Summary
Plaquing ist eine Routinemethode zur Quantifizierung lebender Viren in einer Population. Obwohl Plaquing häufig in verschiedenen mikrobiologischen Lehrplänen mit Bakterien und Bakteriophagen gelehrt wird, ist das Plaquieren von Säugetierviren komplexer und zeitaufwendiger. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren, die für die regelmäßige Arbeit mit Herpes-simplex-Viren zuverlässig funktionieren.
Abstract
Es gibt zahlreiche veröffentlichte Protokolle für das Plaquieren von Viren, einschließlich Referenzen in der Primärliteratur für die Methodik. Das Plaquieren von Viren kann jedoch schwierig durchzuführen sein, da es erforderlich ist, sich auf seine Spezifikationen und Verfeinerung zu konzentrieren. Es ist eine unglaublich herausfordernde Methode für neue Schüler, vor allem, weil sie akribische Aufmerksamkeit für die kleinsten Details erfordert. Diese Demonstration des Plaquing von Herpes-simplex-Viren sollte denjenigen helfen, die im Laufe der Jahre mit der Visualisierung der Methode, insbesondere ihrer Nuancen, zu kämpfen hatten. Während dieses Manuskript auf den gleichen Prinzipien der Standard-Plaquing-Methodik basiert, unterscheidet es sich dadurch, dass es eine detaillierte Beschreibung enthält, (1) wie Wirtszellen am besten gehandhabt werden, um Störungen während des Prozesses zu vermeiden, (2) ein nützlicheres viskoses Medium als Agarose, um die Diffusion von Virionen zu begrenzen, und (3) ein einfaches Fixierungs- und Färbeverfahren, das zuverlässig reproduzierbare Ergebnisse liefert. Darüber hinaus hilft das begleitende Video, die feineren Unterscheidungen im Prozess zu demonstrieren, die häufig übersehen werden, wenn andere in die Durchführung von Plaque-Assays eingewiesen werden.
Introduction
Die Anfänge der Virus-Plaque-Assays gehen auf die ersten Entdeckungen von Viren in den 1890er Jahren zurück1. Das Tabakmosaikvirus wurde zunächst isoliert und auf Tabakblättern weitergegeben, wo einzelne Infektionsflecken erkannt und quantifiziert werden konnten, die von einer einzigen, lebenden Virusentität stammten2, die später als Virion identifiziert wurde2. Spätere bahnbrechende Studien mit Bakterien und Bakteriophagen perfektionierten die Techniken, die verwendet wurden, um diese Viren zu beflecken, einschließlich Bakterien in der Mid-Log-Phase des Wachstums, serielle Verdünnung von Bakteriophagenproben und Top-Agar mit anschließender Visualisierung von buchstäblichen Löchern (benannte Plaques) im Bakterienrasen3.
Das Plaquieren von Tierviren hinkte der spannenden Forschung mit Bakteriophagen hinterher, vor allem, weil die Methoden, die für die Züchtung von Säugetierzellen in Kultur erforderlich sind, erst in den 1940er Jahren entwickelt wurden4. Das Aufkommen von wachsenden murinen Zellen in Abwesenheit des gesamten Wirtsorganismus4 brachte jedoch eine neue Ära in der Fähigkeit hervor, Viren zu kultivieren und zu zählen. Diese Arbeiten wurden für die Vermehrung und Quantifizierung des Western Equine Encephalomyelitis-Virus in Hühnerzellen und des Poliovirus in menschlichen Zellen erweitert5,6. Als sich der Bereich der kultivierbaren Säugetierzellen ausdehnte, gab die Schar verschiedener Wirtszellen für verschiedene Virusinfektionen der Welt ein Füllhorn von Möglichkeiten, alle Arten von Viren zu untersuchen7. Dazu gehörte die Vermehrung und Quantifizierung von humanen Herpesviren, insbesondere Herpes-simplex-Viren-1 (HSV-1) und -2 (HSV-2), die mukokutane Läsionen verursachen8. Wichtig ist, dass alle Plaque-Assays von der Existenz lebender Virionen abhängig sind, die in einer Probe rezeptorvermittelt in Wirtszellen eindringen können9. Unabhängig von der Allgegenwart und Vielzahl von Publikationen zur Durchführung von Plaque-Assays5,10,11,12,13,14,15,16 sind diese Methoden für HSV-1/-2 eine Mischung aus Kunst und Wissenschaft; Man kann den Assay nicht ohne angemessene Aufmerksamkeit für jedes Detail im Protokoll durchführen, noch kann man einen erfolgreichen Assay ohne ein kritisches Auge für Subtilität im Prozess durchführen. Dieses Manuskript zeigt eine der konsistentesten reproduzierbaren Methoden für HSV-1/-2-Plaque-Assays, mit präzisen Details zur Kunst des Assays, die selten diskutiert werden.
