Summary
Detta protokoll presenterar en metod för att öka procent tumörinnehållet i formalinfixerade paraffininbäddade vävnadsprover.
Abstract
Förekomsten av förorenande icke-tumörvävnader i formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnader kan kraftigt undergräva genomiska studier. Här beskriver vi makrodissektion, en metod som är utformad för att öka det procentuella tumörinnehållet i ett vävnadsprov genom att ta bort och eliminera oönskad vävnad innan nedströms nukleinsyraextraktioner utförs. FFPE-vävnadsblock delades för att producera 4-5 μm glidmonterade vävnadssektioner. En representativ sektion lämnades in för färgning av hematoxylin och eosin (H&E) och granskades därefter av en styrelsecertifierad patolog. Under granskningen identifierade och markerade patologen regionerna av tumörvävnad i H&E. När den var klar användes den markerade H&E för att styra resektion av de seriella oskadade sektionerna från samma vävnadsblock. För att demonstrera effekterna av makrodissektion kördes RNA extraherat från matchade makrodissekerade och icke-dissekerade diffusa stora B-celllymfom (DLBCL) på en digital genuttrycksanalys som kan bestämma DLBCL-subtyp och BCL2-translokationsstatus. Resultaten visade att makrodissektion ändrade subtyp eller BCL2-translokationsstatusanrop i 60% av de undersökta proverna. Sammanfattningsvis är makrodissektion en enkel och effektiv metod för att utföra tumöranrikning före nukleinsyraextraktioner, vars produkt sedan med säkerhet kan användas i nedströms genomiska studier.
Introduction
Formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnader, som samlas in som en del av den normala kliniska diagnostiska processen och behålls i kliniska vävnadsförråd, utgör en stor resurs för mänsklig forskning, inklusive cancerforskning1. I takt med att vår förståelse av mänskliga sjukdomar fördjupas blir det allt tydligare att sjukdomar, som tidigare troddes vara enskilda enheter baserade på morfologiska och immunofenotypiska egenskaper, i själva verket består av distinkta molekylära subtyper som kräver molekylära subtypningsmetoder. Följaktligen har högkänsliga genomiska analyser som kan urskilja dessa subtyper blivit allt viktigare2. Även om FFPE-vävnader är kända för att vara dåligt kompatibla med genomiska tekniker på grund av fixeringsrelaterade problem, när teknik och protokoll utvecklas, blir dessa tekniker alltmer kompatibla med detta kliniskt allestädes närvarande vävnadsformat 3,4,5. FFPE-vävnader är emellertid ofta blandningar av tumör- och icke-tumörvävnadsmaterial, där närvaron av icke-tumörmaterial ofta är oönskad och kan, om den förekommer i en hög andel, avsevärt undergräva och påverka resultaten av genomiska analyser6. Faktum är att ett lägsta tumörinnehåll på 60% ofta används för sådana analyser, där vävnader som inte når upp till denna tröskel kan uteslutas, trots att de annars uppfyller studiekriterierna7. Detta kan vara särskilt problematiskt i miljöer med sällsynta sjukdomar, där patientvävnader är värdefulla och svåra att samla in i stort antal.
Makrodissektion är en metod som minimerar effekterna av lågt tumörinnehåll genom att minska mängden normal vävnad3. Avlägsnandet av sådant förvirrande icke-tumörmaterial före nukleinsyraextraktion kan avsevärt öka tumörprocentinnehållet och därmed tumörrenheten hos de extraherade nukleinsyrorna. Vävnadsresektion är kritiskt beroende av expert patologisk granskning, där tumörregionen identifieras och cirklas på en nygenererad hematoxylin och eosin (H&E) färgad vävnadssektion av en styrelsecertifierad patolog8. Den inringade H&E används sedan för att styra avlägsnandet och insamlingen av oönskade respektive målvävnader. Detta protokoll beskriver stegen för makrodissektion från patologisk granskning till vävnadsskörd som utförs vid AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory vid Mayo Clinic.
Protocol
Alla prover samlades in och användes i enlighet med godkända Mayo Clinic IRB-protokoll (PR16-000507 och PR2207-02).
1. Beredning av prover
- Slå på vävnadsflottvattenbadet. Ställ in temperaturen på 39 °C och låt vattnet komma till temperatur. Blötlägg träuppsamlingspinnar i vattenbadet.
- Identifiera och hämta de FFPE-vävnadsblock som ska sektioneras.
- Förmärk mikroskopglas med en permanent markör av histologikvalitet som tål lösningsmedelstvätt.
- Använd en mikrotom för att sektionera FFPE-blocken. Skär minst 2 helsidessektioner med en tjocklek av 4-5 μm per sektion för varje block (figur 1A).
- Överför det nyklippta bandet av vävnadssektioner till det förvärmda vävnadsflödesbadet för glidmontering (figur 1B, C).
