Summary
Plaquing è un metodo di routine utilizzato per quantificare i virus vivi in una popolazione. Sebbene il plaquing sia spesso insegnato in vari curricula di microbiologia con batteri e batteriofagi, il plaquing dei virus dei mammiferi è più complesso e richiede tempo. Questo protocollo descrive le procedure che funzionano in modo affidabile per il lavoro regolare con i virus dell'herpes simplex.
Abstract
Esistono numerosi protocolli pubblicati per plaquing dei virus, inclusi riferimenti all'interno della letteratura primaria per la metodologia. Tuttavia, l'applicazione di virus può essere difficile da eseguire, richiedendo attenzione alle sue specifiche e perfezionamento. È un metodo incredibilmente impegnativo da padroneggiare per i nuovi studenti, principalmente perché richiede un'attenzione meticolosa ai dettagli più minuti. Questa dimostrazione di plaquing herpes simplex virus dovrebbe aiutare coloro che hanno lottato con la visualizzazione del metodo, in particolare le sue sfumature, nel corso degli anni. Mentre questo manoscritto si basa sugli stessi principi della metodologia standard di plaquing, differisce in quanto contiene una descrizione dettagliata di (1) come gestire al meglio le cellule ospiti per evitare interruzioni durante il processo, (2) un mezzo viscoso più utile dell'agarosio per limitare la diffusione dei virioni e (3) una semplice procedura di fissazione e colorazione che produce risultati riproducibili in modo affidabile. Inoltre, il video di accompagnamento aiuta a dimostrare le distinzioni più sottili nel processo, che spesso mancano quando si istruiscono gli altri sulla conduzione di saggi di placca.
Introduction
Gli inizi dei test della placca virale risalgono alle prime scoperte di virus nel 18901. Il virus del mosaico del tabacco è stato isolato e trasmesso per la prima volta sulle foglie di tabacco, dove le singole macchie di infezione potevano essere riconosciute e quantificate come provenienti da una singola entità virale viva2, in seguito identificata come virione2. Successivi studi seminali con batteri e batteriofagi hanno perfezionato le tecniche utilizzate per placcare questi virus, compresi i batteri nella fase intermedia della crescita, la diluizione seriale di campioni di batteriofagi e l'agar superiore con successiva visualizzazione di fori letterali (denominati placche) nel prato batterico3.
Plaquing di virus animali ritardato l'eccitante ricerca condotta con batteriofagi, principalmente perché i metodi necessari per la crescita di cellule di mammifero in coltura non sono stati sviluppati fino al 1940s4. Tuttavia, l'avvento delle cellule murine in crescita in assenza dell'intero organismo ospite4 ha generato una nuova era nella capacità di coltivare e contare i virus. Tale lavoro è stato esteso per la propagazione e la quantificazione del virus dell'encefalomielite equina occidentale nelle cellule di pollo e del poliovirus nelle cellule umane5,6. Con l'espansione del regno delle cellule di mammifero coltivabili, lo stuolo di diverse cellule ospiti per varie infezioni virali ha dato al mondo una cornucopia di possibilità per studiare tutti i tipi di virus7. Ciò includeva la propagazione e la quantificazione degli herpesvirus umani, in particolare il virus dell'herpes simplex-1 (HSV-1) e -2 (HSV-2), che causano lesioni mucocutanee8. È importante sottolineare che tutti i saggi della placca dipendono dall'esistenza di virioni vivi, che possono entrare nelle cellule ospiti in modo mediato dal recettore in un campione9. Indipendentemente dall'ubiquità e dalla moltitudine di pubblicazioni sull'esecuzione di saggi di placca5,10,11,12,13,14,15,16, questi metodi per HSV-1/-2 sono una miscela di arte e scienza; non si può condurre il test senza un'adeguata attenzione ad ogni dettaglio del protocollo, né si può eseguire un test di successo senza un occhio crticiale per la sottigliezza nel processo. Questo manoscritto raffigura uno dei metodi più riproducibili per i saggi della placca HSV-1/-2, con dettagli precisi verso l'arte del saggio che sono raramente discussi.
