Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Plaqueing من فيروسات الهربس البسيط

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/62962
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1,2, 3, 1,4
1Towson University Herpes Virus Lab, Department of Biological Sciences, Towson University, 2Towson University Department of Chemistry, Towson University, 3Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Molecular Biology, Biochemistry, and Bioinformatics Program, Towson University
* These authors contributed equally

Summary

الترقيع هو طريقة روتينية تستخدم لتحديد كمية الفيروسات الحية في السكان. على الرغم من أن الترويح يتم تدريسه في كثير من الأحيان في مختلف مناهج علم الأحياء الدقيقة مع البكتيريا والعاثيات البكتيرية ، إلا أن ترقيع فيروسات الثدييات أكثر تعقيدا ويستغرق وقتا طويلا. يصف هذا البروتوكول الإجراءات التي تعمل بشكل موثوق للعمل المنتظم مع فيروسات الهربس البسيط.

Abstract

هناك العديد من البروتوكولات المنشورة لتصحيح الفيروسات ، بما في ذلك المراجع ضمن الأدبيات الأولية للمنهجية. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تنفيذ فيروسات الترقيح ، مما يتطلب التركيز على مواصفاتها وصقلها. إنها طريقة صعبة بشكل لا يصدق للطلاب الجدد لإتقانها ، ويرجع ذلك أساسا إلى أنها تتطلب اهتماما دقيقا بأدق التفاصيل. يجب أن يساعد هذا العرض التوضيحي لفيروسات الهربس البسيط أولئك الذين كافحوا في تصور الطريقة ، وخاصة الفروق الدقيقة فيها ، على مر السنين. في حين أن هذه المخطوطة تستند إلى نفس مبادئ منهجية الترقيم القياسية ، إلا أنها تختلف في أنها تحتوي على وصف مفصل ل (1) أفضل طريقة للتعامل مع الخلايا المضيفة لتجنب الاضطراب أثناء العملية ، (2) وسط لزج أكثر فائدة من الأغاروز للحد من انتشار الفيروسات ، و (3) إجراء تثبيت وتلطيخ بسيط ينتج عنه نتائج قابلة للتكرار بشكل موثوق. علاوة على ذلك ، يساعد الفيديو المصاحب في إظهار الفروق الدقيقة في العملية ، والتي غالبا ما يتم تفويتها عند توجيه الآخرين حول إجراء اختبارات اللويحات.

Introduction

تعود بدايات فحوصات لوحة الفيروسات إلى الاكتشافات الأولى للفيروسات في 1890s1. تم عزل فيروس فسيفساء التبغ لأول مرة ونقله على أوراق التبغ، حيث يمكن التعرف على بقع العدوى الفردية وتحديدها كميا على أنها ناشئة عن كيان واحد من الفيروسات الحية2، والذي تم تحديده لاحقا على أنه فيروس2. وقد أتقنت الدراسات المنوية اللاحقة التي أجريت على البكتيريا والعاثيات البكتيرية التقنيات المستخدمة لتجويف هذه الفيروسات، بما في ذلك البكتيريا في مرحلة منتصف سجل النمو، والتخفيف التسلسلي لعينات العاثيات البكتيرية، والأجار العلوي مع التصور اللاحق للثقوب الحرفية (المسماة اللويحات) في العشب البكتيري3.

