Summary
Glukoseopptaket økes i Drosophila motoriske nevroner påvirket av TAR DNA-bindende protein (TDP-43) proteinopati, som indikert av en FRET-basert, genetisk kodet glukosesensor.
Abstract
Amyotrofisk lateral sklerose er en nevrodegenerativ lidelse som forårsaker progressiv muskelsvakhet og død innen 2-5 år etter diagnosen. Kliniske manifestasjoner inkluderer vekttap, dyslipidemi og hypermetabolisme; Det er imidlertid fortsatt uklart hvordan disse forholder seg til motorisk nevron degenerasjon. Ved hjelp av en Drosophila-modell av TDP-43-proteinopati som rekapitulerer flere funksjoner i ALS, inkludert cytoplasmatiske inneslutninger, lokomotorisk dysfunksjon og redusert levetid, identifiserte vi nylig brede metabolske underskudd. Blant disse ble glykolyse funnet å være oppregulert og genetiske interaksjonseksperimenter ga bevis for en kompenserende nevrobeskyttende mekanisme. Faktisk, til tross for oppregulering av fosfofructokinase, hastigheten begrensende enzym i glykolyse, en økning i glykolyse ved hjelp av kosthold og genetiske manipulasjoner ble vist å redusere lokomotorisk dysfunksjon og økt levetid i fly modeller av TDP-43 proteinopati. For å undersøke effekten på TDP-43 proteinopati på glykolytisk flux i motoriske nevroner, ble en tidligere rapportert genetisk kodet, FRET-basert sensor, FLII12Pglu-700μδ6, brukt. Denne sensoren består av et bakteriell glukosesensordomene og cyan og gule fluorescerende proteiner som FRET-paret. Ved glukosebinding gjennomgår sensoren en konformasjonsendring som gjør at FRET kan forekomme. Ved hjelp av FLII12Pglu-700μδ6 ble glukoseopptak funnet å være betydelig økt i motoriske nevroner som uttrykker TDP-43G298S, en ALS forårsaker variant. Her viser vi hvordan du måler glukoseopptak, ex vivo, i larval ventrale nerveledningspreparater som uttrykker glukosesensoren FLII12Pglu-700μδ6 i sammenheng med TDP-43 proteinopati. Denne tilnærmingen kan brukes til å måle glukoseopptak og vurdere glykolytisk flux i forskjellige celletyper eller i sammenheng med ulike mutasjoner som forårsaker ALS og relaterte nevrodegenerative lidelser.
Introduction
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en progressiv nevrodegenerativ lidelse som for tiden er uhelbredelig. ALS påvirker øvre og nedre motoriske nevroner som fører til tap av motorisk koordinering, irreversibel lammelse, åndedrettssvikt og eventuell død innen 2-5 års diagnose1. ALS er forbundet med metabolske defekter som vekttap, dyslipidemi og hypermetabolisme (gjennomgått i2); Det er imidlertid fortsatt uklart hvordan disse endringene i metabolismen forholder seg til motorisk nevron degenerasjon. En fellesnevner i ALS og relaterte nevrodegenerative sykdommer er TDP-43, et nukleinsyrebindende protein involvert i flere trinn i RNA-behandling3,4,5. Selv om mutasjoner i TDP-43 bare påvirker 3% -5% av pasientene, finnes wild-type TDP-43 protein i cytoplasmatiske aggregater i >97% av ALS-tilfeller (gjennomgått i6). Denne patologien ble modellert i Drosophila ved overekspression av menneskelig wildtype eller mutant TDP-43 (G298S) i motoriske nevroner, som recapitulates flere aspekter av ALS, inkludert cytoplasmatiske inneslutninger, lokomotorisk dysfunksjon og redusert levetid7,8. Ved hjelp av disse modellene ble det nylig rapportert at TDP-43 proteinopati forårsaker en betydelig økning i pyruvatnivåer og fosfofructokinase (PFK) mRNA, den hastighetsbegrensende enzymet av glykolyse9. Lignende økninger i PFK-transkripsjoner ble funnet i pasientavledede motoriske nevroner og ryggmarger, noe som tyder på at glykolyse er oppregulert i sammenheng med TDP-43 proteinopati. Interessant nok reduserte ytterligere økning i glykolyse ved hjelp av kostholds- og genetiske manipulasjoner flere ALS-fenotyper som lokomotorisk dysfunksjon og økt levetid i flymodeller av TDP-43 proteinopati, i samsvar med en kompenserende, nevrobeskyttende mekanisme for degenerering av motoriske nevroner.