Questo protocollo attuale ottiene conteggi di unità di formazione di placche vive (PFU) per HSV-1 e -2 in modo affidabile. I migliori risultati si ottengono utilizzando cellule Vero (cellule epiteliali del rene di scimmia verde africana trasformate) a basso passaggio (sotto il passaggio numero 155) e coltivate abitualmente in alfa-MEM17 integrate con il 10% di siero fetale di vitello (FCS), L-alanil-L-glutammina e una miscela antibiotica / antimicotica18. Le cellule Vero vengono propagate in modo standard in questo mezzo due o tre volte alla settimana a una diluizione di 1/5 ogni volta.
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Protocol
Tutte le procedure con le cellule Vero e gli herpesvirus vivi sono state approvate dal Comitato istituzionale per la biosicurezza della Towson University. Uno schema generalizzato di queste procedure è rappresentato nella Figura 1.
1. Semina delle cellule Vero
- Il giorno prima di iniziare il test della placca, tripsinizzare le cellule Vero e risospenderle in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) regolare e integrare secondo la metodologia standard di coltura cellulare19. Risospese le cellule tripsinizzate in 10 mL di DMEM per pallone T-75 delle cellule Vero confluenti (~ 107 cellule).
NOTA: DMEM viene utilizzato per i saggi della placca invece di alfa-MEM perché rallenta leggermente il tasso di crescita cellulare e favorisce migliori risultati del test della placca. - Contare le cellule con il metodo preferito (ad esempio, un emocitometro standard con esclusione trypan blue)19.
- Seminare le cellule a 4 x 106 cellule/ piastra; per HSV-2, utilizzare piastre a 6 pozzetti con 2,5 ml di DMEM (con integratori) per pozzetto; e per HSV-1, utilizzare piastre a 12 pozzetti con 1,25 ml di DMEM (con integratori) per pozzetto.
NOTA: Il numero di cellule deve essere costante indipendentemente dalla piastra utilizzata, anche se la dimensione dei pozzetti è importante per quanto riguarda l'accuratezza nel test della placca. È essenziale che le cellule siano distribuite uniformemente, il che può essere realizzato nel modo più efficace spostando la piastra avanti e indietro, non in modo circolare. - Lasciare che le cellule crescano durante la notte a 37 °C/5% di CO2 in un incubatore umidificato.
NOTA: L'umidità viene mantenuta con una padella di acqua distillata contenente un algicida sul fondo dell'incubatore.
2. Diluizione del campione
- Completare la diluizione del campione e l'aggiunta del virus alle cellule in una sessione di laboratorio.
ATTENZIONE: HSV-1 e -2 sono infettivi per l'uomo e devono essere trattati con un adeguato contenimento della biosicurezza (BSL-2). Tenere separati tutti i materiali che entrano in contatto con il virus e disinfettare con un agente quaternario a 1/256 di diluizione (vedere Tabella dei materiali), iodoforo, candeggina o detergente ionico forte (ad esempio, SDS) prima di rimuoverli dall'armadio di biosicurezza. - Il giorno dopo la semina delle cellule Vero, diluire in serie ogni campione di virus da placcare in 1x PBS; in genere utilizzare diluizioni 10 volte superiori per un monitoraggio più preciso.
- Effettuare queste diluizioni attraverso 10-4 (per basse concentrazioni di virus) o attraverso 10-9 (per le aspettative di campioni di titolo più elevato) con almeno 1 mL di ciascun campione rimanente per il test della placca stessa.
- Mantenere tutte le diluizioni virali sul ghiaccio (non più di 1 ora) fino a quando non è pronto per aggiungere questi campioni di virus diluiti alle cellule.
3. Aggiunta di virus alle cellule
- Rimuovere il terreno di coltura cellulare da uno o due pozzetti con una pipetta.
