Summary
La absorción de glucosa aumenta en las neuronas motoras de Drosophila afectadas por la proteinopatía de unión al ADN TAR (TDP-43), según lo indicado por un sensor de glucosa codificado genéticamente basado en FRET.
Abstract
La esclerosis lateral amiotrófica es un trastorno neurodegenerativo que causa debilidad muscular progresiva y muerte dentro de los 2-5 años posteriores al diagnóstico. Las manifestaciones clínicas incluyen pérdida de peso, dislipidemia e hipermetabolismo; sin embargo, no está claro cómo se relacionan con la degeneración de las neuronas motoras. Utilizando un modelo de Drosophila de proteinopatía TDP-43 que recapitula varias características de la ELA, incluidas las inclusiones citoplasmáticas, la disfunción locomotora y la reducción de la vida útil, recientemente identificamos déficits metabólicos de amplio alcance. Entre estos, se encontró que la glucólisis estaba regulada al alza y los experimentos de interacción genética proporcionaron evidencia de un mecanismo neuroprotector compensatorio. De hecho, a pesar de la regulación al alza de la fosfofructoquinasa, la enzima limitante de la velocidad en la glucólisis, se demostró que un aumento en la glucólisis mediante manipulaciones dietéticas y genéticas mitiga la disfunción locomotora y aumenta la vida útil en modelos de mosca de la proteinopatía TDP-43. Para investigar más a fondo el efecto de la proteinopatía TDP-43 sobre el flujo glicolítico en las neuronas motoras, se utilizó un sensor basado en FRET codificado genéticamente previamente, FLII12Pglu-700μδ6. Este sensor está compuesto por un dominio bacteriano sensible a la glucosa y proteínas fluorescentes cian y amarillas como el par FRET. Tras la unión a la glucosa, el sensor sufre un cambio conformacional que permite que se produzca FRET. Usando FLII12Pglu-700μδ6, se encontró que la absorción de glucosa aumentaba significativamente en las neuronas motoras que expresan TDP-43G298S,una variante causante de ELA. Aquí, mostramos cómo medir la absorción de glucosa, ex vivo,en preparaciones larvales del cordón nervioso ventral que expresan el sensor de glucosa FLII12Pglu-700μδ6 en el contexto de la proteinopatía TDP-43. Este enfoque se puede utilizar para medir la absorción de glucosa y evaluar el flujo glucolítico en diferentes tipos de células o en el contexto de diversas mutaciones que causan ELA y trastornos neurodegenerativos relacionados.
Introduction
La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo que actualmente es incurable. La ELA afecta a las neuronas motoras superiores e inferiores, lo que lleva a la pérdida de la coordinación motora, parálisis irreversible, insuficiencia respiratoria y eventual muerte dentro de los 2-5 años posteriores al diagnóstico1. La ELA se asocia con defectos metabólicos como pérdida de peso, dislipidemia e hipermetabolismo (revisado en2); sin embargo, sigue sin estar claro cómo estas alteraciones en el metabolismo se relacionan con la degeneración de la neurona motora. Un denominador común en la ELA y las enfermedades neurodegenerativas relacionadas es TDP-43, una proteína de unión a ácidos nucleicos implicada en varios pasos del procesamiento del ARN3,4,5. Aunque las mutaciones en TDP-43 solo afectan al 3%-5% de los pacientes, la proteína TDP-43 de tipo salvaje se encuentra dentro de los agregados citoplasmáticos en >97% de los casos de ELA (revisado en6). Esta patología fue modelada en Drosophila por sobreexpresión de tipo salvaje humano o mutante TDP-43 (G298S) en neuronas motoras, que recapitula múltiples aspectos de la ELA, incluyendo inclusiones citoplasmáticas, disfunción locomotora y reducción de la vida útil7,8. Usando estos modelos, se informó recientemente que la proteinopatía TDP-43 causa un aumento significativo en los niveles de piruvato y ARNm fosfofructoquinasa (PFK), la enzima limitante de la velocidad de la glucólisis9. Se encontraron aumentos similares en las transcripciones de PFK en las neuronas motoras y la médula espinal derivadas de pacientes, lo que sugiere que la glucólisis está regulada al alza en el contexto de la proteinopatía TDP-43. Curiosamente, un aumento adicional en la glucólisis utilizando manipulaciones dietéticas y genéticas mitigó varios fenotipos de ELA, como la disfunción locomotora y el aumento de la vida útil en modelos de moscas de proteinopatía TDP-43, consistente con un mecanismo compensatorio y neuroprotector en las neuronas motoras degeneradas.