For ytterligere sondeendringer i glykolyse og måle glukoseopptak i Drosophila-modeller av TDP-43-proteinopati, ble en tidligere rapportert genetisk kodet FRET-basert sensor FLII12Pglu-700μδ610 uttrykt i motoriske nevroner spesielt ved hjelp av UAS-GAL4-uttrykkssystemet. FLII12Pglu-700μδ6 glukosesensor bruker resonansenergioverføring mellom to varianter av grønt fluorescerende protein, cyan og gule fluorescerende proteiner (CFP og YFP) for å oppdage glukose på cellenivå. Den består av et bakteriell glukosebindingsdomene fra E. coli MglB-genet smeltet sammen til CFP og YFP i motsatte ender av molekylet. Når sensoren er bundet til et glukosemolekyl, gjennomgår den en konformasjonsendring som bringer CFP og YFP nærmere hverandre og lar FRET forekomme, som deretter kan brukes til å kvantifisere intracellulære glukosenivåer10,11,12 ( figur1). Her viser vi hvordan FLII12Pglu-700μδ6-sensoren kan brukes til å bestemme endringer i glukoseopptak forårsaket av TDP-43 proteinopati i motoriske nevroner. Forsøkene beskrevet her viser at overekspressering av et ALS-assosiert mutant, TDP-43G298S, i motoriske nevroner forårsaker en betydelig økning i glukoseopptak sammenlignet med kontroller. Denne tilnærmingen kan brukes i andre typer ALS (f.eks. SOD1, C9orf72, etc.) og/eller andre celletyper (f.eks. glia, muskler) for å bestemme endringer i glukoseopptaket forbundet med nevrodegenerasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
UAS FLII12Pglu-700μδ6 transgene fluer ble rapportert i Volkenhoff et al.10 og vennligst levert av Dr. S. Schirmeier. UAS TDP-43G298S transgene linjer ble vennlig levert av Dr. T. Iwatsubo13. Rekombinante Drosophila-linjer som huser både UAS FLII12Pglu-700μδ6 og UAS TDP-43 transgenes ble generert i Zarnescu-laboratoriet ved hjelp av standard genetiske tilnærminger og rapportert i Manzo et al.9. D42 GAL4 ble brukt til å drive uttrykket av glukosesensoren alene eller sammen med TDP-43G298S i motoriske nevroner. Alle fluelinjer opprettholdes på melasse maismelmedier, ved 25 °C i 12 timers mørk:lyssyklus.
1. Drosophila Ventral Nerve Cord (VNC) disseksjoner
- Lag silikon elastomer disseksjonsretter.
- Hell silikonelastomerkomponenter i et 50 ml rør som angitt i produsentens protokoll og rør godt.
- Fyll 35 mm vevskulturretter med ca. 2 ml av elastomerblandingen. Bruk en sprøyte til å fjerne eventuelle bobler. Dekk oppvasken og legg dem på en jevn overflate i en 60 °C ovn over natten for å kurere.
- Disseker Drosophila larver for å eksponere VNC samtidig som vevets levedyktighet opprettholdes.
- Samle en vandrende tredje instar larve, skyll med ddH2O, og plasser den deretter i en dråpe HL3-buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sukrose, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES; pH 7,1) på en elastomerforet tallerken.