تأخر تراكم الفيروسات الحيوانية عن الأبحاث المثيرة التي تجرى مع العاثيات البكتيرية ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن الطرق اللازمة لزراعة خلايا الثدييات في الثقافة لم يتم تطويرها حتى 1940s4. ومع ذلك، فإن ظهور خلايا الفئران المتنامية في غياب الكائن الحي المضيف بأكمله4 ولد حقبة جديدة في القدرة على زراعة الفيروسات وعدها. وقد تم توسيع نطاق هذا العمل من أجل انتشار وقياس فيروس التهاب الدماغ والنخاع الخيلي الغربي في خلايا الدجاج وفيروس شلل الأطفال في الخلايا البشرية5،6. ومع توسع عالم خلايا الثدييات القابلة للاستزراع، أعطى وجود مجموعة من الخلايا المضيفة المختلفة لمختلف أنواع العدوى الفيروسية العالم وفرة من الاحتمالات لدراسة جميع أنواع الفيروسات7. وشمل ذلك انتشار فيروسات الهربس البشرية وتحديدها كميا، ولا سيما فيروس الهربس البسيط-1 (HSV-1) و-2 (HSV-2)، اللذين يسببان آفات مخاطية جلدية8. الأهم من ذلك ، أن جميع اختبارات البلاك تعتمد على وجود فيروسات حية ، والتي يمكن أن تدخل الخلايا المضيفة بطريقة بوساطة المستقبلات في عينة9. بغض النظر عن انتشار وتعدد المنشورات حول تنفيذ فحوصات اللويحات5،10،11،12،13،14،15،16 ، فإن هذه الطرق ل HSV-1/-2 هي مزيج من كل من الفن والعلم. لا يمكن للمرء إجراء الفحص دون الاهتمام المناسب بكل التفاصيل في البروتوكول ، ولا يمكن للمرء أن ينفذ فحصا ناجحا دون عين مكررة للدقة في هذه العملية. تصور هذه المخطوطة واحدة من أكثر الطرق القابلة للتكرار باستمرار لمقايسات لوحة HSV-1/-2 ، مع تفاصيل دقيقة حول فن الفحص نادرا ما تتم مناقشتها.

يحصل هذا البروتوكول الحالي على وحدات تشكيل البلاك الحية (PFU) لوحدات HSV-1 و -2 بشكل موثوق. يتم الحصول على أفضل النتائج باستخدام خلايا Vero (الخلايا الظهارية الكلوية للقرد الأخضر الأفريقي) عند مرور منخفض (أسفل رقم الممر 155) وتزرع بشكل روتيني في alpha-MEM17 مع استكمال مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ (FCS) ، L-alanyl-L-glutamine ، وخليط مضاد حيوي / مضاد للفطريات 18. يتم نشر خلايا Vero بشكل قياسي في هذا الوسط مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع عند تخفيف 1/5 في كل مرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات مع خلايا فيرو وفيروسات الهربس الحية من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية بجامعة توسون. ويمثل الشكل 1 مخططا معمما لهذه الإجراءات.

1. بذر خلايا فيرو

  1. في اليوم السابق لبدء فحص اللويحات، قم بتربسين خلايا فيرو وإعادة تعليقها في وسط النسور المعدلة (DMEM) من دولبيكو العادي والملحق وفقا لمنهجية زراعة الخلايا القياسية19. أعد تعليق الخلايا التربسينية في 10 مل من DMEM لكل قارورة T-75 من خلايا Vero المتقاربة (~ 107 خلايا).
    ملاحظة: يستخدم DMEM لمقايسات البلاك بدلا من ألفا-ميم لأنه يبطئ قليلا معدل نمو الخلايا ويفضل نتائج فحص البلاك الأفضل.
  2. عد الخلايا بالطريقة المفضلة للشخص (على سبيل المثال، مقياس الدم القياسي مع استبعاد تريبان بلو)19.
  3. زرع الخلايا في 4 × 106 خلية / لوحة. ل HSV-2 ، استخدم لوحات 6 آبار مع 2.5 مل من DMEM (مع المكملات الغذائية) لكل بئر ؛ وبالنسبة ل HSV-1 ، استخدم لوحات 12 بئرا مع 1.25 مل من DMEM (مع المكملات الغذائية) لكل بئر.
    ملاحظة: يجب أن يكون عدد الخلايا ثابتا بغض النظر عن اللوحة المستخدمة ، على الرغم من أن حجم الآبار مهم فيما يتعلق بالدقة في فحص اللويحة. من الضروري توزيع الخلايا بالتساوي ، والتي يمكن تحقيقها بشكل أكثر فعالية عن طريق تحريك اللوحة ذهابا وإيابا ، وليس بطريقة دائرية.
  4. اسمح للخلايا بالنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO2 في حاضنة رطبة.
    ملاحظة: يتم الحفاظ على الرطوبة مع مقلاة من الماء المقطر تحتوي على مبيد للجينسيد في الجزء السفلي من الحاضنة.