Para sondear aún más los cambios en la glucólisis y medir la absorción de glucosa en modelos de Drosophila de proteinopatía TDP-43, un sensor basado en FRET codificado genéticamente flII12Pglu-700μδ610 previamente informado se expresó en neuronas motoras utilizando específicamente el sistema de expresión UAS-GAL4. El sensor de glucosa FLII12Pglu-700μδ6 utiliza la transferencia de energía de resonancia entre dos variantes de proteína fluorescente verde, proteínas fluorescentes cian y amarillas (CFP y YFP) para detectar glucosa a nivel celular. Consiste en un dominio de unión a glucosa bacteriana del gen MglB de E. coli fusionado con CFP y YFP en extremos opuestos de la molécula. Cuando se une a una molécula de glucosa, el sensor sufre un cambio conformacional que acerca cfP y YFP y permite que ocurra FRET, que luego se puede usar para cuantificar los niveles de glucosa intracelular10,11,12 (Figura 1). Aquí, mostramos cómo el sensor FLII12Pglu-700μδ6 se puede utilizar para determinar los cambios en la absorción de glucosa causados por la proteinopatía TDP-43 en las neuronas motoras. Los experimentos descritos aquí muestran que la sobreexpresión de un mutante asociado a la ELA, TDP-43G298S,en las neuronas motoras causa un aumento significativo en la absorción de glucosa en comparación con los controles. Este enfoque se puede utilizar en otros tipos de ELA (por ejemplo, SOD1, C9orf72, etc.) y / u otros tipos de células (por ejemplo, glía, músculos) para determinar los cambios en la absorción de glucosa asociados con la neurodegeneración.
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Protocol
Las moscas transgénicas UAS FLII12Pglu-700μδ6 fueron reportadas en Volkenhoff et al.10 y amablemente proporcionadas por el Dr. S. Schirmeier. Las líneas transgénicas UAS TDP-43G298S fueron amablemente proporcionadas por el Dr. T. Iwatsubo13. Las líneas recombinantes de Drosophila que albergan transgenes UAS FLII12Pglu-700μδ6 y UAS TDP-43 se generaron en el laboratorio zarnescu utilizando enfoques genéticos estándar y se informaron en Manzo et al.9. D42 GAL4 se utilizó para impulsar la expresión del sensor de glucosa solo o junto con TDP-43G298S en neuronas motoras. Todas las líneas de mosca se mantienen en medios de harina de maíz de melaza, a 25 °C en 12 h de ciclo oscuro:claro.
1. Disecciones del cordón nervioso ventral de Drosophila (VNC)
- Haga platos de disección de elastómero de silicona.
- Vierta los componentes del elastómero de silicona en un tubo de 50 ml como se indica en el protocolo del fabricante y revuelva bien.
- Llene los platos de cultivo de tejidos de 35 mm con aproximadamente 2 ml de la mezcla de elastómeros. Use una jeringa para eliminar cualquier burbuja. Cubra los platos y colóquelos sobre una superficie nivelada en un horno de 60 ° C durante la noche para curar.
- Diseccionar larvas de Drosophila para exponer el VNC mientras se mantiene la viabilidad del tejido.
- Recoja una tercera larva instar errante, enjuague con ddH2O y luego colóquela en una gota de tampón HL3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sacarosa, 5 mM trehalosa, 5 mM HEPES; pH 7.1) en un plato forrado de elastómero.
