichkeit länger zu inkubieren.
- Schwenken Sie die Durchstechflasche zweimal täglich, um die Larven zu erregen.
HINWEIS: Larven, die länger als 6 mm sind, benötigen 1-2 weitere Tage der Inkubation.
- Schwenken Sie die Durchstechflasche zweimal täglich, um die Larven zu erregen.
13. Tag 10 - 11: Antikörperwäsche
- Ersetzen Sie die Antikörperlösung durch 4 ml PBST und Gestein bei Raumtemperatur für 10 min.
- Ersetzen Sie das PBST durch 4 ml frisches PBST und Gestein für 10 min. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Übertragen Sie die Larven in eine 50 ml Röhre.
- Fügen Sie 40 ml PBST2 hinzu. Legen Sie die Röhre auf die Seite und rocken Sie sie über Nacht bei 4 °C.
- Ersetzen Sie den PBST2 durch 40 ml frisches PBST2 und rocken Sie ihn über Nacht bei 4 °C. Es ist möglich, aus Bequemlichkeit länger zu inkubieren.
HINWEIS: Larven, die länger als 6 mm sind, benötigen 1-2 weitere Waschtage.
14. Tag 12: Färben
- Übertragen Sie die Larven auf eine 6-Well-Platte.
- Ersetzen Sie den PBST2 durch 3 ml Färbepuffer und Gestein bei Raumtemperatur für 5 min.
- Ersetzen Sie den Färbepuffer durch 3 ml frischen Färbepuffer und Gestein für 5 min. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Ersetzen Sie den Färbepuffer durch 3 ml der Färbelösung. Mit Alufolie abdecken und die Flecken in den nächsten Stunden überwachen.
- Bei Sonden mit schwachem Signal über Nacht bei 4 °C inkubieren und die Färbelösung zwischendurch durch frische Färbelösung ersetzen.
- Wenn die gewünschte Färbeintensität erreicht ist, ersetzen Sie die Färbelösung durch 3 ml der Stopplösung und des Gesteins für 30 min.
- Ersetzen Sie die Stopplösung durch 3 ml Frischstopplösung und Steine für 30 min. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Die Larven in eine neue Glasfläschchen geben und die Stopplösung durch 4 ml frische Fixierlösung ersetzen und für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Es ist möglich, länger bei 4 ° C zu inkubieren, um die Bequemlichkeit zu erhöhen.
- Lagern Sie die Larven in der Fixierlösung im Dunkeln bei 4 °C bis zu einem Jahr.
15. Tag 12: Bildgebung
- Ersetzen Sie die Fixierlösung durch 4 ml PBST und Gestein bei Raumtemperatur für 10 min.
- Übertragen Sie die Larven auf eine 6-Well-Platte.
- Ersetzen Sie das PBST durch 4 ml frisches PBST und Gestein für 10 min. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Ersetzen Sie das PBST durch 3 ml 50% Glycerin (in PBST) und Gestein für 10 min.
- Ersetzen Sie die Lösung in Schritt 15.4 durch 3 ml 100% Glycerin ohne Schaukeln für 10 min.
- Verwenden Sie ein Seziermikroskop, um die Larven direkt in der 6-Well-Platte abzubilden, oder übertragen Sie die Larven in einen Depressionsobjektträger, um unter einem zusammengesetzten Mikroskop abzubilden. Verwenden Sie einen Wimpernmanipulator, um die Larven zu orientieren.
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Representative Results
Unter Verwendung der transgenen Linie Tg(lhx1a-EGFP) wurde gezeigt, dass dieses In-situ-Hybridisierungsprotokoll bei der Markierung von Nierenvorläuferzellen und verschiedenen Nephronstrukturen während der Mesonephrosentwicklung wirksam ist. Wie erwartet, ist auch das zentrale Nervensystem in dieser transgenen Linie markiert (nicht gezeigt). Das anfängliche mesonephrische Nephron bildet sich bei etwa 5,2 mm, dorsal zum Pronephros (Abbildung 2A), und der distale Tubulus dieses Nephrons ist mit EGFP10,12 gekennzeichnet. Vorläufercluster sind in diesem Stadium und später vorhanden (Abbildung 2A-B, Pfeilspitzen), und einzelne Vorläuferzellen sind ebenfalls markiert (Abbildung 2C). Diese Methode bietet ein zusätzliches Werkzeug bei der Untersuchung der Nierenentwicklung und hilft, Das Verständnis der menschlichen Niere zu beleuchten.