- Bruk et par tang (# 5 eller 55 tang) under et dissekerende mikroskop, fest de fremre og bakre endene av larvens dorsale side opp, forsiktig strekker larven på langs med insektpinner (Minutein Pins).
- Lag et snitt rett over den bakre pinnen ved hjelp av en par vinklede iris saks. Lag et vertikalt kutt som starter fra snittet mot den fremre enden av larven.
- Legg til noen dråper HL-3-buffer om nødvendig. Fjern luftrøret og resten av de flytende organene uten å forstyrre CNS. Fest klaffene som strekker kroppsveggen for å eksponere CNS mens du holder det nevromuskulære systemet (VNCer, aksoner og nevromuskulære veikryss) intakt.
2. Bildeoppkjøp
- Optimaliser bildebehandlingsparameterne.
- Slå på mikroskopet og laserne før du starter disseksjonene. Bilder må anskaffes ved hjelp av et oppreist konfokalt mikroskop med en 40x vanninnlevelseslinse. Bruk en 405 nm laser for å begeistre CFP og skaffe bildene i både CFP (465-499 nm) og FRET (535-695 nm) deteksjonskanaler.
- Optimaliser anskaffelsesparametere som skannehastighet (6), gjennomsnitt (2), objektiv (40x), zoom (1x), pinhole-størrelse (1 AU) og romlig oppløsning (512 x 512). Juster forsterkningen slik at signalet er i det optimale dynamiske området. De samme parameterne må brukes for alle genotyper.
- Bildemotoriske nevroner i VNC.
- Plasser silikonfatet med den dissekerte prøven under linsen. Senk linsen slik at den kommer i kontakt med trehalose-sukrose HL3 buffer (se 1.2.1). Det er viktig å sikre at objektivet er helt nedsenket i bufferen. Legg til mer buffer om nødvendig.
- Bruk CFP- og FRET-kanalene til manuelt å velge en optisk seksjon som består av minst 6 motoriske nevroner i fokus, plassert langs VNC-midtlinjen. Motornevronene identifiseres basert på uttrykket av glukosesensoren og posisjonen langs den fremre bakre aksen.
- Hent bilder hver 10. Disse bildene representerer grunnlinjen.
- Stimulere med glukose supplert HL-3.
- Fjern trehalose-sukrose som inneholder HL3-buffer ved hjelp av en Pasteur pipette og erstatt den med 5 mM glukose supplert HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sukrose, 5 mM glukose, 5 mM HEPES, pH 7.7.). Dette trinnet må utføres med stor forsiktighet, for å unngå bevegelse av VNC så mye som mulig.
- Skaff bilder hver 10 s i ytterligere 10 minutter. Disse bildene representerer stimuleringsfasen.
- Lagre bildene som .czi filer eller en hvilken som helst filtype som støttes av bildebehandling programvare med et filnavn inkludert dato, genetisk bakgrunn, eksperimentell tilstand (baseline eller stimulering), og kanaler som brukes.
- Bruk parameterne på nytt til å bilde alle genotypene (Figur 2A).
3. Bildebehandling og ROI-valg
- Åpne czi-filene i Fiji/ImageJ og angi Fargemodus: Gråtone, velg Vis stakk med: Hyperstakk, og velg Del kanaler i Separate Vinduer.
- Behandle bilder ved hjelp av drift korreksjon plugins: turboreg og stackreg. Hver kanal korrigeres separat ved å velge Stackreg under Plugins, og deretter velge Transformasjon: Oversettelse.
- Velg interesseområdene manuelt for å trekke ut den gjennomsnittlige grå verdien for hver kanal.
- Velg ROIene ved å spore alle motoriske nevroner som forblir i fokus gjennom hele tidsserien. Bruk ROI-lederen til å lagre hver motor neuron kontur.
- Bruk multimålfunksjonen til å måle gjennomsnittsgråverdien i hver avkastning på hvert tidspunkt. Kopier ROIene som spores fra den første kanalen, til den andre kanalen for bildet før stimulering.
