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Immunology and Infection

हरपीज सिंप्लेक्स वायरस की Plaquing

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/62962
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1,2, 3, 1,4
1Towson University Herpes Virus Lab, Department of Biological Sciences, Towson University, 2Towson University Department of Chemistry, Towson University, 3Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Molecular Biology, Biochemistry, and Bioinformatics Program, Towson University
* These authors contributed equally

Summary

प्लाक्विन एक नियमित विधि है जिसका उपयोग आबादी में जीवित वायरस को मापने के लिए किया जाता है। यद्यपि प्लाक्विन को अक्सर बैक्टीरिया और बैक्टीरियोफेज के साथ विभिन्न माइक्रोबायोलॉजी पाठ्यक्रमों में पढ़ाया जाता है, स्तनधारी वायरस की प्लाक्विन अधिक जटिल और समय लेने वाली है। यह प्रोटोकॉल उन प्रक्रियाओं का वर्णन करता है जो दाद सिंप्लेक्स वायरस के साथ नियमित रूप से काम करने के लिए मज़बूती से कार्य करते हैं।

Abstract

प्लाक्विन वायरस के लिए कई प्रकाशित प्रोटोकॉल हैं, जिनमें कार्यप्रणाली के लिए प्राथमिक साहित्य के भीतर संदर्भ शामिल हैं। हालांकि, प्लाक्विन वायरस का प्रदर्शन करना मुश्किल हो सकता है, इसके विनिर्देशों और शोधन पर ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता होती है। यह नए छात्रों के लिए मास्टर करने के लिए एक अविश्वसनीय रूप से चुनौतीपूर्ण तरीका है, मुख्य रूप से क्योंकि इसके लिए सबसे मिनट के विवरण पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता होती है। plaquing दाद सिंप्लेक्स वायरस के इस प्रदर्शन को उन लोगों की मदद करनी चाहिए जिन्होंने वर्षों से विधि, विशेष रूप से इसकी बारीकियों की कल्पना के साथ संघर्ष किया है। जबकि यह पांडुलिपि मानक प्लाक्विन पद्धति के समान सिद्धांतों पर आधारित है, यह इस बात में भिन्न है कि इसमें (1) प्रक्रिया के दौरान व्यवधान से बचने के लिए मेजबान कोशिकाओं को संभालने के लिए सबसे अच्छा तरीका है, (2) virions के प्रसार को सीमित करने के लिए agarose की तुलना में अधिक उपयोगी चिपचिपा माध्यम, और (3) एक सरल निर्धारण और धुंधला प्रक्रिया जो मज़बूती से पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करती है। इसके अलावा, साथ का वीडियो प्रक्रिया में महीन भेदों को प्रदर्शित करने में मदद करता है, जो अक्सर पट्टिका assays के संचालन पर दूसरों को निर्देश देते समय याद किया जाता है।

Introduction

वायरस पट्टिका assays की शुरुआत 1890s1 में वायरस की पहली खोजों के लिए वापस जाना. तम्बाकू मोज़ेक वायरस को पहले अलग किया गया था और तंबाकू के पत्तों पर पारित किया गया था, जहां संक्रमण के व्यक्तिगत धब्बों को पहचाना जा सकता था और एक एकल, जीवित वायरस एंटिटी 2 से उत्पन्न होने के रूप में परिमाणित किया जा सकता था, जिसे बाद में एक virion2 के रूप में पहचाना गया था। बैक्टीरिया और बैक्टीरियोफेज के साथ बाद के मौलिक अध्ययनों ने इन वायरसों को पट्टिका करने के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकों को पूरा किया, जिसमें विकास के मध्य-लॉग चरण में बैक्टीरिया, बैक्टीरियोफेज नमूनों का सीरियल कमजोर पड़ने, और बैक्टीरियल लॉन 3 में शाब्दिक छेद (नामित सजीले टुकड़े) के बाद के दृश्य के साथ शीर्ष आगर शामिल है।