- Usando un par de fórceps (# 5 o 55 fórceps) bajo un microscopio de disección, fije los extremos anterior y posterior del lado dorsal de la larva hacia arriba, estirando cuidadosamente la larva a lo largo con alfileres de insectos (Pines de Minutein).
- Haga una incisión justo encima del pasador posterior con un par de tijeras de iris en ángulo. Haga un corte vertical a partir de la incisión hacia el extremo anterior de la larva.
- Agregue unas gotas de búfer HL-3 si es necesario. Retire la tráquea y el resto de los órganos flotantes sin perturbar el SNC. Fije los colgajos que estiran la pared del cuerpo para exponer el SNC mientras mantiene intacto el sistema neuromuscular (VNC, axones y uniones neuromusculares).
2. Adquisición de imágenes
- Optimice los parámetros de imagen.
- Encienda el microscopio y los láseres antes de comenzar las disecciones. Las imágenes deben adquirirse utilizando un microscopio confocal vertical con una lente de inmersión en agua de 40x. Utilice un láser de 405 nm para excitar CFP y adquirir las imágenes en los canales de detección CFP (465-499 nm) y FRET (535-695 nm).
- Optimice los parámetros de adquisición, como la velocidad de escaneo (6), el promedio (2), el objetivo (40x), el zoom (1x), el tamaño estenopeico (1 UA) y la resolución espacial (512 x 512). Ajuste la ganancia de tal manera que la señal esté en el rango dinámico óptimo. Se deben utilizar los mismos parámetros para todos los genotipos.
- Imagen de neuronas motoras dentro del VNC.
- Coloque el plato de silicona con la muestra diseccionada debajo de la lente. Baje el cristalino para que entre en contacto con el tampón HL3 de trehalosa-sacarosa (véase 1.2.1). Es fundamental asegurarse de que la lente esté completamente sumergida en el búfer. Agregue más búfer si es necesario.
- Utilice los canales CFP y FRET para seleccionar manualmente una sección óptica que consta de al menos 6 neuronas motoras enfocadas, ubicadas a lo largo de la línea media VNC. Las neuronas motoras se identifican en función de la expresión del sensor de glucosa y la posición a lo largo del eje anterior-posterior.
- Adquiere imágenes cada 10 s durante 10 min. Estas imágenes representan la línea de base.
- Estimular con glucosa suplementada con HL-3.
- Retire la trehalosa-sacarosa que contiene tampón HL3 con una pipeta Pasteur y reemplácela con 5 mM de glucosa suplementada con HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM de sacarosa, 5 mM de glucosa, 5 mM HEPES, pH 7.1). Este paso debe realizarse con mucho cuidado, para evitar el movimiento del VNC tanto como sea posible.
- Adquiere imágenes cada 10 s durante otros 10 min. Estas imágenes representan la fase de estimulación.
- Guarde las imágenes como archivos .czi o cualquier tipo de archivo compatible con el software de imágenes con un nombre de archivo que incluya la fecha, los antecedentes genéticos, la condición experimental (línea de base o estimulación) y los canales utilizados.
- Reutilizar los parámetros para obtener imágenes de todos los genotipos(Figura 2A).
3. Procesamiento de imágenes y selección de ROI
- Abra los archivos czi en Fiji/ImageJ y establezca Modo de color: Escala de grises,elija Ver pila con: Hyperstacky seleccione Dividir canales en ventanas separadas.
- Procese imágenes utilizando los plugins de corrección de deriva: turboreg y stackreg. Cada canal se corrige por separado seleccionando Stackreg en Pluginsy, a continuación, elija Transformación: Traducción.
- Seleccione manualmente las regiones de interés (ROI) para extraer el valor gris medio de cada canal.
- Elija el ROI rastreando todas las neuronas motoras que permanecen enfocadas durante toda la serie de tiempo. Utilice el administrador de ROI para guardar cada contorno de neurona motora.