- Gjenta denne prosessen for bildene etter stimulering i hver kanal ved hjelp av de samme cellene/ROIene som er valgt for bildet før stimulering.
4. Dataanalyse
- Beregn FRET/CFP-forholdet ved hjelp av de gjennomsnittlige grå verdiene for FRET- og CFP-kanalene. Endringer i FRET/CFP-forholdet gjenspeiler endringer i den intracellulære glukosekonsentrasjonen.
- Plott fret / CFP forhold for hver avkastning og tidspunkt kontra tid. Innenfor hver VNC vil noen av ROIene ha en nedgang i FRET/CFP-forhold etter stimulering.
MERK: Dette tolkes som en manglende evne for noen nevroner til å ta glukose, muligens på grunn av stress forårsaket av disseksjoner og elimineres derfor fra analysen. De resterende FRET/CFP-forholdene for hver avkastning og hvert tidspunkt er i gjennomsnitt for å generere et enkelt FRET/CFP-forhold per tidspunkt per genotype (glukosesensor alene og glukosesensor med TDP-43G298S). Disse enkle FRET/CFP-forholdene brukes til alle etterfølgende normaliseringer. 31 ROIer ble analysert for glukosesensorkontroller og 24 ROIer ble analysert for TDP-43G298S.
- Plott fret / CFP forhold for hver avkastning og tidspunkt kontra tid. Innenfor hver VNC vil noen av ROIene ha en nedgang i FRET/CFP-forhold etter stimulering.
- Baseline normalisering: Beregn gjennomsnittet av FRET/CFP-forhold for de første 10 minutter (baseline), og normaliser deretter individuelle FRET/CFP-forhold for hvert tidspunkt i hele eksperimentet til 10 min basislinjegjennomsnitt (se figur 2B).
- Normalisering av tidspunkt: Normaliser TDP-43G298S FRET/CFP-forhold til FRET/CFP-forhold fra glukosesensor alene på hvert tidspunkt (se figur 3A).
- Stolpediagrammer: For sammenligninger av grunnlinje kontra stimulering i form av stolpediagrammer, bruk FRET/CFP-forhold fra 5-10 min (baseline) og 15-20 min (stimulering) for hver genotype. Normaliser stimuleringsforholdet til grunnlinjeforholdet (se figur 3B).
5. Statistiske analyser
- Evaluer de normaliserte datasettene ved hjelp av Mann-Whitney-korrigering (for baseline- og timepoint-normaliseringer) eller Kruskall-Walis-test (for stolpegrafrepresentasjon av stimulering versus baseline FRET/CFP-forhold).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bildeinnhenting av glukosesensoren i lufte nerveledningen (VNC), ex vivo
For å bestemme forskjeller i glukoseopptak i en Drosophila-modell av ALS basert på TDP-43, ble det brukt en genetisk kodet FRET-basert glukosesensor. Sensoren besto av CFP og YFP smeltet sammen til glukosebindingsdomenet fra E. coli MglB-genet. Glukosebinding fremkaller en konformasjonsendring, som kan påvises ved fluorescensresonansenergioverføring (FRET) mellom CFP og YFP 10,11,12. Når glukose ikke er bundet til sensoren, forårsaker CFP-eksitasjon bare CFP-utslipp, og når glukose binder seg, kan YFP-signalet oppdages på grunn av FRET som oppstår mellom CFP og YFP (Figur 1A). D42 GAL4-driveren ble brukt til å uttrykke sensoren alene eller sammen med als-assosiert mutant TDP-43G298S i motoriske nevroner via det todelte UAS-GAL4-uttrykkssystemet14. Tredje instar larver ble dissekert i HL3 buffer uten glukose og festet for å eksponere nevromuskulært system, inkludert VNC fortsatt koblet til nevromuskulære kryss via motoriske nevron aksoner. VNC ble avbildet med et 40x vanninnlevelsesobjektiv med en romlig oppløsning på 512 x 512 piksler (se Protokoll og figur 1B). CFP- og FRET-signaler ble innhentet i henholdsvis 465-499 nm og 535-695 nm, etter CFP-eksitasjon med 405 nm laser. Stykket som skulle avbildes ble valgt basert på flyet der VNC var synlig med minst seks motoriske nevroner i fokus langs midtlinjen. Det valgte planet ble avbildet i 10 minutter, og fanget et bilde hver 10. De sprø filene ble lagret som: genotype_sample # _baseline. Etter at 10 min tidsforløpet var fullført for basislinjeforhold, ble bufferen erstattet med glukose supplert HL3. Bildet ble fokusert på nytt for å finne det samme planet som ble avbildet under grunnlinjebetingelser. De samme bildeinnstillingene ble brukt for alle eksempler. VNC ble deretter avbildet igjen i 10 minutter for å skaffe seg et nytt bilde hver 1 _post genotype_sample 0.