पशु वायरस की प्लैंकिंग ने बैक्टीरियोफेज के साथ किए जा रहे रोमांचक शोध को पीछे छोड़ दिया, मुख्य रूप से क्योंकि संस्कृति में स्तनधारी कोशिकाओं को बढ़ाने के लिए आवश्यक तरीकों को 1940 के दशक तक विकसित नहीं किया गया था। हालांकि, पूरे मेजबान जीव 4 की अनुपस्थिति में बढ़ती मुरीन कोशिकाओं के आगमन ने वायरस को संस्कृति और गिनने की क्षमता में एक नए युग को जन्म दिया। इस तरह के काम को चिकन कोशिकाओं में पश्चिमी इक्वाइन एन्सेफलोमाइलाइटिस वायरस और मानव कोशिकाओं में पोलियोवायरस के प्रसार और मात्रा के लिए विस्तारित किया गया था5,6। जैसा कि कृषि योग्य स्तनधारी कोशिकाओं के दायरे का विस्तार हुआ, विभिन्न वायरल संक्रमणों के लिए विभिन्न मेजबान कोशिकाओं के बेवी ने दुनिया को वायरस के सभी तरीकों का अध्ययन करने की संभावनाओं का एक कॉर्नुकोपिया दिया। इसमें मानव दाद वायरस, विशेष रूप से दाद सिंप्लेक्स वायरस -1 (एचएसवी -1) और -2 (एचएसवी -2) का प्रसार और परिमाणीकरण शामिल था, जो म्यूकोक्यूटेनियस घावों का कारण बनता है। महत्वपूर्ण रूप से, सभी पट्टिका assays लाइव virions के अस्तित्व पर निर्भर हैं, जो एक नमूना 9 में एक रिसेप्टर-मध्यस्थता फैशन में मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश कर सकते हैं। पट्टिका assays5,10,11,12,13,14,15,16 के निष्पादन पर सर्वव्यापकता और प्रकाशनों की भीड़ के बावजूद, HSV-1/-2 के लिए ये तरीके कला और विज्ञान दोनों का मिश्रण हैं; एक प्रोटोकॉल में हर विस्तार के लिए उचित ध्यान के बिना परख का संचालन नहीं कर सकते हैं, और न ही एक प्रक्रिया में subtlety के लिए एक crticial आँख के बिना एक सफल परख निष्पादित कर सकते हैं. इस पांडुलिपि HSV-1 /-2 पट्टिका assays के लिए सबसे लगातार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकों में से एक को दर्शाता है, परख की कला है कि शायद ही कभी चर्चा कर रहे हैं की कला की ओर सटीक विवरण के साथ.

यह वर्तमान प्रोटोकॉल HSV-1 और -2 मज़बूती से के लिए लाइव पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (PFU) की गिनती प्राप्त करता है। सबसे अच्छे परिणाम वेरो कोशिकाओं (परिवर्तित अफ्रीकी हरे बंदर गुर्दे की उपकला कोशिकाओं) का उपयोग करके कम मार्ग (मार्ग संख्या 155 से नीचे) पर प्राप्त किए जाते हैं और नियमित रूप से अल्फा-एमईएम 17 में 10% भ्रूण बछड़े के सीरम (एफसीएस), एल-एलानिल-एल-ग्लूटामाइन और एक एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक मिश्रण 18 के साथ पूरक होते हैं। वेरो कोशिकाओं को मानक रूप से इस माध्यम में प्रति सप्ताह दो से तीन बार 1/5 कमजोर पड़ने पर हर बार 1/5 कमजोर पड़ने पर प्रचारित किया जाता है।

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Protocol

वेरो कोशिकाओं और लाइव हर्पीजवायरस के साथ सभी प्रक्रियाओं को Towson University Institutional Biosafety Committee द्वारा अनुमोदित किया गया है। इन प्रक्रियाओं की एक सामान्यीकृत योजना को चित्र 1 में दर्शाया गया है।