OBS: Det varma vattnet hjälper till att "stryka" ut rynkorna i sektionerna (figur 1C). - Hantera varje sektion sekventiellt, använd pincett för att bryta en enda sektion bort från menyfliksområdet (bild 1D).
- Samla den enda sektionen på ett förmärkt mikroskopglas.
- Sänk ner mikroskopglaset i en vinkel under sektionen och placera bilden så att kanten på vävnadssektionen vidrör bilden (figur 1E).
- När du väl är i kontakt med vävnadssektionen drar du långsamt ut bilden ur flytbadet så att vävnadssektionen kan räta ut sig mot bilden när den kommer ut ur vattnet (figur 1F).
- Montera 1 vävnadssektion per bild och upprepa tills alla sektioner har samlats in.
- Låt de glidmonterade vävnadssektionerna torka ordentligt vid rumstemperatur (RT).
2. Patologisk granskning
- Utför H&E-färgning på en representativ vävnadssektion för varje block9.
- Skicka in de nyfärgade H&Es för patologisk granskning av en styrelsecertifierad patolog.
OBS: Under granskningen bestämmer och registrerar patologen det procentuella tumörinnehållet i varje vävnad och cirklar tumörområdet på varje H&E-bild (se figur 2 och figur 3, rad 1). Tabell 1 beskriver det procentuella tumörinnehållet efter cellularitet som bestäms under den patologiska granskningen av H&Es för prover A-E som visas i figur 3, rad 1. Sektioner med <60% tumörinnehåll kräver makrodissektion7. Antalet sektioner som behövs för nukleinsyraextraktion beror på storleken på det cirklade tumörområdet. Om otillräckliga sektioner skars i avsnitt 1 i protokollet och ytterligare nedskärningar är möjliga, kan ytterligare sektioner behöva skäras.
3. Deparaffinisering
- I en dragskåp, förfyll två glasmålningsfat med outspädd histologikvalitet d-Limonene eller ett d-Limonene-baserat lösningsmedel och 1 glasmålningsfat med outspädd 200-bevis molekylkvalitet etanol.
VARNING: Undvik d-Limonene-kontakt med hud och ögon, undvik inandning av ånga eller dimma och håll dig borta från antändningskällor. Håll etanol borta från värme, gnistor och öppna lågor, undvik spill och kontakt med hud eller ögon, ventilera väl och undvik andningsångor.
OBS: Fyll diskarna tillräckligt för att sänka ner de rackade bilderna (figur 4A); 250 ml krävs för att fylla de 20-glidfärgningsdiskar som visas. Byt ut d-Limonen och etanoltvättarna efter var 40:e diabild. D-Limonen (C10H16) är ett alternativt, lika effektivt och mindre giftigt avvaxningsmedel till xylen som blir vanligare i histologiska metoder och ger nukleinsyra av god kvalitet efter extraktion 10,11,12,13,14. Även om detta protokoll kan utföras med hjälp av mer biovänliga alternativ15, återstår deras effekter, om några, på extraherad nukleinsyrakvalitet att bestämma. - Racka de ostoppade FFPE-vävnadsmonterade bilderna i Coplin-glidställen i glas (figur 4A, infälld).
- Sänk ner de rackade bilderna i d-Limonene tvätt 1 i 2 min; agitera försiktigt under de första 20 s.
OBS: För att minimera överföringen mellan tvättar, när du tar bort stället med diabilder från en tvätt, låt racket rinna av kort innan du försiktigt dabbar botten av stället på silkespapper för att ta bort överflödig tvätt. - Sänk ner de rackade bilderna i outspädd D-Limonene-tvätt 2 i 2 minuter; agitera försiktigt under de första 20 s. Ta bort, töm och badda racket igen.
- Sänk ner de rackade bilderna i etanoltvätten i 2 minuter; agitera försiktigt under de första 20 s. Ta bort stället och placera det på en absorberande vävnad för att tömma. Låt bilderna lufttorka i minst 10 min, men inte mer än 2 timmar.
3. Makrodissektion
- På bänken förfyller du en Coplin-glasburk med 50 ml 3% glycerol i DNase / RNase-fritt vatten
OBS: Byt ut glyceroltvätten efter var 40: e bild. - Förmärk och förfyll 1,5 ml mikrorör med 160 μl vävnadsuppslutningsbuffert per mikrorör.
OBS: Nukleinsyraextraktioner utförda efter makrodissektion använde ett DNA / RNA FFPE-extraktionssats (materialtabell). Således omfattade vävnadsförtunningsbufferten som användes i detta protokoll 10 μL proteinas K och 150 μl PKD-buffert. - Spåra de patologiska markeringarna på H&E på baksidan av deparaffiniserade vävnadsglasen.