2. تخفيف عينة

  1. أكمل تخفيف العينة وإضافة الفيروس إلى الخلايا في جلسة عمل مختبرية واحدة.
    تنبيه: HSV-1 و -2 معديان للبشر ويجب التعامل معهما في إطار احتواء السلامة الأحيائية السليم (BSL-2). إبقاء جميع المواد التي تتلامس مع الفيروس منفصلة وتطهيرها بعامل رباعي عند تخفيف 1/256 (انظر جدول المواد) أو اليودوفور أو المبيض أو المنظفات الأيونية القوية (مثل SDS) قبل إزالتها من خزانة السلامة الأحيائية.
  2. في اليوم التالي لبذر خلايا Vero ، قم بتخفيف كل عينة فيروس بشكل متسلسل ليتم تجميعها في 1x PBS ؛ عادة ما تستخدم تخفيفات 10 أضعاف للتتبع الأكثر دقة.
  3. قم بإجراء هذه التخفيفات من خلال 10-4 (للتركيزات المنخفضة من الفيروسات) أو من خلال 10-9 (لتوقعات عينات عيار أعلى) مع بقاء 1 مل على الأقل من كل عينة لفحص البلاك نفسه.
  4. احتفظ بجميع التخفيفات الفيروسية على الجليد (لا تزيد عن 1 ساعة) حتى تصبح جاهزة لإضافة عينات الفيروسات المخففة هذه إلى الخلايا.

3. إضافة الفيروس إلى الخلايا

  1. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من بئر أو بئرين بواسطة ماصة.
    ملاحظة: لا تستخدم جهاز شفاط لأنه يزيل الكثير من السائل من الطبقة الأحادية للخلية ويجفف الخلايا. أحد الاعتبارات الحاسمة هو ضمان بقاء الطبقة الأحادية للخلية رطبة طوال فترة التجربة. إذا جفت الخلايا ، فسوف تغسل اللوحة في الخطوة الأخيرة وتولد بيانات غير صالحة للاستخدام. لذلك ، قم بمعالجة بئر واحد أو اثنين فقط في وقت واحد لتقليل هذا الاحتمال.
  2. أضف بعناية عينة الفيروس المخفف (يتم استخدام 100-400 ميكرولتر و 50-200 ميكرولتر من عينة الفيروس للوحات 6-well و 12-well ، على التوالي) بقطرة إلى كل طبقة أحادية ، مع إضافة القطرات إلى جانب كل بئر. كرر العملية لكل بئر أو بئرين حتى تمتلئ اللوحة بأكملها بعينات الفيروس التي يتم لوحاتها.
    ملاحظة: إضافة القطرات إلى وسط البئر قد يؤدي عن غير قصد إلى إزاحة الخلايا عن الركيزة.
  3. قم بهز اللوحة بأكملها برفق باليد للتأكد من أن PBS الذي يحتوي على الفيروس يغطي الطبقة الأحادية الكاملة من الخلايا في كل بئر ، ثم ضع اللوحة في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية للسماح للفيروس بالامتزاز.
  4. كل 10 دقائق في غضون ساعة واحدة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ، وهزها بلطف مرة أخرى لنشر الفيروس بشكل أكثر توازنا عبر كل بئر ، ثم ضعها مرة أخرى في الحاضنة.
    ملاحظة: ستحدد كل تجربة عدد النسخ المتماثلة وأي التخفيفات المستخدمة؛ تفضيل القارئ يملي هذا القرار.
  5. لتقليل إمكانية حساب اللقاح غير الممتص عن غير قصد ، قم بإزالة عينة الفيروس من الآبار باستخدام أطراف ماصة 1000 ميكرولتر وضعها في وعاء نفايات.
    ملاحظة: مرة أخرى ، يتم إجراء هذا الإجراء مع بئر واحد أو اثنين فقط في وقت واحد للحفاظ على ترطيب الطبقة الأحادية الخلية.
  6. ضع 2.5 مل من تراكب ميثيل سليلوز (قم بإذابة 5٪ ميثيل سليلوز ث / ث في 100 مل من PBS ، الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية و 15 رطل لكل بوصة مربعة في دورة سائلة ، ثم أضف 375 مل من DMEM بالإضافة إلى 25 مل من FBS).
  7. بمجرد أن تحتوي اللوحة بأكملها على تراكب ، ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة للسماح بالنمو لمدة يومين.
    ملاحظة: إذا سمح للفيروس والخلايا بالنمو لمدة ثلاثة أيام ، حتى في مكملات DMEM plus ، فقد يؤدي ذلك إلى فقدان كبير للخلايا في الطبقة الأحادية ، مما يعرض البيانات النهائية للخطر.
  8. قم بتطهير كوب النفايات، عادة مع إضافة المبيض أو اليودوفور أو فيروسيد مماثل، قبل إزالته من خزانة السلامة الأحيائية.