Dieses aktuelle Protokoll erhält zuverlässig lebende plaquebildende Einheiten (PFU) für HSV-1 und -2. Die besten Ergebnisse werden unter Verwendung von Vero-Zellen (transformierte Nierenepithelzellen des afrikanischen grünen Affen) bei niedriger Passage (unter Passage Nummer 155) erzielt und routinemäßig in alpha-MEM17 gezüchtet, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), L-Alanyl-L-Glutamin und einer antibiotischen/antimykotischen Mischung18. Vero-Zellen werden in diesem Medium standardmäßig zwei- bis dreimal pro Woche mit einer 1/5-Verdünnung jedes Mal vermehrt.
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Protocol
Alle Verfahren mit den Vero-Zellen und lebenden Herpesviren wurden vom Towson University Institutional Biosafety Committee genehmigt. Ein verallgemeinertes Schema dieser Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Aussaat der Vero-Zellen
- Trypsinisieren Sie am Tag vor Beginn des Plaque-Assays Vero-Zellen und resuspendieren Sie sie in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) und ergänzen Sie sie gemäß der Standard-Zellkulturmethodik19. Resuspendieren Sie die trypsinisierten Zellen in 10 ml DMEM pro T-75-Kolben der konfluenten Vero-Zellen (~ 107 Zellen).
HINWEIS: DMEM wird für Plaque-Assays anstelle von Alpha-MEM verwendet, da es die Zellwachstumsrate leicht verlangsamt und bessere Plaque-Assay-Ergebnisse begünstigt. - Zählen Sie die Zellen nach der bevorzugten Methode (z. B. ein Standard-Hämozytometer mit Trypan Blue-Ausschluss)19.
- Samen Sie die Zellen bei 4 x 106 Zellen / Platte; Verwenden Sie für HSV-2 6-Well-Platten mit 2,5 ml DMEM (mit Nahrungsergänzungsmitteln) pro Well; und für HSV-1 verwenden Sie 12-Well-Platten mit 1,25 ml DMEM (mit Ergänzungen) pro Well.
HINWEIS: Die Anzahl der Zellen sollte unabhängig von der verwendeten Platte konstant sein, obwohl die Größe der Vertiefungen für die Genauigkeit des Plaque-Assays von Bedeutung ist. Es ist wichtig, die Zellen gleichmäßig zu verteilen, was am effektivsten erreicht werden kann, indem die Platte hin und her bewegt wird, nicht kreisförmig. - Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C/5% CO2 in einem befeuchteten Inkubator wachsen.
HINWEIS: Die Luftfeuchtigkeit wird mit einer Pfanne mit destilliertem Wasser, das ein Algizid enthält, im Boden des Inkubators aufrechterhalten.
2. Verdünnung der Probe
- Schließen Sie die Probenverdünnung und die Zugabe von Viren zu Zellen in einer Laborsitzung ab.
