Summary
Plaquing er en rutinemessig metode som brukes til å kvantifisere levende virus i en befolkning. Selv om plaquing ofte undervises i ulike mikrobiologiske læreplaner med bakterier og bakteriofager, er plaquing av pattedyrvirus mer kompleks og tidkrevende. Denne protokollen beskriver prosedyrene som fungerer pålitelig for vanlig arbeid med herpes simplex virus.
Abstract
Det er mange publiserte protokoller for plaquing virus, inkludert referanser innen primærlitteratur for metodikk. Det kan imidlertid være vanskelig å utføre plaquing-virus, noe som krever fokus på spesifikasjoner og raffinement. Det er en utrolig utfordrende metode for nye studenter å mestre, hovedsakelig fordi det krever omhyggelig oppmerksomhet til de fleste minutters detaljer. Denne demonstrasjonen av plaquing herpes simplex virus bør hjelpe de som har slitt med å visualisere metoden, spesielt dens nyanser, gjennom årene. Selv om dette manuskriptet er basert på de samme prinsippene for standard plaquing-metodikk, er det forskjellig ved at det inneholder en detaljert beskrivelse av (1) hvordan man best kan håndtere vertsceller for å unngå forstyrrelser under prosessen, (2) et mer nyttig viskøs medium enn agarose for å begrense spredningen av virioner, og (3) en enkel fikserings- og fargingsprosedyre som gir pålitelig reproduserbare resultater. Videre bidrar den medfølgende videoen til å demonstrere de finere forskjellene i prosessen, som ofte går glipp av når de instruerer andre om å gjennomføre plakkanalyser.
Introduction
Begynnelsen av virusplakkanalyser går tilbake til de første oppdagelsene av virus på 1890-tallet1. Tobakk mosaikkvirus ble først isolert og overført på tobakkblader, hvor individuelle infeksjonsflekker kunne gjenkjennes og kvantifiseres som opprinnelse fra en enkelt, levende virusenhet2, senere identifisert som en virion2. Senere seminalstudier med bakterier og bakteriofager perfeksjonerte teknikkene som brukes til å plakk disse virusene, inkludert bakterier i midtloggfasen av vekst, seriell fortynning av bakteriofageprøver og toppagar med etterfølgende visualisering av bokstavelige hull (navngitte plakk) i bakteriell plen3.
Plaquing av dyrevirus forsinket den spennende forskningen som ble utført med bakteriofager, hovedsakelig fordi metodene som kreves for å dyrke pattedyrceller i kultur ikke ble utviklet før på 1940-tallet4. Imidlertid skapte ankomsten av voksende murine celler i fravær av hele vertsorganismen4 en ny epoke i evnen til å kultur og telle virus. Slikt arbeid ble utvidet for forplantning og kvantasjon av Western Equine Encephalomyelittvirus i kyllingceller og poliovirus i menneskelige celler5,6. Etter hvert som riket av dyrkbare pattedyrceller utvidet seg, ga bevy av forskjellige vertsceller for ulike virusinfeksjoner verden en cornucopia av muligheter til å studere alle slags virus7. Dette inkluderte forplantning og kvantifisering av humane herpesvirus, spesielt herpes simplex virus-1 (HSV-1) og -2 (HSV-2), som forårsaker mucocutaneous lesjoner8. Viktigst er at alle plakkanalyser er avhengige av eksistensen av levende virioner, som kan komme inn i vertsceller på en reseptormediert måte i en prøve9. Uavhengig av allestedsnærværende og mange publikasjoner om utførelsen av plakettanalyser5,10,11,12,13,14,15,16, er disse metodene for HSV-1/-2 en blanding av både kunst og vitenskap; man kan ikke gjennomføre analysen uten riktig oppmerksomhet på hver detalj i protokollen, og man kan heller ikke utføre en vellykket analyse uten et crticial øye for subtilitet i prosessen. Dette manuskriptet skildrer en av de mest konsekvent reproduserbare metodene for HSV-1/-2 plakettanalyser, med presise detaljer om analysens kunst som sjelden diskuteres.
Denne aktuelle protokollen oppnår live plakkdannende enheter (PFU) teller for HSV-1 og -2 pålitelig. Beste resultater oppnås ved hjelp av Vero celler (transformert afrikansk grønn ape nyre epitelceller) ved lav passasje (under passasje nummer 155) og rutinemessig vokst i alfa-MEM17 supplert med 10% fosterkalv serum (FCS), L-alanyl-L-glutamin, og en antibiotika / antimykotisk blanding18. Vero-celler forplantes standard i dette mediet to til tre ganger i uken ved en 1/5 fortynning hver gang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer med Vero-cellene og levende herpesvirus er godkjent av Towson University Institutional Biosafety Committee. En generalisert ordning av disse prosedyrene er representert i figur 1.