4. تلطيخ لويحات

  1. بعد الحضانة لمدة يومين ، قم بإزالة تراكب ميثيل سليلوز بواسطة ماصة ، مرة أخرى بئر أو بئرين في كل مرة ، وضعه في وعاء نفايات.
  2. أضف ~ 2 مل من 1٪ من البنفسج البلوري (انظر جدول المواد) في 50٪ من الإيثانول إلى كل بئر لتلطيخ اللويحات.
    ملاحظة: ليس من الضروري إزالة كل قطرة أخيرة من التراكب.
  3. احتضن اللوحة مع جميع الآبار المملوءة بالبقعة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. عند هذه النقطة ، قم بتطهير كأس النفايات على النحو الوارد أعلاه في الخطوة 3.8.
  4. اغسل الأطباق بقوة بماء الصنبور حتى يصبح الجريان السطحي واضحا.
    ملاحظة: تيار لطيف من الماء ليس قويا بما فيه الكفاية. مطلوب ضغط كامل من تركيبات بالوعة المختبر.
  5. في هذه المرحلة ، تأكد من وجود اختلافات 10 أضعاف تقريبا في عدد اللويحات عبر كل سلسلة تخفيف.
  6. اترك الألواح تجف بين عشية وضحاها رأسا على عقب ، وبعد ذلك يمكن حساب اللويحات الفردية.

