Summary
Zebrafisken är en viktig modell för att förstå njurutveckling. Här är ett in situ hybridiseringsprotokoll optimerat för att upptäcka genuttryck hos zebrafisklarver och ungdomar under mesonephros utveckling.
Abstract
Zebrafisken bildar två njurstrukturer under sin livstid. Pronephros (embryonal njure) bildas under embryonal utveckling och börjar fungera vid 2 dagar efter befruktning. Bestående av endast två nefrorer fungerar pronephros som den enda njuren under larvlivet tills mer njurfunktion krävs på grund av den ökande kroppsmassan. För att klara av denna högre efterfrågan börjar mesonephros (vuxen njure) bildas under metamorfos. De nya primära nefronerna smälter till benägna frros och bildar anslutna lumen. Sedan smälter sekundära nefrooner till primära (och så vidare) för att skapa ett förgreningsnätverk i mesonephros. Den stora majoriteten av forskningen är inriktad på benägna att använda embryon. Således finns det ett behov av att utveckla tekniker för att studera äldre och större larver och ungfisk för att bättre förstå mesonephros utveckling. Här är ett in situ hybridiseringsprotokoll för genuttrycksanalys optimerat för sondpenetration, tvättning av sonder och antikroppar och blekning av pigment för att bättre visualisera mesonephros. Den transgena linjen Tg(lhx1a-EGFP) används för att märka stamceller och distala tubuler av gryende nefroner. Detta protokoll fyller en lucka i mesonephros forskning. Det är en viktig modell för att förstå hur nya njurvävnader bildas och integreras med befintliga nefross och ge insikter om regenerativa terapier.
Introduction
Zebrafiskembryon är en viktig modell för att studera vävnadsutveckling på grund av dess lilla storlek, transparens, tillgängliga verktyg och överlevnad utan utfodring i upp till fem dagar1,2. Det har i hög grad bidragit till förståelsen av njurutveckling och bevarandet mellan zebrafisk och däggdjur3,4,5. Njuren spelar en viktig roll för att upprätthålla flytande homeostas, filtrera blodet och utsöndra avfall6. Nefron, njurens funktionella enhet, består av ett blodfilter anslutet till en lång tubule. I zebrafisk bildas två njurstrukturer under hela sitt liv. Pronephros (den tillfälliga embryonala njuren) bildas först under tidig utveckling. Den består av två nefrorier som löper längs den främre bakre axeln och blir funktionell vid cirka 2 dagar efter befruktning (dpf). Nyttan av pronephros ligger i dess enkelhet, med bara två nefror som mestadels är linjära och lätta att visualisera (även om den proximala invecklade tubule börjar spola vid tre dpf)3. Detta har underlättat inte bara studier av dess tidiga utveckling från den mellanliggande mesodermen, men också segmenteringsmönstret och tubulereparation7,8.
Nyttan av zebrafisk blir begränsad efter fem dpf, när äggulan minskar och larverna förlitar sig på utfodring i vattensystemet9. Vid cirka 2 veckors ålder genomgår larverna metamorfos till ungdomar, där nya vävnader bildas och gamla vävnader går förlorade och/ eller omorganiseras9. Detta är också när mesonephros (den permanenta vuxna njuren) bildar10,11,12. Den första vuxna nefron bildas nära den sjätte somiten och smälter samman med den distala tidiga tubuleen hos pronephros. Ytterligare nephrons läggs till bakre till denna position inledningsvis, men också mot den främre senare. De primära nefronerna i denna första våg smälter till tubules av pronephros och delar en gemensam lumen för att deponera sitt avfall. Sekundära nefrostrar bildas i nästa våg och smälter till primära nefroner. Denna reiterativa process skapar en mesonephros som är förgrenad, något lik däggdjurs njuren. Förmodligen förlorar pronephros så småningom sin tubule identitet och blir två stora samla kanaler där alla nefroner dränerar sitt avfall13.
