Summary
Questo protocollo presenta un metodo per aumentare il contenuto percentuale di tumore di campioni di tessuto incorporato in paraffina fissata in formalina.
Abstract
La presenza di tessuti non tumorali contaminanti in tessuti incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE) può compromettere notevolmente gli studi genomici. Qui descriviamo la macrodissezione, un metodo progettato per aumentare il contenuto percentuale di tumore di un campione di tessuto rimuovendo ed eliminando il tessuto indesiderato prima di eseguire estrazioni di acido nucleico a valle. I blocchi di tessuto FFPE sono stati sezionati per produrre sezioni di tessuto montate su vetrino da 4-5 μm. Una sezione rappresentativa è stata presentata per la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E) e successivamente esaminata da un patologo certificato. Durante la revisione, il patologo ha identificato e contrassegnato le regioni del tessuto tumorale nell'H & E. Una volta completato, l'H&E marcato è stato utilizzato per guidare la resezione delle sezioni seriali non macchiate dallo stesso blocco tissutale. Per dimostrare gli effetti della macrodissezione, l'RNA estratto da linfomi diffusi a grandi cellule B (DLBCL) macrosezionati e non sezionati abbinati è stato eseguito su un test di espressione genica digitale in grado di determinare il sottotipo DLBCL e lo stato di traslocazione BCL2. I risultati hanno mostrato che la macrodissezione ha cambiato il sottotipo o le chiamate allo stato di traslocazione BCL2 nel 60% dei campioni esaminati. In conclusione, la macrodissezione è un metodo semplice ed efficace per eseguire l'arricchimento tumorale prima delle estrazioni di acidi nucleici, il cui prodotto può quindi essere tranquillamente utilizzato negli studi genomici a valle.
Introduction
I tessuti incorporati in paraffina fissata alla formalina (FFPE), raccolti come parte del normale processo diagnostico clinico e conservati nei depositi di tessuti clinici, rappresentano una vasta risorsa per la ricerca umana, compresa la ricerca sul cancro1. Man mano che la nostra comprensione della malattia umana si approfondisce, sta diventando sempre più chiaro che le malattie, precedentemente ritenute singole entità basate su caratteristiche morfologiche e immunofenotipiche, sono in realtà composte da sottotipi molecolari distinti che richiedono saggi di sottotipizzazione molecolare. Di conseguenza, i saggi genomici ad alta sensibilità in grado di discernere questi sottotipi sono diventati sempre più importanti2. Sebbene i tessuti FFPE siano rinomati per essere scarsamente compatibili con le tecniche genomiche a causa di problemi legati alla fissazione, man mano che la tecnologia e i protocolli si evolvono, queste tecniche stanno diventando sempre più compatibili con questo formato di tessuto clinicamente onnipresente 3,4,5. Tuttavia, i tessuti FFPE sono spesso miscele di materiali tissutali tumorali e non tumorali, in cui la presenza di materiale non tumorale è spesso indesiderata e può, se presente in proporzione elevata, minare e influenzare significativamente i risultati delle analisi genomiche6. Infatti, un contenuto minimo di tumore del 60% viene spesso utilizzato per tali analisi, dove i tessuti che non raggiungono questa soglia possono essere esclusi, pur soddisfacendo altrimenti i criteri di studio7. Ciò può essere particolarmente problematico nelle impostazioni di malattie rare, dove i tessuti dei pazienti sono preziosi e difficili da raccogliere in numero elevato.
La macrodissezione è un metodo che minimizza gli effetti del basso contenuto tumorale riducendo la quantità di tessuto normale3. La rimozione di tale materiale non tumorale confondente prima dell'estrazione dell'acido nucleico può aumentare significativamente il contenuto percentuale del tumore e quindi la purezza tumorale degli acidi nucleici estratti. La resezione tissutale si basa criticamente sulla revisione patologica di esperti, in cui la regione tumorale viene identificata e cerchiata su una sezione di tessuto colorato di ematossilina ed eosina (H & E) appena generata da un patologo certificato8. L'H&E cerchiato viene quindi utilizzato per guidare la rimozione e la raccolta di tessuti indesiderati e bersaglio, rispettivamente. Questo protocollo descrive le fasi della macrodissezione dalla revisione patologica alla raccolta dei tessuti eseguita presso l'AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory presso la Mayo Clinic.
Protocol
Tutti i campioni sono stati raccolti e utilizzati in conformità con i protocolli IRB approvati della Mayo Clinic (PR16-000507 e PR2207-02).
1. Preparazione del campione
- Accendere il bagno d'acqua di galleggiamento dei tessuti. Impostare la temperatura a 39 °C e lasciare che l'acqua raggiunga la temperatura. Immergere i bastoncini di raccolta in legno a bagnomaria.
- Identificare e recuperare i blocchi di tessuto FFPE da sezionare.
- Vetrini per microscopi pre-etichetta che utilizzano un marcatore permanente di grado istologico in grado di resistere ai lavaggi con solvente.
- Utilizzare un microtomo per sezionare i blocchi FFPE. Tagliare almeno 2 sezioni a faccia intera con uno spessore di 4-5 μm per sezione per ciascun blocco (Figura 1A).
- Trasferire il nastro appena tagliato di sezioni di tessuto nel bagno di galleggiamento del tessuto preriscaldato per il montaggio a vetrino (Figura 1B, C).
NOTA: L'acqua calda aiuta a "stirare" le rughe nelle sezioni (Figura 1C). - Gestendo ogni sezione in sequenza, utilizzare la pinza per separare una singola sezione dalla barra multifunzione (Figura 1D).
- Raccogliere la singola sezione su un vetrino per microscopio pre-etichettato.
- Immergere il vetrino del microscopio con un angolo sotto la sezione, posizionando il vetrino in modo tale che il bordo della sezione tissutale tocchi il vetrino (Figura 1E).
- Una volta a contatto con la sezione tissutale, estrarre lentamente il vetrino dal bagno di galleggiamento per consentire alla sezione tissutale di raddrizzarsi a filo contro il vetrino mentre emerge dall'acqua (Figura 1F).
- Montare 1 sezione di tessuto per diapositiva e ripetere fino a quando tutte le sezioni sono state raccolte.
- Lasciare asciugare accuratamente le sezioni di tessuto montate su vetrino a temperatura ambiente (RT).
2. Revisione patologica
- Eseguire la colorazione H&E su una sezione di tessuto rappresentativa per ciascun blocco9.
- Invia gli H& E appena macchiati per la revisione patologica da parte di un patologo certificato.
NOTA: Durante la revisione, il patologo determina e registra la percentuale di contenuto tumorale in ciascun tessuto e circonda l'area tumorale su ciascun vetrino H& E (vedere Figura 2 e Figura 3, Riga 1). La Tabella 1 delinea la percentuale di contenuto tumorale per cellularità determinata durante la revisione patologica degli H&E per i campioni A-E mostrati in Figura 3, Riga 1. Le sezioni con contenuto tumorale <60% richiedono la macro-dissezione7. Il numero di sezioni necessarie per l'estrazione dell'acido nucleico dipende dalla dimensione dell'area tumorale cerchiata. Se nella sezione 1 del protocollo sono state tagliate sezioni insufficienti e sono possibili ulteriori tagli, potrebbe essere necessario tagliare sezioni aggiuntive.
3. Deparaffinizzazione
- In una cappa aspirante, preriempire due piatti di colorazione del vetro con istologia non diluita grado d-Limonene o un solvente a base di d-Limonene e 1 piatto di colorazione del vetro con etanolo molecolare non diluito a prova di 200.
ATTENZIONE: Evitare il contatto del d-limonene con la pelle e gli occhi, evitare l'inalazione di vapore o nebbia e tenere lontano da fonti di accensione. Tenere l'etanolo lontano da calore, scintille e fiamme libere, evitare la fuoriuscita e il contatto con la pelle o gli occhi, ventilare bene ed evitare di respirare vapori.
NOTA: riempire le stoviglie a sufficienza per immergere le diapositive a scaffalature (Figura 4A); Sono necessari 250 ml per riempire le piastre di colorazione a 20 vetrine mostrate. Sostituire i lavaggi di d-limonene ed etanolo dopo ogni 40 vetrini. Il D-limonene (C10H16) è un agente deceramizzante alternativo, altrettanto efficace e meno tossico allo xilene che sta diventando sempre più comune nelle metodologie istologiche e produce acido nucleico di buona qualità dopo l'estrazione 10,11,12,13,14. Sebbene questo protocollo possa essere eseguito utilizzando alternative più biofriendly15, i loro effetti, se presenti, sulla qualità dell'acido nucleico estratto rimangono da determinare. - Racchiudere i vetrini montati su tessuto FFPE non macchiato nei portaslitte copino in vetro (Figura 4A, inserto).
- Immergere gli scivoli a cremagliera in d-Limonene lavare 1 per 2 min; agitare delicatamente per i primi 20 s.
NOTA: per ridurre al minimo il riporto tra i lavaggi, quando si rimuove il rack di diapositive da un lavaggio, lasciare che il rack si scarichi brevemente prima di tamponare delicatamente il fondo del rack su carta velina per rimuovere il lavaggio in eccesso. - Immergere le guide a cremagliera in lavaggio D-Limonene non diluito 2 per 2 min; agitare delicatamente per i primi 20 s. Rimuovere, scolare e tamponare nuovamente il rack.
- Immergere le diapositive a cremagliera nel lavaggio a etanolo per 2 minuti; agitare delicatamente per i primi 20 s. Rimuovere il rack e posizionarlo su un tessuto assorbente per drenare. Lasciare asciugare all'aria le diapositive per almeno 10 minuti, ma non più di 2 ore.
3. Macrodissezione
- Sul banco, preriempire un barattolo di vetro Coplin con 50 ml di glicerolo al 3% in acqua priva di DNasi/RNasi
NOTA: Sostituire il lavaggio del glicerolo dopo ogni 40 diapositive. - Pre-etichetta e preriempizione di microtubi da 1,5 mL con 160 μL di tampone per la digestione dei tessuti per microtubo.
NOTA: Le estrazioni di acido nucleico eseguite dopo la macrodissezione hanno utilizzato un kit di estrazione FFPE DNA/RNA (Table of Materials). Pertanto, il tampone di digestione tissutale utilizzato in questo protocollo comprendeva 10 μL di proteinasi K e 150 μL di tampone PKD. - Traccia i segni patologici sull'H & E sul retro dei vetrini di tessuto deparaffinato.
NOTA: rispetto ai tessuti non deparaffinizzati (Figura 3, Riga 2 e Figura 4B), i tessuti deparaffinizzati sono bianchi e altamente visibili (Figura 3, Riga 3 e Figura 4C). È questa maggiore visibilità e discernibilità delle caratteristiche del tessuto deparaffinizzato che consente la macrodissezione. Posiziona l'H & E a faccia in giù sulla panca e posiziona la parte anteriore del vetrino deparaffinato contro il retro dell'H&E recensito dal patologo abbinato (Figura 4D). Allineare il tessuto deparaffinizzato con il tessuto H&E (Figura 4E). Tracciare i segni del patologo è un passo fondamentale nel processo di macrodissezione e bisogna fare attenzione a riprodurre questi segni nel modo più accurato possibile. Ciò può essere particolarmente difficile per tessuti piccoli e/o disconnessi come i campioni B, D ed E (Figura 3, Figura 4E e Figura 4E nell'inserto i). Per facilitare il tracciamento, si dovrebbe usare un marcatore a punta fine o ultrafine (Figura 4E, inserto ii) per tracciare i segni disegnati dal patologo. Le salviette a base di etanolo possono essere utili per rimuovere gli errori e consentire il ritracciamento se necessario. - Ruotare il tessuto di scorrimento deparaffinizzato ora marcato a faccia in su e tracciare la linea del marcatore con l'angolo di una lama di rasoio pulita per pre-tagliare i bordi dell'area tumorale.
- Maneggiando ogni vetrino in sequenza, immergere i vetrini deparaffinizzati nella soluzione di glicerolo al 3%. Assicurarsi che il tessuto sia completamente sommerso prima di rimuovere lentamente il vetrino (Figura 4F).
NOTA: Lo scopo della immersione del glicerolo è quello di smorzare il tessuto per aiutare la raccolta dei tessuti, ma anche per ridurre l'accumulo di carica statica che può causare repulsione tra il tessuto e il microtubo di plastica in cui deve essere posizionato il tessuto raccolto. - Pulire delicatamente la parte posteriore del vetrino con un fazzoletto per rimuovere la soluzione di glicerolo in eccesso e posare il vetrino sul banco, asciugato lateralmente a faccia in giù. Lasciare asciugare brevemente i tessuti per 1-2 minuti.
NOTA: Il trasferimento del glicerolo in eccesso nel processo di estrazione può influire negativamente sulla resa e sulla qualità delle estrazioni di acido nucleico. I tessuti dovrebbero essere leggermente umidi ma non visibilmente bagnati quando vengono raccolti. - A seconda di dove si trova l'area tumorale di interesse sul vetrino, utilizzare il bordo piatto della lama del rasoio per (a) raccogliere direttamente il tessuto tumorale, usando il rasoio per raschiare / raccogliere il tessuto di interesse dal vetrino, o (b) rimuovere e scartare il tessuto non tumorale prima di raccogliere il tessuto tumorale di interesse (Figura 3).
NOTA: il tessuto raccolto tende a raccogliersi o arrotolarsi nella parte inferiore della lama (Figura 4G) - Utilizzare un bastoncino di legno per rimuovere il tessuto raccolto dalla lama (Figura 4H e inserto) e trasferirlo nell'apposito microtubo pre-marcato e preriempito (Figura 4I).
NOTA: Il tampone di digestione serve a "tirare" il tessuto dal piccone di legno nel liquido. - Procedere all'estrazione dell'acido nucleico.
NOTA: Le estrazioni di acidi nucleici sono state completate utilizzando il kit di estrazione FFPE DNA/RNA secondo le istruzioni del produttore e gli acidi nucleici risultanti sono stati quantificati utilizzando uno spettrofotometro UV-vis. L'RNA risultante è stato eseguito sul test DLBCL90 16 basato sul profilo di espressionegenica digitale.
Representative Results
Sono stati sezionati un totale di 5 blocchi di tessuto FFPE per linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) e le sezioni risultanti sono state macrodissezionate o non prima dell'estrazione dell'acido nucleico. L'RNA estratto è stato eseguito sul test DLBCL9016. I campioni macrosezionati sono stati eseguiti due volte, una volta utilizzando 5 μL di concentrazione di RNA ma non più di 300 ng di input di RNA totale e una volta utilizzando 5 μL di stock di RNA diluito per abbinare gli input di RNA delle rispettive controparti non sezionate. I risultati di DLBCL90 sono descritti nella Tabella 2.
DLBCL è composto da 3 distinti sottotipi di cellule di origine (COO) con diversa reattività terapeutica, vale a dire GCB, ABC e un gruppo intermedio noto come non classificato o UNC17,18. Traslocazioni che coinvolgono MYC, BCL2 e o BCL6 da soli o in combinazione (doppio o triplo colpo) sono spesso osservate anche in DLBCL, in particolare nel sottotipoGCB 19. Il test DLBCL90 è un'espansione del suo predecessore, il test clinico Lymph2Cx, ed è quindi in grado di determinare il sottotipo DLBCL COO, ma è stato sviluppato principalmente per identificare campioni che ospitano traslocazioni a doppio colpo (DH) che coinvolgono BCL2 utilizzando l'espressione genica digitale come alternativa all'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH)16,20. I risultati della Tabella 2 mostrano che la macrodissezione ha modificato il COO o lo stato di DHITsig richiede il 60% (3/5) dei campioni esaminati.
La macrodissezione del campione A non ha avuto alcun effetto sulla chiamata COO, ma ha cambiato la chiamata DHITsig da NEG a UNCLASS, e questo cambiamento è stato osservato indipendentemente dall'input di RNA del campione macrodissecato e con punteggi di probabilità simili (0,224, 0,254). Al contrario, la macrodissezione del campione C non ha avuto alcun effetto sulla chiamata DHITsig, ma ha cambiato la chiamata COO da GCB a UNC. Ancora una volta, questo cambiamento è stato osservato indipendentemente dall'input di RNA del campione macrosezionato. Tuttavia, a 0,117, la probabilità di chiamata COO era più vicina alla soglia di chiamata di 0,1 per il campione macrodissecato con ingresso di RNA ridotto. Analogamente al campione A, la macrodissezione del campione E non ha avuto alcun effetto sulla chiamata coO, ma ha modificato la chiamata DHITsig. Tuttavia, per il campione E la chiamata è cambiata da UNCLASS a NEG e lo ha fatto indipendentemente dall'input di RNA del campione macrodissecato con chiamate di probabilità ragionevolmente simili (0,849, 0,833). In particolare, questo cambiamento di chiamata a DHITsig NEG ha senso biologico dato che il campione E è stato trovato in ABC-DLBCL e le traslocazioni a doppio colpo che coinvolgono BCL2 sono state segnalate per essere osservate esclusivamente in GCB-DLBCL19.
Figura 1: Generazione di sezioni di tessuto montate su vetrini utilizzando un microtomo. (A) Blocco di tessuto FFPE tenuto in posizione dal mandrino microtome e tagliato per produrre un nastro di sezioni di tessuto FFPE sequenziali. (B) Utilizzando bastoncini di legno pre-imbevuti, il nastro viene raccolto dal microtomo e trasferito a un bagno d'acqua calda. (C) Il calore dell'acqua aiuta a stirare le pieghe nel nastro di tessuto. (D) Le singole sezioni di tessuto FFPE vengono rimosse dal nastro di tessuto posizionando una pinza chiusa alla giunzione di due sezioni e aprendo delicatamente la pinza, che rompe le sezioni l'una dall'altra. (E) Le sezioni vengono raccolte dall'acqua immergendo un vetrino ad angolo e spostando delicatamente il lato verso la sezione di tessuto fino a quando il bordo della sezione tocca il vetrino. (F) Una volta che la diapositiva e la sezione si toccano, rimuovere lentamente la diapositiva dall'acqua, lasciando che la sezione del tessuto cada a filo contro la diapositiva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Patologia e revisione istologica di una sezione colorata di ematossilina ed eosina (H & E). (A, B) La sezione di tessuto H & E è sottoposta a revisione microscopica da parte di un patologo certificato. (C,D) Una volta che il patologo ha visto l'intero tessuto e ha scoperto che non è al 100% tessuto tumorale, il patologo utilizzerà un marcatore per circondare l'area tumorale del tessuto. (E,F) Tenendo il marcato H & E contro il blocco di tessuto FFPE originale mostra che non tutto il tessuto è materiale tumorale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Campioni di tessuto. Questa immagine mostra le sezioni di tessuto FFPE patologicamente riviste e marcate con tumore (riga 1), le sezioni di tessuto FFPE montate su vetrino non elaborate (riga 2), le sezioni di tessuto FFPE deparaffinate montate su vetrino (riga 3), le sezioni di tessuto FFPE deparaffinato montate su vetrino con segni patologici tracciati sul retro del vetrino (riga 4), le sezioni di tessuto FFPE deparaffinato e macrodissezionate montate su vetrino (riga 5) per i 5 campioni (A-E) utilizzati per dimostrare questo protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Deparaffinizzazione e macro-dissezione delle sezioni di tessuto FFPE: (A) In una cappa aspirante, i tessuti FFPE montati in una griglia scorrevole vengono lavati in due lavaggi d-limonene e un lavaggio a etanolo. (B,C) Dopo il lavaggio, tutta la paraffina è stata rimossa e solo il tessuto rimane sul vetrino, che ora è bianco e altamente visibile rispetto alla sua controparte prelavata. (D) La sezione di tessuto deparaffinato montata su vetrino viene posizionata a faccia in giù sul retro del suo corrispondente marcato H & E. (E) I segni dell'area tumorale sull'H & E vengono quindi tracciati sul retro del vetrino deparaffinato utilizzando un marcatore permanente con pennino fine o ultrafine (F) La sezione di tessuto deparaffinato marcata montata su vetrino viene quindi immersa in un lavaggio al glicerolo per smorzare la sezione di tessuto per la raccolta. Il vetrino viene rimosso lentamente dal glicerolo e il retro del vetrino viene pulito con un fazzoletto per rimuovere il glicerolo in eccesso prima di posare il tessuto del vetrino a faccia in su sul banco. (G) Usando il lato piatto di una lama di rasoio pulita, il tessuto viene macrodissezionato e il tessuto indesiderato al di fuori dei segni del patologo viene scartato prima di raccogliere il tessuto di interesse, che si raccoglie lungo il bordo della lama. (H) Un bastone di legno viene utilizzato per rimuovere il tessuto raccolto dal bordo della lama. (I) Il tessuto viene quindi trasferito in un tampone di digestione tissutale preriempito con microtubi pre-etichettati ed è pronto per l'estrazione di acidi nucleici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| ID di esempio | Tessuto intero (a) | Area cerchiata del tessuto (b) | Contenuto tumorale complessivo del tessuto intero (c) | Aumento della piega del contenuto tumorale per macrodissezione (d) | Non macrosezionato (e) | Macroselezionati (f) | ||||
| % Tumore vitale | % Altro | % Tumore vitale | % Altro | # di vetrini da 5 μm estratti | RNA conc (ng/μL) | # di vetrini da 5 μm estratti | RNA conc (ng/μL) |
|||
| Esempio A | 60 | 40 | 75 | 25 | 45 | 1.7 | 2 | 19.0 | 4 | 58.3 |
| Esempio B | 60 | 40 | 65 | 35 | 39 | 1.7 | 1 | 34.0 | 2 | 60.0 |
| Esempio C | 40 | 60 | 65 | 35 | 26 | 2.5 | 1 | 13.7 | 2 | 46.2 |
| Esempio D | 35 | 65 | 90 | 10 | 32 | 2.9 | 1 | 57.3 | 2 | 60.0 |
| Esempio E | 20 | 80 | 30 | 70 | 6 | 5.0 | 3 | 25.2 | 3 | 44.6 |
Tabella 1: Dati di revisione della patologia. La tabella mostra (a) la percentuale di tumore vitale nell'intera sezione tissutale per area, (b) la percentuale di tumore vitale nell'area cerchiata/marcata dal patologo durante la revisione per cellularità, (c) la cellularità tumorale complessiva stimata dell'intero tessuto (a x b), (d) l'aumento stimato della cellularità tumorale raggiunto con la macrodissezione, e e f) il numero di sezioni di tessuto FFPE non macchiate da 5 μm estratte e le concentrazioni di RNA risultanti per campioni abbinati non macrodissezionati e macrodissezionati. % Altro si riferisce a tutti gli altri tessuti presenti in un dato campione che non è tessuto tumorale e può includere tessuto connettivo, fibroblasti stromali, vasi sanguigni e altri elementi stromali intrinseci. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
| ID di esempio | Ingresso RNA (ng) | Chiamata COO DLBCL90 | Probabilità di chiamata DLBCL90 | Chiamata DHITsig | Probabilità di pos DHITsig | Probabilità di neg DHITsig | |
| Non macroselezionato | Esempio A | 95.0 | Gcb | 0.000 | Neg | 0.135 | 0.865 |
| Esempio B | 170.0 | Gcb | 0.000 | Neg | 0.032 | 0.968 | |
| Esempio C | 68.5 | Gcb | 0.028 | Neg | 0.033 | 0.967 | |
| Esempio D | 286.5 | Abc | 0.998 | Neg | 0.002 | 0.998 | |
| Esempio E | 126.0 | Abc | 0.989 | UNCLASSE | 0.212 | 0.788 | |
| Macrodissezionato | Esempio di A_M | 291.7 | Gcb | 0.000 | UNCLASSE | 0.224 | 0.776 |
| Esempio B_M | 300.0 | Gcb | 0.000 | Neg | 0.016 | 0.984 | |
| Esempio C_M | 231.2 | UNCLASSE | 0.210 | Neg | 0.015 | 0.985 | |
| Esempio D_M | 300.0 | Abc | 0.999 | Neg | 0.002 | 0.998 | |
| Esempio di E_M | 223.2 | Abc | 0.987 | Neg | 0.151 | 0.849 | |
| Macrodissecato & RNA diluito | Esempio di A_M | 95.0 | Gcb | 0.000 | UNCLASSE | 0.254 | 0.746 |
| Esempio B_M | 170.0 | Gcb | 0.000 | Neg | 0.023 | 0.977 | |
| Esempio C_M | 68.5 | UNCLASSE | 0.117 | Neg | 0.027 | 0.973 | |
| Esempio D_M | 286.5 | Abc | 0.999 | Neg | 0.002 | 0.998 | |
| Esempio di E_M | 126.0 | Abc | 0.995 | Neg | 0.167 | 0.833 | |
Tabella 2: Risultati del test di espressione genica digitale DLBCL90. Cinque campioni (A-E) non sono stati macrosezionati o macrodissezionati prima che venissero eseguite estrazioni di acidi nucleici. L'RNA risultante è stato eseguito sul test DLBCL90, per il quale il volume massimo di ingresso dell'RNA è di 5 μL. Campioni non macrosezionati sono stati eseguiti utilizzando 5 μL di RNA di riserva. Ogni campione macrosezionato è stato eseguito due volte utilizzando (a) 5 μL di RNA di riserva a meno che non fossero possibili aliquote di 60 ng/μL e (b) 5 μL di RNA di riserva diluito per corrispondere alle concentrazioni/input delle loro controparti non macrodissezionate. Il suffisso _M indica che il campione è stato macrosezionato. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Discussion
I tessuti FFPE sono spesso mescolanze eterogenee di tessuti tumorali e non tumorali. I test genomici ad alta sensibilità stanno diventando sempre più diffusi sia in ambito clinico che di ricerca, ma possono essere confusi dalla presenza di tessuto non tumorale contaminante. Infatti, un contenuto minimo di tumore del 60% è spesso raccomandato per gli studi genomici. La percentuale di tumore può essere determinata dall'area di tessuto occupata dal materiale tumorale o dalla proporzione di cellule tumorali all'interno del tessuto. Sebbene il tumore per area sia una metrica comunemente usata per la purezza del tumore, non sempre ritrae una descrizione accurata del tessuto. Consideriamo due tessuti, entrambi con 1000 cellule, di cui 500 sono cellule tumorali. Nel tessuto A, le 500 cellule non tumorali sono cellule stromali con volumi simili a quelli della cellula tumorale. In questo tessuto, la percentuale di tumore può essere considerata del 50% sia dalla cellularità che dall'area. Nel tessuto B, le 500 cellule non tumorali sono cellule adipose con volumi 4 volte superiori a quelli della cellula tumorale. In questo tessuto, la percentuale di tumore è ancora del 50% per cellularità ma del 20% per area. Un terzo tessuto, il tessuto C, è composto da 500 cellule tumorali più 400 cellule adipose e 800 cellule stromali con volumi che sono rispettivamente 4x e 0,5x quello delle cellule tumorali. Dato che 100 cellule adipose equivalgono al volume di 800 cellule stromali, la percentuale di tumore del tessuto C è del 29% per cellularità (500/1700) ma ancora del 20% per area. Il tessuto D è anche composto da cellule tumorali, adipose e stromali con rapporti di volume di 1x, 4x e 0,1x. Tuttavia, il numero di celle è rispettivamente 400, 10 e 720. Pertanto, la percentuale di tumore del tessuto D è del 35% per cellularità (400/1130) ma del 78% per area. Questi esempi sono eccessivamente semplicistici e non riflettono le composizioni tissutali del mondo reale, ma trasmettono chiaramente l'importanza della composizione tissutale e la differenza tra il contenuto tumorale per area e per cellularità. È importante sottolineare che, quando si tratta di arricchire il contenuto tumorale per l'estrazione di acidi nucleici a valle, la cellularità tumorale è l'attributo più importante a causa dell'accresciuto potenziale confondente dell'estrazione di materiale genomico da più cellule non tumorali rispetto alle cellule tumorali. Ciò sottolinea non solo la necessità di valutare il contenuto tumorale dei tessuti in termini di percentuale di cellularità, ma anche la necessità di asportare il tessuto indesiderato al fine di ridurre al minimo eventuali potenziali effetti negativi del tessuto non tumorale. Esistono diversi metodi disponibili per l'arricchimento dei tessuti, i principali dei quali sono la macrodissezione e la microdissezione.
La macrodissezione, il metodo descritto in questo protocollo, è relativamente veloce, semplice e non richiede attrezzature costose o specializzate. Sebbene la macrodissezione possa migliorare notevolmente il contenuto tumorale, è importante capire che non elimina completamente il materiale non tumorale. Lo scopo della macrodissezione è quello di arricchire sufficientemente il tessuto di interesse attraverso l'esclusione di tessuti indesiderati al fine di ridurre il "rumore" derivante da tessuto indesiderato, che a sua volta può potenziare il segnale di interesse dal tessuto di interesse. Pertanto, l'arricchimento tumorale mediato dalla macrodissezione è un modo per migliorare il rapporto segnale-rumore al fine di rilevare meglio i marcatori di interesse, in particolare i marcatori molecolari specifici del tumore con bassa abbondanza o scarsa espressione. Tuttavia, la macrodissezione ha dei limiti a causa della mancanza di precisione offerta da strumenti grossolani come le lame di rasoio ed è suscettibile di problemi di precisione derivanti dallo spessore della linea del marcatore del patologo, nonché potenziali errori nel tracciare le demarcazioni H&E dei patologi. Come accennato in precedenza, non è possibile raggiungere il 100% di purezza tumorale a causa della presenza di elementi stromali intrinseci e che inducono il tumore (cioè tessuto connettivo, fibroblasti stromali, vasi sanguigni, linfociti reattivi benigni, macrofagi) incorporati all'interno del tumore stesso. Infatti, molte neoplasie invasive o diffusamente infiltrative inducono una robusta risposta stromale desmoplastica, con conseguente aggregazione di cellule tumorali intimamente mescolate con fibroblasti stromali e altri tipi di cellule non neoplastiche; dove i tumori associati a questo modello di reazione stromale, come i tessuti tumorali pancreatici21, possono beneficiare maggiormente della microdissezione guidata digitalmente piuttosto che della macrodissezione manuale.
La microdissezione manuale viene eseguita al microscopio per facilitare l'identificazione, la dissezione e l'isolamento di cellule o popolazioni specifiche dei tessuti utilizzando un ago o un bisturi e ha il vantaggio di una maggiore precisione rispetto alla macrodissezione22. Tuttavia, la microdissezione manuale è un processo laborioso che manca della finezza necessaria per tessuti complessi con basso contenuto tumorale o caratteristiche intricate che sono incompatibili con la dissezione manuale. Tali tessuti possono essere sezionati utilizzando metodi automatizzati ad alta precisione come la microdissezione a cattura laser. In effetti, la microdissezione guidata digitalmente ha dimostrato di produrre contenuti tumorali percentuali più elevati rispetto alla macrodissezione manuale nei tessuti tumorali pancreatici23. Tuttavia, gli svantaggi di questi metodi automatizzati ad alta precisione, come la necessità di attrezzature specializzate e costose e di individui altamente qualificati, hanno ostacolato la sua incorporazione nei flussi di lavoro. Uno studio di de Bruin et al. che ha confrontato gli effetti della macrodissezione e della microdissezione a cattura laser (LCM) sul profilo di espressione genica ha rilevato che i campioni di LCM avevano bassi rendimenti totali di RNA (media 30 ng) e richiedevano due cicli di amplificazione dell'mRNA per soddisfare la soglia di input di preparazione della libreria cDNA24. Gli autori hanno scoperto che i profili di espressione genica LCM risultanti erano influenzati dai cicli di amplificazione dell'mRNA più che dai profili macrodissezionati influenzati da contributi stromali non tumorali e hanno concluso che la macrodissezione potrebbe essere adeguatamente utilizzata per generare dati affidabili sull'espressione genica24.
Un vantaggio significativo del profilo di espressione genica digitale NanoString, in particolare quando si lavora con RNA derivato da FFPE altamente degradato, è che non richiede processi enzimatici dipendenti come l'amplificazione dell'RNA o la preparazione di librerie di cDNA. Tuttavia, i saggi sono tipicamente ottimizzati per input tra 50-300 ng di RNA totale25,26, che, sulla base dei risultati di de Bruin et al.24, potrebbero non essere compatibili con i tessuti microdissecati senza aumentare l'input tissutale; una domanda sfavorevole in un'epoca in cui i campioni di tessuto sono sempre più raccolti come piccole biopsie piuttosto che resezioni chirurgiche. Gli input di RNA utilizzati per il test DLBCL90 variavano da 68,5-300 ng sia per i tessuti macrosezionati che per quelli non sezionati. I risultati mostrano che la macrodissezione ha provocato cambiamenti di chiamata nel 60% dei campioni esaminati e che questi cambiamenti sono stati osservati indipendentemente dall'input di RNA dei campioni macrodissezionati. Tuttavia, la probabilità COO per l'input di RNA basso ha invaso la soglia di chiamata di probabilità COO GCB / UNC, dove le soglie sono da 0 a < 0,1 per GCB, 0,1-0,9 per UNC e >0,9 a 1,0 per le chiamate ABC20. I principali sottotipi di COO DLBCL sono GCB e ABC, che costituiscono il 41% e il 44% di tutti i casi di DLBCL, con UNC che rappresenta un gruppo intermedio dei due e ABC che è il più aggressivo20,27. Pertanto, mentre il cambiamento della chiamata COO alla macrodissezione del campione C non ha causato un cambiamento franco nel sottotipo coO da GCB ad ABC, il cambiamento da GCB a UNC può suggerire uno spostamento verso una malattia più aggressiva. Inoltre, studi recenti indicano che il sottotipo UNC non è semplicemente un sottotipo intermedio e che può potenzialmente possedere attributi terapeuticamente sfruttabili specifici del sottotipo28. Allo stesso modo, la macrodissezione dei campioni A ed E non ha causato cambiamenti franchi nelle chiamate DHITsig da DH negativo a DH positivo, o viceversa. Tuttavia, i movimenti di un campione GCB (campione A) da NEG a UNCLASS e di un campione ABC (campione E) da UNCLASS a NEG dopo macrodissezione sono biologicamente appropriati in quanto le traslocazioni a doppio colpo che coinvolgono BCL2 sono segnalate come un fenomeno esclusivamente GCB19. Sebbene le traslocazioni siano tradizionalmente e ubiquitariamente rilevate da FISH in contesti clinici, c'è un crescente slancio per identificare un metodo alternativo meno coinvolto e dispendioso in termini di tempo per il loro rilevamento. Il test DLBCL90 è uno strumento importante che risponde a questa esigenza, in cui il razionale per il suo utilizzo è rafforzato dalla scoperta che questo test è in grado di rilevare traslocazioni criptiche alle sonde FISH utilizzate nella diagnostica clinica29.
Il protocollo di macrodissezione sopra descritto delinea un metodo semplice che consente ai ricercatori di aumentare il contenuto tumorale di campioni di tessuto che normalmente scenderebbero al di sotto delle soglie dei criteri di inclusione dello studio comunemente usati. Includere la macrodissezione in un flusso di lavoro di studio consente ai ricercatori di salvare tessuti scarsamente densi di tumore dall'esclusione dello studio aumentando il loro contenuto tumorale. A sua volta, ciò consente una maggiore fiducia che l'RNA e gli eluati di DNA risultanti rappresentino il tumore oggetto di indagine genomica. Sebbene esistano altri metodi più precisi per la dissezione dei tessuti, per i tumori che crescono in modo più espansivo, non infiltrativo, simile a un foglio o solido, la macrodissezione è probabilmente sufficiente. I risultati qui presentati evidenziano l'importanza della purezza del tumore nei saggi genomici e nella macrodissezione come strumento affidabile per raggiungere questo obiettivo.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR, UM1 CA181255-2) finanziato dal NIH nell'ambito del suo programma scientifico di biocampioni. Il video è stato girato e il montaggio in post-produzione è stato eseguito da Mayo Clinic Media Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200-proof ethanol | Decon | 2701 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | DNA/RNA FFPE extraction kit |
| Coplin pots | Various | x | |
| DLBCL90 probes | NanoString | various | Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay |
| d-Limonene | VWR | 89376-092 | |
| Forceps | Various | x | |
| Glass micrscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Glycerol | VWR | 0854-1L | |
| Master kits | NanoString | various | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Microtubes | Ambion | AM12400 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation |
| nCounter | NanoString | x | Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay |
| Permanent marker | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Razor blade dispenser | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
| Razor blades | Electrib Microscope Sciences | 71985-23 | |
| Tissue digestion buffer | Qiagen | 80234 | |
| Ultrapure water | VWR | SH30538.02 | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
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