5. عد اللويحات وتحديد عيار الفيروس

  1. بغض النظر عن النهج (انظر الملاحظة أدناه) ، اضرب عدد اللويحات في عامل التخفيف (على سبيل المثال ، إذا تم حساب اللويحات في البئر 10-4 ، ضرب عدد اللويحات في 104).
    ملاحظة: على الرغم من أن العد ضمن نطاق 10-100 لوحة مفيد5، فإن عد الآبار التي تحتوي على 30-300 لوحة أكثر موثوقية إلى حد ما ويأخذ في الاعتبار ما يقرب من 1/2 تخفيفات السجل بدلا من التخفيفات الكاملة للسجل.
  2. اقسم هذا الرقم على حجم اللقاح (كما هو موضح أعلاه في الخطوة 3.2) ، ومتوسط جميع الآبار التي تحتوي على لويحات ضمن النطاق المذكور للحصول على عيار HSV الأكثر دقة في العينة الأصلية.
  3. قم بإجراء العمليات الحسابية في الخطوات من 5.3.1 إلى 5.3.5، مع مراعاة استخدام البيانات الوهمية في الجدول 1.
    1. النظر فقط في الآبار مع 30-300 لويحات (الخطوة 5.1). وبالتالي ، في الجدول 1 ، استخدم العمود 10-5 فقط للنسخ المتماثلة 1 و 2 و 3.
    2. خذ عدد اللويحات عند التخفيف المعطى واضربها في متبادل عامل التخفيف. وبالتالي ، فإن العمود 10-5 من العينة 1 ينتقل من 81 لوحة عند التخفيف 10-5 إلى 81 لوحة في 105.
    3. ثم اقسم هذا الرقم على حجم (بالمل) لتخفيف الفيروس المضاف إلى الخلايا في ذلك البئر. وإذا افترضنا أن البيانات المتعلقة ب HSV-1 في الجدول 1 هي من صفيحة من 12 بئرا، فإن 0.2 مل سيكون القياس الأنسب. وبالتالي يصبح الحساب من الخطوة 5.3.2 81 × 105 مقسوما على 0.2 مل ، أو 4.0 × 107 PFU / mL من HSV-1.
    4. كرر هذه العملية لجميع البيانات المفيدة والمتوسط. ومن ثم إجراء الحساب في 5-3-2-5-3-3 على جميع العينات في العمود 10-5، على افتراض أنها نشأت من نفس عينة الفيروس وأجريت النسخ المتماثلة البيولوجية للحصول على أدق قياس عيار للنظر. وفي حالة الجدول 1، يبلغ المتوسط 4.0 × 107 و 2.1 × 107 و 2.6 × 107 PFU/mL للحصول على متوسط عيار نهائي قدره 2.9 × 107 ± 0.98 × 107 PFU/mL لهذه العينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الجدول 1 تجربة لها أفضل النتائج. تتبع جميع التخفيفات 10 أضعاف انخفاضا بمقدار 10 أضعاف تقريبا في عدد اللويحات. يمكن أيضا رؤية هذه الأنواع من البيانات في الشكل 2 ، وهو فحص فعلي للويحات حيث انخفض العدد القابل للعد من اللويحات في نطاق 10-4 لجميع النسخ المتماثلة الثلاثة. ويمكن ملاحظة الشيء نفسه في الشكل 3، الصف العلوي، حيث كان العدد القابل للعد من اللويحات في التخفيف 10-3.

ومع ذلك ، يوضح الشكل 3 ، الصف السفلي ، نتيجة مختلفة تماما عندما لا يتم إجراء فحص البلاك بشكل جيد. أولا ، هناك عدد قليل جدا من اللويحات المرئية من أي تخفيف. وبالتالي ، فإن البيانات غير قابلة للاستخدام. ثانيا ، هناك مناطق مرئية حول الجزء العلوي حيث رفعت خلايا فيرو بالكامل من الركيزة ، وهذا دليل إما على السماح للخلايا بالجفاف في هذه العملية أو على السحب بقوة كبيرة في تلك المنطقة من البئر.

ويبين الجدول 2 أيضا مجموعة من النتائج التي يحتمل أن تكون شاذة في تعداد اللويحات ويتطلب تحذيرات على طول الطريق. وتجدر الإشارة إلى أنه لا الصف العلوي ولا الصف السفلي من النسخ المتماثلة يتبع اختلافا منتظما بمقدار 10 أضعاف في عدد اللويحات عندما ينتقل المرء من تخفيف إلى آخر. تشير هذه البيانات إلى خطأ المستخدم أثناء عملية تخفيف الفيروس. علاوة على ذلك ، من غير المحتمل أن يحسب المستخدم بدقة أكثر من 15000 لوحة ، لذلك يجب على المرء أن يشكك في هذه البيانات. أخيرا ، يمكن للمرء أن يلاحظ أنه في التخفيف المتماثل 1 ، 10-6 ، هناك عدد من اللويحات في نطاق 30-300 ؛ ومع ذلك ، نظرا للطبيعة السيئة لبقية البيانات في هذا النسخ المتماثل ، فمن غير المرجح أن يكون عدد اللوحات 42 رقما دقيقا. وبالتالي، فإن البيانات الوحيدة التي يمكن تصديقها في الجدول 2 هي في النسخة المتماثلة 2.

