Summary
Denne protokol præsenterer en metode til at øge procentdelen af tumorindholdet i formalinfikserede paraffinindlejrede vævsprøver.
Abstract
Tilstedeværelsen af kontaminerende ikke-tumorvæv i formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) væv kan i høj grad undergrave genomiske undersøgelser. Heri beskriver vi makrodissektion, en metode designet til at øge det procentvise tumorindhold i en vævsprøve ved at fjerne og eliminere uønsket væv inden udførelse af downstream-nukleinsyreekstraktioner. FFPE vævsblokke blev sektioneret til at producere 4-5 μm glidemonterede vævssektioner. Et repræsentativt afsnit blev indsendt til hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning og efterfølgende gennemgået af en bestyrelsescertificeret patolog. Under gennemgangen identificerede og markerede patologen regionerne af tumorvæv i H&E. Når den var færdig, blev den markerede H&E brugt til at guide resektion af de serielle ufarvede sektioner fra den samme vævsblok. For at demonstrere virkningerne af makrodissektion blev RNA ekstraheret fra matchede makrodissekterede og ikke-dissekerede diffuse store B-celle lymfomer (DLBCL) kørt på et digitalt genekspressionsassay, der var i stand til at bestemme DLBCL-subtype og BCL2-translokationsstatus. Resultaterne viste, at makrodissektion ændrede subtypen eller BCL2-translokationsstatusopkaldene i 60% af de undersøgte prøver. Afslutningsvis er makrodissektion en enkel og effektiv metode til udførelse af tumorberigelse forud for nukleinsyreekstraktioner, hvis produkt derefter med sikkerhed kan anvendes i nedstrøms genomiske undersøgelser.
Introduction
Formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) væv, indsamlet som en del af den normale kliniske diagnostiske proces og opbevaret i kliniske vævslagre, udgør en enorm ressource til human forskning, herunder kræftforskning1. Efterhånden som vores forståelse af menneskelig sygdom uddybes, bliver det mere og mere klart, at sygdomme, der tidligere blev anset for at være enkeltenheder baseret på morfologiske og immunophenotypiske egenskaber, faktisk består af forskellige molekylære undertyper, der kræver molekylære subtyping-assays. Følgelig er genomiske assays med høj følsomhed, der er i stand til at skelne disse undertyper, blevet stadig vigtigere2. Selvom FFPE-væv er kendt for at være dårligt kompatible med genomiske teknikker på grund af fikseringsrelaterede problemer, efterhånden som teknologi og protokoller udvikler sig, bliver disse teknikker i stigende grad kompatible med dette klinisk allestedsnærværende vævsformat 3,4,5. FFPE-væv er imidlertid ofte blandinger af tumor- og ikke-tumorvævsmaterialer, hvor tilstedeværelsen af ikke-tumormateriale ofte er uønsket og, hvis det er til stede i en høj andel, kan undergrave og påvirke resultaterne af genomiske analyser betydeligt6. Faktisk anvendes et tumorindhold på mindst 60 % ofte til sådanne analyser, hvor væv, der ligger under denne tærskel, kan udelukkes, selv om det ellers opfylder undersøgelseskriterierne7. Dette kan være særligt problematisk i sjældne sygdomsindstillinger, hvor patientvæv er dyrebart og vanskeligt at indsamle i stort antal.
Makrodissektion er en metode, der minimerer virkningerne af lavt tumorindhold ved at reducere mængden af normalt væv3. Fjernelsen af sådant forvirrende ikke-tumormateriale før nukleinsyreekstraktion kan signifikant øge tumorprocentindholdet og dermed tumorrenheden af de ekstraherede nukleinsyrer. Vævsresektion er kritisk afhængig af ekspert patologisk gennemgang, hvor tumorregionen identificeres og cirkles på en frisk genereret hæmatoxylin og eosin (H&E) farvet vævssektion af en bestyrelsescertificeret patolog8. Den cirklede H&E bruges derefter til at guide fjernelse og indsamling af henholdsvis uønsket og målvæv. Denne protokol beskriver trinene i makrodissektion fra patologisk gennemgang gennem vævshøstning som udført på AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory på Mayo Clinic.
Protocol
Alle prøver blev indsamlet og anvendt i overensstemmelse med godkendte Mayo Clinic IRB-protokoller (PR16-000507 og PR2207-02).
1. Forberedelse af prøve
- Tænd for vævsflådningsvandbadet. Indstil temperaturen til 39 °C, og lad vandet komme i temperatur. Sug træopsamlingspinde i vandbadet.
- Identificer og hent de FFPE-vævsblokke, der skal sektioneres.
- Pre-label mikroskop dias ved hjælp af en histologi kvalitet permanent markør, der kan modstå opløsningsmiddelvask.
- Brug en mikrotom til at sektionere FFPE-blokkene. Skær mindst 2 sektioner med fuld overflade i en tykkelse på 4-5 μm pr. sektion for hver blok (figur 1A).