Bildeanalyse
En betydelig utfordring med live bildebehandling eksperimenter er driften som VNCs gjennomgår i løpet av 20 min bildebehandling intervall. For å løse dette problemet ble Stackreg brukt i FIJI før bildeanalyse og ROI-valg (se Protokoll og figur 2A). 6-8 individuelle celler/ROIer ble valgt fra hver VNC og skissert ved hjelp av FRET/YFP-kanalen. Valgene ble kopiert til CFP-kanalen, og de gjennomsnittlige grå verdiene ble målt ved hjelp av flermålsfunksjonen. Kvantifiseringer ble utført ved først å beregne FRET/CFP-forholdet per tidspunkt, og deretter beregne gjennomsnittet for hele 10 min per genotype. Disse gjennomsnittene ble deretter brukt til å normalisere FRET/CFP-forholdet på hvert tidspunkt og plottet over tid for å generere en første evaluering av dataene (Figur 2B). Ved hjelp av denne normaliseringsmetoden, det ble funnet at ved stimulering, kontroll motoriske nevroner som uttrykker glukosesensor alene, viser en liten, men betydelig økning i glukoseopptak (3,9%,P-verdi < 0,0001) mens motornevroner som uttrykker TDP-43G298S viser et betydelig høyere glukoseopptak (16,76%,P-verdi < 0,0001). Disse dataene er i samsvar med TDP-43 proteinopati som forårsaker økt glukoseopptak i motoriske nevroner, som tidligere vist i referanse9.
Dataanalyser - måling av glukoseopptak i motoriske nevroner i Drosophila VNC
For å få ytterligere innsikt i forskjeller mellom kontroller og TDP-43G298S mutantmotoriske nevroner ble hvert FRET/CFP-forhold normalisert til kontrollen ved hvert tidspunkt (figur 3A). Dette gir mulighet for en sammenligning i glukoseopptak mellom ALS motoriske nevroner som uttrykker TDP-43G298S og kontrollmotoriske nevroner som uttrykker glukosesensoren alene i sanntid. Under baseline-forhold var det ingen forskjell mellom genotypene. Ved stimulering med glukose ble det imidlertid observert en rask (7,31% etter 1 min glukoseapplikasjon) og betydelig økning (12,76% etter 10 min,P-verdi < 0,0001) i glukoseopptak i TDP-43G298S sammenlignet med kontrollen.