يوضح الشكل 4 نفس المشاكل المتعلقة بجفاف الخلايا أو إساءة التعامل معها أثناء فحص اللويحات. ومع ذلك ، فإن الشكل 4 يوضح بشكل نقدي ضعف بذر خلايا فيرو. يظهر كل بئر بقع أرجوانية داكنة ، مما يدل على أن الخلايا لا تنتشر بشكل جيد عبر البئر وتتراكم فوق بعضها البعض في مجموعات.

Figure 1
الشكل 1: مخطط فحص البلاك الشامل. مقتبس من قالب Biorender ، "بروتوكول فحص اللويحات الفيروسية" ، بواسطة BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: فحص اللويحات ل HSV-1 في اثني عشر لوحة بئر. أجريت النسخ المتماثلة البيولوجية على النحو المبين في الشكل 1 على عينة واحدة من HSV-1. تمت إضافة تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف لعينة HSV-1 (بدءا من التخفيف 10-2 ) إلى خلايا Vero ، محتضنة ، ثم ملطخة باللون البنفسجي البلوري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: فحص البلاك ل HSV-2 في لوحات من ستة آبار. أجريت النسخ المتماثلة البيولوجية على النحو المبين في الشكل 1 على عينة واحدة من HSV-2. تمت إضافة تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف لعينة HSV-2 (بدءا من التخفيف 10-2 ) إلى خلايا Vero ، واحتضانها ، ثم تلطيخها باللون البنفسجي البلوري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: فحص البلاك ل HSV-1 في اثني عشر لوحة بئر. أجريت النسخ المتماثلة البيولوجية على النحو المبين في الشكل 1 على عينة واحدة من HSV-1. تمت إضافة تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف لعينة HSV-1 (بدءا من التخفيف 10-2 ) إلى خلايا Vero ، واحتضانها ، ثم تلطخها باللون البنفسجي البلوري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عامل التخفيف
تكرار 10-3 10-4 10-5 10-6
1 5721 635 81 5
2 4592 365 42 0
3 5,519 521 53 1

الجدول 1: عدد اللوحات التمثيلية من فحص ناجح واحد. وأجريت عمليات تمييع تسلسلية من كل نسخة بيولوجية؛ يتم عرض عدد اللويحات التمثيلية (بدءا من التخفيف 10-3 ) لكل تخفيف.

عامل التخفيف
تكرار 10-3 10-4 10-5 10-6
1 15225 635 450 42
2 4592 365 42 0
3 5519 5400 53 1

الجدول 2: عدد اللوحات التمثيلية من فحص واحد غير ناجح. وأجريت عمليات تمييع تسلسلية من كل نسخة بيولوجية؛ يتم عرض عدد اللويحات التمثيلية (بدءا من التخفيف 10-3 ) لكل تخفيف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في حين أن مقايسات البلاك قديمة قدم زراعة خلايا الثدييات نفسها تقريبا ، يبدو أن كل مختبر لديه مجموعة خاصة به من البروتوكولات لتنفيذ هذا الفحص الأساسي5،6،10،11،12،13،14،15،16،20 . على الرغم من أن التعليمات الواردة في كل نسخة منشورة من فحص اللوحة تختلف اختلافا طفيفا ، إلا أن القليل من هذه المخطوطات توضح الفروق الدقيقة الحرجة التي ينطوي عليها الحصول على نتائج متسقة.