- Overfør det nyskårne bånd af vævssektioner til det forvarmede vævsflådebad til glidemontering (figur 1B, C).
BEMÆRK: Det varme vand hjælper med at "stryge" rynkerne i sektionerne (figur 1C). - Håndter hver sektion sekventielt, brug pincet til at bryde en enkelt sektion væk fra båndet (figur 1D).
- Saml den enkelte sektion på et formærket mikroskopglas.
- Nedsænk mikroskopglasset i en vinkel under sektionen, og placer diaset således, at kanten af vævssektionen berører diaset (figur 1E).
- Når du er i kontakt med vævssektionen, skal du trække glideren langsomt ud af flydebadet for at lade vævssektionen rette sig ud mod diaset, når det kommer ud af vandet (figur 1F).
- Monter 1 vævssektion pr. dias, og gentag, indtil alle sektionerne er samlet.
- Lad de glidemonterede vævssektioner tørre grundigt ved stuetemperatur (RT).
2. Patologisk gennemgang
- Udfør H&E-farvning på en repræsentativ vævssektion for hver blok9.
- Indsend de nyfarvede H&Es til patologisk gennemgang af en bestyrelsescertificeret patolog.
BEMÆRK: Under gennemgangen bestemmer og registrerer patologen procentdelen af tumorindholdet i hvert væv og cirkler tumorområdet på hvert H&E-dias (se figur 2 og figur 3, række 1). Tabel 1 skitserer procentdelen af tumorindhold efter cellularitet bestemt under den patologiske gennemgang af H&E'erne for prøver A-E vist i figur 3, række 1. Sektioner med <60% tumorindhold kræver makrodissektion7. Antallet af sektioner, der er nødvendige til nukleinsyreekstraktion, afhænger af størrelsen af det cirklede tumorområde. Hvis der blev skåret utilstrækkelige sektioner i protokollens afsnit 1, og yderligere nedskæringer er mulige, skal der muligvis skæres yderligere sektioner.
3. Deparaffinisering
- I en røghætte skal du fylde to glasfarvningsfade med ufortyndet histologikvalitet d-Limonen eller et d-Limonenbaseret opløsningsmiddel og 1 glasfarvningsskål med ufortyndet 200-bevis ethanol af molekylær kvalitet.
FORSIGTIG: Undgå d-Limonene kontakt med hud og øjne, undgå indånding af damp eller tåge, og hold dig væk fra antændelseskilder. Hold ethanol væk fra varme, gnister og åben ild, undgå spild og kontakt med hud eller øjne, ventilér godt ud og undgå at indånde dampe.
BEMÆRK: Fyld opvasken tilstrækkeligt til at nedsænke de ristede dias (figur 4A); 250 ml er påkrævet for at fylde de viste 20-diasfarvede retter. Udskift d-Limonene og ethanol vasker efter hver 40 dias. D-Limonen (C10H16) er et alternativt, tilsvarende effektivt og mindre giftigt afvoksningsmiddel til xylen, der bliver mere almindeligt i histologiske metoder og giver nukleinsyre af god kvalitet efter ekstraktion 10,11,12,13,14. Selv om denne protokol kan udføres ved hjælp af mere biovenlige alternativer15, er deres eventuelle virkninger på ekstraheret nukleinsyrekvalitet endnu ikke bestemt. - Rack det ufarvede FFPE-væv monteret glider ind i Glass Coplin-glidestativerne (figur 4A, indsat).
- Nedsænk de rackede dias i d-Limonene vask 1 i 2 minutter; agitere forsigtigt i de første 20 s.
BEMÆRK: For at minimere overførsel mellem vaske, når du fjerner stativet med dias fra en vask, skal du lade stativet tømme kort, før du forsigtigt dupper bunden af stativet på silkepapir for at fjerne overskydende vask. - Nedsænk de rackede dias i ufortyndet D-Limonene vask 2 i 2 minutter; agitere forsigtigt i de første 20 s. Fjern, tøm og dup stativet igen.
- Nedsænk de ristede glider i ethanolvasken i 2 minutter; agitere forsigtigt i de første 20 s. Fjern stativet og læg det på et absorberende væv for at dræne. Lad gliderne lufttørre i mindst 10 minutter, men ikke mere end 2 timer.
3. Makrodissering
- På bænken skal du fylde en Coplin glaskrukke med 50 ml 3% glycerol i DNase / RNase frit vand
BEMÆRK: Udskift glycerolvasken efter hver 40 dias. - Formærk og udfyld 1,5 ml mikrorør med 160 μL vævsfordøjelsesbuffer pr. Mikrorør.
BEMÆRK: Nukleinsyreekstraktioner udført efter makrodissektion anvendte et DNA / RNA FFPE-ekstraktionssæt (materialetabel). Vævsfordøjelsesbufferen, der blev anvendt i denne protokol, omfattede således 10 μL proteinase K og 150 μL PKD-buffer. - Spor de patologiske markeringer på H&E på bagsiden af de deparaffiniserede vævsglas.