- Utilice la función Multimedida para medir el valor gris medio en cada ROI en cada punto de tiempo. Copie los ROI trazados desde el primer canal hasta el segundo canal para la imagen de preestimulación.
- Repita este proceso para las imágenes posteriores a la estimulación en cada canal utilizando las mismas células/ ROI seleccionadas para la imagen de preestimulación.
4. Análisis de datos
- Calcule la relación FRET/CFP, utilizando los valores grises medios para los canales FRET y CFP. Los cambios en las relaciones FRET/CFP reflejan alteraciones en la concentración intracelular de glucosa.
- Traza las relaciones FRET/CFP para cada ROI y punto de tiempo frente al tiempo. Dentro de cada VNC, algunos de los ROI exhibirán una caída en las relaciones FRET / CFP después de la estimulación.
NOTA: Esto se interpreta como una incapacidad de algunas neuronas para absorber glucosa, posiblemente debido al estrés causado por las disecciones y, por lo tanto, se eliminan del análisis. Las relaciones FRET/CFP restantes para cada ROI y punto de tiempo se promedian para generar una única relación FRET/CFP por punto de tiempo por genotipo (sensor de glucosa solo y sensor de glucosa con TDP-43G298S). Estas relaciones FRET/CFP únicas se utilizan para todas las normalizaciones posteriores. Se analizaron 31 ROI para los controles del sensor de glucosa y se analizaron 24 ROI para TDP-43G298S.
- Traza las relaciones FRET/CFP para cada ROI y punto de tiempo frente al tiempo. Dentro de cada VNC, algunos de los ROI exhibirán una caída en las relaciones FRET / CFP después de la estimulación.
- Normalización basal: Calcule el promedio de las relaciones FRET/CFP durante los primeros 10 minutos (línea de base) y luego normalice las relaciones FRET/CFP individuales para cada punto de tiempo de todo el experimento hasta el promedio de referencia de 10 minutos (consulte la Figura 2B).
- Normalización del punto de tiempo: Normalice las relaciones TDP-43G298S FRET/CFP a las relaciones FRET/CFP solo desde el sensor de glucosa en cada punto de tiempo (ver Figura 3A).
- Gráficos de barras: Para las comparaciones de línea de base versus estimulación en forma de gráficos de barras, use relaciones FRET/CFP de 5-10 min (línea de base) y 15-20 min (estimulación) para cada genotipo. Normalizar la relación de estimulación con respecto a la relación basal (ver Figura 3B).
5. Análisis estadísticos
- Evalúe los conjuntos de datos normalizados utilizando la corrección de Mann-Whitney (para las normalizaciones basales y de punto de tiempo) o la prueba de Kruskall-Walis (para la representación de gráficos de barras de la estimulación frente a las relaciones FRET/CFP basales).