1. वेरो कोशिकाओं के सीडिंग

  1. पट्टिका परख शुरू करने से एक दिन पहले, ट्रिप्सिनाइज़ वेरो कोशिकाओं और उन्हें नियमित रूप से Dulbecco के संशोधित ईगल्स मध्यम (DMEM) और मानक सेल संस्कृति पद्धति के अनुसार पूरक में resuspend. Confluent Vero कोशिकाओं (~ 107 कोशिकाओं) के प्रति T-75 फ्लास्क प्रति DMEM के 10 mL में ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाओं को पुन: निलंबित कर दिया।
    नोट: DMEM अल्फा-MEM के बजाय पट्टिका assays के लिए प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह थोड़ा सेल विकास दर धीमा कर देता है और बेहतर पट्टिका परख परिणामों का पक्ष लेता है।
  2. किसी की पसंदीदा विधि से कोशिकाओं की गणना करें (उदाहरण के लिए, ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण के साथ एक मानक हेमोसाइटोमीटर)19।
  3. 4 x 106 कोशिकाओं / प्लेट पर कोशिकाओं को बीज; HSV-2 के लिए, DMEM के 2.5 mL के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करें (पूरक के साथ) प्रति अच्छी तरह से; और HSV-1 के लिए, DMEM के 1.25 mL के साथ 12-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करें (पूरक के साथ) प्रति अच्छी तरह से।
    नोट: कोशिकाओं की संख्या का उपयोग किया प्लेट की परवाह किए बिना स्थिर होना चाहिए, हालांकि कुओं का आकार पट्टिका परख में सटीकता से संबंधित मामलों. कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करना आवश्यक है, जिसे प्लेट को आगे और पीछे ले जाकर सबसे प्रभावी ढंग से पूरा किया जा सकता है, न कि एक परिपत्र फैशन में।
  4. कोशिकाओं को एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर रात भर बढ़ने की अनुमति दें।
    नोट: नमी को इनक्यूबेटर के तल में एक एल्गिसाइड युक्त आसुत पानी के एक पैन के साथ बनाए रखा जाता है।

2. नमूना कमजोर पड़ने

  1. नमूना कमजोर पड़ने और एक प्रयोगशाला सत्र में कोशिकाओं के लिए वायरस के अलावा पूरा करें।
    सावधानी: एचएसवी -1 और -2 मनुष्यों के लिए संक्रामक हैं और उचित जैव सुरक्षा रोकथाम (बीएसएल -2) के तहत संभाला जाना चाहिए। वायरस के संपर्क में आने वाली सभी सामग्रियों को अलग रखें और 1/256 कमजोर पड़ने पर एक चतुर्भुज एजेंट के साथ कीटाणुरहित करें ( सामग्री की तालिका देखें), आयोडोफोर, ब्लीच, या मजबूत आयनिक डिटर्जेंट (जैसे, एसडीएस) उन्हें जैव सुरक्षा कैबिनेट से हटाने से पहले।
  2. वेरो कोशिकाओं के सीडिंग के बाद के दिन, क्रमिक रूप से प्रत्येक वायरस के नमूने को पतला करने के लिए 1x PBS में प्लाक किया जा सकता है; आमतौर पर सबसे सटीक ट्रैकिंग के लिए 10 गुना dilutions का उपयोग करें।
  3. 10-4 (वायरस की कम सांद्रता के लिए) के माध्यम से या 10-9 के माध्यम से (उच्च टिटर नमूनों की अपेक्षाओं के लिए) पट्टिका परख के लिए शेष प्रत्येक नमूने के कम से कम 1 मिलीलीटर के साथ इन dilutions बनाओ ही.
  4. बर्फ पर सभी वायरल dilutions रखें (1 घंटे से अधिक नहीं) जब तक कि कोशिकाओं में इन पतला वायरस के नमूनों को जोड़ने के लिए तैयार न हो।