1. Såing av Vero-cellene
- Dagen før du starter plakkanalysen, må du prøve å initiere Vero-celler og bruke dem på nytt i vanlig Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) og supplere i henhold til standard cellekulturmetodikk19. Resuspend de trypsiniserte cellene i 10 ml DMEM per T-75 kolbe av de sammenfølende Vero-cellene (~107 celler).
MERK: DMEM brukes til plakkanalyser i stedet for alfa-MEM fordi det reduserer cellevekstraten litt og favoriserer bedre plakkanalyseresultater. - Tell cellene etter ens foretrukne metode (f.eks. et standard hemocytometer med Trypan Blue-ekskludering)19.
- Frø cellene på 4 x 106 celler / plate; For HSV-2, bruk 6-brønnsplater med 2,5 ml DMEM (med kosttilskudd) per brønn; og for HSV-1, bruk 12-brønnsplater med 1,25 ml DMEM (med kosttilskudd) per brønn.
MERK: Antall celler bør være konstant uavhengig av platen som brukes, selv om størrelsen på brønnene er viktig med hensyn til nøyaktighet i plakkanalysen. Det er viktig å få celler jevnt fordelt, noe som mest effektivt kan oppnås ved å flytte platen frem og tilbake, ikke på en sirkulær måte. - La cellene vokse over natten ved 37 °C/5 % CO2 i en fuktet inkubator.
MERK: Fuktighet opprettholdes med en panne med destillert vann som inneholder et algicid i bunnen av inkubatoren.
2. Prøvefortynning
- Fullfør prøvefortynning og tilsetning av virus til celler i en laboratorieøkt.
FORSIKTIG: HSV-1 og -2 er smittsomme for mennesker og må håndteres under riktig biosikkerhet (BSL-2). Hold alle materialer som kommer i kontakt med viruset atskilt og desinfiserer med et kvartært middel ved 1/256 fortynning (se Materialfortegnelse), iodofor, blekemiddel eller sterkt ionisk vaskemiddel (f.eks. SDS) før du fjerner dem fra biosikkerhetsskapet. - Dagen etter sådd av Vero-cellene, fortynn hver virusprøve som skal plakkes i 1x PBS; bruk vanligvis 10 ganger fortynning for mest presis sporing.
- Gjør disse fortynningene gjennom 10-4 (for lave konsentrasjoner av virus) eller gjennom 10-9 (for forventninger om høyere titerprøver) med minst 1 ml av hver prøve som gjenstår for selve plakkanalysen.
- Hold alle virale fortynninger på is (ikke lenger enn 1 time) til de er klare til å legge til disse fortynnede virusprøvene til cellene.
3. Tilsetning av virus til cellene
- Fjern cellekulturmediet fra en eller to brønner med pipette.
MERK: Ikke bruk en aspirator fordi den fjerner for mye væske fra cellemonolayet og tørker ut cellene. En avgjørende vurdering er å sikre at cellemonolayeren forblir hydrert gjennom hele eksperimentet. Hvis cellene tørker ut, vil de vaske av platen i det siste trinnet og generere ubrukelige data. Bearbeid derfor bare en eller to brønner om gangen for å redusere denne muligheten. - Legg forsiktig til den fortynnede virusprøven (henholdsvis 100-400 μL og 50-200 μL virusprøve brukes til henholdsvis 6-brønns og 12-brønnsplater) dråpevis til hver monolayer, og legger til dråpene ned på siden av hver brønn. Gjenta prosessen for hver eneste eller to brønner til hele platen er fylt med virusprøvene som plakkes.
MERK: Hvis du legger til dråpene i midten av brønnen, kan det ved et uhell slå celler av substratet. - Rock forsiktig hele platen for hånd for å sikre at PBS som inneholder viruset dekker hele monolayer av celler i hver brønn, og plasser deretter platen i en CO2-inkubator ved 37 °C for å la viruset adsorbere.
- Hver 10 min innen 1 time, fjern platen fra inkubatoren, rock den forsiktig igjen for å spre viruset jevnere over hver brønn, og legg den deretter tilbake i inkubatoren.
MERK: Hvert eksperiment vil diktere antall repliker og hvilke fortynninger som brukes; leserens preferanse tilsier denne beslutningen. - For å redusere muligheten for utilsiktet telling av unabsorbert inoculum, fjern virusprøven fra brønnene med 1000 μL pipettespisser og legg den i et avfallsbeger.