NOTA: Non utilizzare un aspiratore perché rimuove troppo liquido dal monostrato cellulare e asciuga le cellule. Una considerazione cruciale è garantire che il monostrato cellulare rimanga idratato per tutto il corso dell'esperimento. Se le celle si asciugano, laveranno via la piastra nella fase finale e genereranno dati inutilizzabili. Pertanto, elaborare solo uno o due pozzi alla volta per ridurre questa possibilità. - Aggiungere con attenzione il campione di virus diluito (100-400 μL e 50-200 μL di campione di virus vengono utilizzati rispettivamente per piastre a 6 pozzetti e 12 pozzetti) a goccia a ciascun monostrato, aggiungendo le gocce lungo il lato di ciascun pozzetto. Ripetere il processo per ogni uno o due pozzetti fino a quando l'intera piastra non viene riempita con i campioni di virus da placcare.
NOTA: l'aggiunta delle gocce al centro del pozzo può inavvertitamente rimuovere le cellule dal substrato. - Scuotere delicatamente l'intera piastra a mano per assicurarsi che il PBS che contiene il virus copra l'intero monostrato di cellule in ciascun pozzetto, quindi posizionare la piastra in un incubatore a CO2 a 37 ° C per consentire al virus di assorbire.
- Ogni 10 minuti entro 1 ora, rimuovere la piastra dall'incubatrice, scuoterla delicatamente di nuovo per diffondere il virus in modo più uniforme su ciascun pozzetto, quindi riposizionarla nell'incubatrice.
NOTA: ogni esperimento determinerà il numero di repliche e quali diluizioni vengono utilizzate; la preferenza del lettore detta tale decisione. - Per ridurre la possibilità di contare inavvertitamente l'inoculo non assorbito, rimuovere il campione di virus dai pozzetti con punte di pipetta da 1000 μL e metterlo in un becher di scarto.
NOTA: Ancora una volta, questa procedura viene condotta con solo uno o due pozzetti alla volta per mantenere l'idratazione del monostrato cellulare. - Posizionare 2,5 mL di una sovrapposizione di metilcellulosa (sciogliere il 5% di metilcellulosa p/p in 100 mL di PBS, autoclave per 15 minuti a 121 °C e 15 psi su un ciclo liquido, quindi aggiungere 375 mL di DMEM più 25 ml di FBS).
- Una volta che un intero piatto contiene sovrapposizione, riposizionare il piatto nell'incubatrice per consentire la crescita per due giorni.
NOTA: Se il virus e le cellule sono autorizzati a crescere per tre giorni, anche in DMEM più integratori, può verificarsi una sostanziale perdita di cellule nel monostrato, compromettendo così i dati finali. - Disinfettare il becher di scarto, in genere con l'aggiunta di candeggina, uno iodoforo o un virucida simile, prima di rimuoverlo dall'armadio di biosicurezza.
4. Colorazione per placche
- Dopo l'incubazione di due giorni, rimuovere la sovrapposizione di metilcellulosa con una pipetta, di nuovo uno o due pozzetti alla volta, e metterla in un becher di scarto.
- Aggiungere ~ 2 ml di viola cristallino all'1% (vedi Tabella dei materiali) in etanolo al 50% a ciascun pozzetto per macchiare le placche.
NOTA: non è essenziale rimuovere ogni ultima goccia della sovrapposizione. - Incubare la piastra con tutti i pozzetti riempiti con la macchia per 30 minuti a 37 °C. A questo punto, disinfettare il becher di scarto come sopra al punto 3.8.
- Lavare vigorosamente i piatti con acqua del rubinetto fino a quando il deflusso è chiaro.
NOTA: Un leggero flusso d'acqua non è abbastanza vigoroso; è necessaria la piena pressione da un dispositivo di lavello da laboratorio. - A questo punto, assicurati che ci siano differenze di circa 10 volte nel numero di placche in ogni serie di diluizione.
- Lasciare asciugare le piastre durante la notte a testa in giù, dopo di che le singole placche possono essere contate.