Stolpediagrammer gir en alternativ tilnærming til å illustrere forskjeller mellom genotyper (TDP-43G298S versus kontroller) før og etter glukosestimulering (figur 3B). Dette ble gjort ved å normalisere FRET/CFP-forholdet for begge forholdene til grunnlinjen for de respektive genotypene og plotte henholdsvis gjennomsnittsforholdet for de siste 5 min med baseline og stimuleringsavbildning. Ved stimulering viser nevroner som uttrykker glukosesensor alene en liten, men signifikant økning i FRET / CFP-forholdet (3,83% ± 0,08%,P-verdien < 0,0001) sammenlignet med grunnlinjen. Mens nevroner som uttrykte TDP-43G298S viste en signifikant økning i FRET/CFP-forholdet ved stimulering (14,73 % ± 0,08 %,P-verdien < 0,0001) sammenlignet med baseline. Nettoforskjellen i FRET/CFP-forhold mellom motornevroner som uttrykker TDP-43G298S og glukosesensor alene er 10,9 %(P-verdi = 0,005). Denne analysen viser også at forholdene stabiliserer seg rundt de siste 5 min av hver tidskursavbildning, så denne tidsrammen ble valgt for grafen. Denne analysen gir en oversikt på høyt nivå over resultatene, inkludert statistisk signifikante forskjeller mellom genotyper og behandlinger i en graf.
Figur 1: FRET-sensor og bildeanskaffelse. (A) FRET-basert glukosesensordiagram som brukes til å måle glukoseopptak i motoriske nevroner. Glukosebinding fører til at FRET oppstår. (B) Diagram over nevromuskulært kryss (NMJ) disseksjon som viser område avbildet i VNC. Bilder til venstre som viser TDP-43G298S før og etter glukosestimulering i både FRET- (YFP) og CFP-kanaler. Skalastenger: 20 μm. Forstørrelse: 40x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bildeanalyse av glukosesensor i sammenheng med TDP-43 mutant. (A) Representative bilder av FRET- og CFP-signaler i glukosesensorkontroller og TDP-43G298S-prøver under baseline- og stimuleringsforhold. En representativ motorisk neuron er skissert i hvert bilde som et eksempel på en avkastning. Skalastenger: 20 μm. Forstørrelse: 40x. (B) Gjennomsnittlige forhold mellom FRET / CFP i glukosesensor og TDP-43 mutantmotoriske nevroner over 20 min bildebehandling. Forholdet ble normalisert til gjennomsnittlig grunnlinjeforhold for hver genotype (se baseline normalisering i protokollen). Viste verdier er gjennomsnittet av 25-30 motornevroner (ROI) fra 5 VNCer per genotype. Mann-Whitney ble brukt til å evaluere statistisk signifikans. =P-verdi < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dataanalyse av glukosesensor i sammenheng med TDP-43G298S. (A) FRET/CFP-forholdet mellom TDP-43G298S normaliseres til glukosesensorkontroll ved hvert tidspunkt. Mann-Whitney ble brukt til å evaluere statistisk signifikans. =P-verdi < 0,0001. (B) Bar graf representasjon av glukose opptak i glukose sensor kontroll og TDP-43G298S viser en betydelig økning i glukose opptak i kontrollmotor nevroner ved stimulering og i sammenheng med TDP-43G298S sammenlignet med kontroller. Kruskall-Walis ble brukt til å evaluere statistisk signifikans. ** =P-verdi < 0,01, **** =P-verdi < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikken beskrevet i detalj her kan brukes til å måle glukoseopptak i en bestemt celletype av interesse for levende Drosophila ved hjelp av FLII12Pglu-700μδ6, en FRET-basert sensor som kan oppdage endringer i glukosenivåer til et millimolarområde10,11,12. Denne sensoren har tidligere blitt brukt sammen med UAS-GAL4-systemet for å målrette uttrykket mot bestemte celletyper, inkludert nevroner9,10. I denne studien ble D42 GAL4 brukt til å uttrykke FLII12Pglu-700μδ6 alene eller sammen med sykdom assosiert med TDP-43G298S for å demonstrere hvordan denne tilnærmingen kan brukes til å evaluere glukoseopptak i ALS motoriske nevroner. Videre kan denne metoden brukes bredt på bildet en rekke fluorescerende sensorer i larval VNC.