ACHTUNG: HSV-1 und -2 sind für den Menschen infektiös und müssen unter ordnungsgemäßer Eindämmung der biologischen Sicherheit (BSL-2) gehandhabt werden. Bewahren Sie alle Materialien, die mit dem Virus in Berührung kommen, getrennt auf und desinfizieren Sie sie mit einem quartären Mittel bei einer Verdünnung von 1/256 (siehe Materialtabelle), Iodophor, Bleichmittel oder starkem ionischem Reinigungsmittel (z. B. SDB), bevor Sie sie aus der Biosicherheitskabine entfernen. - Am Tag nach der Aussaat der Vero-Zellen verdünnen Sie seriell jede Virusprobe, um sie in 1x PBS zu beflecken; Verwenden Sie typischerweise 10-fache Verdünnungen für die präziseste Nachverfolgung.
- Machen Sie diese Verdünnungen durch 10-4 (für niedrige Konzentrationen von Viren) oder durch 10-9 (für Erwartungen von Proben mit höherem Titer), wobei mindestens 1 ml jeder Probe für den Plaque-Assay selbst verbleiben.
- Halten Sie alle viralen Verdünnungen auf Eis (nicht länger als 1 h), bis Sie bereit sind, diese verdünnten Virusproben zu den Zellen hinzuzufügen.
3. Zugabe von Viren zu den Zellen
- Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus einer oder zwei Vertiefungen mit der Pipette.
HINWEIS: Verwenden Sie keinen Aspirator, da er zu viel Flüssigkeit aus der Zellmonoschicht entfernt und die Zellen austrocknet. Eine entscheidende Überlegung ist, sicherzustellen, dass die Zellmonoschicht während des gesamten Verlaufs des Experiments hydratisiert bleibt. Wenn die Zellen austrocknen, waschen sie im letzten Schritt die Platte ab und erzeugen unbrauchbare Daten. Verarbeiten Sie daher nur ein oder zwei Vertiefungen gleichzeitig, um diese Möglichkeit zu verringern. - Fügen Sie die verdünnte Virusprobe (100-400 μL und 50-200 μL Virusprobe werden für 6-Well- bzw. 12-Well-Platten verwendet) vorsichtig zu jeder Monoschicht hinzu und fügen Sie die Tropfen an der Seite jedes Wells hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang für alle ein oder zwei Vertiefungen, bis die gesamte Platte mit den Virusproben gefüllt ist, die mit Plaque behaftet sind.
HINWEIS: Das Hinzufügen der Tropfen in die Mitte des Brunnens kann versehentlich Zellen vom Substrat abspalten. - Schaukeln Sie die gesamte Platte vorsichtig von Hand, um sicherzustellen, dass das PBS, das das Virus enthält, die gesamte Monoschicht von Zellen in jedem Brunnen bedeckt, und legen Sie die Platte dann bei 37 ° C in einen CO2-Inkubator, damit das Virus adsorbieren kann.
- Entfernen Sie alle 10 Minuten innerhalb von 1 Stunde die Platte aus dem Inkubator, schaukeln Sie sie vorsichtig erneut, um das Virus gleichmäßiger über jeden Brunnen zu verteilen, und legen Sie sie dann wieder in den Inkubator.
HINWEIS: Jedes Experiment bestimmt die Anzahl der Replikate und welche Verdünnungen verwendet werden. Die Präferenz des Lesers diktiert diese Entscheidung. - Um die Möglichkeit zu verringern, versehentlich nicht absorbiertes Inokulum zu zählen, entfernen Sie die Virusprobe aus den Vertiefungen mit 1000 μL Pipettenspitzen und legen Sie sie in ein Abfallbecherglas.
HINWEIS: Auch dieses Verfahren wird mit nur einem oder zwei Vertiefungen gleichzeitig durchgeführt, um die Hydratation der Zellmonoschicht aufrechtzuerhalten. - 2,5 ml eines Methylcellulose-Overlays platzieren (5% Methylcellulose w/w in 100 ml PBS auflösen, 15 min bei 121 °C und 15 psi in einem Flüssigkeitszyklus autoklavieren, dann 375 ml DMEM plus 25 mL FBS hinzufügen).
- Sobald eine ganze Platte eine Überlagerung enthält, legen Sie die Platte wieder in den Inkubator, um das Wachstum für zwei Tage zu ermöglichen.