MERK: Igjen utføres denne prosedyren med bare en eller to brønner om gangen for å opprettholde hydrering av cellemonolayeren. - Plasser 2,5 ml metylcelluloseoverlegg (oppløs 5 % metylcellulose m/w i 100 ml PBS, autoklav i 15 minutter ved 121 °C og 15 psi på en væskesyklus, og tilsett deretter 375 ml DMEM pluss 25 ml FBS).
- Når en hel plate inneholder overlegg, plasser platen tilbake i inkubatoren for å tillate vekst i to dager.
MERK: Hvis viruset og cellene får vokse i tre dager, selv i DMEM pluss kosttilskudd, kan det oppstå et betydelig tap av celler i monolayeren, og dermed kompromittere de endelige dataene. - Desinfiser avfallsbegeret, vanligvis med tilsetning av blekemiddel, en iodofor eller en lignende virucide, før du fjerner den fra biosikkerhetsskapet.
4. Farging for plakk
- Etter to-dagers inkubasjon, fjern metylcelluloseoverlegget med en pipette, igjen en eller to brønner om gangen, og legg den i et avfallsbeger.
- Tilsett ~2 ml 1% krystallfiolett (se Materialtabell) i 50% etanol til hver brønn for å farge plakkene.
MERK: Det er ikke viktig å fjerne hver eneste dråpe av overlegget. - Inkuber platen med alle brønner fylt med flekken i 30 min ved 37 °C. På dette tidspunktet desinfiserer du avfallsbegeret som ovenfor i trinn 3.8.
- Vask platene kraftig med vann fra springen til avrenningen er klar.
MERK: En mild strøm av vann er ikke kraftig nok; fullt trykk fra en lab vask armatur er nødvendig. - På dette tidspunktet må du sørge for at det er omtrent 10 ganger forskjeller i antall plakk på tvers av hver fortynningsserie.
- La platene tørke over natten opp ned, hvorpå de enkelte plakkene kan telles.
5. Telle plakk og bestemme virustipper
- Uavhengig av tilnærmingen (se MERKNAD nedenfor), multipliser antall plakk med fortynningsfaktoren (f.eks. hvis plakkene ble talt i 10-4-brønnen , ville antall plakk bli multiplisert med 104).
MERK: Selv om telling innenfor et område på 10-100 plakk er nyttig5, er det å telle brønner med 30-300 plakk noe mer pålitelig og tar hensyn til ca. 1/2-logg fortynning i stedet for fortynning av full logg. - Del dette tallet med volumet av inokulum (som ovenfor i trinn 3.2), og gjennomsnittlig alle brønner som har plakk innenfor det angitte området for å få den mest nøyaktige titeren av HSV i den opprinnelige prøven.
- Utfør beregningene i trinn 5.3.1 til 5.3.5, med tanke på bruk av spottdata i tabell 1.
- Vurder kun brønner med 30-300 plakk (trinn 5.1). I tabell 1 bruker du derfor bare 10-5-kolonnen for replikeringer 1, 2 og 3.
- Ta antall plakk ved gitt fortynning og multipliser med resiprokal av fortynningsfaktoren. Derfor går 10-5 kolonnen med prøve 1 fra 81 plakk ved 10-5 fortynning til 81 plakk ganger 105.
- Del deretter dette tallet med volumet (i ml) av virusfortynning lagt til cellene i den brønnen. Forutsatt at dataene på HSV-1 i tabell 1 er fra en 12-brønnsplate, vil 0,2 ml være den mest hensiktsmessige målingen. Beregningen fra trinn 5.3.2 blir derfor 81 x 105 delt på 0,2 ml, eller 4,0 x 107 PFU/ml HSV-1.
- Gjenta denne prosessen for alle nyttige data og gjennomsnitt. Utfør derfor beregningen i 5.3.2-5.3.3 på alle prøver i 10-5-kolonnen, forutsatt at de stammer fra samme virusprøve og de biologiske replikeringene ble utført for å oppnå den mest nøyaktige titermålingen. Når det gjelder tabell 1, er gjennomsnittet 4,0 x 107, 2,1 x 107 og 2,6 x 107 PFU/ml for å oppnå en endelig gjennomsnittlig titer på 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/ml for denne prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 1 viser et eksperiment som har optimale resultater. Alle 10 ganger fortynninger følger en ca. 10 ganger reduksjon i antall plakk. Denne typen data kan også ses i figur 2, en faktisk plakettanalyse der det tellbare antallet plakk falt i 10-4-området for alle tre replikeringene. Det samme kan ses i figur 3, den øverste raden, hvor det tellbare antall plakk var i 10-3 fortynning.