BEMÆRK: Sammenlignet med ikke-deparaffiniseret væv (figur 3, række 2 og figur 4B) er deparaffiniserede væv hvide og meget synlige (figur 3, række 3 og figur 4C). Det er denne øgede synlighed og mærkbarhed af deparaffiniserede vævsfunktioner, der tillader makrodissering. Placer H&E med forsiden nedad på bænken og placer forsiden af den deparaffiniserede rutsjebane mod bagsiden af den matchede patolog, der er gennemgået H&E (figur 4D). Juster det deparaffiniserede væv med H&E-vævet (figur 4E). Sporing af patologens markeringer er et kritisk trin i makrodissektionsprocessen, og man skal sørge for at gengive disse markeringer så nøjagtigt som muligt. Dette kan være særligt udfordrende for små og eller frakoblede væv såsom prøve B, D og E (figur 3, figur 4E og figur 4E indsat i). For at hjælpe med sporing skal man bruge en blækfin eller ultrafin nibbed markør (figur 4E, indsat ii) til at spore de patologtegnede markeringer. Ethanolservietter kan være nyttige til at fjerne fejl og tillade sporing igen, hvis det er nødvendigt. - Drej det nu markerede deparaffiniserede glidevæv med forsiden opad og spor markørens linje med hjørnet af et rent barberblad for at forskære kanterne af tumorområdet.
- Håndtering af hvert dias sekventielt, dypp de deparaffiniserede dias i 3% glycerolopløsningen. Sørg for, at vævet er helt nedsænket, før du fjerner diaset langsomt (figur 4F).
BEMÆRK: Formålet med glyceroldypningen er at dæmpe vævet for at hjælpe vævsindsamling, men også for at reducere opbygningen af statisk ladning, der kan forårsage frastødning mellem vævet og plastmikrorøret, hvor det opsamlede væv skal placeres. - Tør forsigtigt bagsiden af diaset med et væv for at fjerne overskydende glycerolopløsning, og læg diaset på bænken, tørret side med forsiden nedad. Lad vævene kortvarigt lufte i 1-2 min.
BEMÆRK: Overførsel af overskydende glycerol til ekstraktionsprocessen kan påvirke udbyttet og kvaliteten af nukleinsyreekstraktioner negativt. Væv skal være let fugtigt, men ikke synligt vådt, når det opsamles. - Afhængigt af hvor tumorområdet af interesse er placeret på diaset, skal du bruge barberbladets flade kant til enten (a) direkte at opsamle tumorvævet ved hjælp af barbermaskinen til at skrabe / samle vævet af interesse fra diaset eller (b) fjerne og kassere ikke-tumorvæv først, før du samler tumorvævet af interesse (figur 3).
BEMÆRK: Opsamlet væv har tendens til at samle sig eller rulle op i bunden af bladet (figur 4G) - Brug en træpind til at fjerne det opsamlede væv fra bladet (figur 4H og indsats) og overfør det til det relevante formærkede og fyldte mikrorør (figur 4I).
BEMÆRK: Fordøjelsesbufferen tjener til at "trække" vævet fra træplukket ind i væsken. - Fortsæt til nukleinsyreekstraktion.
BEMÆRK: Nukleinsyreekstraktioner blev afsluttet ved hjælp af DNA / RNA FFPE-ekstraktionssættet i henhold til producentens anvisninger, og de resulterende nukleinsyrer blev kvantificeret ved hjælp af et UV-vis-spektrofotometer. Det resulterende RNA blev kørt på det digitale genekspressionsprofileringsbaserede DLBCL90-assay16.
Representative Results
I alt 5 diffuse store B-celle lymfom (DLBCL) FFPE vævsblokke blev sektioneret, og de resulterende sektioner var enten makrodissekerede eller ikke før nukleinsyreekstraktion. Det ekstraherede RNA blev kørt på DLBCL90-assay16. Makrodissektionerede prøver blev kørt to gange, en gang ved anvendelse af 5 μL RNA-lagerkoncentration, men ikke mere end 300 ng total RNA-input og en gang ved anvendelse af 5 μL RNA-lager fortyndet for at matche RNA-input fra deres respektive ikke-dissekerede modstykker. DLBCL90-resultaterne er beskrevet i tabel 2.
DLBCL består af 3 forskellige oprindelsescelleundertyper (COO) med forskellig terapeutisk lydhørhed, nemlig GCB, ABC og en mellemgruppe kendt som uklassificeret eller UNC17,18. Translokationer, der involverer MYC, BCL2 og eller BCL6 alene eller i kombination (dobbelt eller tredobbelt hit), observeres også ofte i DLBCL, især i GCB-undertype19. DLBCL90-analysen er en udvidelse af sin forgænger, lymf2Cx klinisk assay, og er således i stand til DLBCL COO-subtypebestemmelse, men blev hovedsageligt udviklet til at identificere prøver, der huser dobbelt hit (DH) translokationer, der involverer BCL2 ved hjælp af digital genekspression som et alternativ til fluorescens in-situ hybridisering (FISH)16,20. Resultaterne i tabel 2 viser, at makrodissektion ændrede enten COO- eller DHITsig-status for 60% (3/5) af de undersøgte prøver.