وبالتالي ، هناك بعض أجزاء هذا البروتوكول التي هي فن أكثر من العلم. عندما يتم زرع خلايا فيرو في الآبار للفحص ، يجب أن تنتشر بالتساوي في جميع أنحاء البئر (الشكل 4). يجب أن تتم جميع الخطوات التي تنطوي على نقل السائل (على سبيل المثال ، الخطوات 3.1 و 3.2 و 3.5 و 3.6 و 4.1 و 4.2) بعناية للحفاظ على طبقة Vero أحادية الطبقة رطبة (الشكل 3 والشكل 4). ومن الأهمية بمكان أيضا عدم لمس قاع البئر بأي ماصة، وإلا فقد تتخلص الخلايا، مما يزيد من المساس بالبيانات النهائية (الشكل 4).

في حين أن ميثيل السليلوز مفيد كمادة تراكب لمنع انتشار الفيروسات عبر البئر بأكمله ، يمكن استخدام البدائل. على سبيل المثال ، يمكن للمرء استخدام السليلوز الجريزوفولفين 21,22 أو كربوكسي ميثيل السليلوز 21. بغض النظر عن ذلك ، ميثيل سليلوز هو واحد من أسهل وأقل تكلفة وسائط تراكب السائل لاستخدامها ، على الرغم من ذلك. يمكن للمرء أيضا استخدام صبغة مختلفة 21 أو محلول تثبيت (على سبيل المثال ، paraformaldehyde)21 للجزء الملون من البروتوكول (الخطوة 4) ، ولكن البنفسجي البلوري في 50٪ من الإيثانول هو الأسهل والأقل تكلفة بين الخيارات.

في حين أنه قد يكون من السهل بشكل علني إجراء هذه الفحوصات، إلا أنها تتطلب التدريب والممارسة. يجدر استخدام عينات لا يمكن الاستغناء عنها لتعلم هذه الطريقة حتى يتقن المرء هذه التقنية عندما تكون أكثر أهمية.

ومع ذلك ، يجب استخدام اختبارات البلاك نفسها فقط عندما يحتاج المرء إلى حساب الفيروسات الحية بحسن نية. يعد الترقيم منهجية أقدم بكثير لقياس جزيئات الفيروس5,10 مقارنة بالطرق الكمية الأحدث مثل الفحص المجهري الفلوري23 أو ELISA24 أو النشاط الإنزيمي25,26 أو qPCR27. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق الأخيرة تولد بيانات بديلة تشير إلى وجود فيروسات كاملة ، ولكنها قد تؤدي إلى مبالغة كبيرة في تقدير الجسيمات القابلة للحياة لأن المستخدم سيحدد كميا مؤشرا للعدوى ، وليس الفيروسات الحقيقية. يقيس الفحص المجهري الفلوري الفيروسات المعدية من خلال عدد الخلايا التي تظهر وجود بروتين يعبر عنه الفيروس ولكنه لا يكتشف بالضرورة الفيروسات الكاملة المختصة بالتكاثر. وبالمثل ، يكتشف ELISA وجود بروتينات فيروسية قد توجد بدون فيروسات معدية تماما. إن فحص النشاط الإنزيمي ، على الرغم من أنه يوحي بوجود فيريون سليم ، إلا أنه يظهر فقط أن إنزيما نشطا واحدا موجودا ولا يعكس الطبيعة المعدية الحقيقية لفيريون كامل. ويقوم qPCR فقط بتحديد نسخ من جينوم الفيروس، سواء كان هذا الجينوم معيبا أم لا. الطريقة الوحيدة المماثلة لفحص البلاك لقياس الفيروسات الحية هي فحص تخفيف نقطة النهاية28 ، والذي لا يزال يتطلب تقديرا إحصائيا عبر طرق Reed-Muench أو Spearman-Kärber 29,30,31 لتحديد تركيز الفيروس.