5. Conteggio delle placche e determinazione del titolo del virus
- Indipendentemente dall'approccio (vedi NOTA sotto), moltiplicare il numero di placche per il fattore di diluizione (ad esempio, se le placche fossero contate nel pozzetto 10-4 , il numero di placche verrebbe moltiplicato per 104).
NOTA: Sebbene il conteggio entro un intervallo di 10-100 placche sia utile5, il conteggio dei pozzetti con 30-300 placche è un po 'più affidabile e tiene conto di circa 1/2 log di diluizioni invece di diluizioni a log completo. - Dividere questo numero per il volume di inoculo (come sopra nel passaggio 3.2) e fare la media di tutti i pozzetti che hanno placche all'interno dell'intervallo indicato per ottenere il titolo più accurato di HSV nel campione originale.
- Eseguire i calcoli nei passaggi da 5.3.1 a 5.3.5, considerando l'uso di dati fittizi nella tabella 1.
- Considera solo i pozzi con 30-300 placche (passaggio 5.1). Pertanto, nella Tabella 1, utilizzare solo la colonna 10-5 per le repliche 1, 2 e 3.
- Prendi il numero di placche alla diluizione data e moltiplica per il reciproco del fattore di diluizione. Quindi, la colonna 10-5 del campione 1 va da 81 placche alla diluizione 10-5 a 81 placche volte 105.
- Quindi dividere quel numero per il volume (in ml) della diluizione del virus aggiunta alle cellule in quel pozzo. Supponendo che i dati su HSV-1 nella Tabella 1 provengano da una piastra a 12 pozzetti, 0,2 ml sarebbe la misura più appropriata. Quindi il calcolo dal passo 5.3.2 diventa 81 x 105 diviso per 0,2 mL, o 4,0 x 107 PFU / mL di HSV-1.
- Ripeti questo processo per tutti i dati utili e medi. Quindi condurre il calcolo in 5.3.2-5.3.3 su tutti i campioni nella colonna 10-5, supponendo che provengano dallo stesso campione di virus e che le repliche biologiche siano state condotte per ottenere la misurazione del titolo più accurata. Nel caso della Tabella 1, media 4,0 x 107, 2,1 x 107 e 2,6 x 107 PFU/mL per ottenere un titolo medio finale di 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/mL per questo campione.
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Representative Results
La Tabella 1 mostra un esperimento che ha risultati ottimali. Tutte le diluizioni 10 volte seguono una diminuzione di circa 10 volte del numero di placca. Questi tipi di dati possono anche essere visti nella Figura 2, un vero e proprio test della placca in cui il numero numerabile di placche è caduto nell'intervallo 10-4 per tutte e tre le repliche. Lo stesso può essere visto nella Figura 3, la riga superiore, dove il numero numerabile di placche era nella diluizione 10-3.
Tuttavia, la Figura 3, riga inferiore, mostra un risultato completamente diverso quando un test della placca non viene condotto bene. In primo luogo, ci sono pochissime placche visibili da qualsiasi diluizione; quindi, i dati sono inutilizzabili. In secondo luogo, ci sono aree visibili intorno alla parte superiore in cui le cellule Vero si sono completamente sollevate dal substrato, prova sia di permettere alle cellule di asciugarsi nel processo o di pipettare troppo vigorosamente in quella regione del pozzo.
La Tabella 2 mostra anche una serie di esiti potenzialmente aberranti nel conteggio delle placche e richiede precauzioni lungo il percorso. Da notare, né la riga superiore né la fila inferiore di repliche seguono una differenza regolare di 10 volte nel conteggio della placca mentre si passa da una diluizione all'altra; questi dati indicano l'errore dell'utente durante il processo di diluizione del virus. Inoltre, non è probabile che un utente conti accuratamente oltre 15.000 placche, quindi è necessario mettere in discussione tali dati. Infine, si può notare che nella replica 1, 10-6 diluizione, c'è un conteggio della placca nell'intervallo 30-300; tuttavia, data la scarsa natura del resto dei dati in questa replica, è improbabile che il conteggio delle 42 placche sia un numero accurato. Quindi, gli unici dati credibili nella Tabella 2 sono in replica 2.