OBS: Jämfört med icke-deparaffiniserade vävnader (figur 3, rad 2 och figur 4B) är deparaffiniserade vävnader vita och mycket synliga (figur 3, rad 3 och figur 4C). Det är denna ökade synlighet och urskiljbarhet av deparaffiniserade vävnadsfunktioner som möjliggör makrodissektion. Placera H&E med framsidan nedåt på bänken och placera framsidan av den avparaffiniserade bilden mot baksidan av den matchade patologgranskade H&E (figur 4D). Rikta in den deparaffiniserade vävnaden mot H&E-vävnaden (figur 4E). Att spåra patologens markeringar är ett kritiskt steg i makrodissektionsprocessen, och man bör se till att reproducera dessa markeringar så exakt som möjligt. Detta kan vara särskilt utmanande för små och eller frånkopplade vävnader som proverna B, D och E (figur 3, figur 4E och figur 4E infälld i). För att underlätta spårningen bör man använda en bläckfin eller ultrafin nibbad markör (figur 4E, infälld ii) för att spåra de patologritade markeringarna. Etanolservetter kan vara användbara för att ta bort fel och tillåta retracing om det behövs. - Vänd den nu markerade avparaffiniserade glidvävnaden uppåt och spåra markörens linje med hörnet på ett rent rakblad för att förskära tumörområdets kanter.
- Hantera varje bild i följd, doppa deparaffiniserade bilderna i 3% glycerollösningen. Se till att vävnaden är helt nedsänkt innan du tar bort bilden långsamt (figur 4F).
OBS: Syftet med glyceroldippen är att dämpa vävnaden för att underlätta vävnadsuppsamlingen men också för att minska uppbyggnaden av statisk laddning som kan orsaka avstötning mellan vävnaden och plastmikroröret där den uppsamlade vävnaden måste placeras. - Torka försiktigt av baksidan av bilden med en vävnad för att ta bort överskottet av glycerollösning och lägg glidet på bänken, torkad sida nedåt. Låt vävnaderna lufta kort i 1-2 min.
OBS: Överföring av överskott av glycerol till extraktionsprocessen kan påverka utbytet och kvaliteten på nukleinsyraextraktioner negativt. Vävnaderna ska vara lite fuktiga men inte synligt våta när de samlas upp. - Beroende på var tumörområdet av intresse ligger på bilden, använd rakbladets plana kant för att antingen (a) direkt samla tumörvävnaden, använda rakhyveln för att skrapa / samla in vävnaden av intresse från bilden, eller (b) ta bort och kassera icke-tumörvävnad först innan du samlar in tumörvävnaden av intresse (figur 3).
OBS: Uppsamlad vävnad tenderar att samlas eller rullas upp längst ner på bladet (figur 4G) - Använd en träpinne för att ta bort den uppsamlade vävnaden från bladet (figur 4H och infälld) och överför den till lämpligt förmärkt och förfyllt mikrorör (figur 4I).
OBS: Matsmältningsbufferten tjänar till att "dra" vävnaden från träplockningen till vätskan. - Fortsätt till nukleinsyraextraktion.
OBS: Nukleinsyraextraktioner slutfördes med hjälp av DNA / RNA FFPE-extraktionssatsen enligt tillverkarens instruktioner, och de resulterande nukleinsyrorna kvantifierades med hjälp av en UV-vis-spektrofotometer. Det resulterande RNA kördes på den digitala genuttrycksprofileringsbaserade DLBCL90-analysen16.
Representative Results
Totalt 5 diffusa stora B-celllymfom (DLBCL) FFPE-vävnadsblock delades och de resulterande sektionerna makrodissekerades antingen eller inte före nukleinsyraextraktion. Det extraherade RNA kördes på DLBCL90-analysen16. Makrodissekerade prover kördes två gånger, en gång med 5 μl RNA-stamkoncentration men högst 300 ng av den totala RNA-ingången och en gång med 5 μL RNA-lager utspädd för att matcha RNA-ingångarna för deras respektive icke-dissekerade motsvarigheter. DLBCL90-resultaten beskrivs i tabell 2.
DLBCL består av 3 distinkta ursprungscells (COO) subtyper med olika terapeutisk respons, nämligen GCB, ABC och en mellanliggande grupp som kallas oklassificerad eller UNC17,18. Translokationer som involverar MYC, BCL2 och eller BCL6 ensamma eller i kombination (dubbel eller trippel träff) observeras också ofta i DLBCL, särskilt i GCB-subtyp19. DLBCL90-analysen är en utvidgning av sin föregångare, lymph2Cx kliniska analys, och kan därmed DLBCL COO-subtypbestämning men utvecklades huvudsakligen för att identifiera prover som innehåller dubbla träff (DH) translokationer som involverar BCL2 med hjälp av digitalt genuttryck som ett alternativ till fluorescens in-situ hybridisering (FISH)16,20. Resultaten i tabell 2 visar att makrodissektion förändrade antingen COO eller DHITsig status kräver 60% (3/5) av de undersökta proverna.