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Representative Results
Adquisición de imágenes del sensor de glucosa en el cordón nervioso ventral (VNC), ex vivo
Para determinar las diferencias en la absorción de glucosa en un modelo de ELA de Drosophila basado en TDP-43, se utilizó un sensor de glucosa basado en FRET codificado genéticamente. El sensor comprendía CFP y YFP fusionados al dominio de unión a glucosa del gen E. coli MglB. La unión a la glucosa provoca un cambio conformacional, que puede detectarse mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre el CFP y YFP 10,11,12. Cuando la glucosa no está unida al sensor, la excitación cfp causa emisión de CFP solamente, y cuando la glucosa se une, la señal YFP se puede detectar debido a que fret ocurre entre CFP y YFP(Figura 1A). El controlador D42 GAL4 se utilizó para expresar el sensor solo o junto con el mutante asociado a ALS TDP-43G298S en neuronas motoras a través del sistema de expresión bipartito UAS-GAL414. Las larvas del tercer instar se diseccionaron en tampón HL3 sin glucosa y se fijaron para exponer el sistema neuromuscular, incluido el VNC aún conectado a las uniones neuromusculares a través de los axones de las neuronas motoras. El VNC fue fotografiado usando una lente de inmersión en agua de 40x con una resolución espacial de 512 x 512 píxeles (ver Protocolo y Figura 1B). Las señales CFP y FRET se adquirieron en los 465-499 nm y 535-695 nm, respectivamente, después de la excitación CFP con el láser de 405 nm. La rebanada a fotografiar se eligió en función del plano donde el VNC era visible con un mínimo de seis neuronas motoras enfocadas a lo largo de la línea media. El plano seleccionado fue fotografiado durante 10 min, capturando una imagen cada 10 s para determinar la fluorescencia basal. Los archivos czi se guardaron como: genotype_sample#_baseline. Después de que se completó el curso de tiempo de 10 minutos para las condiciones basales, el tampón se reemplazó con HL3 suplementado con glucosa. La imagen se reenfocó para encontrar el mismo plano que se tomó en las condiciones de referencia. Se utilizó la misma configuración de imagen para todas las muestras. El VNC se volvió a visualizar durante 10 minutos adquiriendo una nueva imagen cada 10 s y se guardó como: genotype_sample #_post estimulación para análisis posteriores.
Análisis de imágenes
Un desafío significativo con los experimentos de imágenes en vivo es la deriva que experimentan las VNC durante el intervalo de imágenes de 20 minutos. Para abordar este problema, se utilizó un complemento de corrección de deriva, Stackreg, en FIJI antes del análisis de imágenes y la selección del ROI (consulte Protocolo y Figura 2A). Se seleccionaron 6-8 células/ROI individuales de cada VNC y se delinearon utilizando el canal FRET/YFP. Las selecciones se copiaron al canal CFP y los valores medios de gris se midieron utilizando la función multimedida. Las cuantificaciones se realizaron promediando primero las relaciones FRET/CFP por punto de tiempo, y luego calculando el promedio para los 10 minutos completos por genotipo. Estos promedios se utilizaron para normalizar las relaciones FRET/CFP en cada punto de tiempo y se trazaron a lo largo del tiempo para generar una primera evaluación de los datos(Figura 2B). Utilizando este enfoque de normalización, se encontró que tras la estimulación, las neuronas motoras de control que expresan el sensor de glucosa por sí solas, exhiben un aumento pequeño pero significativo en la absorción de glucosa (3,9%,valor de P < 0,0001), mientras que las neuronas motoras que expresan TDP-43G298S muestran una absorción de glucosa significativamente mayor (16,76%,valor de P < 0,0001). Estos datos son consistentes con la proteinopatía TDP-43 que causa un aumento de la captación de glucosa en las neuronas motoras, como se mostró anteriormente en la referencia9.
Análisis de datos: medición de la absorción de glucosa en las neuronas motoras en el VNC de Drosophila
Para obtener más información sobre las diferencias entre los controles y las neuronas motoras mutantes TDP-43G298S, cada relación FRET/CFP se normalizó al control en cada punto de tiempo(Figura 3A). Esto permite una comparación en la absorción de glucosa entre las neuronas motoras de ELA que expresan TDP-43G298S y las neuronas motoras de control que expresan el sensor de glucosa solo en tiempo real. En condiciones basales, no hubo diferencias entre los genotipos. Sin embargo, tras la estimulación con glucosa, se observó un aumento rápido (7,31% después de 1 min de aplicación de glucosa) y significativo (12,76% después de 10 min,valor de P < 0,0001) en la absorción de glucosa en TDP-43G298S en comparación con el control.