Makrodissektion af prøve A havde ingen effekt på COO-opkaldet, men ændrede DHITsig-opkaldet fra NEG til UNCLASS, og denne ændring blev observeret uanset det makrodisserede prøve-RNA-input og med lignende sandsynlighedsscorer (0,224, 0,254). I modsætning hertil havde makrodissektion af prøve C ingen effekt på DHITsig-opkaldet, men ændrede COO-opkaldet fra GCB til UNCC. Igen blev denne ændring observeret uanset makrodissekteret prøve-RNA-input. Ved 0,117 var COO-opkaldssandsynligheden imidlertid tættere på opkaldstærsklen på 0,1 for den makrodissektionerede prøve med reduceret RNA-input. I lighed med prøve A havde makrodissering af prøve E ingen effekt på COO-opkaldet, men ændrede DHITsig-opkaldet. For prøve E ændrede opkaldet sig imidlertid fra UNCLASS til NEG og gjorde det uanset det makrodisserede prøve-RNA-input med rimeligt lignende sandsynlighedsopkald (0,849, 0,833). Især giver denne opkaldsændring til DHITsig NEG biologisk mening, da prøve E blev fundet til ABC-DLBCL, og dobbelt hit-translokationer, der involverer BCL2, er rapporteret udelukkende observeret i GCB-DLBCL19.
Figur 1: Generering af glidemonterede vævssektioner ved hjælp af en mikrotom. (A) FFPE-vævsblok, der holdes på plads af mikrotompatronen og skæres for at producere et bånd af sekventielle FFPE-vævssektioner. (B) Ved hjælp af forvædede træpinde opsamles båndet fra mikrotomet og overføres til et varmtvandsbad. (C) Vandets varme hjælper med at stryge folderne i vævsbåndet. (D) Individuelle FFPE-vævssektioner fjernes fra vævsbåndet ved at placere lukkede tang ved krydset mellem to sektioner og forsigtigt åbne tangen, som bryder sektioner væk fra hinanden. (E) Sektioner opsamles fra vandet ved at nedsænke et glasglas i en vinkel og forsigtigt bevæge siden mod vævssektionen, indtil kanten af sektionen berører glasglasset. (F) Når diaset og sektionen rører ved, skal du langsomt fjerne diaset fra vandet, så vævssektionen falder flush mod diaset. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Patologi og histologisk gennemgang af en hæmatoxylin og eosin (H&E) farvede sektioner. (A, B) H&E-vævssektionen underkastes mikroskopisk gennemgang af en bestyrelsescertificeret patolog. (C,D) Når patologen har set hele vævet og fundet ud af, at det ikke er 100% tumorvæv, vil patologen bruge en markør til at omringe tumorområdet i vævet. (E,F) At holde den markerede H&E mod den oprindelige FFPE-vævsblok viser, at ikke alt vævet er tumormateriale. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vævsprøver. Dette billede viser de patologisk gennemgåede og tumormærkede H&Es (række 1), ubehandlede diasmonterede FFPE-vævssektioner (række 2), deparaffiniserede diasmonterede FFPE-vævssektioner (række 3), deparaffiniserede diasmonterede FFPE-vævssektioner med patologimarkeringer sporet på bagsiden af diaset (række 4), deparaffiniserede og makrodisserede diasmonterede FFPE-vævssektioner (række 5) til de 5 prøver (A-E), der bruges til at demonstrere denne protokol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Deparaffinisering og makrodissektion af FFPE-vævssektioner: (A) I en røghætte vaskes FFPE-væv monteret i et diasstativ i to d-limonenvaske og en ethanolvask. (B,C) Efter vask er al paraffin fjernet, og kun vævet forbliver på diaset, som nu er hvidt og meget synligt sammenlignet med dets forvaskede modstykke. (D) Den deparaffiniserede glidemonterede vævssektion placeres med forsiden nedad på bagsiden af dens matchende mærke H&E. (E) Tumorområdemarkeringer på H&E spores derefter på bagsiden af det deparaffiniserede dias ved hjælp af en fin eller ultrafin nibbed permanent markør (F) Den markerede deparaffiniserede diasmonterede vævssektion dyppes derefter i en glycerolvask for at dæmpe vævssektionen til opsamling. Diaset fjernes langsomt fra glycerol, og bagsiden af diaset tørres af med et væv for at fjerne overskydende glycerol, inden glidevævet lægges med forsiden opad på bænken. (G) Ved hjælp af den flade side af et rent