Figur 3, nederste rad, viser imidlertid et helt annet resultat når en plakkanalyse ikke utføres godt. For det første er det svært få plakk synlige fra noen fortynning; Derfor er dataene ubrukelige. For det andre er det synlige områder rundt toppen der Vero-cellene helt har løftet seg fra substratet, bevis enten for å la cellene tørke ut i prosessen eller for pipettering for kraftig i den regionen av brønnen.
Tabell 2 viser også et sett med potensielt avvikende utfall i plakktellinger og krever forsiktighet underveis. Vær oppmerksom på at verken den øverste raden eller den nederste raden med replikeringer følger en vanlig 10-ganger forskjell i plakkantall når en beveger seg fra en fortynning til den neste; Disse dataene indikerer brukerfeil under virusfortynningsprosessen. Videre er det ikke sannsynlig at en bruker nøyaktig vil telle over 15,000 XNUMX plaketter, så man må stille spørsmål ved disse dataene. Til slutt kan man merke seg at i replikering 1, 10-6 fortynning , er det et plakkantall i 30-300-området; Likevel, gitt den dårlige karakteren av resten av dataene i denne replikeringen, er det usannsynlig at 42 plakettantallet er et nøyaktig tall. Derfor er de eneste troverdige dataene i tabell 2 i replikering 2.
Figur 4 viser de samme problemene med at celler tørker ut eller blir feilbehandlet under plakkanalysen. Figur 4 viser imidlertid kritisk dårlig Vero-cellesåing; hver brønn viser mørkere lilla flekker, indikativ for celler som ikke er spredt godt over brønnen og stablet oppå hverandre i klynger.
Figur 1: Samlet plakkanalyseordning. Tilpasset fra Biorender-malen, "Viral Plaque Assay Protocol", av BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Plakkanalyse for HSV-1 i tolv brønnplater. Biologiske reparasjoner ble utført som beskrevet i figur 1 på ett utvalg av HSV-1. Serielle 10 ganger fortynning av en HSV-1-prøve (fra og med 10-2 fortynning ) ble tilsatt til Vero-cellene, inkubert, deretter farget med krystallfiolett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Plakkanalyse for HSV-2 i seksbrønnsplater. Biologiske reparasjoner ble utført som beskrevet i figur 1 på ett utvalg av HSV-2. Serielle 10 ganger fortynning av en HSV-2-prøve (fra og med 10-2 fortynning ) ble tilsatt veroceller, inkubert og deretter farget med krystallfiolett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Plakkanalyse for HSV-1 i tolv brønnplater. Biologiske reparasjoner ble utført som beskrevet i figur 1 på ett utvalg av HSV-1. Serielle 10 ganger fortynning av en HSV-1-prøve (fra og med 10-2 fortynning ) ble tilsatt veroceller, inkubert og deretter farget med krystallfiolett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Fortynningsfaktor | ||||
| Replikere | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 5721 | 635 | 81 | 5 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5,519 | 521 | 53 | 1 |
Tabell 1: Representativ plakett teller fra en vellykket analyse. Serielle fortynninger fra hver biologiske replikering ble utført; representative plakktall (fra og med 10-3 fortynning ) vises for hver fortynning.
| Fortynningsfaktor | ||||
| Replikere | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 15225 | 635 | 450 | 42 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5519 | 5400 | 53 | 1 |
Tabell 2: Representativ plakett teller fra en mislykket analyse. Serielle fortynninger fra hver biologiske replikering ble utført; representative plakktall (fra og med 10-3 fortynning ) vises for hver fortynning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens plakkanalyser er nesten like gamle som pattedyrcellekulturen selv, ser det ut til at hvert laboratorium har sitt eget sett med protokoller for å utføre denne grunnleggende analysen5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 . Selv om instruksjonene i hver publiserte versjon av en plakettanalyse er så forskjellige, er det få av disse manuskriptene som belyser de kritiske nyansene som er involvert i å oppnå konsistente resultater.
Derfor er det noen deler av denne protokollen som er mer kunst enn vitenskap. Når Vero-celler frøs i brønner for analysen, må de spres jevnt gjennom brønnen (figur 4). Alle trinn som involverer en væskeoverføring (f.eks. trinn 3.1, 3.2, 3.5, 3.6, 4.1 og 4.2) må gjøres nøye for å holde Vero-cellemonolayeren hydrert (figur 3 og figur 4). Det er også avgjørende å ikke berøre bunnen av brønnen med pipette, eller cellene kan skrape av, noe som ytterligere kompromitterer de endelige dataene (figur 4).