La Figura 4 mostra gli stessi problemi con le cellule che si asciugano o vengono mal gestite durante il test della placca. Tuttavia, la Figura 4 mostra criticamente una scarsa semina delle cellule Vero; ogni pozzo mostra macchie viola più scure, indicative di cellule non ben distribuite attraverso il pozzo e ammucchiate l'una sull'altra in gruppi.
Figura 1: Schema generale di analisi della placca. Adattato dal modello di biorender, "Viral Plaque Assay Protocol", di BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Saggio della placca per HSV-1 in piastre a dodici pozzetti. Le repliche biologiche sono state condotte come indicato nella Figura 1 su un campione di HSV-1. Le diluizioni seriali 10 volte di un campione HSV-1 (a partire dalla diluizione 10-2 ) sono state aggiunte alle cellule Vero, incubate, quindi colorate con viola cristallino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Saggio della placca per HSV-2 in piastre a sei pozzetti. Le repliche biologiche sono state condotte come indicato nella Figura 1 su un campione di HSV-2. Le diluizioni seriali 10 volte di un campione HSV-2 (a partire dalla diluizione 10-2 ) sono state aggiunte alle cellule Vero, incubate, quindi colorate con viola cristallino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Saggio della placca per HSV-1 in piastre a dodici pozzetti. Le repliche biologiche sono state condotte come indicato nella Figura 1 su un campione di HSV-1. Le diluizioni seriali 10 volte di un campione HSV-1 (a partire dalla diluizione 10-2 ) sono state aggiunte alle cellule Vero, incubate, quindi colorate con viola cristallino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Fattore di diluizione | ||||
| Replicare | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 5721 | 635 | 81 | 5 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5,519 | 521 | 53 | 1 |
Tabella 1: Conteggi rappresentativi delle placche da un test riuscito. Sono state condotte diluizioni seriali da ciascuna replica biologica; i conteggi rappresentativi delle placche (a partire dalla diluizione 10-3 ) sono mostrati per ogni diluizione.
| Fattore di diluizione | ||||
| Replicare | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 15225 | 635 | 450 | 42 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5519 | 5400 | 53 | 1 |
Tabella 2: Conteggi rappresentativi delle placche da un test non riuscito. Sono state condotte diluizioni seriali da ciascuna replica biologica; i conteggi rappresentativi delle placche (a partire dalla diluizione 10-3 ) sono mostrati per ogni diluizione.
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Discussion
Mentre i saggi della placca sono vecchi quasi quanto la coltura cellulare dei mammiferi, sembra che ogni laboratorio abbia il proprio set di protocolli per eseguire questo test di base5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 . Sebbene le istruzioni in ogni versione pubblicata di un test della placca differiscano leggermente, pochi di questi manoscritti chiariscono le sfumature critiche coinvolte nell'ottenere risultati coerenti.
Quindi, ci sono alcune parti di questo protocollo che sono più arte che scienza. Quando le cellule Vero vengono seminate in pozzetti per il test, devono essere distribuite uniformemente in tutto il pozzo (Figura 4). Tutte le fasi che comportano un trasferimento di liquidi (ad esempio, le fasi 3.1, 3.2, 3.5, 3.6, 4.1 e 4.2) devono essere eseguite con attenzione per mantenere idratato il monostrato cellulare Vero (Figura 3 e Figura 4). È anche fondamentale non toccare il fondo del pozzo con alcuna pipetta, altrimenti le celle potrebbero raschiare via, compromettendo ulteriormente i dati finali (Figura 4).