Makrodissektion av prov A hade ingen effekt på COO-anropet men ändrade DHITsig-anropet från NEG till UNCLASS, och denna förändring observerades oberoende av den makrodissekerade prov-RNA-ingången och med liknande sannolikhetspoäng (0,224, 0,254). Däremot hade makrodissektion av prov C ingen effekt på DHITsig-anropet men ändrade COO-anropet från GCB till UNC. Återigen observerades denna förändring oberoende av makrodissekerad prov-RNA-ingång. Men vid 0,117 var COO-samtalssannolikheten närmare samtalströskeln på 0,1 för det makrodissekerade provet med reducerad RNA-ingång. I likhet med prov A hade makrodissektion av prov E ingen effekt på COO-anropet men ändrade DHITsig-anropet. För prov E ändrades dock anropet från UNCLASS till NEG och gjorde det oberoende av den makrodissekerade prov-RNA-ingången med någorlunda liknande sannolikhetsanrop (0,849, 0,833). I synnerhet är denna samtalsändring till DHITsig NEG biologiskt meningsfull med tanke på att prov E hittades till ABC-DLBCL, och dubbla träfftranslokationer som involverar BCL2 har rapporterats uteslutande observeras i GCB-DLBCL19.
Figur 1: Generera glidmonterade vävnadssektioner med hjälp av en mikrotom. (B) Med hjälp av fördränkta träpinnar samlas bandet upp från mikrotomen och överförs till ett varmt vattenbad. (C) Vattnets värme hjälper till att stryka ut vecken i vävnadsbandet. (D) Enskilda FFPE-vävnadssektioner avlägsnas från vävnadsbandet genom att placera slutna pincett vid korsningen av två sektioner och försiktigt öppna tången, vilket bryter sektioner bort från varandra. (E) Sektioner samlas upp från vattnet genom att nedsänka en glasskiva i en vinkel och försiktigt flytta sidan mot vävnadssektionen tills kanten av sektionen vidrör glasskivan. (F) När bilden och sektionen vidrörs, ta långsamt bort bilden från vattnet, så att vävnadssektionen kan falla jämnt mot bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Patologi och histologisk granskning av en hematoxylin och eosin (H&E) färgade sektioner. (C,D) När patologen har tittat på hela vävnaden och funnit att den inte är 100% tumörvävnad, kommer patologen att använda en markör för att omsluta vävnadens tumörområde. (E,F) Att hålla den markerade H&E mot det ursprungliga FFPE-vävnadsblocket visar att inte all vävnad är tumörmaterial. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Vävnadsprover. Denna bild visar de patologiskt granskade och tumörmärkta H&Es (Rad 1), obearbetade glidmonterade FFPE-vävnadssektioner (Rad 2), deparaffiniserade glidmonterade FFPE-vävnadssektioner (Rad 3), deparaffiniserade glidmonterade FFPE-vävnadssektioner med patologimarkeringar spårade på baksidan av bilden (Rad 4), deparaffiniserade och makrodissekerade glidmonterade FFPE-vävnadssektioner (Rad 5) för de 5 prover (A-E) som används för att demonstrera detta protokoll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Avparaffinisering och makrodissektion av FFPE-vävnadssektioner: (A) I en dragskåp tvättas FFPE-vävnader monterade i ett glidställ i två d-limonentvättar och en etanoltvätt. (B,C) Efter tvätt har allt paraffin tagits bort, och endast vävnaden finns kvar på bilden, som nu är vit och mycket synlig jämfört med dess förtvättade motsvarighet. (D) Den deparaffiniserade glidmonterade vävnadssektionen placeras med framsidan nedåt på baksidan av dess matchande märkta H&E. (E) Tumörområdesmarkeringarna på H&E spåras sedan på baksidan av den deparaffiniserade bilden med hjälp av en fin eller ultrafin nibbad permanent markör (F) Den markerade deparaffiniserade glidmonterade vävnadssektionen doppas sedan i en glyceroltvätt för att dämpa vävnadssektionen för insamling. Glidet avlägsnas långsamt från glycerolen och baksidan av bilden torkas med en vävnad för att avlägsna överskott av glycerol innan glidvävnaden läggs uppåt på bänken. (G) Med hjälp av den plana sidan av ett rent rakblad makrodissekeras vävnaden och den oönskade vävnaden utanför patologmarkeringarna kasseras innan vävnaden av intresse samlas in, som samlas längs bladets kant. (H) En träpinne används för att ta bort den uppsamlade vävnaden från bladets kant. (I) Vävnaden överförs sedan till en förmärkt mikrorörsförfylld vävnadsuppslutningsbuffert och är redo för nukleinsyraextraktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Exempel på ID | Hel vävnad (a) | Inringat vävnadsområde (b) | Övergripande tumörinnehåll i hela vävnaden (c) | Vik ökning av tumörinnehåll genom makrodissektion (d) | Inte makrodissekerad (e) | Makrodissekerad (f) | ||||