HINWEIS: Wenn das Virus und die Zellen drei Tage lang wachsen dürfen, selbst in DMEM plus Nahrungsergänzungsmitteln, kann dies zu einem erheblichen Verlust von Zellen in der Monoschicht führen, wodurch die endgültigen Daten beeinträchtigt werden. - Desinfizieren Sie das Abfallbecherglas, typischerweise unter Zusatz von Bleichmittel, einem Iodophor oder einem ähnlichen Viruzid, bevor Sie es aus der Biosicherheitskabine entfernen.
4. Färbung für Plaketten
- Nach der zweitägigen Inkubation entfernen Sie das Methylcellulose-Overlay durch eine Pipette, wieder ein oder zwei Vertiefungen auf einmal, und legen Sie es in ein Abfallbecherglas.
- Fügen Sie ~ 2 ml 1% Kristallviolett (siehe Materialtabelle) in 50% Ethanol zu jeder Vertiefung hinzu, um die Plaques zu färben.
HINWEIS: Es ist nicht unbedingt erforderlich, jeden letzten Tropfen des Overlays zu entfernen. - Bebrüten Sie die Platte mit allen mit dem Fleck gefüllten Vertiefungen für 30 min bei 37 ° C. Desinfizieren Sie an dieser Stelle das Abfallbecherglas wie oben in Schritt 3.8.
- Waschen Sie die Teller kräftig mit Leitungswasser, bis der Abfluss klar ist.
HINWEIS: Ein sanfter Wasserstrahl ist nicht kräftig genug; Der volle Druck einer Laborspüle ist erforderlich. - Stellen Sie an dieser Stelle sicher, dass es ungefähr 10-fache Unterschiede in der Anzahl der Plaques über jede Verdünnungsreihe hinweg gibt.
- Lassen Sie die Platten über Nacht kopfüber trocknen, danach können die einzelnen Plaques gezählt werden.
5. Plaques zählen und Virustiter bestimmen
- Unabhängig vom Ansatz (siehe HINWEIS unten) multiplizieren Sie die Anzahl der Plaques mit dem Verdünnungsfaktor (z. B. wenn die Plaques in der 10-4-Vertiefung gezählt würden, dann würde die Anzahl der Plaques mit 104 multipliziert werden).
HINWEIS: Obwohl das Zählen innerhalb eines Bereichs von 10-100 Plaques nützlich ist5, ist das Zählen von Bohrlöchern mit 30-300 Plaques etwas zuverlässiger und berücksichtigt ungefähr 1/2-Log-Verdünnungen anstelle von Full-Log-Verdünnungen. - Teilen Sie diese Zahl durch das Inokulumvolumen (wie oben in Schritt 3.2) und durchschnittlichen Sie alle Vertiefungen, die Plaques innerhalb des angegebenen Bereichs aufweisen, um den genauesten Titer von HSV in der ursprünglichen Probe zu erhalten.
- Führen Sie die Berechnungen in den Schritten 5.3.1 bis 5.3.5 unter Berücksichtigung der Verwendung von Scheindaten in Tabelle 1 durch.
- Betrachten Sie nur Vertiefungen mit 30-300 Plaketten (Schritt 5.1). Verwenden Sie daher in Tabelle 1 nur die Spalte 10 bis 5 für die Replikate 1, 2 und 3.
- Nehmen Sie die Anzahl der Plaques bei der gegebenen Verdünnung und multiplizieren Sie sie mit dem Kehrwert des Verdünnungsfaktors. Daher geht die 10-5-Säule von Probe 1 von 81 Plaques bei der 10-5-Verdünnung auf 81 Plaques mal 105.