Mentre la metilcellulosa è vantaggiosa come materiale di sovrapposizione per prevenire la diffusione di virioni in tutto il pozzo, possono essere utilizzate alternative. Ad esempio, si può usare cellulosa microcristallina21,22 o carbossimetilcellulosa21. Indipendentemente da ciò, la metilcellulosa è uno dei mezzi di sovrapposizione liquidi più facili e meno costosi da usare, però. Si può anche usare un colorante diverso21 o una soluzione fissante (ad esempio, paraformaldeide)21 per la parte di colorazione del protocollo (fase 4), ma il viola cristallo in etanolo al 50% è il più semplice e il meno costoso tra le opzioni.
Mentre può essere apertamente semplice condurre questi test, richiedono formazione e pratica. Vale la pena utilizzare campioni che non sono insostituibili per l'apprendimento di questo metodo in modo da aver padroneggiato la tecnica quando conta di più.
I saggi della placca stessi dovrebbero essere usati, tuttavia, solo quando è necessario contare i virioni vivi in buona fede. Plaquing è una metodologia molto più vecchia per misurare le particelle virali5,10 rispetto ai metodi quantitativi più recenti come la microscopia a fluorescenza23, ELISA24, attività enzimatica25,26 o qPCR27. Tuttavia, questi ultimi metodi generano dati surrogati che suggeriscono la presenza di virioni interi, ma possono portare a una grossolana sovrastima delle particelle vitali perché l'utente quantificherebbe un indicatore di infezione, non virioni reali. La microscopia a fluorescenza misura i virioni infettivi in base a quante cellule mostrano la presenza di una proteina espressa dal virus, ma non rileva necessariamente virioni completi e competenti per la replicazione. ELISA rileva allo stesso modo la presenza di proteine virali che possono esistere senza un virione completamente infettivo. L'attività enzimatica di analisi, sebbene suggestiva di un virione intatto, mostra solo che è presente un singolo enzima attivo e non riflette la vera natura contagiosa di un intero virione. E qPCR si limita a quantificare le copie del genoma di un virus, indipendentemente dal fatto che quel genoma sia difettoso o meno. L'unico metodo paragonabile a un test della placca per quantificare i virus vivi è un test di diluizione dell'endpoint28, che richiede ancora una stima statistica tramite i metodi Reed-Muench o Spearman-Kärber29,30,31 per determinare la concentrazione di virioni.
Mentre i saggi della placca sono un metodo di routine utilizzato in tutta la virologia, ci sono casi particolari in cui non sono il test quantitativo di scelta. Ad esempio, i saggi della placca richiedono che le cellule ospiti si attacchino a un substrato; se la migliore cellula ospite per l'infezione non è aderente, le placche non si formeranno mai32. Alcuni virus crescono più lentamente del tipico ciclo cellulare dei loro ospiti, e quindi qualsiasi placca in crescita sarebbe invasa dalle cellule ospiti stesse21. Le placche a volte possono non formarsi bene, solo per la natura dell'effetto citopatico, rendendo la determinazione delle placche in buona fede una limitazione21.
L'approccio per plaquing herpesvirus presentato qui non è necessariamente unico. Tuttavia, questa descrizione approfondita degli avvertimenti minori associati a un test della placca HSV di successo può ridurre le difficoltà incontrate da molti utenti, in particolare dai principianti. Indipendentemente da ciò, la metodologia descritta è anche ampiamente applicabile ai saggi della placca con molti altri virus, inclusi ma non limitati a picornavirus33, ortomissovirus34, flavirus35, coronavirus36 e molti altri sistemi in cui è richiesta una quantità quantificabile di virus animali infettivi.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo innumerevoli studenti nei nostri laboratori (PJD e BJM) che hanno lavorato con noi nel corso degli anni perfezionando questi metodi. Un ringraziamento speciale a Stan Person, sotto la cui tutela questa metodologia è stata sviluppata per la prima volta. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal Fondo di supporto alla ricerca universitaria della Towson University Fisher College of Science and Math e dalla sovvenzione NIGMS Bridges to the Baccalaureate 5R25GM058264. Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health's National Institute of General Medical Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
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