| % Livskraftig tumör | % Övrigt | % Livskraftig tumör | % Övrigt | Antal 5 μm utdragna objekt | RNA-conc (ng/μl) | Antal 5 μm utdragna objekt | RNA-conc (ng/μl) |
|||
| Exempel A | 60 | 40 | 75 | 25 | 45 | 1.7 | 2 | 19.0 | 4 | 58.3 |
| Exempel B | 60 | 40 | 65 | 35 | 39 | 1.7 | 1 | 34.0 | 2 | 60.0 |
| Prov C | 40 | 60 | 65 | 35 | 26 | 2.5 | 1 | 13.7 | 2 | 46.2 |
| Exempel D | 35 | 65 | 90 | 10 | 32 | 2.9 | 1 | 57.3 | 2 | 60.0 |
| Exempel E | 20 | 80 | 30 | 70 | 6 | 5.0 | 3 | 25.2 | 3 | 44.6 |
Tabell 1: Uppgifter om patologigranskning. Tabellen visar (a) procentandelen livskraftig tumör i hela vävnadssektionen per område, (b) procentandelen livskraftig tumör i området inringad / markerad av patologen under granskningen av cellularitet, (c) den uppskattade totala tumörcelliteten hos hela vävnaden (a x b), (d) den uppskattade vikökningen i tumörcellitet som uppnås med makrodissektion, e och f) Antalet 5 μm oskadade FFPE-glidmonterade vävnadssektioner som extraherats och de resulterande RNA-koncentrationerna för matchade icke-makrodissekerade och makrodissekerade prover. % Andra avser alla andra vävnader som finns i ett givet prov som inte är tumörvävnad och kan inkludera bindväv, stromafibroblaster, blodkärl samt andra inneboende stromaelement. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
| Exempel på ID | RNA-ingång (ng) | DLBCL90 COO-anrop | Sannolikhet för DLBCL90-samtal | DHITsig-samtal | DHITsig pos sannolikhet | DHITsig neg sannolikhet | |
| Inte makrodissekerad | Exempel A | 95.0 | Gcb | 0.000 | Neg | 0.135 | 0.865 |
| Exempel B | 170.0 | Gcb | 0.000 | Neg | 0.032 | 0.968 | |
| Prov C | 68.5 | Gcb | 0.028 | Neg | 0.033 | 0.967 | |
| Exempel D | 286.5 | Abc | 0.998 | Neg | 0.002 | 0.998 | |
| Exempel E | 126.0 | Abc | 0.989 | UNCLASS | 0.212 | 0.788 | |
| Makrodissekerad | Exempel på A_M | 291.7 | Gcb | 0.000 | UNCLASS | 0.224 | 0.776 |
| Exempel på B_M | 300.0 | Gcb | 0.000 | Neg | 0.016 | 0.984 | |
| Exempel på C_M | 231.2 | UNCLASS | 0.210 | Neg | 0.015 | 0.985 | |
| Exempel på D_M | 300.0 | Abc | 0.999 | Neg | 0.002 | 0.998 | |
| Exempel på E_M | 223.2 | Abc | 0.987 | Neg | 0.151 | 0.849 | |
| Makrodissekerad &RNA utspädd | Exempel på A_M | 95.0 | Gcb | 0.000 | UNCLASS | 0.254 | 0.746 |
| Exempel på B_M | 170.0 | Gcb | 0.000 | Neg | 0.023 | 0.977 | |
| Exempel på C_M | 68.5 | UNCLASS | 0.117 | Neg | 0.027 | 0.973 | |
| Exempel på D_M | 286.5 | Abc | 0.999 | Neg | 0.002 | 0.998 | |
| Exempel på E_M | 126.0 | Abc | 0.995 | Neg | 0.167 | 0.833 | |
Tabell 2: DLBCL90-analysresultat för digitalt genuttryck. Fem prover (A-E) makrodissekerades eller makrodissekerades innan nukleinsyraextraktioner utfördes. Det resulterande RNA kördes på DLBCL90-analysen, för vilken den maximala RNA-ingångsvolymen är 5 μL. Icke-makrodissekerade prover kördes med användning av 5 μL stam-RNA. Varje makrodissekerat prov kördes två gånger med (a) 5 μL stam-RNA om inte alikvoter på 60 ng/μl var möjliga och (b) 5 μL stam-RNA utspädda för att matcha koncentrationerna/inmatningen av deras icke-makrodissekerade motsvarigheter. Suffixet _M anger att det provet makrodissekerades. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