- Dann teilen Sie diese Zahl durch das Volumen (in ml) der Virusverdünnung, die den Zellen in diesem Brunnen hinzugefügt wird. Unter der Annahme, dass die Daten zu HSV-1 in Tabelle 1 von einer 12-Well-Platte stammen, wären 0,2 ml die am besten geeignete Messung. Daher ergibt die Berechnung aus Schritt 5.3.2 81 x 105 geteilt durch 0,2 ml oder 4,0 x 107 PFU/ml von HSV-1.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle nützlichen Daten und den Durchschnitt. Daher ist die Berechnung in 5.3.2-5.3.3 an allen Proben in der Spalte 10-5 durchzuführen, vorausgesetzt, sie stammen aus derselben Virusprobe und die biologischen Replikate wurden durchgeführt, um die genaueste Titermessung zu erhalten. Im Falle von Tabelle 1 ergeben sich durchschnittlich 4,0 x 107, 2,1 x 107 und 2,6 x 107 PFU/ml, um einen endgültigen durchschnittlichen Titer von 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/ml für diese Probe zu erhalten.
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Representative Results
Tabelle 1 zeigt ein Experiment mit optimalen Ergebnissen. Alle 10-fachen Verdünnungen folgen einer etwa 10-fachen Abnahme der Plaquezahl. Diese Art von Daten ist auch in Abbildung 2 zu sehen, einem tatsächlichen Plaque-Assay, bei dem die abzählbare Anzahl von Plaques für alle drei Replikate im Bereich von 10-4 lag. Dasselbe ist in Abbildung 3, der obersten Reihe, zu sehen, wo die abzählbare Anzahl von Plaques in der 10-3-Verdünnung war.
Abbildung 3, untere Zeile, zeigt jedoch ein völlig anderes Ergebnis, wenn ein Plaque-Assay nicht gut durchgeführt wird. Erstens gibt es nur sehr wenige Plaques, die durch eine Verdünnung sichtbar sind; Daher sind die Daten unbrauchbar. Zweitens gibt es sichtbare Bereiche um die Oberseite, in denen sich die Vero-Zellen vollständig vom Substrat abgehoben haben, was darauf hindeutet, dass die Zellen entweder dabei austrocknen können oder dass sie in diesem Bereich des Brunnens zu kräftig pipettieren.
Tabelle 2 zeigt auch eine Reihe potenziell abweichender Ergebnisse bei der Plaque-Anzahl und erfordert Vorsichtsmaßnahmen auf dem Weg. Bemerkenswert ist, dass weder die obere noch die untere Reihe der Replikate einem regelmäßigen 10-fachen Unterschied in der Plaqueanzahl folgt, wenn man sich von einer Verdünnung zur nächsten bewegt; Diese Daten weisen auf Benutzerfehler während des Virusverdünnungsprozesses hin. Darüber hinaus ist es unwahrscheinlich, dass ein Benutzer über 15.000 Plaketten genau zählen würde, so dass man diese Daten in Frage stellen muss. Schließlich kann man feststellen, dass bei der Replikation 1, 10-6 Verdünnung eine Plaque-Anzahl im Bereich von 30-300 vorliegt; Angesichts der schlechten Natur des Rests der Daten in dieser Replik ist es jedoch unwahrscheinlich, dass die Anzahl der 42 Plaques eine genaue Zahl ist. Daher befinden sich die einzigen glaubwürdigen Daten in Tabelle 2 in Replikat 2.
Abbildung 4 zeigt die gleichen Probleme mit Zellen, die während des Plaque-Assays austrocknen oder falsch gehandhabt werden. Abbildung 4 zeigt jedoch kritisch eine schlechte Vero-Zellaussaat; Jeder Brunnen zeigt dunklere violette Flecken, die darauf hindeuten, dass sich Zellen nicht gut über den Brunnen verteilen und in Clustern übereinander gestapelt sind.