barberblad makrodisponeres vævet, og det uønskede væv uden for patologmarkeringer kasseres, inden det væv, der samler sig langs bladets kant, opsamles. (H) En træpind bruges til at fjerne det opsamlede væv fra kanten af bladet. (I) Vævet overføres derefter til en præmærket mikrorørfyldt vævsfordøjelsesbuffer og er klar til nukleinsyreekstraktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Eksempel på id | Hele væv (a) | Cirkuleret område af væv (b) | Samlet tumorindhold i hele væv (c) | Fold stigning i tumorindhold ved makrodissektion (d) | Ikke makrodissekverteret (e) | Makrodisseret (f) | ||||
| % levedygtig tumor | % Andet | % levedygtig tumor | % Andet | # af 5 μm dias ekstraheret | RNA konc (ng/μL) | # af 5 μm dias ekstraheret | RNA konc (ng/μL) |
|||
| Prøve A | 60 | 40 | 75 | 25 | 45 | 1.7 | 2 | 19.0 | 4 | 58.3 |
| Prøve B | 60 | 40 | 65 | 35 | 39 | 1.7 | 1 | 34.0 | 2 | 60.0 |
| Prøve C | 40 | 60 | 65 | 35 | 26 | 2.5 | 1 | 13.7 | 2 | 46.2 |
| Prøve D | 35 | 65 | 90 | 10 | 32 | 2.9 | 1 | 57.3 | 2 | 60.0 |
| Prøve E | 20 | 80 | 30 | 70 | 6 | 5.0 | 3 | 25.2 | 3 | 44.6 |
Tabel 1: Patologi gennemgangsdata. Tabellen viser (a) procentdelen af levedygtig tumor i hele vævsafsnittet efter område, (b) procentdelen af levedygtig tumor i det område, der cirkuleres / markeres af patologen under gennemgangen ved cellularitet, (c) den estimerede samlede tumorcellulæritet af hele vævet (a x b), (d) den estimerede foldforøgelse i tumorcellulæritet opnået med makrodissektion, e og f) antallet af 5 μm ufarvede FFPE-glidemonterede vævssektioner ekstraheret og de resulterende RNA-koncentrationer for matchede ikke-makrodissektionerede og makrodisserede prøver. % Andet henviser til alle andre væv, der er til stede i en given prøve, som ikke er tumorvæv og kan omfatte bindevæv, stromale fibroblaster, blodkar samt andre iboende stromale elementer. Klik her for at downloade denne tabel.
| Eksempel på id | RNA-indgang (ng) | DLBCL90 COO opkald | Sandsynlighed for DLBCL90-opkald | DHITsig opkald | DHITsig pos sandsynlighed | DHITsig neg sandsynlighed | |
| Ikke makrodissekteret | Prøve A | 95.0 | GCB | 0.000 | Neg | 0.135 | 0.865 |
| Prøve B | 170.0 | GCB | 0.000 | Neg | 0.032 | 0.968 | |
| Prøve C | 68.5 | GCB | 0.028 | Neg | 0.033 | 0.967 | |
| Prøve D | 286.5 | Abc | 0.998 | Neg | 0.002 | 0.998 | |
| Prøve E | 126.0 | Abc | 0.989 | AFLASTNING | 0.212 | 0.788 | |
| Makrodissekteret | Eksempel på A_M | 291.7 | GCB | 0.000 | AFLASTNING | 0.224 | 0.776 |
| Eksempel på B_M | 300.0 | GCB | 0.000 | Neg | 0.016 | 0.984 | |
| Eksempel C_M | 231.2 | AFLASTNING | 0.210 | Neg | 0.015 | 0.985 | |
| Eksempel på D_M | 300.0 | Abc | 0.999 | Neg | 0.002 | 0.998 | |
| Eksempel på E_M | 223.2 | Abc | 0.987 | Neg | 0.151 | 0.849 | |
| Makrodissekteret &RNA fortyndet | Eksempel på A_M | 95.0 | GCB | 0.000 | AFLASTNING | 0.254 | 0.746 |
| Eksempel på B_M | 170.0 | GCB | 0.000 | Neg | 0.023 | 0.977 | |
| Eksempel C_M | 68.5 | AFLASTNING | 0.117 | Neg | 0.027 | 0.973 | |
| Eksempel på D_M | 286.5 | Abc | 0.999 | Neg | 0.002 | 0.998 | |
| Eksempel på E_M | 126.0 | Abc | 0.995 | Neg | 0.167 | 0.833 | |
Tabel 2: DLBCL90 digitale genekspressionsassayresultater. Fem prøver (A-E) var enten ikke makrodissekterede eller makrodisserede, før nukleinsyreekstraktioner blev udført. Det resulterende RNA blev kørt på DLBCL90-assayet, for hvilket det maksimale RNA-indgangsvolumen er 5 μL. Ikke-makrodisserede prøver blev kørt under anvendelse af 5 μL lager-RNA. Hver makrodissekverteret prøve blev kørt to gange under anvendelse af (a) 5 μL stock RNA, medmindre aliquoter på 60 ng/ μL var mulige og (b) 5 μL stock RNA fortyndet for at matche koncentrationerne / input af deres ikke-makrodisserede modstykker. Suffikset _M angiver, at prøven var makrodissekuteret. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