FFPE-vävnader är ofta heterogena blandningar av tumör- och icke-tumörvävnader. Högkänsliga genomiska tester blir allt vanligare i både kliniska och forskningsmiljöer men kan förvirras av förekomsten av förorenande icke-tumörvävnad. Faktum är att ett lägsta tumörinnehåll på 60% ofta rekommenderas för genomiska studier. Procentuell tumör kan bestämmas av vävnadsområdet som upptas av tumörmaterialet eller av andelen tumörceller i vävnaden. Även om tumör efter område är ett vanligt mått för tumörrenhet, visar det inte alltid en korrekt beskrivning av vävnaden. Tänk på två vävnader, båda med 1000 celler, varav 500 är tumörceller. I vävnad A är de 500 icke-tumörcellerna stromaceller med liknande volymer som tumörcellen. I denna vävnad kan andelen tumör betraktas som 50% av både cellularitet och område. I vävnad B är de 500 icke-tumörcellerna fettceller med volymer som är 4x tumörcellens. I denna vävnad är den procentuella tumören fortfarande 50% av cellularitet men 20% efter område. En tredje vävnad, vävnad C, består av 500 tumörceller plus 400 fettceller och 800 stromaceller med volymer som är 4x respektive 0,5x tumörcellernas. Givet 100 fettceller motsvarar volymen av 800 stromaceller, är den procentuella tumören i vävnad C 29% av cellularitet (500/1700) men fortfarande 20% efter område. Vävnad D består också av tumör-, fett- och stromacellerna med volymförhållanden på 1x, 4x och 0,1x. Antalet celler är emellertid 400, 10 respektive 720. Således är den procentuella tumören i vävnad D 35% av cellularitet (400/1130) men 78% efter område. Dessa exempel är alltför förenklade och återspeglar inte verkliga vävnadskompositioner utan förmedlar tydligt vikten av vävnadssammansättning och skillnaden mellan tumörinnehåll per område och cellitet. Viktigt, när det gäller att berika tumörinnehåll för nedströms nukleinsyrautvinning, är tumörcellitet det viktigaste attributet på grund av den ökade förvirrande potentialen att extrahera genomiskt material från fler icke-tumörceller än tumörceller. Detta understryker inte bara behovet av att bedöma tumörinnehållet i vävnader när det gäller procentuell cellularitet utan också behovet av att skära ut oönskad vävnad för att minimera eventuella negativa effekter av icke-tumörvävnaden. Det finns flera metoder tillgängliga för vävnadsanrikning, varav de viktigaste är makrodissektion och mikrodissektion.
Makrodissektion, metoden som beskrivs i detta protokoll, är relativt snabb, enkel och kräver inte kostsam eller specialiserad utrustning. Även om makrodissektion kan förbättra tumörinnehållet kraftigt är det viktigt att förstå att det inte helt eliminerar icke-tumörmaterial. Syftet med makrodissektion är att berika vävnaden av intresse tillräckligt genom uteslutning av oönskad vävnad för att minska "bruset" som härrör från oönskad vävnad, vilket i sin tur kan förbättra signalen av intresse från vävnaden av intresse. Således är makrodissektionsmedierad tumöranrikning ett sätt att förbättra signal-brusförhållandet för att bättre upptäcka markörer av intresse, särskilt tumörspecifika molekylära markörer med låg överflöd eller dåligt uttryck. Makrodissektion har dock begränsningar på grund av bristen på precision som erbjuds av grova verktyg som rakblad och är mottaglig för precisionsproblem som härrör från linjetjockleken på patologens markör, liksom potentiella fel vid spårning av patologernas H&E-avgränsningar. Som nämnts ovan är det inte möjligt att uppnå 100% tumörrenhet på grund av närvaron av inneboende och tumörinducerande stromaelement (dvs bindväv, stromala fibroblaster, blodkärl, godartade reaktiva lymfocyter, makrofager) inbäddade i själva tumören. Faktum är att många invasiva eller diffust infiltrativa maligniteter inducerar ett robust desmoplastiskt stromalt svar, vilket resulterar i kluster av tumörceller som är intimt blandade med stromala fibroblaster och andra icke-neoplastiska celltyper; där tumörer associerade med detta stromala reaktionsmönster, såsom bukspottkörtelcancervävnader21, kan dra mer nytta av digitalt styrd mikrodissektion snarare än manuell makrodissektion.