Före bildandet av den första vuxna nefroronen börjar enstaka stamceller dyka upp i ~4 mm (total längd) larver (~ 10 dpf). Dessa celler, som är markerade i Tg (lhx1a-EGFP) transgena linjen, följer pronephros och verkar migrera till framtida platser för nefrogenes. De enstaka cellerna förenas till kluster, som skiljer sig åt i nya nefros12. det är oklart var dessa celler bor eller vilka gener de uttrycker före uppkomsten av mesonephrogenesis.
Att förstå mesonephros utveckling ger insikter om däggdjurs njuren på sätt som benägnaphros inte kan. Dessa inkluderar bildandet av nefrogena aggregat från enstaka stamceller, funktionell integration av nya nefros med befintliga och förgrening av morfogenes. Det finns dock begränsningar för att studera postembryonic utveckling. Larverna är mindre transparenta på grund av sin större storlek och med pigmentering. Den utvecklingsmässiga tidslinjen är inte synkron bland enskilda djur och är i hög grad beroende av miljöfaktorer, såsom utfodring och trängsel9,14. Även om knockdown reagenser finns, är de mindre effektiva i larver jämfört med embryon15. I detta protokoll beskrivs en in situ hybridisering metod för att bestämma gen uttryck under zebrafish mesonephros utveckling beskrivs. Flera steg är optimerade för att öka visualiseringen av mesonephros och penetration och tvättning av sonden och antikroppen. Den transgena linjen Tg(lhx1a-EGFP) används tillsammans med en sond för EGFP för att märka enstaka stamceller, nefrogena aggregat och distala tubuler av gryende nefrorer. Denna metod kommer att ge en djupare förståelse för mesonephros utveckling och insikt i regenerativa terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av zebrafisklarver och ungfisk är godkänd av IUP IACUC (protokoll #02-1920, #08-1920). Information om lösningsinnehållet visas i tabellen över material.
1. Höja larver
OBS: Det tar upp till 21 dagar eller mer att höja larver och ungdomar till intressestadiet.
- Ställ upp vuxna zebrafiskar för att kompisera genom att lägga till 1 manlig och 1 kvinnlig fisk i en parningstank sent på eftermiddagen efter deras sista måltid.
OBS: Inte alla fiskpar kommer att para sig. Börja med att ställa in 20 par för att bestämma parningshastigheten och justera därefter i framtida experiment. - Nästa dag efter att fisken har slutat parning (cirka 13:00), samla embryona med E3 medium i Petri tallrikar.
- Se till att det inte finns mer än 30 embryon per tallrik.
- Ta bort skräp (t.ex. avföring) från Petri-plattorna och tillsätt 20 ml E3-medium.
- Inkubera vid 28,5 °C i 1 dag.
- Sätt tillbaka den vuxna zebrafisken i vattensystemet.
- Vid 1 dpf, byt ut E3-mediet mot färsk E3.
- Inkubera vid 28,5 °C i ytterligare 4 dagar tills 5 dpf.
- Sätt en 400 μm skärm i en 2,8 L tank och fyll den med 2 cm systemvatten.
- Tillsätt 5 dpf larver från 1 tallrik (upp till 30 totala larver).
- Sätt tanken i vattensystemet, men starta inte vattenflödet.
- Mata larverna 4 ml pulvermat två gånger om dagen tills 14 dpf.
- Vid 6 dpf, starta vattenflödet vid 1 droppe per sekund.
OBS: Kontrollera vattenflödet dagligen och justera därefter. - Vid 8 dpf, öka vattenflödet till en långsam, stadig ström.
- Vid 14 dpf, mata levande saltlakeräkor förutom pulvermaten.
2. Dag 1 - 2: Fixering av larver
- Ta bort en tank larver vid önskad tidpunkt.
- Fyll en Petri-platta med 20 ml systemvatten.
- Använd ett fint nät för att försiktigt skopa larverna och ta dem till vattenytan.
- Skär av spetsen på en överföringspipett för att ge en bredare öppning och överför larverna till Petri-plattan. Den större pipettens mun möjliggör överföring av flera små larver eller några större på en gång.
- Tillsätt 2 ml trikain (2%, pH 7-buljong) för att immobilisera larverna.