3. कोशिकाओं के लिए वायरस के अलावा

  1. पिपेट द्वारा एक या दो कुओं से सेल कल्चर माध्यम को हटा दें।
    नोट: एक aspirator का उपयोग न करें क्योंकि यह सेल मोनोलेयर से बहुत अधिक तरल को हटा देता है और कोशिकाओं को सूख जाता है। एक महत्वपूर्ण विचार यह सुनिश्चित करना है कि सेल मोनोलेयर प्रयोग के पूरे पाठ्यक्रम में हाइड्रेटेड रहता है। यदि कोशिकाएं सूख जाती हैं, तो वे अंतिम चरण में प्लेट को धो देंगी और अनुपयोगी डेटा उत्पन्न करेंगी। इसलिए, इस संभावना को कम करने के लिए एक समय में केवल एक या दो कुओं को संसाधित करें।
  2. ध्यान से पतला वायरस नमूना जोड़ें (100-400 μL और वायरस के नमूने के 50-200 μL क्रमशः 6-अच्छी तरह से और 12-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए उपयोग किया जाता है) प्रत्येक monolayer के लिए dropwise ड्रॉपवाइज, प्रत्येक अच्छी तरह से के पक्ष के नीचे बूँदें जोड़ने. हर एक या दो कुओं के लिए प्रक्रिया को दोहराएं जब तक कि पूरी प्लेट वायरस के नमूनों से भरी न हो जाए।
    नोट: अच्छी तरह से के केंद्र में बूँदें जोड़ना अनजाने में सब्सट्रेट से कोशिकाओं को slough हो सकता है।
  3. धीरे से पूरे प्लेट को हाथ से रॉक करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पीबीएस जिसमें वायरस शामिल है, प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं के पूरे मोनोलेयर को कवर करता है, फिर प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें ताकि वायरस को adsorb करने की अनुमति मिल सके।
  4. 1 घंटे के भीतर हर 10 मिनट में, इनक्यूबेटर से प्लेट को हटा दें, धीरे-धीरे इसे फिर से हिलाएं ताकि वायरस को प्रत्येक कुएं में अधिक समान रूप से फैलाया जा सके, और फिर इसे इनक्यूबेटर में वापस रखा जा सके।
    नोट: प्रत्येक प्रयोग प्रतिकृतियों की संख्या को निर्धारित करेगा और कौन से dilutions का उपयोग किया जाता है; पाठक की प्राथमिकता उस निर्णय को निर्धारित करती है।
  5. अनजाने में अवशोषित इनोकुलम की गिनती की संभावना को कम करने के लिए, 1000 μL पिपेट युक्तियों के साथ कुओं से वायरस के नमूने को हटा दें और इसे एक अपशिष्ट बीकर में रखें।
    नोट: फिर से, यह प्रक्रिया सेल मोनोलेयर के जलयोजन को बनाए रखने के लिए एक समय में केवल एक या दो कुओं के साथ आयोजित की जाती है।
  6. एक मिथाइलसेल्यूलोज ओवरले के 2.5 मिलीलीटर रखें (पीबीएस के 100 मिलीलीटर में 5% मिथाइलसेल्यूलोज डब्ल्यू / डब्ल्यू को भंग करें, 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए आटोक्लेव और एक तरल चक्र पर 15 पीएसआई, फिर डीएमईएम के 375 एमएल प्लस एफबीएस के 25 एमएल जोड़ें)।
  7. एक बार जब एक पूरी प्लेट में ओवरले होता है, तो प्लेट को दो दिनों के लिए विकास की अनुमति देने के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    नोट: यदि वायरस और कोशिकाओं को तीन दिनों के लिए बढ़ने की अनुमति है, यहां तक कि DMEM प्लस सप्लीमेंट्स में भी, मोनोलेयर में कोशिकाओं का पर्याप्त नुकसान हो सकता है, जिससे अंतिम डेटा से समझौता हो सकता है।
  8. अपशिष्ट बीकर को कीटाणुरहित करें, आमतौर पर ब्लीच, एक आयोडोफोर, या इसी तरह के विरुसाइड के अलावा, इसे जैव सुरक्षा कैबिनेट से हटाने से पहले।

4. सजीले टुकड़े के लिए धुंधला

  1. दो दिन के इनक्यूबेशन के बाद, एक पिपेट द्वारा मिथाइलसेल्यूलोज ओवरले को हटा दें, फिर से एक समय में एक या दो कुएं, और इसे एक अपशिष्ट बीकर में रखें।
  2. सजीले टुकड़े दाग करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 50% इथेनॉल में 1% क्रिस्टल बैंगनी के ~ 2 mL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: ओवरले की हर अंतिम बूंद को निकालना आवश्यक नहीं है।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए दाग से भरे सभी कुओं के साथ प्लेट को इनक्यूबेट करें। इस बिंदु पर, चरण 3.8 में ऊपर के रूप में अपशिष्ट बीकर कीटाणुरहित करें।
  4. नल के पानी से प्लेटों को जोर से धोएं जब तक कि अपवाह स्पष्ट न हो जाए।
    नोट: पानी की एक कोमल धारा पर्याप्त जोरदार नहीं है; एक प्रयोगशाला सिंक स्थिरता से पूर्ण दबाव की आवश्यकता होती है।
  5. इस बिंदु पर, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला में सजीले टुकड़े की संख्या में लगभग 10 गुना अंतर हैं।
  6. प्लेटों को रात भर उल्टा सूखने की अनुमति दें, जिसके बाद व्यक्तिगत सजीले टुकड़े गिने जा सकते हैं।