Los gráficos de barras ofrecen un enfoque alternativo para ilustrar las diferencias entre los genotipos (TDP-43G298S versus controles) antes y después de la estimulación de la glucosa(Figura 3B). Esto se hizo normalizando la relación FRET/CFP para ambas condiciones a la línea de base de los genotipos respectivos y trazando la relación promedio para los últimos 5 minutos de imágenes de referencia y estimulación, respectivamente. Tras la estimulación, las neuronas que expresan el sensor de glucosa solo muestran un aumento pequeño pero significativo en la relación FRET/CFP (3,83% ± 0,08%,valor de P < 0,0001) en comparación con la línea de base. Mientras que las neuronas que expresan TDP-43G298S mostraron un aumento significativo en la relación FRET/CFP tras la estimulación (14,73% ± 0,08%,el valor de P < 0,0001) en comparación con la línea de base. La diferencia neta en las relaciones FRET/CFP entre las neuronas motoras que expresan TDP-43G298S y el sensor de glucosa solo es del 10,9%(valor de P = 0,005). Este análisis también muestra que las proporciones se estabilizan alrededor de los últimos 5 minutos de cada imagen de curso de tiempo, por lo que se eligió este marco de tiempo para el gráfico. Este análisis proporciona una visión general de alto nivel de los resultados, incluidas las diferencias estadísticamente significativas entre los genotipos y los tratamientos en un gráfico.
Figura 1: Sensor FRET y adquisición de imágenes. (A) Diagrama de sensor de glucosa basado en FRET utilizado para medir la absorción de glucosa en las neuronas motoras. La unión a la glucosa hace que se produzca FRET. (B) Diagrama de disección de la unión neuromuscular (NMJ) que muestra el área fotografiada en el VNC. Imágenes a la izquierda que muestran TDP-43G298S antes y después de la estimulación de la glucosa en los canales FRET (YFP) y CFP. Barras de escala: 20 μm. Aumento: 40x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de imagen del sensor de glucosa en el contexto del mutante TDP-43. (A) Imágenes representativas de señales FRET y CFP en controles de sensores de glucosa y muestras TDP-43G298S en condiciones basales y de estimulación. Una neurona motora representativa se describe en cada imagen como un ejemplo de un ROI. Barras de escala: 20 μm. Aumento: 40x. (B) Las proporciones promedio de FRET/CFP en el sensor de glucosa y las neuronas motoras mutantes TDP-43 durante 20 min de imagen. Las proporciones se normalizaron a la relación basal promedio para cada genotipo (ver normalización basal en el Protocolo). Los valores mostrados son el promedio de 25-30 neuronas motoras (ROI) de 5 VNC por genotipo. Se utilizó Mann-Whitney para evaluar la significación estadística. =Valor de P < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de datos del sensor de glucosa en el contexto de TDP-43G298S. (A) Las relaciones FRET/CFP de TDP-43G298S se normalizan para el control del sensor de glucosa en cada punto de tiempo. Se utilizó Mann-Whitney para evaluar la significación estadística. =Valor de P < 0,0001. (B) La representación gráfica de barras de la absorción de glucosa en el control del sensor de glucosa y TDP-43G298S muestra un aumento significativo en la absorción de glucosa en las neuronas motoras de control tras la estimulación y en el contexto de TDP-43G298S en comparación con los controles. Se utilizó Kruskall-Walis para evaluar la significación estadística. ** =Valor de P < 0,01, **** =Valor de P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La técnica descrita en detalle aquí se puede aplicar para medir la absorción de glucosa en un tipo celular específico de interés en Drosophila viva utilizando FLII12Pglu-700μδ6, un sensor basado en FRET que puede detectar cambios en los niveles de glucosa a un rango milimolar10,11,12. Este sensor se ha utilizado previamente en conjunto con el sistema UAS-GAL4 para dirigir su expresión a tipos celulares específicos, incluidas las neuronas9,10. En este estudio, D42 GAL4 se utilizó para expresar FLII12Pglu-700μδ6 por sí solo o junto con la enfermedad asociada A TDP-43G298S para demostrar cómo este enfoque se puede utilizar para evaluar la absorción de glucosa en las neuronas motoras de la ELA. Además, este método se puede aplicar ampliamente para obtener imágenes de una multitud de sensores fluorescentes en el VNC larvario.