- När larverna slutar röra sig, ta bort det mesta av vattnet och tillsätt 10 ml trikain. Vänta i 15 minuter tills larverna avlivas.
- Valfritt: För ungdomar längre än 8 mm, skär av huvuden och svansar med ett rakblad (efter dödshjälp) under ett dissekerande mikroskop för att förbättra inträngningen av fästlösningen. Se till att registrera den totala längden på varje djur innan du skär av huvudet och svansen och isolerar var och en i sin egen Petri-tallrik. Se steg 3 för hur man mäter djuren.
- Ersätt trikain med 20 ml fixeringslösning (4% paraformaldehyd, 1% DMSO). Sätt tillbaka locket på Petri-plattan och vagga långsamt i en rökhuv.
OBS: Det är viktigt att använda en gungplattform. En skakplattform med en cirkulär rörelse gör att djuraxeln kröks. Använd endast färsk (inte förtillverkad fryst) fixeringslösning.
VARNING: Fixeringslösningen innehåller paraformaldehyd, vilket är ett troligt cancerframkallande ämne. Använd rökhuv (eller mask) och handskar för att mäta pulvret. - Efter 30 min, byt ut fästlösningen mot en ny fixeringslösning.
- Samla upp den använda fästlösningen i en separat avfallsbehållare för korrekt bortskaffande.
- Överför larverna till ett 50 ml-rör som innehåller 25 ml färsk fixeringslösning.
- Se till att locket är tätt och vagga långsamt vid 4 °C i 2 dagar. Det är möjligt att inkubera längre för bekvämlighet.
3. Dag 3: Mätning av larver
- Byt ut fästlösningen mot 20 ml PBST i en rökhuv.
- Överför larverna till en Petri-tallrik.
- Sätt en platt linjal på ett dissekerande mikroskop och lägg Petri-plattan ovanpå linjalen.
- Använd en ögonfransmanipulatör för att flytta varje larva till linjalen för att mäta dess totala längd (från nosen till spetsen på det kaudala fenan) (figur 1).
- Kombinera flera larver av liknande längd (t.ex. 5,0 mm och 5,1 mm) till en 5,5 ml glasflaska, upp till 10 larver per flaska.
4. Dag 3 - 4: Uttorkning
- Ersätt PBST med 4 ml 100% metanol. Rocka injektionsflaskan i 5 min vid rumstemperatur.
- Ersätt metanolen med färsk metanol och sten i 5 min. Upprepa en gång till.
- Förvara injektionsflaskan vid -20 °C i 2 dagar. Det är möjligt att inkubera längre för bekvämlighet.
5. Dag 5: Rehydrering
- Värm injektionsflaskan till rumstemperatur.
- Ersätt metanolen med 4 ml 75% metanol/25% PBST. Sten i 5 min vid rumstemperatur.
- Ersätt lösningen i steg 5,2 med 4 ml 50% metanol/50% PBST och sten i 5 min.
- Ersätt lösningen i steg 5,3 med 4 ml 25% metanol/75% PBST och sten i 5 min.
- Ersätt lösningen i steg 5.4 med 4 ml PBST och sten i 10 min.
- Byt ut PBST med 4 ml färsk PBST och sten i 10 min. Upprepa en gång till.
6. Dag 5: Proteinas K-sammandrag
- Ersätt PBST med 2 ml proteinas K-lösningen (20 μg/ml, 1% DMSO slutlig koncentration i PBST) och berg vid rumstemperatur i 30 min.
OBS: Larver längre än 6 mm behöver en längre inkubationstid och/eller en högre proteinas K-koncentration. Den exakta tiden och koncentrationen måste bestämmas empiriskt. Börja med en 10 min ökning av inkubationstiden för varje 0,5 mm längre än 6 mm. - Ersätt proteinas K-lösningen med 4 ml PBST och sten i 10 min.
- Byt ut PBST med 4 ml färsk PBST och sten i 10 min. Upprepa en gång till.
- Byt ut PBST med 4 ml färsk fixeringslösning och sten i 1 h. Det är möjligt att inkubera längre vid 4 °C för bekvämlighet.