5. सजीले टुकड़े गिनती और वायरस टिटर का निर्धारण

  1. दृष्टिकोण के बावजूद (नीचे नोट देखें), कमजोर पड़ने वाले कारक से सजीले टुकड़े की संख्या को गुणा करें (उदाहरण के लिए, यदि सजीले टुकड़े को 10-4 अच्छी तरह से गिना जाता है, तो सजीले टुकड़े की संख्या को 104 से गुणा किया जाएगा)।
    नोट: हालांकि 10-100 सजीले टुकड़े की एक सीमा के भीतर गिनती उपयोगी है5, 30-300 सजीले टुकड़े के साथ कुओं की गिनती कुछ अधिक विश्वसनीय है और पूर्ण लॉग dilutions के बजाय लगभग 1/2-लॉग dilutions खाते में लेता है।
  2. इस संख्या को इनोकुलम की मात्रा से विभाजित करें (जैसा कि चरण 3.2 में ऊपर दिया गया है), और मूल नमूने में एचएसवी के सबसे सटीक टिटर प्राप्त करने के लिए बताई गई सीमा के भीतर सजीले टुकड़े वाले सभी कुओं का औसत करें।
  3. तालिका 1 में मॉक डेटा के उपयोग पर विचार करते हुए, चरण 5.3.1 से 5.3.5 में परिकलन निष्पादित करें।
    1. केवल 30-300 सजीले टुकड़े (चरण 5.1) के साथ कुओं पर विचार करें। इसलिए, तालिका 1 में, 1, 2 और 3 को दोहराने के लिए केवल 10-5 स्तंभ का उपयोग करें।
    2. दिए गए तनुकरण पर सजीले टुकड़े की संख्या लें और तनुकरण कारक के व्युत्क्रम से गुणा करें। इसलिए, नमूना 1 का 10-5 स्तंभ 10-5 कमजोर पड़ने पर 81 सजीले टुकड़े से 81 सजीले टुकड़े बार 105 तक जाता है।
    3. फिर उस संख्या को उस संख्या को उस कुएं में कोशिकाओं में जोड़े गए वायरस कमजोर पड़ने की मात्रा (एमएल में) से विभाजित करें। यह मानते हुए कि तालिका 1 में HSV-1 पर डेटा 12-वेल प्लेट से हैं, 0.2 mL सबसे उपयुक्त माप होगा। इसलिए चरण 5.3.2 से गणना 81 x 105 को 0.2 mL, या HSV-1 के 4.0 x 107 PFU/mL से विभाजित हो जाती है।
    4. सभी उपयोगी डेटा और औसत के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। इसलिए 10-5 कॉलम में सभी नमूनों पर 5.3.2-5.3.3 में गणना का संचालन करें, यह मानते हुए कि वे एक ही वायरस के नमूने से उत्पन्न हुए थे और जैविक प्रतिकृतियों को सबसे सटीक टिटर माप प्राप्त करने के लिए आयोजित किया गया था। तालिका 1 के मामले में, इस नमूने के लिए 2.9 x 107 ± 0.98 x 107 PFU/mL का अंतिम औसत टिटर प्राप्त करने के लिए औसत 4.0 x 107, 2.1 x 107, और 2.6 x 107 PFU/mL का औसत।

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Representative Results

तालिका 1 एक प्रयोग है कि इष्टतम परिणाम है दिखाता है। सभी 10-गुना dilutions पट्टिका गिनती में लगभग 10 गुना कमी का पालन करते हैं। डेटा के इन प्रकार भी चित्रा 2, एक वास्तविक पट्टिका परख में देखा जा सकता है जहां सजीले टुकड़े की गिनती की संख्या सभी तीन प्रतिकृतियों के लिए 10-4 सीमा में गिर गया. वही चित्रा 3, शीर्ष पंक्ति में देखा जा सकता है, जहां सजीले टुकड़े की गिनती की संख्या 10-3 कमजोर पड़ने में थी।

हालांकि, चित्रा 3, नीचे पंक्ति, एक पूरी तरह से अलग परिणाम दिखाता है जब एक पट्टिका परख अच्छी तरह से आयोजित नहीं किया जाता है। सबसे पहले, किसी भी कमजोर पड़ने से दिखाई देने वाले बहुत कम सजीले टुकड़े हैं; इसलिए, डेटा अनुपयोगी हैं। दूसरा, शीर्ष के चारों ओर दिखाई देने वाले क्षेत्र हैं जहां वेरो कोशिकाओं ने पूरी तरह से सब्सट्रेट से उठाया है, या तो कोशिकाओं को प्रक्रिया में सूखने की अनुमति देने या कुएं के उस क्षेत्र में बहुत सख्ती से पिपेटिंग का सबूत है।