Mens metylcellulose er fordelaktig som overleggsmateriale for å forhindre diffusjon av virioner over hele brønnen, kan alternativer brukes. Man kan for eksempel bruke mikrokrystallinsk cellulose21,22 eller karboksymetylcellulose21. Uansett er metylcellulose et av de enkleste og billigste flytende overleggsmediene å bruke. Man kan også bruke en annen fargestoff21 eller festeløsning (f.eks. paraformaldehyd)21 for fargingsdelen av protokollen (trinn 4), men krystallfiolett i 50% etanol er den enkleste og billigste blant alternativene.
Selv om det kan være altfor enkelt å gjennomføre disse analysene, krever de trening og praksis. Det er vel verdt å bruke prøver som ikke er uerstattelige for å lære denne metoden, slik at man har mestret teknikken når det gjelder mest.
Plakettanalyser selv bør imidlertid bare brukes når man trenger å telle bona fide levende virioner. Plaquing er en mye eldre metodikk for å måle viruspartikler5,10 sammenlignet med nyere kvantitative metoder som fluorescensmikroskopi23, ELISA24, enzymatisk aktivitet25,26 eller qPCR27. Imidlertid genererer disse sistnevnte metodene surrogatdata som antyder tilstedeværelsen av hele virsjoner, men kan føre til en grov overestimering i levedyktige partikler fordi brukeren vil kvantifisere en indikator på infeksjon, ikke ekte virioner. Fluorescensmikroskopi måler smittsomme virioner ved hvor mange celler som viser tilstedeværelsen av et protein uttrykt av viruset, men oppdager ikke nødvendigvis komplette, replikerings-kompetente virioner. ELISA oppdager på samme måte tilstedeværelsen av virusproteiner som kan eksistere uten en helt smittsom virion. Analyse av enzymatisk aktivitet, mens det antyder en intakt virion, viser bare at et enkelt aktivt enzym er tilstede og ikke gjenspeiler den sanne smittsomme naturen til en hel virion. Og qPCR kvantifiserer bare kopier av et virusgenom, enten det genomet er defekt eller ikke. Den eneste metoden som kan sammenlignes med en plakkanalyse for å kvantifisere levende virus er en endepunktfortynning assay28, som fortsatt krever en statistisk estimering via Reed-Muench eller Spearman-Kärber metoder29,30,31 for å bestemme virion konsentrasjon.
Selv om plakettanalyser er en rutinemessig metode som brukes gjennom virologi, er det spesielle tilfeller der de ikke er den kvantitative analysen du velger. Plakkanalyser krever for eksempel vertsceller for å festes til et substrat. Hvis den beste vertscellen for infeksjon ikke er tilhenger, vil plakk aldri dannes32. Noen virus vokser saktere enn den typiske cellesyklusen til vertene, og derfor vil eventuelle blomstrende plakk bli overgrodd av vertscellene selv21. Plaketter kan noen ganger ikke danne seg godt, bare av arten av den cytopatiske effekten, noe som gjør bestemmelsen av bona fide plakk en begrensning21.
Tilnærmingen til plaquing herpesvirus presentert her er ikke nødvendigvis unik. Imidlertid kan denne grundige beskrivelsen av de mindre forbeholdene knyttet til en vellykket HSV-plakkanalyse redusere vanskelighetene som oppleves av mange brukere, spesielt nybegynnere. Uansett er den beskrevne metodikken også bredt anvendelig for plakkanalyser med mange andre virus, inkludert, men ikke begrenset til picornavirus33, orthomyxovirus34, flavirus35, koronavirus36 og mange andre systemer der det kreves en kvantifiserbar mengde smittsomme dyrevirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker utallige studenter i laboratoriene våre (PJD og BJM) som har jobbet med oss gjennom årene med å raffinere disse metodene. En spesiell takk til Stan Person, under hvis veiledning denne metodikken først ble utviklet. Dette arbeidet ble delvis støttet av Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support Fund og NIGMS Bridges til Baccalaureate grant 5R25GM058264. Dette innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health's National Institute of General Medical Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
- Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
- Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
- Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
- Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
- Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Fields Virology. Knipe, D. M., et al. 1, Wolters Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins. 1823-1897 (2013).
- Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
- Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
- Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
- Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
- Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
- Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
- Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
- Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
- Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63 (2006).
- Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201 (2016).
- Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
- Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
- Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
- Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , Academic Press. (2017).
- Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15H 11 (2013).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
- Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
- Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).