FFPE væv er ofte heterogene blandinger af tumor og ikke-tumor væv. Genomiske tests med høj følsomhed bliver mere og mere udbredt i både kliniske og forskningsmæssige indstillinger, men kan blive forvirret af tilstedeværelsen af forurenende ikke-tumorvæv. Faktisk anbefales et minimum tumorindhold på 60% ofte til genomiske undersøgelser. Procent tumor kan bestemmes af det vævsområde, der optages af tumormaterialet eller af andelen af tumorceller i vævet. Selvom tumor efter område er en almindeligt anvendt metrik for tumorrenhed, skildrer den ikke altid en nøjagtig beskrivelse af vævet. Overvej to væv, begge med 1000 celler, hvoraf 500 er tumorceller. I væv A er de 500 ikke-tumorceller stromale celler med lignende volumener som tumorcellen. I dette væv kan procentdelen af tumor betragtes som 50% af både cellularitet og areal. I væv B er de 500 ikke-tumorceller fedtceller med volumener, der er 4x tumorcellens. I dette væv er procentdelen tumor stadig 50% efter cellularitet, men 20% efter område. Et tredje væv, væv C, består af 500 tumorceller plus 400 fedtceller og 800 stromale celler med volumener, der er henholdsvis 4x og 0,5x tumorcellernes. Givet 100 fedtceller svarer til volumenet af 800 stromale celler, er procentdelen af tumor af væv C 29% efter cellularitet (500/1700), men stadig 20% efter område. Væv D består også af tumor-, fedt- og stromale celler med volumenforhold på 1x, 4x og 0,1x. Antallet af celler er dog henholdsvis 400, 10 og 720. Således er procentdelen tumor af væv D 35% efter cellularitet (400/1130), men 78% efter område. Disse eksempler er alt for forenklede og afspejler ikke vævssammensætninger i den virkelige verden, men formidler klart vigtigheden af vævssammensætning og forskellen mellem tumorindhold efter område og efter cellularitet. Det er vigtigt, at når det kommer til berigelse af tumorindhold til downstream nukleinsyreekstraktion, er tumorcellulæritet den vigtigere egenskab på grund af det øgede confoundingspotentiale ved ekstraktion af genomisk materiale fra flere ikke-tumorceller end tumorceller. Dette understreger ikke kun behovet for at vurdere tumorindholdet i væv med hensyn til procentvis cellularitet, men også behovet for at fjerne uønsket væv for at minimere eventuelle negative virkninger af ikke-tumorvævet. Der er flere metoder til rådighed til vævsberigelse, hvor de vigtigste er makrodissivektion og mikrodissicering.
Makrodissektion, metoden beskrevet i denne protokol, er relativt hurtig, enkel og kræver ikke dyrt eller specialiseret udstyr. Selvom makrodissektion i høj grad kan forbedre tumorindholdet, er det vigtigt at forstå, at det ikke fuldstændigt eliminerer ikke-tumormateriale. Formålet med makrodissektion er at berige vævet af interesse tilstrækkeligt gennem udelukkelse af uønsket væv for at reducere "støj" fra uønsket væv, hvilket igen kan forbedre signalet om interesse fra vævet af interesse. Makrodissektion medieret tumorberigelse er således en måde at forbedre signal-støj-forholdet for bedre at detektere markører af interesse, især tumorspecifikke molekylære markører med lav overflod eller dårlig ekspression. Makrodissektion har imidlertid begrænsninger på grund af manglen på præcision, der tilbydes af grove værktøjer såsom barberblade og er modtagelig for præcisionsproblemer, der stammer fra linjetykkelsen af patologens markør, samt potentielle fejl ved sporing af patologernes H&E-afgrænsninger. Som nævnt ovenfor er det ikke muligt at opnå 100% tumorrenhed på grund af tilstedeværelsen af iboende og tumorfremkaldende stromale elementer (dvs. bindevæv, stromale fibroblaster, blodkar, godartede reaktive lymfocytter, makrofager) indlejret i selve tumoren. Faktisk inducerer mange invasive eller diffust infiltrative maligniteter et robust desmoplastisk stromalt respons, hvilket resulterer i klynger af tumorceller, der er tæt blandet med stromale fibroblaster og andre ikke-neoplastiske celletyper; hvor tumorer forbundet med dette stromale reaktionsmønster, såsom kræftvævi bugspytkirtlen 21, kan drage større fordel af digitalt guidet mikrodissektion snarere end manuel makrodissektion.