في حين أن مقايسات البلاك هي طريقة روتينية تستخدم في جميع أنحاء علم الفيروسات ، إلا أن هناك حالات معينة لا تكون فيها هي المقايسة الكمية المفضلة. على سبيل المثال ، تتطلب اختبارات البلاك أن تعلق الخلايا المضيفة على الركيزة ؛ إذا كانت أفضل خلية مضيفة للعدوى غير ملتصقة ، فلن تتشكل اللويحات أبدا32. تنمو بعض الفيروسات ببطء أكثر من دورة الخلايا النموذجية لمضيفيها، وبالتالي فإن أي لويحات مزدهرة سوف تتضخم من قبل الخلايا المضيفة نفسها21. قد لا تتشكل اللويحات في بعض الأحيان بشكل جيد ، فقط بسبب طبيعة تأثير اعتلال الخلايا ، مما يجعل تحديد لويحات حسن النية قيدا 21.

النهج المتبع في ترقيم فيروسات الهربس المعروضة هنا ليس بالضرورة فريدا. ومع ذلك ، فإن هذا الوصف المتعمق للمحاذير البسيطة المرتبطة بفحص لوحة HSV الناجح قد يقلل من الصعوبات التي يواجهها العديد من المستخدمين ، وخاصة المبتدئين. وبغض النظر عن ذلك، فإن المنهجية الموصوفة تنطبق أيضا على نطاق واسع على مقايسات اللويحات مع العديد من الفيروسات الأخرى، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر فيروسات البيكورنا33 وفيروسات الأورثوميكسوفيروس34 وفيروسات الفلافيزيرز35 والفيروسات التاجية36 والعديد من الأنظمة الأخرى التي تتطلب كمية قابلة للقياس الكمي من الفيروسات الحيوانية المعدية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر عددا لا يحصى من الطلاب في مختبراتنا (PJD و BJM) الذين عملوا معنا على مر السنين لتحسين هذه الأساليب. شكر خاص ل Stan Person ، الذي تم تطوير هذه المنهجية تحت وصايته لأول مرة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل صندوق دعم البحوث الجامعية لكلية فيشر للعلوم والرياضيات بجامعة توسون وجسر NIGMS إلى منحة البكالوريا 5R25GM058264. هذا المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 3512
6-well plates Corning 3516
Alpha-MEM Lonza 12169F
Antibiotic/antimycotic Gibco 15240096
Crystal violet Alfa Aesar B2193214
DMEM Gibco 11965092
Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) Gibco 14190144
Fetal calf serum Millipore-Sigma TMS-013-B
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) Gibco GS07F161BA
Hemacytometer Thermo Fisher 02-671-54
Methylcellulose Millipore-Sigma 27-441-0
Quaternary agent (Lysol I.C.) Thermo Fisher NC9645698
Trypan Blue Corning 25900CI
Trypsin Cytiva SH30042.01
Vero cells ATCC CCL-81

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
  2. Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
  3. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  4. Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
  5. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
  6. Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
  7. Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
  8. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Fields Virology. Knipe, D. M., et al. 1, Wolters Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins. 1823-1897 (2013).
  9. Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).
  10. Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
  11. Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
  12. Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
  13. Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
  14. Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
  15. Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
  16. Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
  17. Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
  18. Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).
  19. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
  20. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
  21. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
  22. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63 (2006).
  23. Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201 (2016).
  24. Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
  25. Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
  26. Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
  27. Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
  28. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
  29. Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
  30. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
  31. Spearman, C. The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
  32. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , Academic Press. (2017).
  33. Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15H 11 (2013).
  34. Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
  35. Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
  36. Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 177،
Plaqueing من فيروسات الهربس البسيط
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sadowski, L. A., Lesko, G. M.,… More

Sadowski, L. A., Lesko, G. M., Suissa, C., Upadhyay, R., Desai, P. J., Margulies, B. J. Plaquing of Herpes Simplex Viruses. J. Vis. Exp. (177), e62962, doi:10.3791/62962 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter