Summary
プラーキングは、集団内の生きたウイルスを定量化するために使用される日常的な方法です。プラーキングは、細菌やバクテリオファージを用いたさまざまな微生物学のカリキュラムで頻繁に教えられていますが、哺乳類ウイルスのプラーキングはより複雑で時間がかかります。このプロトコルは、単純ヘルペスウイルスとの定期的な作業のために確実に機能する手順を説明しています。
Abstract
ウイルスをプラクシングするための多数の公開されたプロトコルがあり、方法論に関する一次文献内の参考文献を含む。しかし、ウイルスのプラーキは実行が難しく、その仕様と改良に焦点を当てる必要があります。これは、主に最も細かい細部に細心の注意を払わなければならないため、新入生が習得するのに信じられないほど挑戦的な方法です。単純ヘルペスウイルスをプラキューイングするこのデモンストレーションは、長年にわたってこの方法、特にそのニュアンスを視覚化するのに苦労してきた人々を助けるはずです。この原稿は標準的なプラーキング方法論の同じ原則に基づいていますが、(1)プロセス中の破壊を避けるために宿主細胞を処理する最善の方法、(2)ビリオンの拡散を制限するためにアガロースよりも有用な粘性媒体、および(3)確実に再現可能な結果をもたらす簡単な固定および染色手順の詳細な説明が含まれている点で異なります。さらに、添付のビデオは、プラークアッセイの実施を他の人に指示するときにしばしば見逃されるプロセスのより細かい区別を実証するのに役立ちます。
Introduction
ウイルスプラークアッセイの始まりは、1890年代のウイルスの最初の発見にさかのぼります1。タバコモザイクウイルスは最初に分離され、タバコの葉に伝染し、そこでは個々の感染スポットが単一の生きたウイルス実体2に由来すると認識され、定量化され、後にビリオン2として同定された。その後のバクテリアとバクテリオファージを用いた精力的な研究は、増殖の中間対数段階の細菌、バクテリオファージサンプルの段階希釈、および細菌芝生の文字通りの穴(プラークと名付けられた)のその後の視覚化を伴う上部寒天を含む、これらのウイルスをプラークするために使用される技術を完成させました3。
動物ウイルスのプラークは、主に培養中の哺乳類細胞を増殖させるために必要な方法が1940年代まで開発されなかったため、バクテリオファージで行われているエキサイティングな研究に遅れをとっていました4。しかし、宿主生物全体の存在下でマウス細胞が増殖する出現4は、ウイルスを培養し数える能力に新しい時代を生み出しました。このような研究は、ニワトリ細胞におけるウマ頭脳脊髄炎ウイルスおよびヒト細胞におけるポリオウイルスの増殖および定量のために拡張された5,6。培養可能な哺乳類細胞の領域が拡大するにつれて、さまざまなウイルス感染のためのさまざまな宿主細胞の群れは、あらゆる種類のウイルスを研究する可能性の宝庫を世界に与えました7。これには、ヒトヘルペスウイルス、特に皮膚粘膜病変を引き起こす単純ヘルペスウイルス-1(HSV-1)および-2(HSV-2)の増殖および定量化が含まれていた8。重要なことに、すべてのプラークアッセイは、サンプル中の受容体媒介性様式で宿主細胞に入ることができる生ビリオンの存在に依存している9。プラークアッセイの実行に関する遍在性および多数の出版物5,10,11,12,13,14,15,16にかかわらず、HSV-1/-2のためのこれらの方法は、芸術と科学の両方の混合物である。プロトコルのあらゆる細部に適切な注意を払わずにアッセイを行うことはできませんし、プロセスの微妙さに対する批判的な目なしでアッセイを成功させることもできません。この原稿は、HSV-1/-2プラークアッセイのための最も一貫して再現可能な方法の1つを描いており、アッセイの技術分野に関する正確な詳細はほとんど議論されていない。
この現在のプロトコルは、HSV-1および-2の生プラーク形成単位(PFU)数を確実に取得します。最良の結果は、低継代時(継代番号155以下)でVero細胞(形質転換アフリカミドリザル腎臓上皮細胞)を使用し、10%ウシ胎児血清(FCS)、L-アラニル-L-グルタミン、および抗生物質/抗真菌剤混合物を添加したα-MEM17で日常的に増殖させることです18。Vero細胞は、この培地中で週に2〜3回、毎回1/5希釈で標準的に増殖される。
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Protocol
Vero細胞および生ヘルペスウイルスを用いたすべての手順は、タウソン大学機関バイオセーフティ委員会によって承認されています。これらの手順の一般化されたスキームを 図 1 に示します。
1. ベロ細胞の播種
- プラークアッセイを開始する前日に、Vero細胞をトリプシン処理し、通常のダルベッコの改変イーグルス培地(DMEM)に再懸濁し、標準的な細胞培養方法論に従って補足します19。コンフルエントベロ細胞(〜107細胞)のT−75フラスコ当たり10mL のDMEMにトリプシン処理細胞を再懸濁する。
注:DMEMは、細胞増殖速度をわずかに遅くし、より良いプラークアッセイ結果を支持するため、α-MEMの代わりにプラークアッセイに使用されます。 - 細胞を自分の好みの方法(例えば、トリパンブルー排除による標準的な血球計数器)によって計数する19。
- 細胞を4 x 106 細胞/プレートで播種する。HSV-2の場合は、ウェルあたり2.5mLのDMEM(サプリメントを含む)を含む6ウェルプレートを使用してください。HSV-1の場合は、1ウェルあたり1.25mLのDMEM(サプリメント付き)を含む12ウェルプレートを使用してください。
注:細胞数は、使用するプレートに関係なく一定でなければなりませんが、ウェルのサイズはプラークアッセイの精度に関係します。細胞を均等に分布させることが不可欠であり、これはプレートを円形ではなく前後に動かすことによって最も効果的に達成することができる。 - 加湿インキュベーター内で細胞を37°C/5%CO2 で一晩成長させます。
注:湿度は、インキュベーターの底部にアルジサイドを含む蒸留水の鍋で維持されます。
2. サンプル希釈
- サンプル希釈を完了し、1回のラボセッションで細胞へのウイルスの添加を完了します。
注意: HSV-1 および -2 はヒトに感染性であり、適切なバイオセーフティ封じ込め (BSL-2) の下で取り扱う必要があります。ウイルスと接触するすべての材料を別々に保ち、バイオセーフティキャビネットから取り出す前に、第4級剤を1/256希釈( 材料表を参照)、ヨードフォール、漂白剤、または強イオン性洗剤(SDSなど)で消毒してください。 - Vero細胞の播種翌日に、プラークされる各ウイルスサンプルを1x PBSで段階的に希釈する;通常、最も正確な追跡のために10倍希釈を使用します。
- これらの希釈液を10~4 (低濃度のウイルスの場合)または10~9 (より高い力価のサンプルを期待する場合)まで行い、プラークアッセイ自体のために各サンプルの少なくとも1mLを残します。
- これらの希釈されたウイルスサンプルを細胞に加える準備ができるまで、すべてのウイルス希釈液を氷上に(1時間以内)保管してください。
3.細胞へのウイルスの添加
- ピペットにより細胞培養培地を1つまたは2つのウェルから取り除く。
注:アスピレーターは、細胞単層からあまりにも多くの液体を除去し、細胞を乾燥させるため、使用しないでください。1つの重要な考慮事項は、実験の全過程を通して細胞単層が水和したままであることを保証することである。細胞が乾燥すると、最終ステップでプレートから洗い流され、使用できないデータが生成されます。したがって、一度に 1 つまたは 2 つのウェルのみを処理して、この可能性を減らします。 - 希釈したウイルスサンプル(それぞれ100〜400μLおよび50〜200μLのウイルスサンプルを6ウェルプレートおよび12ウェルプレートにそれぞれ使用)を各単分子層に滴下し、各ウェルの側面に滴を加える。プレート全体がプラークされているウイルスサンプルで満たされるまで、1つまたは2つのウェルごとにこのプロセスを繰り返します。
注:ウェルの中央に滴を加えると、誤って細胞が基質から脱落する可能性があります。 - プレート全体を手で静かに揺らして、ウイルスを含むPBSが各ウェルの細胞の単層全体を覆うようにし、プレートを37°CのCO2 インキュベーターに入れてウイルスを吸着させます。
- 1時間以内に10分ごとに、プレートをインキュベーターから取り出し、再び静かに揺らして各ウェルにウイルスをより均一に広げ、インキュベーターに戻します。
注: 各実験では、反復数と使用する希釈値が決まります。読者の好みがその決定を左右します。 - 吸収されていない接種物を誤ってカウントする可能性を減らすには、1000 μLのピペットチップでウェルからウイルスサンプルを取り出し、廃ビーカーに入れます。
注:繰り返しますが、この手順は、細胞単層の水和を維持するために、一度に1つまたは2つのウェルのみで行われます。 - 2.5 mLのメチルセルロースオーバーレイを置きます(5%メチルセルロースw/wを100 mLのPBSに溶解し、オートクレーブを121°Cで15分間、液体サイクルで15psiにしてから、375 mLのDMEMと25 mLのFBSを加えます)。
- プレート全体にオーバーレイが含まれたら、プレートをインキュベーターに戻して2日間成長させます。
注:ウイルスと細胞が3日間増殖すると、DMEMとサプリメントであっても、単層中の細胞の実質的な損失が生じ、最終データが損なわれる可能性があります。 - バイオセーフティキャビネットから取り出す前に、通常、漂白剤、ヨードフォア、または同様のウイルス化物を添加して、廃ビーカーを消毒します。
4. プラークの染色
- 2日間のインキュベーションの後、メチルセルロースオーバーレイをピペットで取り除き、再び一度に1つまたは2つのウェルを、廃ビーカーに入れた。
- 約2mLの1%クリスタルバイオレット( 材料表を参照)を各ウェルに50%エタノール中に加え、プラークを染色する。
メモ: オーバーレイの最後の一滴をすべて削除することは必須ではありません。 - 染色剤を充填した全てのウェルと共にプレートを37°Cで30分間インキュベートする。 この時点で、ステップ3.8で上記のように廃ビーカーを消毒する。
- 流出がはっきりするまで水道水でプレートを激しく洗ってください。
注:穏やかな水の流れは十分に活発ではありません。ラボシンク治具からの完全な圧力が必要です。 - この時点で、各希釈系列全体でプラークの数に約 10 倍の差があることを確認します。
- プレートを一晩逆さまに乾燥させ、その後、個々のプラークを数えることができます。
5. プラークのカウントとウイルス力価の決定
- アプローチに関係なく(下記の注を参照)、プラークの数に希釈係数を掛けます(例えば、プラークが10-4 ウェルでカウントされた場合、プラークの数は104で乗算されます)。
注: 10 ~ 100 個のプラークの範囲内でカウントすることは有用ですが5、30 ~ 300 個のプラークを含むウェルのカウントはやや信頼性が高く、フルログ希釈ではなく約 1/2 対数希釈が考慮されます。 - この数値を接種剤の体積で割り(ステップ3.2で上記のように)、記載された範囲内にプラークを有するすべてのウェルを平均して、元のサンプル中のHSVの最も正確な力価を得る。
- ステップ 5.3.1 から 5.3.5 までの計算を、 表 1 のモック・データの使用を考慮して実行します。
- 30-300個のプラークを持つ井戸だけを考えてみましょう(ステップ5.1)。したがって、表1では、反復 1、2、および3に10~5 の列のみを使用します。
- 与えられた希釈率におけるプラークの数を取り、希釈係数の逆数を掛ける。したがって、サンプル1の10-5カラムは、10-5希釈時の81プラークから105倍の81プラークに変わります。
- 次に、その数を、そのウェル内の細胞に加えたウイルス希釈液の体積(mL単位)で除算する。表1のHSV-1に関するデータが 12 ウェルプレートからのものであると仮定すると、0.2mLが最も適切な測定であろう。したがって、ステップ5.3.2からの計算は、81 x 105を 0.2 mLで割った値、またはHSV-1の4.0 x 107 PFU/mLになります。
- すべての有用なデータと平均についてこのプロセスを繰り返します。したがって、10-5列のすべてのサンプルについて5.3.2-5.3.3で計算を行い、それらが同じウイルスサンプルから発生し、生物学的複製が最も正確な力価測定を得たと仮定します。表1の場合、平均4.0 x 107、2.1 x 107、および2.6 x 107 PFU/mLで、このサンプルの最終平均力価は2.9 x 107±0.98 x 107 PFU/mLでした。
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Representative Results
表1は、最適な結果を得た実験を示す。すべての10倍希釈は、プラーク数の約10倍の減少に従う。これらの種類のデータは、3つの反復すべてについてプラークの可算数が10〜4の範囲に落ちた実際のプラークアッセイである図2にも見ることができる。同じことが図3でも見ることができ、上段は、プラークのカウント可能な数が10-3希釈であった。
しかしながら、 図3、下段は、プラークアッセイがうまく行われない場合に全く異なる結果を示している。まず、希釈から見えるプラークはほとんどありません。したがって、データは使用できません。第二に、Vero細胞が基質から完全に持ち上げられた上部の周囲には目に見える領域があり、その過程で細胞が乾燥するのを許すか、井戸のその領域であまりにも激しくピペッティングする証拠です。
表2 はまた、プラーク数における潜在的に異常な結果のセットを示しており、その過程で注意が必要である。注目すべきは、複製の一番上の行も一番下の行も、ある希釈から次の希釈に移動するにつれて、プラークカウントの規則的な10倍の差に従っていないことです。これらのデータは、ウイルス希釈プロセス中のユーザーエラーを示しています。さらに、ユーザーが15,000以上のプラークを正確に数える可能性は低いため、これらのデータに疑問を投げかける必要があります。最後に、反復1、10-6 希釈では、30-300の範囲のプラーク数があることに注意することができます。それにもかかわらず、この反復の残りのデータの性質が悪いことを考えると、42プラーク数が正確な数である可能性は低い。したがって、 表 2 の信頼できるデータは反復 2 のみです。
図4は 、プラークアッセイ中に細胞が乾燥または誤って取り扱われることに関する同じ問題を示しています。しかし、 図4は 、貧弱なVero細胞播種を批判的に示している。すべてのウェルはより濃い紫色の斑点を示し、細胞がウェル全体にうまく広がらず、クラスター内で互いに積み重ねられていないことを示しています。
図1:全体的なプラークアッセイスキーム。 バイオレンダーテンプレート「ウイルスプラークアッセイプロトコル」から BioRender.com に適応。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:12ウェルプレートにおけるHSV−1のプラークアッセイ。 生物学的複製は、HSV−1の1つのサンプルについて 図1 に概説されるように実施した。HSV−1サンプルの連続10倍希釈(10−2 希釈から開始)をVero細胞に添加し、インキュベートし、次いでクリスタルバイオレットで染色した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:6ウェルプレートにおけるHSV−2のプラークアッセイ。 生物学的複製は、HSV−2の1つのサンプルについて 図1 に概説されるように実施した。HSV−2サンプルの連続10倍希釈(10−2 希釈から開始)をVero細胞に添加し、インキュベートし、次いでクリスタルバイオレットで染色した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:12ウェルプレートにおけるHSV−1についてのプラークアッセイ。 生物学的複製は、HSV−1の1つのサンプルについて 図1 に概説されるように実施した。HSV−1サンプルの連続10倍希釈(10−2 希釈から開始)をVero細胞に添加し、インキュベートし、次いでクリスタルバイオレットで染色した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 希釈係数 | ||||
| レプリケート | 10-3. | 10-4. | 10~5 | 10~6 |
| 1 | 5721 | 635 | 81 | 5 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5,519 | 521 | 53 | 1 |
表1:1つの成功したアッセイからの代表的なプラークカウント。各生物学的複製物からの段階希釈を実施した;代表的なプラーク数(10〜3 希釈から開始)を各希釈について示す。
| 希釈係数 | ||||
| レプリケート | 10-3. | 10-4. | 10~5 | 10~6 |
| 1 | 15225 | 635 | 450 | 42 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5519 | 5400 | 53 | 1 |
表2:1つの失敗したアッセイからの代表的なプラークカウント。各生物学的複製物からの段階希釈を実施した;代表的なプラーク数(10〜3 希釈から開始)を各希釈について示す。
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Discussion
プラークアッセイは哺乳類細胞培養自体とほぼ同じくらい古いものですが、各ラボにはこの基本的なアッセイを実行するための独自のプロトコルセットがあるようです5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 .プラークアッセイの各公表版の指示は微妙に異なるが、これらの原稿のほとんどが一貫した結果を得るのに関わる重要なニュアンスを解明していない。
したがって、このプロトコルには、科学よりも芸術的な部分があります。Vero 細胞をアッセイのためにウェルに播種する場合、ウェル全体に均等に広げる必要があります(図 4)。液体移送を含むすべてのステップ(例えば、ステップ3.1、3.2、3.5、3.6、4.1、および4.2)は、Vero細胞単層を水和させておくために慎重に行う必要があります(図3 および 図4)。また、ピペットでウェルの底に触れないことも重要です。そうしないと、細胞が削り取られ、最終データがさらに損なわれる可能性があります(図4)。