7. Dag 5: Blekning
- Byt ut fixeringslösningen mot 4 ml PBST och berg vid rumstemperatur i 10 min.
- Byt ut PBST med 4 ml färsk PBST och sten i 10 min. Upprepa en gång till.
- Överför larverna till en 6-brunnsplatta (upp till 10 larver per brunn).
- Byt ut PBST med 3 ml färsk blekningslösning.
- Rocka vid rumstemperatur och övervaka pigmenteringen under ett dissekerande mikroskop var 5:e minut. Leta efter försvinnandet av pigmentering längs mesonephros (dorsal till simblåsan och tarmen).
OBS: För larver upp till 6 mm långa tar det upp till 20 minuter att bleka pigmenteringen som omger mesonephros. Blek inte längre än nödvändigt för att bevara larvernas integritet. - Överför larverna tillbaka till en glasflaska.
- Byt ut blekningslösningen mot 4 ml PBST. Rock i 10 min.
- Byt ut PBST med 4 ml färsk PBST och sten i 10 min. Upprepa en gång till.
- Byt ut PBST med 4 ml färsk fixeringslösning och sten i 1 h. Det är möjligt att inkubera längre vid 4 °C för bekvämlighet.
8. Dag 5: Prehybridization
OBS: För steg som görs vid 70 °C är det viktigt att arbeta snabbt för att minimera injektionsflaskan som kyls ner.
- Byt ut fixeringslösningen mot 4 ml PBST och berg vid rumstemperatur i 10 min.
- Byt ut PBST med 4 ml färsk PBST och sten i 10 min. Upprepa en gång till.
- Byt ut PBST med 4 ml Hyb-lösningen och sten i rumstemperatur i 10 min.
VARNING: Hyb-, Hyb+- och sondlösningarna innehåller formamid, vilket kan irritera huden. Använd handskar för att hantera dessa lösningar. - Byt ut Hyb- med 4 ml färsk Hyb- och sten i 10 min. Upprepa en gång till.
- Samla in de använda Hyb-, Hyb+- och sondlösningarna i en separat avfallsbehållare för korrekt bortskaffande.
- Byt ut Hyb- med 4 ml Hyb+-lösningen.
- Inkubera injektionsflaskan vid 70 °C över natten.
- Späd egfp-fluoresceinsonden 1:100 i 500 μL Hyb+ och inkubera den O/N vid 70 °C.
OBS: Följ tillverkarens anvisningar för sondsyntes.
9. Dag 6: Hybridisering av sond
- Byt ut Hyb+-lösningen i injektionsflaskan med den förvärmda sonden och inkubera vid 70 °C över natten.
OBS: Larver längre än 6 mm behöver 2 dagars inkubation. - Förvärm tvättbufferten, 2x SSCT och 0,2x SSCT-lösningar vid 70 °C för över natten.
10. Dag 7: Sondtvätt
- Byt ut sonden mot 4 ml av den förvärmda tvättbufferten och inkubera vid 70 °C i 30 minuter.
- Samla den använda sonden i en separat avfallsbehållare för korrekt bortskaffande.
- Byt ut tvättbufferten mot 4 ml färsk tvättbuffert och inkubera vid 70 °C i 30 min.
- Byt ut tvättbufferten mot 4 ml förvärmd 2x SSCT-lösning och inkubera den vid 70 °C i 15 minuter.
- Tillsätt 50 ml förvärmt 0,2x SSCT i ett 50 ml-rör.
- Sätt in en cellsil (100 μm) i toppen av röret. Se till att cellsilen trycks hela vägen ner tills den stannar.
- Överför larverna från glasflaskan till cellsilen. Se till att larverna är nedsänkta i bufferten och inkuberar vid 70 °C i 2 timmar.
- Förbered ett nytt rör som innehåller 50 ml förvärmt 0,2x SSCT.
- Överför cellsilen från steg 10.4.2 till det nya röret på 0,2x SSCT och inkubera vid 70 °C i 2 timmar.
- Upprepa steg 10,5 en gång till.