Manuel mikrodissivektion udføres under et mikroskop for at hjælpe identifikation, dissektion og isolering af vævsspecifikke celler eller populationer ved hjælp af en nål eller skalpel og har fordelen ved øget præcision i forhold til makrodissektion22. Manuel mikrodissektion er imidlertid en besværlig proces, der mangler den finesse, der er nødvendig for komplekse væv med lavt tumorindhold eller indviklede funktioner, der er uforenelige med manuel dissektion. Sådanne væv kan dissekeres ved hjælp af automatiserede metoder med høj præcision som laserfangst mikrodissektion. Faktisk har digitalt guidet mikrodissektion vist sig at give højere procentdel tumorindhold sammenlignet med manuel makrodissektion i kræftvæv i bugspytkirtlen23. Ulemperne ved disse automatiserede metoder med høj præcision, såsom behovet for specialiseret, dyrt udstyr og højtuddannede personer, har imidlertid hindret dets inkorporering i arbejdsgange. En undersøgelse af de Bruin et al., der sammenlignede virkningerne af makrodissektion og laserfangstmikrodissektion (LCM) på genekspressionsprofilering, viste, at LCM-prøver havde lave samlede RNA-udbytter (30 ng gennemsnit) og krævede to runder mRNA-amplifikation for at opfylde cDNA-bibliotekets prep-inputtærskel24. Forfatterne fandt ud af, at de resulterende LCM-genekspressionsprofiler blev påvirket af runderne af mRNA-amplifikation mere end makrodissektionsprofiler blev påvirket af ikke-tumorstromale bidrag og konkluderede, at makrodissektion kunne anvendes tilstrækkeligt til at generere pålidelige genekspressionsdata24.
En væsentlig fordel ved NanoString digital genekspressionsprofilering, især når man arbejder med stærkt nedbrudt FFPE-afledt RNA, er, at det ikke kræver enzymatiske afhængige processer såsom RNA-amplifikation eller forberedelse af cDNA-biblioteker. Imidlertid er assays typisk optimeret til input mellem 50-300 ng af total RNA25,26, som baseret på resultaterne af de Bruin et al.24 muligvis ikke er kompatible med mikrodissekteret væv uden at øge vævsinputtet; en ugunstig efterspørgsel i en tid, hvor vævsprøver i stigende grad indsamles som små biopsier snarere end kirurgiske resektion. RNA-indgangene, der blev anvendt til DLBCL90-assayet, varierede fra 68,5-300 ng for både det makrodissektionerede og ikke-dissekerede væv. Resultaterne viser, at makrodissektion resulterede i opkaldsændringer i 60% af de undersøgte prøver, og at disse ændringer blev observeret uanset RNA-input af de makrodisserede prøver. COO-sandsynligheden for det lave RNA-input greb imidlertid ind i COO GCB /UNC-sandsynlighedsopkaldstærsklen, hvor tærsklerne er 0 til <0,1 for GCB, 0,1-0,9 for UNC og > 0,9 til 1,0 for ABC-opkald20. De vigtigste DLBCL COO-undertyper er GCB og ABC, som udgør 41% og 44% af alle DLBCL-tilfælde, hvor UNC repræsenterer en mellemgruppe af de to og ABC er den mest aggressive20,27. Mens COO-opkaldsændringen ved makrodissering af prøve C således ikke forårsagede en ærlig ændring i COO-undertype fra GCB til ABC, kan ændringen fra GCB til UNC antyde et skift i retning af en mere aggressiv sygdom. Desuden viser nylige undersøgelser, at UNC-undertypen ikke blot er en mellemliggende undertype, og at den potentielt kan besidde subtypespecifikke terapeutisk udnyttelige egenskaber28. Tilsvarende forårsagede makrodissering af prøver A og E ikke ærlige ændringer i DHITsig-opkald fra DH-negativ til DH-positiv eller omvendt. Imidlertid er bevægelserne af en GCB-prøve (prøve A) fra NEG til UNCLASS og en ABC-prøve (prøve E) fra UNCLASS til NEG ved makrodissektion biologisk passende, da dobbelt hittranslokationer, der involverer BCL2, rapporteres at være et udelukkende GCB-fænomen19. Selvom translokationer traditionelt og allestedsnærværende detekteres af FISH i kliniske omgivelser, er der et voksende momentum for at identificere en alternativ mindre involveret og tidskrævende metode til deres påvisning. DLBCL90-analysen er et vigtigt værktøj, der imødekommer dette behov, hvor begrundelsen for dets anvendelse styrkes ved konstateringen af, at dette assay er i stand til at detektere translokationer kryptiske til FISH-sonder, der anvendes i klinisk diagnostik29.