Abbildung 1: Allgemeines Plaque-Assay-Schema. Adaptiert von der Biorender-Vorlage "Viral Plaque Assay Protocol" von BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Plaque-Assay für HSV-1 in Zwölf-Well-Platten. Biologische Replikate wurden wie in Abbildung 1 dargestellt an einer Probe von HSV-1 durchgeführt. Serielle 10-fache Verdünnungen einer HSV-1-Probe (beginnend mit der 10-2-Verdünnung) wurden den Vero-Zellen hinzugefügt, inkubiert und dann mit Kristallviolett gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Plaque-Assay für HSV-2 in Sechs-Well-Platten. Biologische Replikationen wurden wie in Abbildung 1 dargestellt an einer Probe von HSV-2 durchgeführt. Serielle 10-fache Verdünnungen einer HSV-2-Probe (beginnend mit der 10-2-Verdünnung) wurden zu Vero-Zellen hinzugefügt, inkubiert und dann mit Kristallviolett gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Plaque-Assay für HSV-1 in Zwölf-Well-Platten. Biologische Replikate wurden wie in Abbildung 1 dargestellt an einer Probe von HSV-1 durchgeführt. Serielle 10-fache Verdünnungen einer HSV-1-Probe (beginnend mit der 10-2-Verdünnung) wurden zu Vero-Zellen gegeben, inkubiert und dann mit Kristallviolett gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Verdünnungsfaktor | ||||
| Replizieren | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 Jahre |
| 1 | 5721 | 635 | 81 | 5 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5,519 | 521 | 53 | 1 |
Tabelle 1: Repräsentative Plaque-Anzahl aus einem erfolgreichen Assay. Serielle Verdünnungen von jedem biologischen Replikat wurden durchgeführt; Repräsentative Plaque-Zählungen (beginnend bei der 10-3-Verdünnung ) werden für jede Verdünnung angezeigt.
| Verdünnungsfaktor | ||||
| Replizieren | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 Jahre |
| 1 | 15225 | 635 | 450 | 42 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5519 | 5400 | 53 | 1 |
Tabelle 2: Repräsentative Plaque-Zählung aus einem erfolglosen Assay. Serielle Verdünnungen von jedem biologischen Replikat wurden durchgeführt; Repräsentative Plaque-Zählungen (beginnend bei der 10-3-Verdünnung ) werden für jede Verdünnung angezeigt.
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Discussion
Während Plaque-Assays fast so alt sind wie die Zellkultur von Säugetieren selbst, scheint es, dass jedes Labor seine eigenen Protokolle hat, um diesen grundlegenden Assay auszuführen5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 . Obwohl sich die Anweisungen in jeder veröffentlichten Version eines Plaque-Assays geringfügig unterscheiden, erläutern nur wenige dieser Manuskripte die kritischen Nuancen, die mit der Erzielung konsistenter Ergebnisse verbunden sind.
Daher gibt es einige Teile dieses Protokolls, die mehr Kunst als Wissenschaft sind. Wenn Vero-Zellen für den Assay in Vertiefungen ausgesät werden, müssen sie gleichmäßig über das Bohrloch verteilt werden (Abbildung 4). Alle Schritte, die einen Flüssigkeitstransfer beinhalten (z. B. Schritte 3.1, 3.2, 3.5, 3.6, 4.1 und 4.2), müssen sorgfältig durchgeführt werden, um die Vero-Zell-Monoschicht hydratisiert zu halten (Abbildung 3 und Abbildung 4). Es ist auch wichtig, den Boden des Brunnens nicht mit einer Pipette zu berühren, da die Zellen sonst abkratzen können, was die endgültigen Daten weiter beeinträchtigt (Abbildung 4).
Während Methylcellulose als Overlay-Material vorteilhaft ist, um die Diffusion von Virionen über das gesamte Bohrloch zu verhindern, können Alternativen verwendet werden. Zum Beispiel kann man mikrokristalline Cellulose21,22 oder Carboxymethylcellulose21 verwenden. Unabhängig davon ist Methylcellulose jedoch eines der am einfachsten und kostengünstigsten flüssigen Overlay-Medien. Man kann auch einen anderen Farbstoff21 oder eine andere Fixierlösung (z. B. Paraformaldehyd)21 für den Färbeteil des Protokolls (Schritt 4) verwenden, aber Kristallviolett in 50% Ethanol ist die einfachste und kostengünstigste unter den Optionen.