Los pasos críticos en el protocolo incluyen maximizar la relación señal-ruido. Con este fin, se establecieron parámetros de adquisición de imágenes de tal manera que la fluorescencia no esté sobresaturada y se pueda cuantificar el rango completo de intensidad de la señal. Los parámetros de imagen como la ganancia, la velocidad de escaneo, el tamaño estenopeico y el zoom se mantuvieron sin cambios durante todo el estudio. Los experimentos se realizaron durante varios días; sin embargo, en cada experimento se tomaron imágenes de ambos genotipos, es decir, los controles y el TDP-43G298S para tener en cuenta la variabilidad. La obtención de imágenes del SNC larval de Drosophila utilizando una lente de inmersión en agua podría dar lugar a cambios en el plano óptico con el tiempo. Se debe tener cuidado de evitar cambios drásticos en el plano óptico mediante el uso de suficiente búfer. Se descartaron muestras con cambios de enfoque.
Aunque las condiciones y los parámetros se mantienen sin cambios a lo largo de los experimentos, esta técnica requiere un cambio en el búfer durante la obtención de imágenes. Después de 10 minutos de imágenes, el tampón libre de glucosa debe reemplazarse con un tampón HL-3 suplementado con glucosa, lo que podría cambiar el plano focal óptico. La lente debe ser reenfocada al mismo plano focal para que el mismo conjunto de células sean fotografiadas antes y después de la suplementación con glucosa. Un subconjunto de neuronas motoras exhibió una caída en las relaciones FRET/CFP después de la estimulación. Esto indica que algunas neuronas no absorben glucosa, posiblemente debido al estrés causado por la disección y fueron eliminadas del análisis.
La selección del ROI, el procesamiento de imágenes y la cuantificación se realizaron utilizando Fiji/ImageJ. Si bien el ROI se selecciona manualmente en la primera imagen de la serie, es fundamental corregir la deriva menor en las imágenes de lapso de tiempo para mantener el ROI invariable a lo largo de la serie de imágenes. Se utilizó un complemento de corrección de deriva de código abierto, Stackreg, para explicar este problema.
La disponibilidad del láser de excitación correcto es una limitación importante para esta técnica. Aunque el láser de excitación de 436 nm es ideal para este sensor de glucosa, hemos demostrado que el sensor se puede utilizar con el láser de excitación de 405 nm, que está más ampliamente disponible. Otra limitación de esta técnica es que se puede utilizar para medir la dinámica de la glucosa, pero no las concentraciones absolutas de glucosa. Una posible estrategia alternativa para medir los niveles absolutos de glucosa es iGlucoSnFR-TS, un sensor de glucosa de por vida, que se puede calibrar para medir las concentraciones absolutas de glucosa15.
La glucosa es una fuente importante de energía en el cerebro y es necesaria para las funciones fisiológicas. Los defectos en el metabolismo de la glucosa se han asociado con varias condiciones patológicas (revisado en16). Drosophila es un potente modelo genético utilizado para estudiar trastornos neurodegenerativos17. Sin embargo, existen técnicas limitadas disponibles para medir directamente los niveles de glucosa en Drosophila. Este sensor de glucosa basado en FRET proporciona una medida directa de los cambios intracelulares en los niveles de glucosa. A pesar de algunos desafíos y limitaciones experimentales, este sensor se puede utilizar con éxito para estudiar la dinámica de la glucosa en tipos celulares específicos (por ejemplo, neuronas motoras, glía, músculos) en varios modelos de enfermedades, incluidos múltiples tipos de ELA y trastornos neurodegenerativos relacionados.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Stefanie Schirmeier y Takeshi Iwatsubo por proporcionar cepas de Drosophila. También agradecemos a Patricia Jansma por ayudar con las imágenes en el Marley Imaging Core de la Universidad de Arizona. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud NIH NS091299, NS115514 (a DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (a EM) y el Programa de Investigación de Biología de Pregrado (a HB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
References
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