तालिका 2 भी पट्टिका गिनती में संभावित रूप से असामान्य परिणामों का एक सेट दिखाता है और रास्ते में सावधानी बरतने की आवश्यकता होती है। ध्यान दें, न तो शीर्ष पंक्ति और न ही प्रतिकृति की निचली पंक्ति पट्टिका की गिनती में एक नियमित 10-गुना अंतर का पालन करती है क्योंकि एक कमजोर पड़ने से अगले तक जाता है; ये डेटा वायरस कमजोर पड़ने की प्रक्रिया के दौरान उपयोगकर्ता त्रुटि को इंगित करते हैं। इसके अलावा, यह संभावना नहीं है कि एक उपयोगकर्ता सटीक रूप से 15,000 सजीले टुकड़े से अधिक की गिनती करेगा, इसलिए किसी को उन डेटा को प्रश्न में कॉल करना चाहिए। अंत में, कोई भी ध्यान दे सकता है कि 1, 10-6 कमजोर पड़ने को दोहराने में, 30-300 रेंज में एक पट्टिका गिनती है; फिर भी, इस प्रतिकृति में शेष डेटा की खराब प्रकृति को देखते हुए, यह संभावना नहीं है कि 42 पट्टिका गिनती एक सटीक संख्या है। इसलिए, तालिका 2 में एकमात्र विश्वसनीय डेटा प्रतिकृति 2 में है।

चित्रा 4 कोशिकाओं को सुखाने या पट्टिका परख के दौरान mishandled किया जा रहा के साथ एक ही समस्याओं से पता चलता है. हालांकि, चित्रा 4 गंभीर रूप से खराब वेरो सेल सीडिंग दिखाता है; हर अच्छी तरह से गहरे बैंगनी धब्बे दिखाता है, कोशिकाओं का संकेत अच्छी तरह से अच्छी तरह से नहीं फैला है और समूहों में एक दूसरे के शीर्ष पर ढेर है।

Figure 1
चित्रा 1: समग्र पट्टिका परख योजना. Biorender टेम्पलेट से अनुकूलित, "वायरल पट्टिका परख प्रोटोकॉल," BioRender.com द्वारा. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: बारह अच्छी तरह से प्लेटों में HSV-1 के लिए पट्टिका परख. जैविक प्रतिकृतियों को एचएसवी -1 के एक नमूने पर चित्र 1 में उल्लिखित के रूप में आयोजित किया गया था। एक HSV-1 नमूने के सीरियल 10-गुना dilutions (10-2 कमजोर पड़ने पर शुरू) वेरो कोशिकाओं में जोड़ा गया था, इनक्यूबेट किया गया था, फिर क्रिस्टल बैंगनी के साथ दाग दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: छह अच्छी तरह से प्लेटों में HSV-2 के लिए पट्टिका परख. एचएसवी -2 के एक नमूने पर चित्र 1 में उल्लिखित जैविक प्रतिकृतियों का आयोजन किया गया था। एक HSV-2 नमूने के सीरियल 10-गुना dilutions (10-2 कमजोर पड़ने पर शुरू) वेरो कोशिकाओं में जोड़ा गया था, इनक्यूबेट किया गया था, फिर क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: बारह अच्छी तरह से प्लेटों में HSV-1 के लिए पट्टिका परख. जैविक प्रतिकृतियों को एचएसवी -1 के एक नमूने पर चित्र 1 में उल्लिखित के रूप में आयोजित किया गया था। एक HSV-1 नमूने (10-2 कमजोर पड़ने पर शुरू) के सीरियल 10-गुना dilutions वेरो कोशिकाओं में जोड़ा गया था, इनक्यूबेट, फिर क्रिस्टल बैंगनी के साथ दाग दिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तनुकरण गुणक
प्रतिकृति 10-3 10-4 10-5 10-6
1 5721 635 81 5
2 4592 365 42 0
3 5,519 521 53 1

तालिका 1: प्रतिनिधि पट्टिका एक सफल परख से गिना जाता है. प्रत्येक जैविक प्रतिकृति से सीरियल dilutions आयोजित किए गए थे; प्रतिनिधि पट्टिका गिनती (10-3 कमजोर पड़ने पर शुरू) प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए दिखाया गया है।

तनुकरण गुणक
प्रतिकृति 10-3 10-4 10-5 10-6
1 15225 635 450 42
2 4592 365 42 0
3 5519 5400 53 1

तालिका 2: प्रतिनिधि पट्टिका एक असफल परख से गिना जाता है. प्रत्येक जैविक प्रतिकृति से सीरियल dilutions आयोजित किए गए थे; प्रतिनिधि पट्टिका गिनती (10-3 कमजोर पड़ने पर शुरू) प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए दिखाया गया है।

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Discussion

जबकि पट्टिका assays स्तनधारी सेल संस्कृति के रूप में ही लगभग के रूप में पुराने हैं, ऐसा लगता है कि प्रत्येक प्रयोगशाला प्रोटोकॉल का अपना सेट है इस बुनियादी परख को निष्पादित करने के लिए5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 . यद्यपि एक पट्टिका परख के प्रत्येक प्रकाशित संस्करण में निर्देश कभी भी थोड़ा अलग होते हैं, इन पांडुलिपियों में से कुछ लगातार परिणाम प्राप्त करने में शामिल महत्वपूर्ण बारीकियों को स्पष्ट करते हैं।

इसलिए, इस प्रोटोकॉल के कुछ हिस्से हैं जो विज्ञान की तुलना में अधिक कला हैं। जब वेरो कोशिकाओं परख के लिए कुओं में seeded रहे हैं, वे अच्छी तरह से भर में समान रूप से फैल जाना चाहिए (चित्रा 4). तरल हस्तांतरण से जुड़े सभी चरण (उदाहरण के लिए, चरण 3.1, 3.2, 3.5, 3.6, 4.1, और 4.2) को वेरो सेल मोनोलेयर हाइड्रेटेड रखने के लिए सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए (चित्रा 3 और चित्रा 4)। किसी भी पिपेट के साथ कुएं के नीचे को स्पर्श न करना भी महत्वपूर्ण है, या कोशिकाएं स्क्रैप कर सकती हैं, आगे अंतिम डेटा (चित्रा 4) से समझौता कर सकती हैं।

जबकि मिथाइलसेल्यूलोज पूरे कुएं में virions के प्रसार को रोकने के लिए एक ओवरले सामग्री के रूप में फायदेमंद है, विकल्पों का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कोई माइक्रोक्रिस्टलाइन सेल्यूलोज 21,22 या कार्बोक्सीमिथाइल सेल्यूलोज 21 का उपयोग कर सकता है। भले ही, मिथाइलसेल्यूलोज उपयोग करने के लिए सबसे आसान और कम से कम महंगे तरल ओवरले मीडिया में से एक है, हालांकि। कोई भी प्रोटोकॉल (चरण 4) के धुंधला भाग के लिए एक अलग डाई 21 या फिक्सिंग समाधान (उदाहरण के लिए, पैराफॉर्मेल्डिहाइड) 21 का उपयोग कर सकता है, लेकिन 50% इथेनॉल में क्रिस्टल वायलेट विकल्पों में सबसे आसान और कम से कम महंगा है।

हालांकि यह इन assays का संचालन करने के लिए अत्यधिक सरल हो सकता है, उन्हें प्रशिक्षण और अभ्यास की आवश्यकता होती है। यह उन नमूनों का उपयोग करने के लायक है जो इस विधि को सीखने के लिए अपूरणीय नहीं हैं ताकि किसी ने तकनीक में महारत हासिल कर ली हो जब यह सबसे अधिक मायने रखता है।

पट्टिका assays खुद को केवल इस्तेमाल किया जाना चाहिए, हालांकि, जब एक को बोनाफाइड लाइव virions गिनती की जरूरत है. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 23, एलिसा 24, एंजाइमेटिक गतिविधि 25,26, या qPCR27 जैसे नए मात्रात्मक तरीकों की तुलना में वायरस कणों को मापने के लिए Plaquing एक बहुत पुरानी पद्धति है। हालांकि, ये बाद के तरीके सरोगेट डेटा उत्पन्न करते हैं जो पूरे virions की उपस्थिति का सुझाव देते हैं, फिर भी व्यवहार्य कणों में सकल अतिरंजित हो सकते हैं क्योंकि उपयोगकर्ता संक्रमण के संकेतक को परिमाणित करेगा, न कि वास्तविक virions। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी संक्रामक virions को मापता है कि कितनी कोशिकाएं वायरस द्वारा व्यक्त प्रोटीन की उपस्थिति का प्रदर्शन करती हैं, लेकिन जरूरी नहीं कि पूर्ण, प्रतिकृति-सक्षम virions का पता लगाएं। एलिसा इसी तरह वायरस प्रोटीन की उपस्थिति का पता लगाता है जो पूरी तरह से संक्रामक विषाणु के बिना मौजूद हो सकता है। एंजाइमेटिक गतिविधि का आकलन करना, जबकि एक बरकरार virion का विचारोत्तेजक, केवल यह दर्शाता है कि एक एकल सक्रिय एंजाइम मौजूद है और एक पूरे virion की सच्ची संक्रामक प्रकृति को प्रतिबिंबित नहीं करता है। और क्यूपीसीआर केवल एक वायरस के जीनोम की प्रतियों को निर्धारित करता है, चाहे वह जीनोम दोषपूर्ण हो या नहीं। जीवित वायरस को मापने के लिए एक पट्टिका परख के लिए तुलनीय एकमात्र विधि एक समापन बिंदु कमजोर पड़ने परख 28 है, जो अभी भी रीड-म्यूंच या स्पीयरमैन-केर्बर विधियों के माध्यम से एक सांख्यिकीय अनुमान की आवश्यकता होती है29,30,31 virion एकाग्रता निर्धारित करने के लिए।