メチルセルロースは、ウェル全体にわたるビリオンの拡散を防止するオーバーレイ材料として有利であるが、代替物が使用され得る。例えば、微結晶セルロース21、22またはカルボキシメチルセルロース21を使用することができる。それにもかかわらず、メチルセルロースは、使用するのが最も簡単で安価な液体オーバーレイ媒体の1つです。プロトコル(ステップ4)の染色部分に異なる色素21または固定溶液(例えば、パラホルムアルデヒド)21を使用することもできるが、50%エタノール中のクリスタルバイオレットは、選択肢の中で最も簡単で安価である。
これらのアッセイを実施するのはあからさまに簡単かもしれませんが、トレーニングと練習が必要です。この方法を学ぶのにかけがえのないサンプルを使用して、最も重要なときにテクニックを習得する価値があります。
プラークアッセイ自体は、しかし、真正な生きたビリオンを数える必要がある場合にのみ使用する必要があります。プラーキングは、蛍光顕微鏡23、ELISA24、酵素活性25、26、qPCR27などの新しい定量方法と比較して、ウイルス粒子5,10を測定するためのはるかに古い方法論です。しかし、これらの後者の方法は、ビリオン全体の存在を示唆する代理データを生成するが、ユーザーが実際のビリオンではなく感染の指標を定量化するため、生存可能な粒子における重大な過大評価につながる可能性がある。蛍光顕微鏡は、ウイルスによって発現されるタンパク質の存在を示す細胞の数によって感染性ビリオンを測定するが、必ずしも完全で複製能力のあるビリオンを検出するとは限らない。ELISAは同様に、完全に感染性のビリオンなしで存在する可能性のあるウイルスタンパク質の存在を検出する。酵素活性をアッセイすることは、無傷のビリオンを示唆するが、単一の活性酵素が存在することを示すだけであり、ビリオン全体の真の伝染性の性質を反映していない。そしてqPCRは、ウイルスのゲノムに欠陥があるかどうかにかかわらず、そのゲノムのコピーを定量するだけです。生ウイルスを定量するためのプラークアッセイに匹敵する唯一の方法はエンドポイント希釈アッセイ28であり、ビリオン濃度を決定するためにリード・ミュンヒ法またはスピアマン・ケルバー法29,30,31による統計的推定が必要である。
プラークアッセイはウイルス学全体で使用される日常的な方法ですが、定量アッセイではない特定のケースがあります。例えば、プラークアッセイでは、宿主細胞を基質に付着させる必要があります。感染に最適な宿主細胞が非付着性である場合、プラークは決して形成されません32。一部のウイルスは宿主の典型的な細胞周期よりも成長が遅いため、急成長しているプラークは宿主細胞自体によって過剰増殖します21。プラークは、細胞変性効果の性質上、うまく形成されないことがあるため、真正なプラークの決定が制限される21。
ここで提示されたヘルペスウイルスをプラキシングするアプローチは、必ずしもユニークではない。しかし、HSVプラークアッセイの成功に関連する軽微な警告のこの詳細な説明は、多くのユーザー、特に初心者が経験する困難を軽減する可能性があります。それにもかかわらず、記載されている方法論は、ピコルナウイルス33、オルトミクソウイルス34、フラウイルス35、コロナウイルス36、および定量化可能な量の感染性動物ウイルスが必要とされる他の多くのシステムを含むがこれらに限定されない他の多くのウイルスを用いたプラークアッセイにも広く適用可能である。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
私たちは、これらの方法を洗練させるために長年にわたって私たちと一緒に働いてきた私たちの研究室(PJDとBJM)の数え切れないほどの学生に感謝します。この方法論が最初に開発されたスタン・パーソンの指導に感謝します。この研究は、タウソン大学フィッシャー・カレッジ・オブ・サイエンス・アンド・マス学部研究支援基金とNIGMSブリッジズ・トゥ・バカロレア助成金5R25GM058264によって部分的に支援されました。このコンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の国立一般医学研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
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