Makrodissektionsprotokollen beskrevet ovenfor skitserer en simpel metode, der gør det muligt for forskere at øge tumorindholdet i vævsprøver, der normalt ville falde under almindeligt anvendte undersøgelseskriterier. Inkludering af makrodissektion i en undersøgelsesarbejdsgang gør det muligt for forskere at redde dårligt tumortæt væv fra undersøgelsesudelukkelse ved at øge deres tumorindhold. Til gengæld tillader dette øget tillid til, at de resulterende RNA- og DNA-eluater repræsenterer tumoren under genomisk undersøgelse. Selvom der findes andre mere præcise metoder til vævsdissektion, er makrodissektion sandsynligvis tilstrækkelig for tumorer, der vokser på en mere ekspansiv, ikke-infiltrativ, arklignende eller solid måde. Resultaterne præsenteret her fremhæver vigtigheden af tumorrenhed i genomiske assays og makrodissektion som et pålideligt værktøj til at opnå dette.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af NIH-finansieret AIDS og Cancer Specimen Resource (ACSR, UM1 CA181255-2) under sit biospecimen videnskabsprogram. Videoen blev filmet, og redigering efter produktionen blev udført af Mayo Clinic Media Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200-proof ethanol | Decon | 2701 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | DNA/RNA FFPE extraction kit |
| Coplin pots | Various | x | |
| DLBCL90 probes | NanoString | various | Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay |
| d-Limonene | VWR | 89376-092 | |
| Forceps | Various | x | |
| Glass micrscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Glycerol | VWR | 0854-1L | |
| Master kits | NanoString | various | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Microtubes | Ambion | AM12400 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation |
| nCounter | NanoString | x | Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay |
| Permanent marker | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Razor blade dispenser | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
| Razor blades | Electrib Microscope Sciences | 71985-23 | |
| Tissue digestion buffer | Qiagen | 80234 | |
| Ultrapure water | VWR | SH30538.02 | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Robetorye, R. S., Maguire, A., Rosenthal, A. C., Rimsza, L. M. Profiling of lymphoma from formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Seminars in Hematology. 56 (1), 46-51 (2019).
- Moorcraft, S. Y., Gonzalez, D., Walker, B. A. Understanding next generation sequencing in oncology: A guide for oncologists. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 96 (3), 463-474 (2015).
- Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PLoS One. 12 (6), 0178706 (2017).
- Oh, E., et al. Comparison of accuracy of whole-exome sequencing with formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen tissue samples. PLoS One. 10 (12), 0144162 (2015).
- Holley, T., et al. Deep clonal profiling of formalin fixed paraffin embedded clinical samples. PLoS One. 7 (11), 50586 (2012).
- Network T.C.G.A.R. TCGA Tissue sample requirements: High quality requirements yield high quality data. , Available from: https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers (2021).
- Javey, M., et al. Innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 23 (4), 399-406 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Duan, Q., Zhang, H., Zheng, J., Zhang, L. Turning cold into hot: Firing up the tumor microenvironment. Trends in Cancer. 6 (7), 605-618 (2020).
- Kim, Y. W., et al. Safety evaluation and risk assessment of d-Limonene. Journal of Toxicology and Environmental Health Part B: Critical Reviews. 16 (1), 17-38 (2013).
- Foti, C., et al. Occupational contact dermatitis to a limonene-based solvent in a histopathology technician. Contact Dermatitis. 56 (2), 109-112 (2007).
- Meuse, C. W., Barker, P. E. Quantitative infrared spectroscopy of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens: paraffin wax removal with organic solvents. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 17 (6), 547-552 (2009).
- Schmeller, J., et al. Setting out the frame conditions for feasible use of FFPE derived RNA. Pathology - Research and Practice. 215 (2), 381-386 (2019).
- Prema, V., et al. Biofriendly substitutes for xylene in deparaffinization. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 12, Suppl 1 623-630 (2020).
- Ennishi, D., et al. Double-hit gene expression signature defines a distinct subgroup of germinal center B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 37 (3), 190-201 (2019).
- Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503-511 (2000).
- Rosenwald, A., et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 346 (25), 1937-1947 (2002).
- Scott, D. W., et al. High-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangements with diffuse large B-cell lymphoma morphology. Blood. 131 (18), 2060-2064 (2018).
- Scott, D. W., et al. Determining cell-of-origin subtypes of diffuse large B-cell lymphoma using gene expression in formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Blood. 123 (8), 1214-1217 (2014).
- Heinrich, M. A., Mostafa, A., Morton, J. P., Hawinkels, L., Prakash, J. Translating complexity and heterogeneity of pancreatic tumor: 3D in vitro to in vivo models. Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 265-293 (2021).
- Erickson, H. S., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R.
- Geiersbach, K., et al. Digitally guided microdissection aids somatic mutation detection in difficult to dissect tumors. Cancer Genetics. 209 (1-2), 42-49 (2016).
- de Bruin, E. C., et al. Macrodissection versus microdissection of rectal carcinoma: minor influence of stroma cells to tumor cell gene expression profiles. BMC Genomics. 6, 142 (2005).
- Ramsower, C. A., et al. Clinical laboratory validation of the MCL35 assay for molecular risk stratification of mantle cell lymphoma. Journal of Hematopathology. 13 (4), 231-238 (2020).
- Maguire, A., et al. Enhanced DNA repair and genomic stability identify a novel HIV-related diffuse large B-cell lymphoma signature. International Journal of Cancer. 145 (11), 3078-3088 (2019).
- Rosenwald, A., Staudt, L. M. Gene expression profiling of diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia & Lymphoma. 44, Suppl 3 41-47 (2003).
- Wright, G. W., et al. A probabilistic classification tool for genetic subtypes of diffuse large B cell lymphoma with therapeutic implications. Cancer Cell. 37 (4), 551-568 (2020).
- Hilton, L. K., et al. The double-hit signature identifies double-hit diffuse large B-cell lymphoma with genetic events cryptic to FISH. Blood. 134 (18), 1528-1532 (2019).