जबकि पट्टिका assays एक नियमित विधि पूरे विषाणु विज्ञान में इस्तेमाल कर रहे हैं, वहाँ विशेष मामलों जहां वे पसंद की मात्रात्मक परख नहीं कर रहे हैं रहे हैं. उदाहरण के लिए, पट्टिका assays एक सब्सट्रेट को संलग्न करने के लिए मेजबान कोशिकाओं की आवश्यकता होती है; यदि संक्रमण के लिए सबसे अच्छा मेजबान सेल गैर-अनुयायी है, तो सजीले टुकड़े कभी भी फॉर्म 32 नहीं होंगे। कुछ वायरस अपने मेजबानों के विशिष्ट सेल चक्र की तुलना में अधिक धीरे-धीरे बढ़ते हैं, और इसलिए किसी भी बढ़ते सजीले टुकड़े को मेजबान कोशिकाओं द्वारा स्वयं 21 से अधिक उगाया जाएगा। सजीले टुकड़े कभी-कभी अच्छी तरह से नहीं बन सकते हैं, बस साइटोपैथिक प्रभाव की प्रकृति से, जिससे बोनाफाइड सजीले टुकड़े का निर्धारण एक सीमा 21 हो जाता है।

यहां प्रस्तुत दाद वायरस को प्लैंक्विन करने का दृष्टिकोण जरूरी नहीं कि अद्वितीय हो। हालांकि, एक सफल एचएसवी पट्टिका परख से जुड़े मामूली चेतावनियों का यह गहन विवरण कई उपयोगकर्ताओं, विशेष रूप से नौसिखियों द्वारा अनुभव की जाने वाली कठिनाइयों को कम कर सकता है। भले ही, वर्णित पद्धति कई अन्य वायरसों के साथ पट्टिका assays पर भी व्यापक रूप से लागू होती है, जिसमें picornaviruses33, orthomyxoviruses34, flaviruses35, coronaviruses36, और कई अन्य प्रणालियों तक सीमित नहीं है, जिसमें संक्रामक पशु वायरस की एक मात्रात्मक मात्रा की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम अपनी प्रयोगशालाओं (पीजेडी और बीजेएम) में अनगिनत छात्रों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने इन तरीकों को परिष्कृत करने वाले वर्षों में हमारे साथ काम किया है। स्टेन व्यक्ति के लिए एक विशेष धन्यवाद, जिसके संरक्षण में इस पद्धति को पहली बार विकसित किया गया था। इस काम को आंशिक रूप से Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support Fund और NIGMS Bridges द्वारा Baccalaureate अनुदान 5R25GM058264 के लिए समर्थित किया गया था। यह सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 3512
6-well plates Corning 3516
Alpha-MEM Lonza 12169F
Antibiotic/antimycotic Gibco 15240096
Crystal violet Alfa Aesar B2193214
DMEM Gibco 11965092
Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) Gibco 14190144
Fetal calf serum Millipore-Sigma TMS-013-B
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) Gibco GS07F161BA
Hemacytometer Thermo Fisher 02-671-54
Methylcellulose Millipore-Sigma 27-441-0
Quaternary agent (Lysol I.C.) Thermo Fisher NC9645698
Trypan Blue Corning 25900CI
Trypsin Cytiva SH30042.01
Vero cells ATCC CCL-81

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 177
हरपीज सिंप्लेक्स वायरस की Plaquing
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Sadowski, L. A., Lesko, G. M., Suissa, C., Upadhyay, R., Desai, P. J., Margulies, B. J. Plaquing of Herpes Simplex Viruses. J. Vis. Exp. (177), e62962, doi:10.3791/62962 (2021).

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