Während es offensichtlich einfach sein kann, diese Assays durchzuführen, erfordern sie Training und Übung. Es lohnt sich, Proben zu verwenden, die für das Erlernen dieser Methode nicht unersetzlich sind, damit man die Technik beherrscht, wenn es darauf ankommt.
Plaque-Assays selbst sollten jedoch nur verwendet werden, wenn man echte lebende Virionen zählen muss. Plaquing ist eine viel ältere Methodik zur Messung von Viruspartikeln5,10 im Vergleich zu neueren quantitativen Methoden wie Fluoreszenzmikroskopie23, ELISA24, enzymatischer Aktivität25,26 oder qPCR27. Diese letzteren Methoden erzeugen jedoch Ersatzdaten, die auf das Vorhandensein ganzer Virionen hindeuten, jedoch zu einer groben Überschätzung der lebensfähigen Partikel führen können, da der Benutzer einen Indikator für eine Infektion quantifizieren würde, nicht echte Virionen. Die Fluoreszenzmikroskopie misst infektiöse Virionen anhand der Anzahl der Zellen, die das Vorhandensein eines vom Virus exprimierten Proteins aufweisen, erkennt jedoch nicht unbedingt vollständige, replikationskompetente Virionen. ELISA weist in ähnlicher Weise das Vorhandensein von Virusproteinen nach, die ohne ein völlig infektiöses Virion existieren können. Die Untersuchung der enzymatischen Aktivität, die auf ein intaktes Virion hindeutet, zeigt nur, dass ein einzelnes aktives Enzym vorhanden ist und spiegelt nicht die wahre ansteckende Natur eines ganzen Virions wider. Und qPCR quantifiziert lediglich Kopien des Genoms eines Virus, unabhängig davon, ob dieses Genom defekt ist oder nicht. Die einzige mit einem Plaque-Assay vergleichbare Methode zur Quantifizierung lebender Viren ist ein Endpunkt-Verdünnungsassay28, der noch eine statistische Schätzung über die Reed-Muench- oder Spearman-Kärber-Methode29,30,31 zur Bestimmung der Virionkonzentration erfordert.
Während Plaque-Assays eine routinemäßige Methode sind, die in der gesamten Virologie verwendet wird, gibt es bestimmte Fälle, in denen sie nicht der quantitative Assay der Wahl sind. Zum Beispiel erfordern Plaque-Assays, dass sich Wirtszellen an ein Substrat anheften; Wenn die beste Wirtszelle für eine Infektion nicht anhaftet, bilden sich niemals Plaques32. Einige Viren wachsen langsamer als der typische Zellzyklus ihrer Wirte, und daher würden aufkeimende Plaques von den Wirtszellen selbst überwuchert21. Plaques können sich manchmal nicht gut bilden, allein aufgrund der Art der zytopathischen Wirkung, was die Bestimmung von Bona-fide-Plaques zu einer Einschränkung macht21.
Der hier vorgestellte Ansatz zur Plaquierung von Herpesviren ist nicht unbedingt einzigartig. Diese eingehende Beschreibung der geringfügigen Vorbehalte, die mit einem erfolgreichen HSV-Plaque-Assay verbunden sind, kann jedoch die Schwierigkeiten vieler Benutzer, insbesondere von Anfängern, verringern. Unabhängig davon ist die beschriebene Methodik auch weitgehend auf Plaque-Assays mit vielen anderen Viren anwendbar, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Picornaviren33, Orthomyxoviren34, Flaviren35, Coronaviren36 und viele andere Systeme, in denen eine quantifizierbare Menge an infektiösen tierischen Viren erforderlich ist.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir danken unzähligen Studenten in unseren Laboren (PJD und BJM), die im Laufe der Jahre mit uns zusammengearbeitet haben, um diese Methoden zu verfeinern. Ein besonderer Dank geht an Stan Person, unter dessen Anleitung diese Methodik zuerst entwickelt wurde. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support Fund und NIGMS Bridges to the Baccalaureate Grant 5R25GM058264 unterstützt. Dieser Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
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