Manuell mikrodissektion utförs under ett mikroskop för att underlätta identifiering, dissektion och isolering av vävnadsspecifika celler eller populationer med hjälp av en nål eller skalpell och har fördelen av ökad precision jämfört med makrodissektion22. Manuell mikrodissektion är emellertid en mödosam process som saknar den finess som behövs för komplexa vävnader med lågt tumörinnehåll eller invecklade funktioner som är oförenliga med manuell dissektion. Sådana vävnader kan dissekeras med hjälp av automatiserade metoder med hög precision som laserfångningsmikrodissektion. Faktum är att digitalt styrd mikrodissektion har visat sig ge högre procentuellt tumörinnehåll jämfört med manuell makrodissektion i bukspottkörtelcancervävnader23. Nackdelarna med dessa automatiserade metoder med hög precision, såsom behovet av specialiserad, dyr utrustning och högutbildade individer, har dock hindrat dess införlivande i arbetsflöden. som jämförde effekterna av makrodissektion och laserfångningsmikrodissektion (LCM) på genuttrycksprofilering fann att LCM-prover hade låga totala RNA-utbyten (30 ng genomsnitt) och krävde två omgångar av mRNA-förstärkning för att uppfylla cDNA-bibliotekets förberedelseinmatningströskel24. Författarna fann att de resulterande LCM-genuttrycksprofilerna påverkades av omgångarna av mRNA-förstärkning mer än makrodissekerade profiler påverkades av icke-tumörstromala bidrag och drog slutsatsen att makrodissektion kunde användas på ett adekvat sätt för att generera tillförlitliga genuttrycksdata24.
En betydande fördel med NanoString digital genuttrycksprofilering, särskilt när man arbetar med mycket försämrat FFPE-härledd RNA, är att det inte kräver enzymatiska beroende processer som RNA-förstärkning eller beredning av cDNA-bibliotek. Analyser är emellertid vanligtvis optimerade för ingångar mellan 50-300 ng av totalt RNA25,26, vilket, baserat på resultaten från de Bruin et al.24, kanske inte är kompatibelt med mikrodissekerade vävnader utan att öka vävnadsingången; en ogynnsam efterfrågan i en tid där vävnadsprover alltmer samlas in som små biopsier snarare än kirurgiska resektioner. RNA-ingångarna som användes för DLBCL90-analysen varierade från 68,5-300 ng för både makrodissekerade och icke-dissekerade vävnader. Resultaten visar att makrodissektion resulterade i samtalsförändringar i 60% av de undersökta proverna och att dessa förändringar observerades oberoende av RNA-inmatning av de makrodissekerade proverna. COO-sannolikheten för den låga RNA-ingången inkräktade dock på COO GCB / UNC-sannolikhetsanropströskeln, där tröskelvärdena är 0 till <0,1 för GCB, 0,1-0,9 för UNC och >0,9 till 1,0 för ABC-samtal20. De viktigaste DLBCL COO-undertyperna är GCB och ABC, som utgör 41% och 44% av alla DLBCL-fall, där UNC representerar en mellanliggande grupp av de två och ABC är de mest aggressiva20,27. Även om COO-samtalsändringen vid makrodissektion av prov C inte orsakade en uppriktig förändring av COO-subtypen från GCB till ABC, kan förändringen från GCB till UNC föreslå en övergång till en mer aggressiv sjukdom. Dessutom tyder nyligen genomförda studier på att UNC-subtypen inte bara är en mellanliggande subtyp och att den potentiellt kan ha subtypspecifika terapeutiskt exploaterbara egenskaper28. På samma sätt orsakade makrodissektion av proverna A och E inte uppriktiga förändringar i DHITsig-samtal från DH-negativa till DH-positiva, eller vice versa. Rörelserna för ett GCB-prov (prov A) från NEG till UNCLASS och ett ABC-prov (prov E) från UNCLASS till NEG vid makrodissektion är dock biologiskt lämpliga eftersom dubbla träfftranslokationer som involverar BCL2 rapporteras vara ett uteslutande GCB-fenomen19. Även om translokationer traditionellt och allestädes närvarande detekteras av FISH i kliniska miljöer, finns det en växande drivkraft för att identifiera en alternativ mindre involverad och tidskrävande metod för deras detektion. DLBCL90-analysen är ett viktigt verktyg som tillgodoser detta behov, där motiveringen för dess användning stärks av upptäckten att denna analys kan detektera translokationer kryptiska till FISH-sonder som används i klinisk diagnostik29.
Makrodissektionsprotokollet som beskrivs ovan beskriver en enkel metod som gör det möjligt för forskare att öka tumörinnehållet i vävnadsprover som vanligtvis skulle falla under vanliga tröskelvärden för studieinkluderingskriterier. Att inkludera makrodissektion i ett studiearbetsflöde gör det möjligt för forskare att rädda dåligt tumörtäta vävnader från studieuteslutning genom att öka deras tumörinnehåll. I sin tur möjliggör detta ökat förtroende för att de resulterande RNA- och DNA-eluaterna representerar tumören under genomisk undersökning. Även om det finns andra mer exakta metoder för vävnadsdissektion, för tumörer som växer på ett mer expansivt, icke-infiltrativt, arkliknande eller fast sätt, är makrodissektion sannolikt tillräcklig. Resultaten som presenteras här belyser vikten av tumörrenhet i genomiska analyser och makrodissektion som ett tillförlitligt verktyg för att uppnå detta.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH-finansierad AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR, UM1 CA181255-2) under dess biospecimen science program. Videon filmades och redigering efter produktion utfördes av Mayo Clinic Media Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200-proof ethanol | Decon | 2701 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | DNA/RNA FFPE extraction kit |
| Coplin pots | Various | x | |
| DLBCL90 probes | NanoString | various | Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay |
| d-Limonene | VWR | 89376-092 | |
| Forceps | Various | x | |
| Glass micrscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Glycerol | VWR | 0854-1L | |
| Master kits | NanoString | various | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Microtubes | Ambion | AM12400 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation |
| nCounter | NanoString | x | Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay |
| Permanent marker | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Razor blade dispenser | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
| Razor blades | Electrib Microscope Sciences | 71985-23 | |
| Tissue digestion buffer | Qiagen | 80234 | |
| Ultrapure water | VWR | SH30538.02 | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Robetorye, R. S., Maguire, A., Rosenthal, A. C., Rimsza, L. M. Profiling of lymphoma from formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Seminars in Hematology. 56 (1), 46-51 (2019).