11. Dag 7: Blockering
- Överför larverna till en ny glasflaska och svalna till rumstemperatur.
- Byt ut 0,2x SSCT med 4 ml 67% 0,2x SSCT/33% MABT och sten vid rumstemperatur i 10 min.
- Ersätt lösningen i steg 11,2 med 4 ml 33% 0,2x SSCT/67% MABT och sten i 10 min.
- Ersätt lösningen i steg 11.3 med 4 ml MABT och sten i 10 min.
- Byt ut MABT med 4 ml färsk MABT och sten i 10 min. Upprepa en gång till.
- Byt ut MABT mot 4 ml av blockeringslösningen och inkubera vid 4 °C över natten. Det är möjligt att inkubera längre för bekvämlighet.
12. Dag 8 - 9: Antikropp inkubation
- Späd ut antifluessenantikroppen 1:5 000 i 500 μL-blockeringslösning.
- Ersätt blockeringslösningen med antikroppslösningen och inkubera vid 4 °C i 2 dagar. Det är möjligt att inkubera längre för bekvämlighet.
- Virvla injektionsflaskan två gånger om dagen för att agitera larverna.
OBS: Larver längre än 6 mm behöver 1-2 dagar till inkubation.
- Virvla injektionsflaskan två gånger om dagen för att agitera larverna.
13. Dag 10 - 11: Antikroppstvätt
- Ersätt antikroppslösningen med 4 ml PBST och berg vid rumstemperatur i 10 min.
- Byt ut PBST med 4 ml färsk PBST och sten i 10 min. Upprepa en gång till.
- Överför larverna till ett 50 ml-rör.
- Tillsätt 40 ml PBST2. Lägg röret på sidan och vagga vid 4 °C över natten.
- Byt ut PBST2 mot 40 ml färsk PBST2 och sten vid 4 °C över natten. Det är möjligt att inkubera längre för bekvämlighet.
OBS: Larver längre än 6 mm behöver 1-2 dagar till av tvätt.
14. Dag 12: Färgning
- Överför larverna till en 6-välplatta.
- Byt ut PBST2 mot 3 ml färgbuffert och sten vid rumstemperatur i 5 min.
- Byt ut färgbufferten mot 3 ml färsk färgbuffert och sten i 5 minuter. Upprepa en gång till.
- Byt ut färgbufferten mot 3 ml av färgningslösningen. Täck med aluminiumfolie och övervaka färgningen under de närmaste timmarna.
- För sonder med svag signal, inkubera vid 4 °C över natten och ersätt färgningslösningen med färsk färglösning en gång däremellan.
- När önskad färgningsintensitet uppnås, byt ut färgningslösningen med 3 ml av stopplösningen och stenen i 30 minuter.
- Byt ut stopplösningen mot 3 ml färsk stopplösning och sten i 30 minuter. Upprepa en gång till.
- Överför larverna till en ny glasflaska och byt ut stopplösningen med 4 ml färsk fixeringslösning och inkubera i 1 h vid rumstemperatur. Det är möjligt att inkubera längre vid 4 °C för bekvämlighet.
- Förvara larverna i fixeringslösningen i mörker vid 4 °C i upp till ett år.
15. Dag 12: Bildbehandling
- Byt ut fixeringslösningen mot 4 ml PBST och berg vid rumstemperatur i 10 min.
- Överför larverna till en 6-välplatta.
- Byt ut PBST med 4 ml färsk PBST och sten i 10 min. Upprepa en gång till.
- Ersätt PBST med 3 ml 50% glycerol (i PBST) och sten i 10 min.
- Ersätt lösningen i steg 15,4 med 3 ml 100% glycerol utan gungning i 10 min.