Kritiske trinn i protokollen inkluderer å maksimere signal-til-støy-forholdet. Til dette formål ble bildeanskaffelsesparametere satt slik at fluorescensen ikke er overmettet, og hele spekteret av signalintensitet kan kvantifiseres. Bildeparametere som forsterkning, skannehastighet, pinhole-størrelse og zoom forble uendret gjennom hele studien. Forsøkene ble utført over flere dager; I hvert eksperiment ble imidlertid både genotypene, det vil si kontroller og TDP-43G298S avbildet sammen for å ta høyde for variasjon. Imaging Drosophila larval CNS ved hjelp av en vann nedsenking linse kan gi opphav til optiske plan endringer over tid. Det bør utvises forsiktighet for å unngå drastiske endringer i optisk plan ved å bruke tilstrekkelig buffer. Prøver med fokusendringer ble forkastet.
Selv om forholdene og parametrene opprettholdes uendret gjennom forsøkene, krever denne teknikken en endring i buffer under avbildning. Etter 10 min med avbildning må den glukosefrie bufferen erstattes med glukosesupplert HL-3-buffer, noe som kan endre det optiske brennplanet. Linsen må fokuseres på nytt til samme fokusplan, slik at det samme settet med celler avbildes før og etter glukosetilskudd. En undergruppe av motoriske nevroner viste en nedgang i FRET/CFP-forhold etter stimulering. Dette indikerer at noen nevroner ikke tar glukose, muligens på grunn av stress forårsaket av disseksjon og ble eliminert fra analysen.
ROI-valg, bildebehandling og kvantifisering ble utført ved hjelp av Fiji/ImageJ. Selv om avkastning er valgt manuelt i det første bildet av serien, er det viktig å korrigere mindre drift i tidsforløpavbildning for å holde avkastningen alltid tilgjengelig gjennom bildeserien. En åpen kildekode drift korreksjon plugin, Stackreg, ble brukt til å ta høyde for dette problemet.
Tilgjengeligheten av riktig eksitasjonslaser er en stor begrensning i denne teknikken. Selv om 436 nm eksitasjonslaser er ideell for denne glukosesensoren, har vi vist at sensoren kan brukes med 405 nm eksitasjonslaser, som er mer allment tilgjengelig. En annen begrensning i denne teknikken er at den kan brukes til å måle glukosedynamikk, men ikke absolutt glukosekonsentrasjoner. En potensiell alternativ strategi for å måle absolutte glukosenivåer er iGlucoSnFR-TS, en livstids glukosesensor, som kan kalibreres for å måle absolutte glukosekonsentrasjoner15.
Glukose er en viktig energikilde i hjernen og er nødvendig for fysiologiske funksjoner. Defekter i glukosemetabolismen har vært forbundet med flere patologiske forhold (gjennomgått i16). Drosophila er en kraftig genetisk modell som brukes til å studere nevrodegenerative lidelser17. Det er imidlertid begrensede teknikker tilgjengelig for å måle glukosenivåer direkte i Drosophila. Denne FRET-baserte glukosesensoren gir et direkte mål på intracellulære endringer i glukosenivået. Til tross for noen eksperimentelle utfordringer og begrensninger kan denne sensoren med hell brukes til å studere glukosedynamikk i bestemte celletyper (f.eks. motoriske nevroner, glia, muskler) i ulike sykdomsmodeller, inkludert flere typer ALS og relaterte nevrodegenerative lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Stefanie Schirmeier og Takeshi Iwatsubo for å ha gitt Drosophila stammer. Vi takker også Patricia Jansma for å ha bistått med bildebehandling i Marley Imaging Core ved University of Arizona. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (til DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (til EM) og Bachelor Biology Research Program (til HB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
References
- Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).
- Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis. The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).
- Buratti, E., Baralle, F. E. Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9. The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).
- Polymenidou, M., et al. Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).
- Tollervey, J. R., et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Estes, P. S., et al. Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS. Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).
- Estes, P. S., et al. Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).
- Manzo, E., et al. Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS. eLife. 8, 45114 (2019).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106, Pt 1 55-64 (2018).
- Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- Ihara, R., et al. RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy. Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Lu, B., Vogel, H.