- Moorcraft, S. Y., Gonzalez, D., Walker, B. A. Understanding next generation sequencing in oncology: A guide for oncologists. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 96 (3), 463-474 (2015).
- Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PLoS One. 12 (6), 0178706 (2017).
- Oh, E., et al. Comparison of accuracy of whole-exome sequencing with formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen tissue samples. PLoS One. 10 (12), 0144162 (2015).
- Holley, T., et al. Deep clonal profiling of formalin fixed paraffin embedded clinical samples. PLoS One. 7 (11), 50586 (2012).
- Network T.C.G.A.R. TCGA Tissue sample requirements: High quality requirements yield high quality data. , Available from: https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers (2021).
- Javey, M., et al. Innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 23 (4), 399-406 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Duan, Q., Zhang, H., Zheng, J., Zhang, L. Turning cold into hot: Firing up the tumor microenvironment. Trends in Cancer. 6 (7), 605-618 (2020).
- Kim, Y. W., et al. Safety evaluation and risk assessment of d-Limonene. Journal of Toxicology and Environmental Health Part B: Critical Reviews. 16 (1), 17-38 (2013).
- Foti, C., et al. Occupational contact dermatitis to a limonene-based solvent in a histopathology technician. Contact Dermatitis. 56 (2), 109-112 (2007).
- Meuse, C. W., Barker, P. E. Quantitative infrared spectroscopy of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens: paraffin wax removal with organic solvents. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 17 (6), 547-552 (2009).
- Schmeller, J., et al. Setting out the frame conditions for feasible use of FFPE derived RNA. Pathology - Research and Practice. 215 (2), 381-386 (2019).
- Prema, V., et al. Biofriendly substitutes for xylene in deparaffinization. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 12, Suppl 1 623-630 (2020).
- Ennishi, D., et al. Double-hit gene expression signature defines a distinct subgroup of germinal center B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 37 (3), 190-201 (2019).
- Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503-511 (2000).
- Rosenwald, A., et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 346 (25), 1937-1947 (2002).
- Scott, D. W., et al. High-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangements with diffuse large B-cell lymphoma morphology. Blood. 131 (18), 2060-2064 (2018).
- Scott, D. W., et al. Determining cell-of-origin subtypes of diffuse large B-cell lymphoma using gene expression in formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Blood. 123 (8), 1214-1217 (2014).
- Heinrich, M. A., Mostafa, A., Morton, J. P., Hawinkels, L., Prakash, J. Translating complexity and heterogeneity of pancreatic tumor: 3D in vitro to in vivo models. Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 265-293 (2021).
- Erickson, H. S., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R.
- Geiersbach, K., et al. Digitally guided microdissection aids somatic mutation detection in difficult to dissect tumors. Cancer Genetics. 209 (1-2), 42-49 (2016).
- de Bruin, E. C., et al. Macrodissection versus microdissection of rectal carcinoma: minor influence of stroma cells to tumor cell gene expression profiles. BMC Genomics. 6, 142 (2005).
- Ramsower, C. A., et al. Clinical laboratory validation of the MCL35 assay for molecular risk stratification of mantle cell lymphoma. Journal of Hematopathology. 13 (4), 231-238 (2020).
- Maguire, A., et al. Enhanced DNA repair and genomic stability identify a novel HIV-related diffuse large B-cell lymphoma signature. International Journal of Cancer. 145 (11), 3078-3088 (2019).
- Rosenwald, A., Staudt, L. M. Gene expression profiling of diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia & Lymphoma. 44, Suppl 3 41-47 (2003).
- Wright, G. W., et al. A probabilistic classification tool for genetic subtypes of diffuse large B cell lymphoma with therapeutic implications. Cancer Cell. 37 (4), 551-568 (2020).
- Hilton, L. K., et al. The double-hit signature identifies double-hit diffuse large B-cell lymphoma with genetic events cryptic to FISH. Blood. 134 (18), 1528-1532 (2019).