Abbildung 1: Messen von Larven. Feste Larven in einer Petriplatte werden auf ein flaches Lineal gelegt. Unter einem Seziermikroskop werden die Larven vermessen und durch Gruppen ähnlicher Größe getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mesonephros-Entwicklung. Bei etwa 5,2 mm in der transgenen Linie Tg(lhx1a-EGFP) bildet sich das erste mesonephrische Nephron dorsal zu Pronephros und Schwimmblase (SB) (A). Cluster von Vorläuferzellen sind während der Mesonephrosentwicklung (A-B, Pfeilspitzen) zusätzlich zu einzelnen Vorläuferzellen (C, Bracket) vorhanden. Bei größeren Jungtieren kann es zu Hintergrundfärbungen in den Somiten (C, Pfeile) kommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die hier beschriebene In-situ-Hybridisierungsmethode zielt darauf ab, die Entwicklung von Mesonephrosen zu untersuchen. Es kann jedoch angewendet werden, um die Entwicklung anderer Gewebe und Organe während der Metamorphose zu untersuchen, wie Darm, Nervensystem, Schuppen und Pigmentierung14. Sonden können für endogene Gene oder fluoreszierende Marker in transgenen Linien erzeugt werden.
Es ist wichtig, dass die Larven intakt bleiben, um die Organe und Gewebe in ihrem natürlichen Kontext zu beobachten. Um die Integrität des Gewebes zu erhalten, ist es wichtig, die Zeit der Proteinase-K-Behandlung zu minimieren. Es ist wichtig, die beste Behandlungszeit für jede neue Enzymcharge zu bestimmen. Alternativ kann Aceton anstelle von Proteinase K zur Verbesserung der Gewebeintegrität verwendet werden16. Übermäßiges Bleaching reduziert auch die Gewebeintegrität. Minimale Bleiche und die Möglichkeit, dass die Augen eine gewisse Pigmentierung behalten, helfen bei der Visualisierung der Larven während des Waschens. Es ist üblich, dass die Augen während des Hybridisierungsschritts abfallen, was ein Indikator für die Zerbrechlichkeit des Gewebes ist. Die Verwendung von DMSO mit der Fixierungs- und Proteinase-K-Lösung ist entscheidend für die Gewebepenetration17.
Eine Einschränkung dieser Methode ist das schlechte Eindringen von Reagenzien in größere Tiere. Um die Penetration zu verbessern, können Kopf und Schwanz vor der Fixierung mit einer Rasierklinge entfernt werden17. Der Darm kann nach der Fixierung mit einer feinen Pinzette und Wolframnadeln entfernt werden, um einen direkten Zugang der Reagenzien zum Mesonephros zu ermöglichen. Lange Sonden (größer als 1 KB) können eine schlechte Penetration des Gewebes aufweisen, aber sie können in kurze Fragmente (etwa 0,3 KB) hydrolysiert werden, um die Penetration zu verbessern18. Bei Sonden mit schwachen Signalen können Steuersonden mit der Tastfolge verwendet werden, um zwischen dem Hintergrund- und dem Sondensignal zu unterscheiden. Größere Tiere haben eine höhere Hintergrundfärbung der Somiten (Abbildung 2C, Pfeile). Dies kann jedoch mit längeren Waschungen der Sonde und der Antikörper minimiert werden.
Das Protokoll kann hier auch auf sezierte und isolierte Gewebe und Organe angewendet werden, wie z.B. die adulte Zebrafischniere12,19. Obwohl es veröffentlichte Beschreibungen ähnlicher Protokolle gibt9,16, beschreibt keines von ihnen den gesamten Prozess von der Aufzucht der Larven bis zur In-situ-Hybridisierung mit diesem Detaillierungsgrad. Daher bietet diese Methode ein zusätzliches Werkzeug bei der Entschlüsselung der Entwicklung der Wirbeltierniere.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Finanzierung wurde von der Pennsylvania Academy of Science und dem Commonwealth of Pennsylvania Biologs sowie der Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology und dem Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence) bereitgestellt. Die transgene Tg(lhx1a-EGFP)- Leitung wurde von Dr. Neil Hukriede (University of Pittsburgh) zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
References
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