- Använd ett dissekerande mikroskop för att avbilda larverna direkt i 6-brunnsplattan eller överföra larverna till en depressionsbild till bilden under ett sammansatt mikroskop. Använd en ögonfrans manipulator för att orientera larverna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av Tg(lhx1a-EGFP) transgena linjen, visades det att detta in situ hybridisering protokoll är effektivt vid märkning njure stamceller och olika nephron strukturer under mesonephros utveckling. Som förväntat är centrala nervsystemet också märkt i denna transgena linje (visas inte). Den ursprungliga mesonephric nephron bildas på cirka 5,2 mm, dorsala till pronephros (figur 2A), och den distala tubule av denna nephron är märkt av EGFP10,12. Stamceller finns i detta skede och senare (figur 2A-B, pilspetsar) och enstaka stamceller är också märkta (figur 2C). Denna metod ger ett extra verktyg för att studera njurutveckling och hjälper till att kasta ljus över förståelsen av den mänskliga njuren.
Figur 1: Mätning av larver. Fasta larver i en Petri-platta placeras ovanpå en platt linjal. Under ett dissekerande mikroskop mäts larverna och separeras av grupper av liknande storlekar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Mesonephros utveckling. Vid cirka 5,2 mm i den transgena linjen Tg(lhx1a-EGFP) bildas den första mesonephric nephron dorsal till pronephros och simblåsan (SB) (A). Kluster av stamceller finns under mesonephros utveckling (A-B, pilspetsar) förutom enstaka stamceller (C, parentes). I större ungdomar kan bakgrundsfärgning förekomma i somiterna (C, pilar). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In situ hybridiseringsmetoden som beskrivs här syftar till att studera mesonephros utveckling. Det kan dock tillämpas för att studera utvecklingen av andra vävnader och organ under metamorfos, såsom tarm, nervsystem, vågar och pigmentering14. Sonder kan genereras för endogena gener eller fluorescerande markörer i transgena linjer.
Det är viktigt att larverna förblir intakta för att observera organen och vävnaderna i sitt ursprungliga sammanhang. För att behålla vävnadsintegriteten är det viktigt att minimera tiden för proteinas K-behandling. Det är viktigt att bestämma den bästa behandlingstiden för varje ny sats av enzym. Alternativt kan aceton användas istället för proteinas K för förbättrad vävnadsintegritet16. Överdriven blekning minskar också vävnadens integritet. Minimal blekning och låta ögonen behålla viss pigmentering hjälper till att visualisera larverna under tvättar. Det är vanligt att ögonen faller av under hybridiseringssteget, vilket är en indikator på vävnadsskörhet. Användningen av DMSO med fixerings- och proteinas K-lösningen är avgörande för vävnadspenetration17.
En begränsning av denna metod är den dåliga penetrationen av reagenser hos större djur. För att förbättra penetrationen kan huvud och svans avlägsnas med ett rakblad före fixering17. Tarmen kan avlägsnas med fina pincett och volframnålar efter fixering för att möjliggöra direkt åtkomst av reagenserna till mesonephros. Långa sonder (större än 1 KB) kan ha dålig penetration av vävnaden, men de kan hydrolyseras i korta fragment (cirka 0,3 KB) för att förbättra penetrationen18. För sonder med svaga signaler kan styrsonder med avkänningssekvensen användas för att skilja mellan bakgrunden och sondens signal. Större djur kommer att ha en högre bakgrundsfärgning av somiterna (figur 2C, pilar). Detta kan dock minimeras med längre tvättar av sonden och antikropparna.
Protokollet här kan också tillämpas på dissekerade och isolerade vävnader och organ, såsom den vuxna zebrafisken njure12,19. Även om det finns publicerade beskrivningar av liknande protokoll9,16, beskriver ingen av dem hela processen från uppfödning av larver till in situ hybridisering med denna detaljnivå. Därför ger denna metod ett ytterligare verktyg för att dechiffrera utvecklingen av ryggradsdjurets njure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Finansiering tillhandahölls av Pennsylvania Academy of Science och Commonwealth of Pennsylvania Biologists och Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology och Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). Den transgena linjen Tg(lhx1a-EGFP) tillhandahölls av Dr. Neil Hukriede (University of Pittsburgh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
References
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
- Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
- Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
- Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
- McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
- Diep, C. Q., et al.
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., et al. The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. Cartner, S. C., et al. , Elsevier. 145-150 (2020).
- Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
- Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
- Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).
- Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).
